4.附图说明

图1A显示了线粒体替换的细胞(MirC)的产生方案。

图1B显示了线粒体靶向序列(MTS)-XbaI限制性内切酶(XbaIR)质粒的质粒构建体。

图1C显示了通过XbaI限制性内切酶在多个位点消化分离的线粒体DNA，然而线粒体DNA的NotI消化导致产生了单一片段，如通过线粒体DNA的剑桥参考序列(CRS)所预测的。

图1D显示了人线粒体DNA上的5个XbaIR核酸内切酶位点(1193、2953、7440、8286、10256)，如通过剑桥参考序列(CRS)所预测的。

图1E显示了在使用电转化仪(Nucleofector)的融合MTS-绿色荧光蛋白(GFP)质粒的吸收之后，人皮肤成纤维细胞在相差(左图)、绿色荧光蛋白的免疫荧光(中间)和合并视野(右图)下的显微镜学。顶部，低放大倍数。底部，高放大倍数。

图1F显示了pCAGGS-MTS-EGFP-PuroR和pCAGGS-MTS-XbaIR-PuroR质粒的构建体。

图1G显示了使用四甲基罗丹明，甲酯(TMRM)通过线粒体-特异性染色，外源转基因产物MTS-EGFP在线粒体中的定位。

图2A显示了相对于未接触的细胞，将MTS-XbaIR核酸内切酶方法(顶部)与使用溴化乙锭(EtBr)的传统方法(中间)相比较的时间表的方案。

图2B显示了相对于未接触的细胞，在与MTS-XbaIR核酸内切酶方法或者溴化乙锭处理接触后，人β-肌动蛋白(Actb)，左列，和线粒体DNA(mtDNA)，右列，的定量。与EtBr处理相比，XbaIR导致mtDNA更大的减小。Actb被用作管家基因。

图2C显示了基于线粒体中表达的DsRed荧光，相对于EtBr处理，在暴露于MTS-XbaIR的基因转移后，线粒体的更大的减小。

图2D显示了使用通过使用TMRM的FACS分析，在与MTS-XbaIR或EtBr的基因转移接触的细胞中，线粒体膜电位(线粒体含量的替代标志物)的半定量，并且显示MTS-XbaIR导致线粒体的更大的减小。

图2E显示了在基因转移系统中在14天内的转基因表达的时间过程定量。

图2F和图2G显示了在嘌罗霉素选择之前(“前”)和之后(“后”)，在具有GFP的质粒的转移后的荧光图像(图2F)，并且GFP/线粒体的比的定量(图2G)显示了在嘌罗霉素选择后GFP质粒的富集。

图3A显示了线粒体替换的时间表的方案。TF：XbaIR的基因转染或空转染；Puro：用于基因转移细胞富集的嘌罗霉素；U+：尿嘧啶核苷的添加以挽救缺少线粒体ATP生产的ρ(-)细胞；Mt Tx：线粒体转移；NHDF：正常人皮肤成纤维细胞；EPC100：胎盘静脉内皮-来源的细胞系。

图3B显示如通过TMRM染色所测量的，在第6天，线粒体在XbaIR的基因转移后减少(顶部)，但是在阴性对照载体表达GFP转移后不减少(底部)。

图3C显示了在XbaIR或GFP转染的基因转染后，相对于NHDF细胞中的核β-肌动蛋白水平，通过人12S rRNA的qPCR估计的线粒体DNA拷贝数的定量。将线粒体转移到所指明的受体细胞中(“Mt Tx”)。XbaIR导致线粒体DNA显著降低，这在外源线粒体转移后可以挽救至与控制处理细胞相当的水平。N＝3，*p<0.01。

图3D显示了来自时间间隔拍摄(time lapse movie)的照片：左上：ρ(-)细胞与分离且DsRed-标记的线粒体的共培养；右上：作为对照的ρ(-)；左下：NHDF与线粒体的共培养；右下：NHDF的空转染子与线粒体的共培养；

图3E显示了垂直按时间顺序布置的来自图3D中所示的时间间隔拍摄的一系列10幅静止图像；

图3F显示了通过FACS分析的DsRed标记的线粒体的测量并且显示与先前所述方法相比，本发明(“DsRed-Mt EPC100”)导致外源线粒体吸收提高。

图3G和图3H显示了在使用或不使用抗霉素处理的ρ(0)细胞中的线粒体转移后，DsRed标记的线粒体(图3G)和相衬(图3H)显微镜图片，并且表明在线粒体完全破坏的细胞中没有发生外源线粒体的吞没。

图3I显示了垂直按时间顺序布置的来自图3G中所示的时间间隔拍摄的一系列5幅静止图像。

图3J显示了在ρ(-)细胞中或者在与Ds-红线粒体共培育的ρ(-)空转染细胞或未处理的细胞(附加的Mt)中，每24小时所测量的DsRed-标记的分离的外源线粒体的荧光强度的定量。

图4A显示了使用DsRed标记的线粒体作为供体并且使用EGFP标记的细胞作为受体，在通过受体细胞的吞没后，测量供体线粒体的命运的方案。

图4B显示了来自观察具有GFP标记的线粒体的受体细胞中吞没的外源线粒体(指示为红色)的拍摄的代表性图象。通过使用超精度显微镜记录拍摄，并且识别少数融合图象，并且大部分供体线粒体单独存在于预先存在的线粒体中。

图4C显示了所述融合的立体重构照片。

图4D显示了与线粒体转移信号融合的基因编码DsRed的NHDF转移的照片。

图4E显示了与TFAM融合的基因编码EGFP的EPC100转移的照片。

图4F显示了使用DsRed标记细胞作为受体并且使用TFAM靶向EGFP作为供体线粒体的线粒体转移的时间过程。

图4G显示在外源线粒体与受体细胞短暂接触后，外源TFAM稳定植入预先存在的线粒体中，表明类似于口对口摄入，通过短暂接触，将包括TFAM的线粒体拟核转移至预先存在的线粒体中。

图5A显示了具有指明高变(“HV”)区1/2和5个引物以识别NHDF和EPC100之间的差异的人线粒体DNA的剑桥参考序列(CRS)的完整环状线粒体DNA；

图5B显示了NHDF对照受体细胞(SEQ ID NO：1)、EPC100对照供体细胞(SEQ ID NO：2)、无线粒体替换的NHDF来源的ρ(-)细胞(SEQ ID NO：3)和具有线粒体替换的NHDF来源的ρ(-)细胞(SEQ ID NO：4)中围绕hmt16362的核苷酸的DNA测序数据，并且显示在hmt16362，具有线粒体替换的NHDF来源的ρ(-)细胞(SEQ ID NO：4)从原始受体细胞中的A改变为供体mtDNA中的G。

图5C显示了用于围绕hmt16362的人线粒体DNA D-环的HV1区(SEQ ID NO：8)扩增的hmt16318-F(SEQ ID NO：6)和hmt16414-R(SEQ ID NO：9)的引物组，以及设计用于TaqManSNP基因分型测定的NHDF特异性探针(SEQ ID NO：5)和EPC100特异性探针(SEQ ID NO：7)。

图5D显示了亲代NHDF和EPC100细胞系中，或者用XbaIR处理的，具有(XbaIR Mt+)或不具有来自EPC100细胞的线粒体(XbaIR Mt-)的NHDF细胞中的NHDF特异性hmtDNA(左图)和EPC100特异性hmtDNA(右图)的定量，并且显示EPC100线粒体成功转移到XbaIR Mt+细胞中，如通过使用单核苷酸多态性测定(SNP)所评价的。

图6A显示了来自使用Oroboros Oxygraph-2k所实施的线粒体功能测定的代表性氧气描记(oxygraphy)，并且表明相对于对照NHDF细胞(顶部)和无线粒体替换的ρ(-)NHDF细胞(中间)，具有线粒体替换的NHDF细胞(ρ(-)Mt)(底部)恢复了线粒体功能。机器以红线显示了呼吸流量(pmol/sec/1×10⁶个细胞，右侧轴)并且以蓝线显示了氧浓度(μM，左侧轴)。

图6B显示每个阶段的呼吸流量(常规，电子传递体系(Electron TransferSystem，ETS)，ROX)、游离常规活性(线粒体ATP产生)、质子泄露和耦合效率表明相对于NHDF对照细胞和无mtDNA替换的NHDF(ρ(-))，NHDF细胞(ρ(-)Mt)中的线粒体替换恢复了线粒体功能。

图6C显示了时间间隔显微照相，其使得能够估计基于细胞表面积的连续细胞数目，并且证明ρ(-)细胞在第3至12天之间处于静止状态，然而线粒体替换的细胞在第6天之后恢复了生长能力。

图6D显示了用于检验巨胞饮的分子机制的规程的方案，其包括用MTS-XbaIR-P2A-PuroR质粒转染NHDF细胞，用嘌罗霉素选择，然后将细胞血清饥饿60min或者用棕榈酸(PA)或雷帕霉素处理细胞24小时。

图6E-图6H显示了用于S6激酶磷酸化(图6E)和AMPK磷酸化(图6G)的WES^TM分析，以及分别地相应WES^TM印迹(图6F)和(图6H)的定量，其表明在ρ(-)细胞中AMPK被激活并且mTOR被完全抑制。Rapa：雷帕霉素，PA：棕榈酸，EAA-：必需氨基酸-缺乏。

图6I显示了用于检验MirC产生规程的背景中，mTOR介导的巨胞饮的效果的规程。

图6J-图6L显示了对照(顶部)、空转染细胞(中间)和使用或不使用雷帕霉素处理或者使用或不使用棕榈酸(PA)处理的ρ(-)细胞中的DsRed标记的线粒体吸收的定量(图6J和图6K)和FACS分析(图6L)。相对于空TF细胞对照，ρ(-)细胞显示出更大的线粒体吸收，并且在雷帕霉素处理之后，线粒体吸收显著提高，然而棕榈酸降低了ρ(-)细胞中的线粒体吸收。

图7A显示了显示线粒体DNA中的ND3基因的呼吸链复合物I(CI)亚基中的10158T>C的Leigh综合征相关突变的完整mtDNA序列。

图7B显示了EPC100细胞(顶部；SEQ ID NO：10)和Leigh综合征(7SP)成纤维细胞(底部；SEQ ID NO：11)中的ND3内围绕hmt10158的核苷酸的DNA测序数据，并且用主波中的C和次波中的T的马赛克显示了突变10158T>C，从而表明了异质性。

图7C显示了来自时间间隔拍摄的照片，其表明在具有和不具有外源线粒体的ρ(-)7SP成纤维细胞两者中情况类似，如NHDF实验中。

图7D显示了在XbaIR基因转染或空转染之后，相对于NHDF细胞中的核β-肌动蛋白水平，通过人12S rRNA的qPCR估计的线粒体DNA拷贝数的定量。将线粒体转移至指明的受体细胞中。XbaIR导致线粒体DNA显著减少，这可以通过外源线粒体转移挽救。(n＝3)

图7E显示了7SP对照受体细胞(SEQ ID NO：14)、EPC100对照供体细胞(SEQ ID NO：12)、无线粒体替换的7SP来源的ρ(-)细胞(SEQ ID NO：13)和具有线粒体替换的7SP来源的ρ(-)细胞(SEQ ID NO：15)中围绕hmt10158的核苷酸的DNA测序数据，并且表明7SP对照细胞是异质的(大多数是10158C；SEQ ID NO：14)，然而EPC100仅在线粒体DNA中的相同位点具有T(SEQ ID NO：12)。源自7SP细胞的ρ(-)细胞表达与原始相同的波(SEQ ID NO：13)，然而线粒体替换的7SP细胞作为主波显示T(SEQ ID NO：15)。

图7F显示了用于围绕hmt10158处的Leigh综合征相关SNP的人线粒体DNA的ND3(SEQ ID NO：16)的扩增的hmt10085-F(SEQ ID NO：17)和hmt10184-R(SEQ ID NO：20)引物组，以及设计用于TaqMan SNP基因分型测定的EPC100特异性探针(SEQ ID NO：18)和7SP特异性探针(SEQ ID NO：19)。还显示了ND3肽序列(SEQ ID NO：46)。

图7G显示了通过SNP测定评价的每个细胞组中的hmt10158异质性百分比的定量，并且显示在线粒体替换的7SP细胞中以外源正常序列(“健康”)为主并高达80％，即使突变体序列的原始异质性超过90％。在空转染子的情况下，异质性未显著变化并且维持几乎相同的比值。

图7H和图7I在用空对照处理并进行线粒体转移的7SP细胞中，在3个独立实验中显示了异质性水平百分比(图7H)和绝对mtDNA拷贝数(图7I)的定量。

图7J显示了垂直按时间顺序布置的来自图7G中所示的时间间隔拍摄的一系列10幅静止图像。

图8A显示了与原始7SP成纤维细胞和ρ(-)7SP成纤维细胞相比，ρ(-)线粒体替换的7SP成纤维细胞随时间的显微照片，并且显示线粒体替换的细胞的生长恢复至接近对照水平。

图8B显示了7SP成纤维细胞、ρ(-)7SP成纤维细胞和具有线粒体替换的ρ(-)7SP成纤维细胞中时间推移估计的细胞生长，然而线粒体替换的7SP细胞在约第12天使细胞生长恢复至相当于原始7SP成纤维细胞的水平。

图8C显示了群体倍增水平(PDL)约25的7SP成纤维细胞中的衰老，这在具有PDL 8时实施的健康线粒体替换的ρ(-)7SP成纤维细胞中延长至约PDL 63，表明具有健康线粒体替换的ρ(-)7SP成纤维细胞的寿命延长。

图8D显示PDL的增加产生了细胞尺寸增加(左图)，这在线粒体替换后恢复并且维持甚至超过PDL 50(右图)。

图8E显示了短串联重复序列(STR)测定，其区分了具有不同来源的细胞并且鉴别了不同类型的细胞的污染。在不同时间点，线粒体替换的细胞中的STR类型与原始7SP成纤维细胞中的完全相同。

图8F显示了相对于HeLa和EPC100，对于不同的PDL，7SP成纤维细胞和线粒体替换的细胞中端粒酶的RT-PCR定量，从而表明所述细胞未转化为癌细胞。

图9A显示了在根据耦合-控制规程(coupling-control protocol，CCP)，使用Oroboros O2k的线粒体替换后，在不同的PDL，7SP成纤维细胞中的氧气描记，并且动力学表明相对于作为对照的原始7SP成纤维细胞，在早期PDL，线粒体功能降低，然后缓慢恢复并最终超过原始能力。

图9B和图9C显示在约PDL30之后，在线粒体替换的细胞(ρ(-)Mt)中，呼吸流量(常规，电子传递体系(Electron Transfer System，ETS)，ROX)、游离常规活性(线粒体ATP产生)、质子泄露和耦合效率(图9B)以及通量控制比(FCR)、ROX/E、L/E、R/E和(R-L)/E(图9C)恢复至接近对照水平。

图10A显示了在基础条件下或者在使用H₂O₂的再灌注之后，NHDF、7SP、7SP MirC细胞的显微镜图象，并且显示相对于NHDF细胞，7SP细胞对H₂O₂高度灵敏，然而7SP MirC不是。

图10B-图10D显示了在不处理或者用H₂O₂处理后，膜联蛋白V(图10C)和碘化丙啶(PI；图10D)阳性细胞的FACS分析(图10B)和定量，并且显示相对于NHDF细胞，7SP细胞对H₂O₂高度灵敏，然而7SP MirC不是。

图10E显示了在基础条件下或者在饥饿条件(EAA-)后，NHDF、7SP、7SP MirC细胞的显微镜图象，并且显示相对于NHDF细胞，7SP细胞对饥饿条件高度灵敏，然而7SP MirC不是。

图10F-图10H显示了在不处理或饥饿处理后，膜联蛋白V(图10G)和PI(图10H)阳性细胞的FACS分析(图10F)和定量，并且显示相对于NHDF细胞，7SP细胞对饥饿条件高度灵敏，然而7SP MirC不是。

图11显示了PDL几乎相同(约15至20)的NHDF、7SP成纤维细胞和7SP成纤维细胞-来源的MirC细胞的代表性SASP细胞因子IL-6和IL-8、趋化因子CXCL-1和生长因子ICAM1的表达水平的定量，其表明IL-6显著降低，表明MirC中SASP的逆转。将GAPDH用于归一化。

图12A显示了来自线粒体替换的7SP成纤维细胞的诱导的多潜能干细胞(iPSC)的产生方案。

图12B-图12D显示了作为iPSC的指示剂的碱性磷酸酶(AP)染色和定量，它是从7SP成纤维细胞、7SP成纤维细胞-来源的MirC或来源于7SP成纤维细胞的空转染子产生的。AP染色细胞的微观(图12B左图；7SP成纤维细胞，中间图；7SP成纤维细胞-来源的MirC，右图：7SP成纤维细胞的空转染子)和宏观(图12C左图；7SP成纤维细胞，中间图；7SP成纤维细胞-来源的MirC，右图：7SP成纤维细胞的空转染子)显微镜以及AP染色细胞的定量(图12D)显示在XbaIR处理后，NHDF或7SP成纤维细胞中的线粒体替换导致AP染色升高。

图12E显示了来源于线粒体替换的7SP成纤维细胞的iPSC的集落形成。在重编程因子的基因转移后75天和170天的3个代表性集落的照片。

图12F显示了在线粒体替换后，从7SP成纤维细胞产生的iPSC中的OCT3/4、NANOG、TRA1-80和TRA-160的免疫组织化学染色，它是多潜能干细胞的代表性标志物；

图12G显示了与作为参考的原始7SP成纤维细胞和标准人iPSC(201B7)相比，来源于7SP成纤维细胞来源的MirC的iPSC中的线粒体DNA拷贝数，并且显示iPSC具有与标准人iPSC的类似的有限的线粒体DNA个数。

图12H和图12I显示了在重编程程序后170天，在来源于7SP成纤维细胞-来源的MirC的iPSC中的异质性百分比(图12H)和绝对mtDNA拷贝数(图12I)，并且显示形成iPSC的7SP成纤维细胞-来源的MirC在至少3个克隆中显示出可忽略的水平的突变基因组序列，降低的总mtDNA和接近100％的供体mtDNA，表明MirC中的异质性变化可以恢复至原始状态，并且不同于IVF中的线粒体替换疗法。

图13A显示了从供体细胞向受体细胞的线粒体转移的规程方案，其中所述供体细胞和受体细胞来自生命周期的不同阶段。

图13B显示了具有基因型hmt16145 A的NHDF对照受体细胞(SEQ ID NO：21)和具有基因型hmt16145 G的TIG1对照供体细胞(SEQ ID NO：22)中围绕hmt16145的核苷酸的DNA测序数据。

图13C显示了通过来自线粒体替换的细胞(MirC)(具有来自“年轻”TIG1供体细胞的线粒体的线粒体转移的“老”NHDF受体细胞)的细胞的SNP测定的hmt16145异质性水平(％)定量，并且表明具有来自TIG1来源的线粒体供体细胞的线粒体替换的NHDF来源的MirC细胞中的大于90％的mtDNA是hmt16145 G(即来自TIG1 mtDNA)，然而100％的NHDF对照细胞的mtDNA是hmt16145 A。

图13D显示了在用MTS-GFP(“空”)或MTS-XbaIR(“MirC”)转染并且与来自TIG1供体细胞的外源线粒体共培育的受体NHDF细胞或者未转染的受体NHDF细胞(“对照”)中，群体倍增水平(PDL)相对于时间(天)(左图)和倍增时间(小时)相对于群体倍增水平(右图)的定量。具有“年轻”供体TIG1胚胎肺细胞(PDL 10)对“老”的正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)受体细胞(PDL 41)的替换的MirC显示出寿命延长，如通过PDL中的向上偏移(左图)和PDL中的向右偏移(右图)所示。

图13E显示了在用MTS-GFP加线粒体转移(“空”)或MTS-XbaIR加线粒体转移(“MirC”)转染的正常人皮肤成纤维细胞或者未转染的正常人皮肤成纤维细胞(“对照”)中，群体倍增水平(PDL)相对于时间(天)(左图)和倍增时间(小时)相对于群体倍增水平(右图)的定量。从“老”供体细胞(PDL 49)向“年轻”受体细胞(PDL<21)的线粒体转移显示出寿命缩短，如通过PDL中的向下迁移(左图)和PFL中的向左迁移(右图)所示。

图14A显示了通过体外转录所产生的mRNA的质量评价，如通过对MTS-EGFP和MTS-XbaIR的mRNA的电泳所测量的。

图14B显示在电穿孔后24小时，T细胞的线粒体中MTS-GFP转基因强表达。

图14C显示了在通过电穿孔的MTS-GFP mRNA的转染后，T细胞中GFP表达的FACS分析，并且显示GFP表达存在于几乎所有的T细胞中。

图14D显示了DsRed标记的线粒体的FACS分析，并且表明MTS-XbaIR构建体稳健地降解内源线粒体，然而MTS-GFP不会。

图14E显示了用于确定线粒体共培育的最优时间段的规程设计方案。

图14F显示了对照电穿孔细胞(上图)和MTS-GFP电穿孔细胞(下图)在电穿孔(EP)后4小时、2天、4天、6天和8天时的荧光图像，并且表明在电穿孔后4小时内，MTS-GFP构建体显示出高表达并且到第6天时，几乎不存在。

图14G和图14H显示了相对于GAPDH，在接收MTS-GFP mRNA的细胞中GFP的电泳(图14H)和定量(图14G)。峰值表达发生在第4天，并且到第6天时，表达消失。

图14I显示了4小时、第2天(d2)、第4天(d4)、第6天(d6)和第8天(d8)时XbaIR转录本水平的定量，其表明核酸内切酶的转录本表达在基因转移后4小时是最高的。

图14J显示了经受MTS-XbaI的细胞中线粒体含量的定量(12S rRNA)并且表明到第2天，线粒体减少至约30％，并且在整个实验长度内，保持在小于20％。

图15A显示了在第0天进行电穿孔，在第2天分析，在第7天进行线粒体(mt)转移，在第9和14天进行SNP测定并且在第14天进行ddPCR异质性测定的人原代T细胞的MirC规程方案。

图15B显示了人原代NH T细胞对照受体细胞(顶部；SEQ ID NO：23)和EPC100对照供体细胞(底部；SEQ ID NO：24)中人线粒体DNA D-环的HV1区的hmtDNA 218和hmtDNA 224周围的核苷酸的DNA测序数据。对于T细胞和EPC100细胞，hmtDNA 218和hmtDNA 224分别是C/C(SEQ ID NO：23)和T/T(SEQ ID NO：24)。

图15C显示了用于围绕hmtDNA 218和hmtDNA 224处的SNP的人线粒体DNA D-环(SEQ ID NO：25)的HV1区的扩增的hmtHV1-F(SEQ ID NO：26)和hmtHV1-R(SEQ ID NO：27)的引物组，以及SNP测定引物Primer1-F(SEQ ID NO：40)、SNP测定-引物Primer1-R(SEQ IDNO：41)，设计用于TaqMan SNP基因分型测定的N末端VIC标记的EPC100特异性探针(SEQ IDNO：38)和N末端FAM标记的T细胞特异性探针(SEQ ID NO：39)。

图15D显示了在与来自供体EPC100细胞的外源线粒体共培育后，对于空(MTS-GFP)或MTS-XbaIR(XbaIR)处理的细胞，在第7天和第12天存在于受体细胞中的外源mtDNA的量的定量。作为阳性对照进行受体和供体细胞的定量。

图15E显示了使用Oroboros O2k进行的呼吸测量实验的定量，并且表明了人T细胞-来源的MirC中的ATP产生和耦合效率的恢复，然而通过使用电穿孔的XbaIR mRNA转移所产生的ρ(-)人T细胞在整个实验期间维持ATP产生的丧失。

图15F和图15G显示了使用耦合-控制规程(CCP)的代表性原始数据，并且显示MirCT细胞能够恢复线粒体呼吸。

图16A显示了在RPMI1640(顶部)或TexMACS(底部)中培养的小鼠原代T细胞在第2天(左图左侧)，第4天(左图中间)和第6天(左图右侧)的存活力比较(左图)或者CD3表达(右图)，并且表明相对于TexMACS培养基，RPMI1640产生了更大的存活力和更高的细胞计数，以及轻微的CD3表达升高。

图16B显示了在电穿孔(EP)后，使用pmax GFP(中间)或MTS-GFP(右图)或者无电穿孔(左图)的T细胞中，在EP后6小时(左上图)，EP后2天(右上图)，EP后4天(左下图)和EP后6天(右下图)的GFP表达的定性分析。在EP后2天或4天，使用MTS-GFP不显著影响存活力。

图16C显示了在电穿孔后4小时、2天、4天和6天时，使用MTS-XbaIR载体的电穿孔T细胞中的XbaIR水平的qPCR定量，并且表明XbaIR表达缓慢降低。

图16D显示了使用MTS-XbaIR，在电穿孔T细胞中12S rRNA水平的定量，并且表明到第4天，鼠科mtDNA减少约60％。

图16E显示了使用线粒体共培育，在第5天，在T细胞中用于MirC产生的规程方案。

图16F显示了在与分离的DsRed-标记的线粒体共培育后48小时，受体T细胞中吞没的DsRed-标记的线粒体的FACS分析，并且显示了与无电穿孔的对照细胞(即“附加”)中的0.43％相比，MTS-XbaIR中表达外源线粒体的T细胞的明显的阳性部份(9.73％)。

图17A显示了具有基因型mmt2766-A和mmt2767-T的小鼠mtDNA C57BL6受体细胞(“BL6”；顶部；SEQ ID NO：34)和具有基因型mmt2766-G和mmt2767-C的NZB供体细胞(底部；SEQ ID NO：35)中围绕ND1的核苷酸的DNA测序数据。

图17B显示了用于围绕多态性核苷酸mmt2766和mmt2767的小鼠线粒体DNA的ND1(SEQ ID NO：32)的扩增的2716-F(SEQ ID NO：28)和2883-R(SEQ ID NO：33)的引物组，和设计用于TaqMan SNP基因分型测定的BL6特异性探针(SEQ ID NO：29)和NZB特异性探针(SEQID NO：31)，以及在用于产生能够绝对定量的标准曲线的质粒中用于克隆核苷酸序列的BamH1-mND1-F引物(SEQ ID NO：30)。还显示了ND1肽序列(SEQ ID NO：47)。

图17C显示了对照电穿孔后(分别为第1和2列)或者MTS-XbaI电穿孔并与来自NZB细胞的分离的线粒体共培育后7天和12天(分别为第3和4列)，在BL6受体细胞中的小鼠mtND1异质性水平的定量。作为对照测量了BL6(第5列)和NZB(第6列)细胞的基础水平。

图17D显示了在用MTS-XbaIR mRNA对老的鼠科细胞进行处理并与来自年轻供体细胞的外源线粒体共培育以产生MirC(年轻至老：YtoO)后，端粒长度的测量，并且表明与亲代“老”细胞相比，MirC中的端粒长度增加。

图17E显示了亲代老T细胞或者MirC-来源的T细胞中SASP相关细胞因子CXCL1、ICAM1、IL-6和IL-8的测量，并且表明在MirC-来源的T细胞中CXCL1和IL6较少。

图17F显示了使用组蛋白2A(H2A)磷酸化抗体，在MirC和原始T细胞中的DNA损伤应答的测量，其表明与原始T细胞(4.75％)相比，MirC中的DDR阳性部份较低(1.53％)。

图18A显示了使用具有来自年轻小鼠的T细胞的ACT的老小鼠(组1)、具有ACT的老小鼠(组2)或者具有来源于转移了来自年轻小鼠的外源线粒体的老小鼠的T细胞的MirC的ACT的老小鼠(组3)的体内ACT实验方案。

图18B显示了在实验规程期间实施的肿瘤生长成像的代表性图像。

图18C显示了空、年轻T细胞或MirC组的体重，并且表明在25天实验期间，在3组之间未观察到显著差异。

图18D和图18E显示了个体(图18D)和平均(图18E)癌症物质尺寸的定量并且表明MirC组将癌症物质尺寸降低至相当于年轻T细胞组的水平(下线)，然而在整个实验长度期间，空组中的癌症物质增加(上线)。

图18F显示了用于分析动物中输注的T细胞的存在的规程方案。

图18G显示了周围血液(左图)或脾脏(右图)的FACS分析。对于周围血液和脾脏两者产生了使用C57BL/6小鼠的阴性对照(左上图)和使用GFP转基因小鼠的阳性对照(左下图)。在周围血液和脾脏两者中识别了表达GFP荧光的T细胞的阳性部份，其分别为0.057％和0.9％。

图18H显示了在移植后第6天，在小鼠中检测的转移的T细胞的免疫荧光图象。

图18I显示了在注入1×10⁷或2×10⁷个细胞后，在周围血液(PB)或脾脏中输注外源T细胞后的嵌合性百分比。

图19A和图19B显示了使用X-001、Y-001和T-030程序(分别为MTS-GFP1、2和3)或者作为阳性对照的pmax GFP或者作为阴性对照的Ctl EP，通过显微镜学(图19A)或者FACS(图19B)对MTS-GFP向造血细胞(HSC)的转染的评价，并且显示MTS-GFP1是用于电穿孔HSC的最优规程。

图19C显示了在与来自EPC100细胞的DsRed-标记的线粒体共培育后48小时，骨髓-来源的Sca-1细胞的三维共聚焦荧光成像，并且显示吞没了外源线粒体。

图19D显示了通过DsRed荧光的FACS分析的线粒体转移效率的定量，并且显示约10％的Sca-1亚群显示出荧光的向右迁移。

图19E显示了通过在第4天与外源线粒体共培育并且在第6天通过SNP测定分析MirC的用于产生HSC来源的MirC的方案。

图19F显示了细胞的c-kit+、Sca-1+、系谱-、CD34-(称为KSLC)部份的FACS分选。

图19G显示KSLC部份的倍增时间是19小时。

图19H显示了用于评价HSC来源的MirC的方案。

图19I显示了鼠科KSLC-来源的MirC或者亲代受体BL6细胞或NZB供体细胞中鼠科mtND1异质性水平百分比的定量，并且表明在通过电穿孔的MTS-XbaI mRNA转移后6天，MirC来源的HSC表达99.9％的供体细胞的多态性基因型。

图20A显示了其中在正常人皮肤成纤维细胞中分析了突变的mtDNA和非突变的mtDNA序列的tRNA Leu 3243 A>G的微滴式数字PCR结果的2-D图，并且仅显示检测到非突变的序列(右下象限)并且未检测到突变序列(左上象限)。

图20B显示了其中在正常人皮肤成纤维细胞中分析了突变的mtDNA和非突变的mtDNA序列的ND3 10158 T>C的微滴式数字PCR结果的2-D图，并且仅显示检测到非突变的序列(右下象限)并且未检测到突变序列(左上象限)。

图20C显示了其中在正常人皮肤成纤维细胞中分析了突变的mtDNA和非突变的mtDNA序列的ATP6 9185 T>C的微滴式数字PCR结果的2-D图，并且仅显示检测到非突变的序列(右下象限)并且未检测到突变序列(左上象限)。

图20D显示了其中在来自患有具有mtDNA A3243G突变的MELAS的患者的原代皮肤成纤维细胞中分析了突变mtDNA和非突变mtDNA序列的微滴式数字PCR结果的2-D图，并且显示大部分细胞具有突变mtDNA的同型异源性(左上象限)。

图20E显示了其中在来自患有具有复合物I，ND3基因的mtDNA T10158C突变的Leigh综合征的患者的原代皮肤成纤维细胞中分析了突变mtDNA和非突变mtDNA序列的微滴式数字PCR结果的2-D图，并且在单细胞水平显示了具有异质性的较少部分的双重阳性细胞(右上象限)，并且显示大部分群体具有突变mtDNA的同型异源性(右下)并且无群体具有非突变mtDNA的同型异源性(左上)。

5.发明的详细说明

本文提供了不需要完全除去内源mtDNA并且可以任选地使用与临床使用相容的试剂进行的产生线粒体替换的细胞(MirC)的新型和增强的方法。另外，在某些实施方式中，本文提供了治疗方法，其包括施用治疗有效量的使用本文所提供的方法产生的MirC。

还提供了包含通过本文所提供的方法获得的一种或多种线粒体替换的细胞的组合物。在某些实施方式中，所述组合物还可以包含提高外源线粒体、外源mtDNA或它们的组合的吸收的第二活性剂和/或减少内源mtDNA拷贝数的试剂或者降低内源线粒体功能的试剂。在其它实施方式中，所述组合物还可以包含外源线粒体和/或外源mtDNA、一种或多种受体细胞或它们的组合。在一个具体实施方式中，本文提供了用于在治疗与功能障碍的线粒体有关的疾病或病症中使用的方法和组合物。然而，应理解本文所提供的方法和组合物还可以用于延缓具有功能性线粒体的细胞的衰老，延长其寿命或增强其功能，并且不局限于功能障碍的线粒体的替换。此外，本文所提供的方法和组合物还可以用于用功能障碍或耗竭的外源线粒体替换功能性线粒体(例如)以产生疾病模型。

5.1定义

除非另外具体定义，否则在本发明申请中使用的所有术语，包括技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。通常，在本说明书和以下所述的实验方法中使用的命名是相关领域中普遍已知且通常使用的。

如本文所使用的，术语“线粒体替换的细胞”或MirC旨在表示具有外源线粒体和/或mtDNA对内源线粒体和/或mtDNA的替换的细胞。例如，示例性的线粒体替换的细胞(MirC)包括用编码功能性线粒体的外源mtDNA，如来源于健康对象的mtDNA替换编码功能障碍的线粒体的内源mtDNA，如来源于患有线粒体疾病或病症的对象的mtDNA。示例性的MirC还可以包含用外源线粒体替换内源线粒体的细胞。然而，应理解内源线粒体和/或mtDNA的替换还可以包括(例如)用来自不同细胞，如来自年轻对象的更健康的细胞的功能性外源mtDNA替换来自一种细胞，如来自年老细胞的功能性内源mtDNA。还将理解还可以用功能障碍的外源线粒体和/或外源mtDNA替换健康的内源线粒体和/或mtDNA，如(例如)模拟线粒体疾病或病症。替换不需要导致细胞中所有内源线粒体的完全替换，并且示例性的线粒体和/或mtDNA替换包括约5％或以上，约10％或以上，约20％或以上，约30％或以上，约40％或以上，约50％或以上，约60％或以上，约70％或以上，约80％或以上，约90％或以上或者约95％或以上的内源线粒体和/或mtDNA的替换。

如本文所使用的，术语“受体细胞(recipient cell)”、“受体细胞(acceptorcell)”和“宿主细胞”是可互换的并且表示接收外源线粒体和/或mtDNA的细胞。在一些实施方式中，外源线粒体和/或mtDNA来自分离的线粒体，所述分离的线粒体来自供体细胞。在一些实施方式中，所述供体细胞和所述受体细胞可以是不同的或相同的。在一些实施方式中，所述供体细胞和所述受体细胞来自不同或相同的物种。在一些实施方式中，所述供体细胞和所述受体细胞来自不同或相同的组织。

如本文所使用的，术语“健康供体”旨在表示未患有线粒体疾病或病症、年龄相关疾病或其它功能障碍的线粒体的供体。在优选的实施方式中，相对于线粒体基因组的剑桥参考序列，健康供体具有野生型mtDNA序列。

如本文所使用的，术语“治疗”表示症状严重程度、发展、扩散和/或频率的降低、症状和/或潜在原因的消除、发生症状和/或它们的潜在原因的预防以及伤害的改善或补救。“治疗”表示包括病况、疾病或病症的治疗性治疗以及预防或抑制措施。

当用于表示消除、减少mtDNA时，如本文所使用的，术语“试剂”是指能够减少mtDNA的酶或化合物。优选的试剂包括限制性内切酶，如XbaI，其在一个或多个位点切割mtDNA，而不会在受体细胞中产生毒性。然而，试剂还可以包括抑制mtDNA合成或者选择性促进线粒体降解的酶或化合物。

如本文所使用的，术语“减少”或“降低”通常是指与参考水平相比，至少5％的降低，例如，至少约10％，或者至少约20％，或者至少约30％，或者至少约40％，或者至少约50％，或者至少约60％，或者至少约70％，或者至少约80％，或者至少约90％的降低，或者5％-99％之间的任何降低，如该术语在本文中所定义的。如本文所使用的，应理解部分减小或者部分减小内源mtDNA的试剂或者降低不导致所有内源mtDNA的完全消除(即ρ0细胞)。如本文所使用的术语“升高”通常表示至少5％的升高，例如，至少约10％的升高，或者至少约20％，或者至少约30％，或者至少约40％，或者至少约50％，或者至少约60％，或者至少约70％，或者至少约80％，或者至少约90％，或者大于90％的升高。

如本文所使用的，术语“内源的”是指内部产生或来源的。例如，内源线粒体是细胞天然的线粒体。

如本文所使用的，术语“外源的”是指对于宿主是非天然的细胞材料(例如，线粒体或mtDNA)，如外部来源的细胞材料。“外部”通常表示来自不同来源。例如，当线粒体基因组来源于与宿主细胞或宿主线粒体相比不同的细胞类型或不同的物种时，线粒体基因组对于宿主细胞或宿主线粒体是外源的。另外，“外源的”还可以表示从线粒体除去、操纵并返回相同线粒体的线粒体基因组。

如本文所使用的，术语“足够的一段时间”是指生产所期望的结果的时间量。应理解足够的一段时间将根据实验条件而改变，其包括(但不限于)温度、所使用的试剂的量和细胞类型。作为指导，在全文中为“足够的一段时间期间”提供了示例性规程，并且本领域技术人员将能够识别足够的一段时间而无需过度实验。

如本文所使用的，术语“大多数”旨在表示相对于所比较的另一个量的最大的量。当对两组进行比较时，示例性的大多数是全部群体的大于约50％或以上，约60％或以上，约70％或以上，约80％或以上，或者约90％或以上，或者约95％或以上的任何整数的量，包括它们之间的任何整数的量。应理解大多数将取决于所比较的总群体，并且当存在3个或更多个比较的组时，可以是小于50％的量。

当用于表示外源材料的转移时，如本文所使用的，术语“无创”旨在表示不使用创伤性仪器(例如，纳米刀片或电穿孔)、物理作用力(例如，离心作用)或者有害培养条件(例如，热冲击)。在优选的实施方式中，无创转移程序包括受体细胞和供体线粒体的共培育。

如本文所使用的，术语“需要线粒体替换的对象”旨在表示已经或倾向于具有功能障碍的线粒体的对象。需要线粒体替换的对象可以是无症状的并且需要预防性护理。需要线粒体替换的对象还可以是有症状的并且需要治疗。在某些实施方式中，需要线粒体替换的对象具有不是由于年龄相关疾病或线粒体疾病或病症所造成的功能障碍的线粒体。

如本文所使用的，术语“对象”旨在表示哺乳动物。对象可以是人或非人哺乳动物，如狗、猫、牛、马、小鼠、大鼠、兔或其转基因物种。应理解“对象”还可以表示“患者”，如人患者。

如本文所使用的，术语“有效量”是指对于调节、治疗或改善与异质性和/或功能障碍的线粒体有关的任何疾病或病症有效的本发明的组合物的量。照此，有效量可以包括(例如)治疗有效量，其是指疗法有效量或者生物学有效量，其是指对于生物效应有效的量。术语“治疗有效量”和“有效量”可以涵盖改善整体疗法，减少或避免疾病或病症的症状或病因或者提高另一种治疗剂的治疗效力的量。将对应于这种量的给定组合物的量将根据多种因素而改变，如给定组成、药物制剂、施用途径、病况、疾病或病症的类型、正在治疗的对象或宿主的身份，但是尽管如此本领域技术人员可以常规地确定这些因素。如本文所定义的，技术人员可以通过本领域中已知的常规方法容易地确定试剂的治疗有效量。

如本文所使用的，术语“年龄相关疾病”是指可归因于年龄增长的多种病况。这些病况包括但不限于骨质疏松症、骨流失、关节炎、关节硬化、白内障、黄斑变性、代谢疾病，包括糖尿病、神经退行性疾病，包括阿尔茨海默氏病和帕金森氏症、免疫衰老和心脏病，包括动脉粥样硬化和血脂异常。短语“年龄相关疾病”还涵盖了神经退行性疾病，如阿尔茨海默氏病和相关病症、ALS、亨廷顿病、帕金森氏病和癌症。

如本文所使用的，术语“自体免疫疾病”旨在表示由针对自身组织、器官的免疫反应所产生的疾病或病症，或其表现或者由此产生的病况。自体免疫疾病可以表示由与自体免疫抗原或其表位具有反应性的自体抗体的产生所造成或加重的病况。自体免疫疾病可以是组织-或器官-特异性的，或者它可以是全身性自体免疫疾病。全身性自体免疫疾病包括结缔组织疾病(CTD)，如全身性红斑狼疮(狼疮；SLE)、混合结缔组织病系统性硬化、多肌炎(PM)、皮肤肌炎(DM)和干燥综合征(SS)。其它示例性自体免疫疾病还包括类风湿性关节炎和抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)多血管炎。

如本文所使用的，术语“遗传疾病”是指由核基因组异常，如突变所引起的疾病。示例性的遗传性疾病包括(但不限于)早年衰老综合症、沃纳综合征和亨廷顿病。

如本文所使用的，术语“癌症”包括(但不限于)实体癌和血液扩散的癌症。术语“癌症”和“癌性的”表示或描述了其特征通常为无限制的细胞生长的哺乳动物中的生理条件。

如本文所使用的，术语“线粒体疾病或病症”和“线粒体病症”是可互换的并且表示由遗传性或获得性线粒体损害所造成的一组病况，其导致身体那些区域内能量短缺。受线粒体疾病或病症影响的示例性器官包括消耗大量能量的那些器官，如肝脏、肌肉、脑、眼、耳和心脏。结果通常是肝功能衰竭、肌无力、疲劳以及心脏、眼和多种其它系统的问题。

如本文所使用的，术语“线粒体DNA异常”表示线粒体基因中的突变，其产物定位至线粒体，但在健康对象细胞中观察不到。与线粒体DNA异常有关的示例性疾病包括(例如)慢性进行性眼外肌麻痹(CPEO)、皮尔逊综合症、科恩-塞亚综合征(Kearns-Sayre Syndrome)(KSS)、糖尿病伴耳聋(DAD)、Leber遗传性视神经病变(LHON)、LHON-加、神经病、共济失调和视网膜色素变性综合征(NARP)、母系遗传的Leigh综合征(MILS)，也称为由突变mtDNA所引起的Leigh综合征、线粒体脑肌病、乳酸性酸中毒和中风样发作(MELAS)、肌阵挛性癫痫伴碎红纤维病(MERRF)、家族性双侧纹状体坏死/纹状体黑质变性(FBSN)、Luft病、氨基糖苷引起的耳聋(AID)和线粒体DNA综合征的多种缺失。

在线粒体疾病或病症的背景中，如本文所使用的，术语“核DNA异常”表示其产物定位至线粒体的核基因编码序列的突变或变化。与核突变有关的示例性线粒体疾病或病症包括线粒体DNA缺失综合征-4A、线粒体隐性共济失调综合征(MIRAS)、线粒体神经胃肠道脑肌病(MNGIE)、线粒体DNA缺失综合征(MTDPS)、DNA聚合酶γ(POLG)-相关病症、感觉性共济失调性神经病伴构音障碍及眼肌麻痹(SANDO)、伴脑干与脊髓受累以及乳酸升高的脑白质病(LBSL)、辅酶Q10缺乏症、Leigh综合征(由核突变引起)、线粒体复合物异常、延胡索酸酶缺乏症、α-酮戊二醛脱氢酶复合物(KGDHC)缺乏症、琥珀酰辅酶A连接酶缺乏症、丙酮酸脱氢酶复合物缺乏症(PDHC)、丙酮酸羧化酶缺乏症(PCD)、肉毒碱棕榈酰转移酶I(CPT I)缺乏症、肉毒碱棕榈酰转移酶II(CPT II)缺乏症、肉碱-酰基-肉碱(CACT)缺乏症、常染色体显性-/常染色体隐性-进行性眼外肌麻痹(ad-/ar-PEO)、婴儿型脊髓小脑萎缩(IOSCA)、线粒体肌病(MM)、脊髓性肌萎缩(SMA)、生长停滞、氨基酸尿、胆汁郁积、铁过载、早期死亡(GRACILE)和2A型Charcot-Marei-Tooth病(CMT2A)。

如本文所使用的，术语“功能障碍的线粒体”表示与功能性线粒体相对的线粒体。示例性功能障碍线粒体包括通过氧化磷酸化不能合成ATP或合成的ATP的量不足的线粒体。如本文所使用的，术语“功能性线粒体”是指消耗氧气并产生ATP的线粒体。

如本文所使用的，术语“突变”是指基因结构的任何改变，其导致产生了变体(也称为“突变体”)形式。基因突变可以由DNA中单个碱基的交替或者由较大的基因区或染色体的缺失、插入或重复引起。在一些实施方式中，所述突变可以影响功能或者所产生的蛋白。例如，蛋白编码区中的DNA单核苷酸突变(即点突变)可以导致产生编码不同氨基酸的密码子(即错义突变)。应理解这种不同的氨基酸可以改变蛋白结构并且在某些情况下，如本文所述，可以改变细胞器，如线粒体的功能。

如本文所使用的，术语“异质性”和“异质的”表示个体或样品中不止一种类型的线粒体DNA基因组的出现。不同程度的异质性与本文所述的不同程度的生理条件有关。可以通过本领域已知的方式鉴别异质性，并且预期与特定核苷酸等位基因有关的生理条件的严重程度将随个体内这种相关等位基因的百分比而改变。

当在线粒体DNA的背景中使用时，如本文所使用的，术语“野生型”是指如它在自然界中存在的典型物种形式的基因型。野生型人mtDNA基因组的示例性参考基因组包括剑桥参考序列(CRS)。

如本文所使用的，术语“老”或“较老”旨在表示mtDNA的来源来自年龄比受体细胞更大的对象或者相对于受体细胞，来自自它们离体培养起，群体倍增次数(即群体倍增水平，PDL)更大的细胞群体中的细胞。

如本文所使用的，术语“年轻”或“较年轻”旨在表示mtDNA的来源来自年龄比受体细胞更小的对象或者相对于受体细胞，来自自它们离体培养起，它们的群体倍增次数(即群体倍增水平，PDL)更少的细胞群体中的细胞。

当用于表示线粒体时，如本文所使用的，术语“分离的”是指已与其天然生物环境的其它细胞组分物理分离或从中除去的线粒体。

如本文所使用的，术语“完整的”和“完整的线粒体”是指包含外膜和内膜、膜间腔、嵴(由内膜形成)和基质的线粒体。示例性的完整线粒体含有mtDNA。在优选的实施方式中，完整的线粒体是功能性线粒体。然而，应理解还可以在本发明中使用完整的功能障碍的线粒体。

如本文所使用的，术语“自体同源的”旨在表示得自相同对象的生物成分。

如本文所使用的，术语“同种异体的”旨在表示得自相同物种，但是基因型与接受所述生物成分的对象的不同的生物成分。

如本文所使用的，术语“动物细胞”旨在表示来自真核生物的任何细胞。应理解动物细胞可以包括哺乳动物和非哺乳动物物种，如两栖动物、鱼、昆虫(例如，果蝇(Drosophila))和虫(例如，秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans))。

如本文所使用的，术语“融合蛋白”是指主要但不必需通过肽键彼此连接的氨基酸序列，其中所述序列的一部分来源于(即与序列具有序列相似性)一种来源(天然或合成)，而所述序列的另一部分来源于一种或多种其它来源。可以通过构建编码整个融合蛋白(编码两个部分，如线粒体-靶向序列和核酸内切酶)的表达载体来制备示例性融合蛋白，从而基本上所有的键是肽键。还将理解可以通过化学缀合，如通过使用用于缀合肽的任何已知方法来进行融合。

如本文所使用的，术语“线粒体-靶向序列(MTS)”和“线粒体靶向序列(MTS)”是可互换的并且表示能够导致与之连接的酶、肽、序列或化合物转运至线粒体中的任何氨基酸序列。在某些实施方式中，所述MTS是人MTS。在另一个实施方式中，所述MTS来自另一个物种。这些序列的非限制性实例是细胞色素c氧化酶亚基X(COX10)MTS(MAASPHTLSSRLLTGCVGGSVWYLERRT，SEQ ID NO：36)和细胞色素c氧化酶亚基VIII(COX8)MTS(MSVLTPLLLRSLTGSARRLMVPRA，SEQ ID NO：37)。MTS序列的其它非限制性实例是通过核DNA编码、在细胞质中翻译(产生)并转运到线粒体中的每个单个线粒体蛋白的天然MTS以及柠檬酸合酶(cs)、硫辛酰胺脱氢酶(LAD)和C6ORF66(ORF)。在它们当中，多种MTS对于每种线粒体酶可以是可交换的。每种可能性代表了用于本发明使用的融合蛋白的单独的实施方式。

如本文所使用的，术语“小分子”是指影响生物过程并且分子量为约900道尔顿或以下的化合物。示例性的小分子的分子量在约300至约700道尔顿之间。

当结合数值使用时，如本文所使用的，术语“约”或“大约”表示所提及的数值的1、5、10、15或20％以内的任何数值。

如本文所使用的，术语“体细胞”是指除干细胞、祖细胞和生殖细胞(即卵原细胞和精原细胞)以及由此衍生出的细胞(例如，卵母细胞、精子)外，形成生物体的任何分化的细胞。例如，内脏、皮肤、骨、血液和结缔组织均由体细胞组成。体细胞得自动物，优选地人对象，并且根据本领域那些技术人员可用的标准细胞培养规程培养。

如本文所使用的，术语“内吞途径”是指其中细胞从它们周围吸收分子的细胞过程。内吞途径可以是“内涵素-依赖性的”，其需要招募内涵素来帮助质膜弯曲至吸收所述分子的囊泡中，或者是“不依赖于内涵素的”，其不需要招募内涵素。不依赖于内涵素的内吞的示例性类型包括(例如)巨胞饮。如本文所使用的，术语“内吞激活剂”是指(例如)诱导或激活内吞途径或过程，从而提高内吞途径的试剂。示例性的“内吞激活剂”提高了线粒体从胞外环境的吸收。

如本文所使用的，术语“巨胞饮”是指介导溶质分子、营养物和抗原的非选择性吸收的不依赖于内涵素的内吞形式。

如本文所使用的，术语“化合物”是指能够引起所期望的生物学功能的化合物。所述术语包括(但不限于)DNA、RNA、蛋白、多肽和其它化合物，包括生长因子、细胞因子、激素或小分子。

如本文所使用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白”是可互换使用的并且以其最广泛的含义表示受约束(即，具有一些结构元件，如(例如)引起β转角或β折叠的氨基酸的存在，或者例如，通过二硫键合的Cys残基的存在所造成的环化)或者不受约束(例如，直链或非结构化)氨基酸序列。组成多肽的氨基酸可以是天然来源的或者可以是合成的。可以从生物样品纯化多肽。多肽、蛋白或肽还涵盖了修饰的多肽、蛋白或肽，例如，糖多肽、糖蛋白或糖肽；或者脂多肽、脂蛋白或脂肽。

如本文所使用的，术语“调节”和“调节剂”旨在表示基础内稳态状态的性质或组分改变。示例性调节包括通过破坏内稳态改变细胞代谢，从而使细胞代谢显著降低。术语“调节剂”包括抑制剂和激活剂。抑制剂是(例如)抑制所期望的蛋白、途径或过程的表达或修饰，或者结合至、部分或完全阻断刺激，降低、防止、延迟激活，使所述靶标蛋白、途径或过程的活性失活、脱敏或下调的试剂。在某些实施方式中，抑制剂是靶标蛋白、途径或过程的拮抗剂。激活剂是(例如)诱导或激活所述靶标蛋白、途径或过程的表达或修饰，或者结合至、刺激、提高、打开、激活、有利于、增强抑制剂活性的激活、使所述的靶标蛋白(或者编码多核苷酸)、途径或过程的活性敏化或上调的试剂。在某些实施方式中，激活剂是靶标蛋白、途径或过程的激动剂。调节剂包括天然存在的和合成的配体、拮抗剂和激动剂(例如，用作激动剂或拮抗剂的小化学分子、抗体等)。还将理解调节剂可以是生物(例如，抗体)或化学的。

如本文所使用的，术语“之前”旨在表示在事件开始前的一段时间，从而它是足够长的时间以实现和保持所期望的结果(例如，抗生素选择)或者效应(例如，生物效应)，同时在预期事件起始前，所期望的结果或效应不会完全消散。例如，在示例性情况中，应理解在外源线粒体和/或外源mtDNA的转移之前，调节细胞代谢将包括足够的一段时间以(例如)显示出所期望的生物效应(例如，S6激酶磷酸化作用的升高)，同时在发生外源线粒体和/或外源mtDNA的转移之前，所述生物效应不会恢复到内稳态状态。

如本文所使用的，术语“营养胁迫”是指足以在细胞内稳态中生产扰动的养分缺乏或营养饥饿条件，如引起自噬、AMPK信号转导和/或mTOR信号转导通路。示例性的营养胁迫条件包括血清饥饿、必需氨基酸去除和/或代谢途径破坏。

术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换地用于描述由核苷酸，例如，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或者合成产生的化合物所组成的任何长度的聚合物，所述化合物可以以类似于两种天然存在的核酸的序列特异性方式与天然存在的核酸杂交，例如，可以参与沃森-克里克碱基配对相互作用。如本文所使用的，在多核苷酸序列的背景中，术语“碱基”与“核苷酸”是同义的，即多核苷酸的单体亚基。当用于表示核苷酸时，缩写“A”旨在表示腺嘌呤(A)。当用于表示核苷酸时，缩写“G”旨在表示鸟嘌呤(G)。当用于表示核苷酸时，缩写“C”旨在表示胞嘧啶(C)。当用于表示核苷酸时，缩写“T”旨在表示胸腺嘧啶(T)。

当用于表示载体时，术语“药物可用的”旨在表示必须与所述制剂的其它成分相容并且对其受体无害的载体、稀释剂或赋形剂。

除非另外说明，否则本文所提供的实施方式的实践将使用常规分子生物学、微生物学和免疫学方法，其在本领域工作人员的技术范围内。这些技术在文献中有充分说明。特别适合参考的教科书的实例包括以下：Sambrook等人,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001)；Ausubel等人,CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,MD(1999)；Glover主编,DNA Cloning,第I和II卷(1985)；Gait主编,Oligonucleotide Synthesis(1984)；Hames&Higgins主编,Nucleic Acid Hybridization(1984)；Hames&Higgins主编,Transcription and Translation(1984)；Freshney主编,Animal Cell Culture:Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press,1986)；等人,Plant MolecularBiology–A Laboratory Manual(Melody S.Clark主编；Springer-Verlag,1997)；Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Academic Press,London)；Scopes,Protein Purification:Principles and Practice(Springer Verlag,N.Y.,第2版.1987)；和Weir&Blackwell主编,Handbook of Experimental Immunology,第I-IV卷(1986)。

5.2产生线粒体替换的细胞(MirC)的方法

本发明部分基于以下发现：任何降低内源线粒体功能的试剂，包括减少内源线粒体DNA(mtDNA)的试剂可以提高外源线粒体的无创转移。然而，内源mtDNA的完全消除，如ρ(0)细胞防止了这种提高。这是因为外源线粒体的无创转移是能量依赖性的，并且内源mtDNA的完全消除极大限制了可用于辅助无创转移过程的能量。类似地，当线粒体功能和/或mtDNA不受干扰时，例如，当线粒体仅通过离心共培育(即“附加”)或添加时，外源线粒体的无创转移也是低效的。

因此，本文提供了产生线粒体替换的细胞(MirC)的方法，其可以包括(a)将受体细胞与减少内源mtDNA拷贝数的试剂或者降低线粒体功能的试剂接触；(b)将所述受体细胞与所述试剂培育足够的一段时间以分别部分减少内源mtDNA拷贝数或者部分降低所述受体细胞中的内源线粒体功能；和(c)将(1)其中内源mtDNA或内源线粒体功能已分别部分降低的来自步骤(b)的受体细胞和(2)来自健康供体的外源线粒体共培育足够的一段时间以将外源线粒体无创转移至所述受体细胞，借此产生线粒体替换的细胞。本文还提供了产生线粒体替换的细胞的方法，其包括实施如上所述的步骤(a)和(b)，然后(c)将(1)其中内源mtDNA或内源线粒体功能已分别部分降低的来自步骤(b)的受体细胞和(2)来自健康供体的外源mtDNA共培育足够的一段时间以将外源mtDNA无创转移至所述受体细胞，借此产生线粒体替换的细胞。在某些实施方式中，通过外源线粒体转移外源mtDNA。

MirC的产生可以是多种应用的有用策略。举例来说，外源线粒体、外源mtDNA或它们的组合向受体细胞的转移可以用于(例如)替换功能障碍的内源线粒体和/或由具有功能性线粒体的突变mtDNA组成的内源线粒体，如由野生型mtDNA组成的线粒体。在某些实施方式中，在具有编码功能障碍的线粒体的内源mtDNA的受体细胞中实施本文所提供的方法。在具体的实施方式中，所述内源mtDNA是突变mtDNA。在某些实施方式中，所述内源mtDNA是异质的并且由野生型mtDNA和突变mtDNA两者组成。

如上所述，在某些应用中，外源线粒体、外源mtDNA或它们的组合的转移可以包括功能性线粒体或野生型mtDNA的转移以替换(例如)功能障碍或由突变mtDNA组成的内源线粒体。因此，在某些实施方式中，所述外源mtDNA是野生型mtDNA。在其它实施方式中，受体细胞的内源线粒体具有野生型mtDNA和功能障碍的内源线粒体。例如，具有野生型mtDNA的受体细胞的示例性功能障碍的线粒体可以包括编码线粒体蛋白的突变核DNA或者由于继发效应，如衰老或疾病所引起的功能障碍的线粒体。

因此，可以使用本文所述的方法替换功能障碍的内源线粒体、由突变mtDNA组成的内源线粒体或它们的组合。可以由于多种因素发生线粒体功能障碍。非限制性实例包括由于疾病(例如，年龄相关疾病、线粒体疾病或病症、神经退行性疾病、视网膜疾病、遗传疾病)、糖尿病、听觉障碍或它们的任意组合所造成的线粒体功能障碍。线粒体功能障碍可以包括内源线粒体功能降低了大于5％，大于10％，大于20％，大于30％，大于40％，大于50％，大于60％，大于70％，大于80％或者大于90％。因此，在一些实施方式中，内源线粒体包括功能降低了约5％，约10％，约15％，约20％，约25％，约30％，约40％，约50％，约60％，约70％，约80％，约90％或约100％的线粒体。

本文所提供的方法适用于同质和异质mtDNA两者。在具体实施方式中，所述内源mtDNA是单一类型的mtDNA(即内源mtDNA是均质的)。在其它具体的实施方式中，内源mtDNA包括不止一种类型的mtDNA(即内源mtDNA是异质的)。在一些实施方式中，异质mtDNA包括野生型mtDNA和突变mtDNA两者。通常，突变mtDNA的比例决定了表型的严重程度并且可以影响线粒体功能降低的程度。例如，在一些实施方式中，异质mtDNA是5％的突变mtDNA和95％的野生型mtDNA，并且线粒体功能降低5％。在其它实施方式中，异质mtDNA是55％的突变mtDNA和45％的野生型mtDNA，并且线粒体功能降低55％。然而，应理解突变mtDNA的百分比不需要与线粒体功能成正比。

功能障碍的线粒体的特征通常在于电子传递链效率降低和高能分子，如腺苷-5'-三磷酸(ATP)的合成减少，有害活性氧(ROS)的漏出和/或细胞呼吸破坏。本领域技术人员将理解如何评价线粒体功能。例如，细胞-基测定，如Seahorse Bioscience XF胞外通量分析仪(Extracellular Flux Analyzer)可以在单次试验中用于实施基础氧消耗、糖酵解速率、ATP产生和呼吸量的测定以评价线粒体功能障碍。类似地，Oroboros 02K呼吸仪也可以用于建立定量功能性线粒体诊断。应理解如上所述的测定实例是示例性的并且不包括评价线粒体功能的所有方法。

在一些实施方式中，功能性线粒体具有完整外膜。在一些实施方式中，功能性线粒体是完整线粒体。在另一个实施方式中，功能性线粒体随时间以提高的速率消耗氧气。在另一个实施方式中，通过氧消耗测量线粒体的功能性。在另一个实施方式中，可以通过本领域中已知的任何方法测量线粒体的氧消耗，如(但不限于)MitoXpress荧光探针(Luxcel)。在一些实施方式中，功能性线粒体是在存在ADP和底物，如(但不限于)谷氨酸盐、苹果酸盐或琥珀酸盐的情况下显示出氧消耗速率升高的线粒体。每种可能性代表了本发明的单独的实施方式。在另一个实施方式中，功能性线粒体是产生ATP的线粒体。

尽管本文所提供的方法可以用于从具有功能障碍的线粒体、突变mtDNA或它们的组合的受体细胞产生MirC，但是还应理解MirC的产生不需要在具有功能障碍的线粒体的受体细胞中进行。在一些实施方式中，使用具有功能性内源线粒体、野生型mtDNA或它们的组合的受体细胞产生MirC，并且外源线粒体也是功能性的，含有野生型mtDNA或它们的组合。例如，可以使用本文所提供的方法减少内源野生型mtDNA，并且可以将外源野生型mtDNA转移至受体细胞中，如使用来自健康供体细胞(例如，具有相对低PDL的年轻细胞)的外源mtDNA在“老”受体细胞(例如，来自衰老对象的细胞或者具有相对高群体倍增水平(PDL)的细胞)中的线粒体替换。因此，在某些实施方式中，外源mtDNA来自作为健康供体细胞的供体细胞，例如，比受体细胞年轻的供体细胞。在某些实施方式中，供体和受体细胞的PDL差异为约1.5倍，约2倍，约2.5倍，约3倍，约4倍，约5倍或者大于5倍。在其它实施方式中，供体和受体细胞来自年龄相差约1.5倍，约2倍，约2.5倍，约3倍，约4倍，约5倍或者大于5倍的对象。然而，应理解供体细胞和受体细胞之间的年龄差异不是所要求的。在一些实施方式中，供体和受体细胞是相同年龄的，并且供体细胞是健康的细胞。

在其它实施方式中，在具有功能性内源线粒体，如野生型内源mtDNA的受体细胞中进行MirC的产生，并且外源mtDNA是突变的，编码功能障碍的线粒体，外源线粒体是功能障碍的或它们的组合。在其它实施方式中，外源线粒体、外源mtDNA或它们的组合来自比受体细胞老的供体细胞。例如，在一些实施方式中，可以通过用来自突变和/或编码功能障碍的线粒体的供体细胞的外源mtDNA替换受体细胞中的功能性线粒体来产生线粒体疾病或病症模型。应理解本文所述的实例是示例性的并且不包括涉及mtDNA替换的所有组合。

如本文所提供的，可以使用减少内源mtDNA的试剂或者降低内源线粒体功能的试剂实践产生MirC的方法。在某些情况中，可以使用两种试剂的组合。能够降低线粒体功能的试剂在本领域中是熟知的，并且在本领域技术人员的技术范围内。示例性的试剂包括在存在ADP或解偶联剂的情况下阻断呼吸的线粒体呼吸链抑制剂，如复合物III抑制剂(例如，粘噻唑)、复合物IV抑制剂(例如，叠氮化钠、氰化钾(KCN))或者复合物V抑制剂(例如，寡霉素)；在添加ADP后消除氧消耗爆发，但是对解偶联剂-刺激的呼吸无影响的磷酸化抑制剂；消除呼吸链和据观察具有完整线粒体的磷酸化系统之间的必须连接的解偶联剂(例如，二硝基苯酚、CCCP、FCCP)；防止ATP输出或原材料跨过线粒体内膜输入的ATP/ADP转运抑制剂，如腺嘌呤核苷酸转位酶抑制剂(例如，苍术苷)；使内膜对通常不能跨膜的化合物可透过的离子载体(例如，缬氨霉素、尼日利亚菌素)；或者阻断一个或多个TCA循环酶或辅助反应的三羧酸循环抑制剂(例如，亚砷酸盐、氨基氧乙酸盐)。应理解如上所述能够降低线粒体功能的试剂是非限制性的，并且本领域技术人员可以使用本领域中已知的技术容易地识别能够降低线粒体功能的适合的试剂。

在具体的实施方式中，降低内源线粒体功能的试剂短暂降低内源线粒体功能。在其它实施方式中，降低内源线粒体功能的试剂永久降低内源线粒体功能。在优选的实施方式中，降低内源线粒体功能的试剂部分降低内源线粒体功能。

多种试剂可以用于减少mtDNA。在某些实施方式中，减少mtDNA的试剂选自编码包含线粒体-靶向序列(MTS)和核酸内切酶、核酸内切酶或小分子的融合蛋白的核酸。在某些实施方式中，所述小分子是核苷反转录酶抑制剂(NRTI)。所述核酸可以是信使核糖核酸(mRNA)或者脱氧核糖核酸(DNA)。在某些实施方式中，减少mtDNA的试剂是编码核酸内切酶的质粒DNA表达载体盒。在优选的实施方式中，所述试剂是编码具有MTS的核酸内切酶的质粒DNA表达载体盒。可以使用多种表达载体盒，并且本领域技术人员将理解基于宿主细胞，使核酸内切酶能够成功表达所需的必要考虑。例如，哺乳动物表达载体，如具有巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子或CAG启动子的载体将适合于核酸内切酶在哺乳动物细胞，而不是非哺乳动物细胞中的表达。类似地，应理解还可以使用病毒表达载体并且本领域技术人员将理解这些病毒表达载体可能需要辅助质粒(即包膜和包装质粒)与转移质粒串联使用。在其它实施方式中，所述试剂是编码核酸内切酶的mRNA。在其它优选实施方式中，所述试剂是编码具有MTS的核酸内切酶的mRNA。在其它实施方式中，所述试剂是作为重组蛋白的核酸内切酶。在其它实施方式中，所述试剂是小分子，如(例如)破坏mtDNA合成的小分子。用于产生任何表达方法的技术是本领域技术人员已知的并且可以容易地实施而无需过度实验。在优选的实施方式中，所述试剂适合于临床使用。

在具体的实施方式中，所述核酸内切酶可以是将DNA双螺旋在特定位点切割成片段的限制性内切酶，如XbaI，其切割以下DNA序列：

所述核酸内切酶还可以包括(例如)除XbaI以外的限制性内切酶，如EcoRI、BamHI、HindIII或PstI，它们均在多个位点消解mtDNA。核酸内切酶具有限定的识别位点，其允许预测它们对mtDNA的灵敏度。限制性内切酶的限定识别位点，如(例如)XbaI、EcoRI和SmaI对给定核酸序列特异。因此，在一些实施方式中，可以使用已合并成DNA核酸酶的锌指和转录激活子样效应因子(TALE)进行内源mtDNA的减小。可以将这两类DNA-结合蛋白工程设计，从而对所关心的新DNA序列具有特异性。类似地，还可以通过添加相应编码基因将成簇规律性间隔短回文重复(CRISPR)/Cas9蛋白引入细胞。因此，在一些实施方式中，所述核酸内切酶可以是可编程核酸酶，如RNA-导向的DNA核酸内切酶(例如，Cas9)、锌指核酸酶(ZFN)或者转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)。应理解如上所述的核酸酶是非限制性的，并且本领域技术人员可以使用本领域中已知的技术容易地识别适合的核酸内切酶。例如，剑桥参考序列或类似的共有序列可以通过(例如)计算机分析用于鉴别识别mtDNA序列的适合的核酸内切酶。在具体的实施方式中，核酸内切酶切割野生型mtDNA序列。在其它实施方式中，核酸内切酶切割突变mtDNA序列。还将理解减少内源mtDNA的试剂不需要是核酸内切酶并且可以使用能够减少mtDNA的任何试剂，包括抑制mtDNA生物合成的试剂，如溴化乙锭。在本文中还考虑了试剂，如(例如)尿石素A或小分子p62-介导的线粒体自噬诱导剂(PMI)，其诱导自噬以促进内源线粒体的选择性降解(即线粒体自噬激动剂)。还可以使用核苷反转录酶抑制剂(NRTI)作为减少mtDNA的试剂来实践本发明。

另外，在一些实施方式中，表达载体盒可以包括一种或多种抗生素抗性基因以使得能够选择表达所述表达载体盒的细胞群体。例如，在一些实施方式中，所述表达载体可以包括来自链霉菌属的嘌罗霉素N-乙酰基-转移酶基因(pac)，并且可以使用嘌罗霉素选择细胞。在其中使用抗生素，例如，嘌罗霉素进行选择的情况下，所述选择可以是短暂的(例如，24-48小时)以限制对药物的长期暴露。然而，应理解以上所提供的实例仅是示例性的并且所述表达载体盒可以包括其它抗生素抗性基因，如(例如)用于通过杀稻瘟素进行选择的bsr、bls或BSD基因，或者通过潮霉素B进行选择的hph基因。通常将理解用于选择的抗生素的浓度将基于抗生素的类型和细胞类型，并且对于本领域技术人员是无需过度实验而易于可获得的。还将理解可以通过本领域中已知的任何方式产生选择并且不需要包括抗生素抗性。例如，在一些实施方式中，可以通过(例如)细胞表面标志物的荧光激活细胞分选(FACS)或者通过所述表达所编码的荧光蛋白的表达来进行细胞选择。在其它实施方式中，可以根据细胞表型进行选择。例如，在一些实施方式中，具有异质性的细胞中突变内源mtDNA的成功缺失可以导致可选择的表型反应，如(例如)细胞存活。

因此，在一些实施方式中，在引入含有降解mtDNA的核酸内切酶的表达载体盒之后选择细胞。在一些实施方式中，选择细胞以获得表达降解mtDNA的核酸内切酶的均一细胞群体。在具体的实施方式中，在引入含有降解mtDNA的核酸内切酶的表达载体盒之后选择细胞，并产生均一的稳定细胞系。在其它实施方式中，选择细胞以富集表达降解mtDNA的核酸内切酶的细胞群体。如上所述，通过选择的这种富集可以包括对抗生素的短暂暴露。基于选择压力的程度和/或方式，富集的细胞可以稳定表达所述核酸内切酶或者短暂表达所述核酸内切酶。应理解富集的群体不需要是均一的，并且表达降解mtDNA的核酸内切酶的该富集的细胞群体相对于未选择的细胞群体，含有更高比例的具有所述核酸内切酶的细胞，但是还可以含有不表达所述核酸内切酶的一些细胞。

在其它实施方式中，在引入含有降解mtDNA的核酸内切酶的表达载体之后不选择细胞。在具体的实施方式中，在引入含有降解mtDNA的核酸内切酶的表达载体之后不选择细胞并且核酸内切酶短暂表达。

用于引入质粒DNA表达载体盒、mRNA和/或重组蛋白的多种方法在本领域中是已知的。在一些实施方式中，通过电穿孔引入质粒DNA表达载体盒。在具体的实施方式中，电穿孔法是流式电穿孔，如MaxCyte流式电穿孔。在其它具体的实施方式中，电穿孔法包括核转染技术，如Lonza的Nucleofector^TM技术。在其它实施方式中，通过阳离子脂质转染引入质粒DNA表达载体盒。在其它实施方式中，通过病毒转导引入质粒DNA表达载体盒。应理解如上所述用于引入表达载体盒的方法是非限制性的并且仅旨在是示例性方法，并且本领域中已知的任何方法可以用于引入DNA表达载体盒。

当用于减少内源线粒体的试剂包含核酸内切酶时，核酸内切酶的表达也可以包括引入编码核酸内切酶的mRNA或者作为重组蛋白引入核酸内切酶。在某些实施方式中，MaxCyte电转化仪可以用于mRNA转染，特别是在临床环境中，其已通过了优良制造规范和优良临床规范的标准。可以根据生产商的规程，使用MaxCyte电转化仪进行转染。还将理解如上所述的方法仅是示例性的并且可以使用引入mRNA和/或重组蛋白的任何方式。

可以通过邻近于核酸内切酶编码序列引入线粒体靶向序列(MTS)来实施核酸内切酶对线粒体的特异性靶向，这将导致产生靶向线粒体的融合蛋白。已鉴别了强MTS并且当在它们的N-末端融合时，其显示能够将蛋白质靶向特异性区室，并且将其称为线粒体靶向序列。适合于本发明所述的方法的MTS对于本领域技术人员是熟知的(参见，例如，美国专利No.8,039,587B2，该专利以其全部内容作为参考并入本文)。例如，可以使用针对线粒体基质的MTS，如来自细胞色素c氧化酶亚基IV(COX 4)、亚基VIII(COX 8)或者亚基X(COX 10)的靶向肽的MTS。原则上，能够使融合蛋白成为线粒体运输的蛋白的来源于任何核编码的线粒体基质或内膜酶的任何靶标序列或者人工序列(疏水矩大于5.5，至少两个碱性残基，两亲性α-螺旋构象；参见，例如，Bedwell等人,Mol Cell Biol.9(3)(1989),1014-1025)对于本发明的目的是有用的。

在某些实施方式中，所述MTS是人MTS。在另一个实施方式中，所述MTS来自另一个物种。这些序列的非限制性实例是细胞色素c氧化酶亚基X(COX 10)MTS(MAASPHTLSSRLLTGCVGGSVWYLERRT，SEQ ID NO：36)和细胞色素c氧化酶亚基VIII(COX 8)MTS(MSVLTPLLLRSLTGSARRLMVPRA，SEQ ID NO：37)。MTS序列的其它非限制性实例是通过核DNA编码、在细胞质中翻译(产生)并转运到线粒体中的每个单个线粒体蛋白的天然MTS以及柠檬酸合酶(cs)、硫辛酰胺脱氢酶(LAD)和C6ORF66(ORF)。在它们当中，多种MTS对于每种线粒体酶可以是可交换的。因此，在一些实施方式中，MTS靶向线粒体基质蛋白。在具体的实施方式中，所述线粒体基质蛋白是人细胞色素C氧化酶的亚基VIII。每种可能性代表了用于本发明使用的融合蛋白的单独的实施方式。

一旦将受体细胞与减少内源mtDNA拷贝数的试剂或者降低内源线粒体功能的试剂接触，则将所述受体细胞与所述试剂培育足够的一段时间以分别部分减少所述受体细胞中的内源mtDNA拷贝数或者部分降低所述受体细胞中的内源线粒体功能。识别“足够的一段时间”以允许所述试剂部分减少内源mtDNA拷贝数或者部分降低内源线粒体功能在本领域技术人员的技术范围内。所述足够或适当的时间段将根据多种因素而改变，其包括(但不限于)特定类型的细胞、起始材料的量(例如，受体细胞数目和/或要减少的mtDNA的量)、试剂的量和类型、质粒启动子调节剂和/或培养条件。在多个实施方式中，允许受体细胞中内源mtDNA拷贝数部分减少的足够的一段时间为约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约1-2周、约2-3周或约3-4周。在优选的实施方式中，所述足够的一段时间将足够长，从而所产生的受体细胞具有大部分内源mtDNA拷贝数的减少或者大部分内源线粒体的功能的降低并且在将所述受体细胞与外源mtDNA和/或外源线粒体培育之前还基本不含减少内源mtDNA的试剂或者降低内源线粒体功能的试剂。

本发明的重要且新颖的方面在于以下发现：在内源线粒体完全消除的细胞(即(ρ)0细胞)中线粒体转移效率严重降低，但是当内源mtDNA拷贝数减少但未完全消除(即(ρ)^-细胞)时，可以得到极大改善。此外，本发明还证实简单的附加或离心规程是无效的，其不会部分减小内源mtDNA拷贝数。因此，在优选的实施方式中，所述受体细胞中内源mtDNA拷贝数的减小是小于内源mtDNA的100％消除。在一些实施方式中，所述受体细胞中的内源mtDNA拷贝数减少了约5％至约99％。在具体的实施方式中，所述减少内源mtDNA拷贝数的试剂将内源mtDNA拷贝数减少了约30％至约70％。在其它实施方式中，所述减少内源mtDNA拷贝数的试剂将所述内源mtDNA拷贝数减小了约50％或以上，约60％或以上，约70％或以上，约80％或以上，或者约90％或以上，或者约95％或以上。在其它实施方式中，减少内源mtDNA拷贝数的试剂将内源mtDNA拷贝数减少了约60％至约90％。还将理解在一些实施方式中，所述减少内源mtDNA拷贝数的试剂减少了线粒体物质。

在某些实施方式中，所述外源mtDNA包含在来自供体细胞的分离的外源线粒体中。可以通过任何一些熟知的技术来实现线粒体的分离，其包括(但不限于)本文所述的和所引用的参考文献中的那些。在某些实施方式中，使用商品化试剂盒，如(例如)Qproteum线粒体分离试剂盒(Qiagen,USA)、MITOISO2线粒体分离试剂盒(Sigma,USA)或者用于培养细胞的线粒体分离试剂盒(Thermo Scientific)分离用于在线粒体转移中使用的外源线粒体。在其它实施方式中，手动分离用于在线粒体转移中使用的外源线粒体。例如，线粒体的示例性手动分离包括通过使供体细胞成粒，清洗来源于在培养中生长的约10⁹个细胞的1-2mL的细胞颗粒，使细胞在低渗缓冲液中膨胀，使用紧密配合的研棒用Dounce或Potter-Elvehjem匀浆器使细胞破裂并通过差速离心分离线粒体，从供体细胞分离线粒体。手动分离也可以包括(例如)蔗糖密度梯度超速离心或自由流动电泳。不希望受任何具体方法的束缚，应理解本文所述的试剂盒和手动方法是示例性的并且可以使用任何线粒体分离方法，并且它将在本领域技术人员的技术范围内。

在一些实施方式中，分离的供体线粒体是基本不含其它细胞器的。在其它实施方式中，分离的线粒体可以含有杂质并且对于线粒体富集。例如，在一些实施方式中，分离的线粒体为约90％纯的，约80％纯的，约70％纯的，约60％纯的，约50％纯的或者它们之间的任何整数。通常，应理解一旦线粒体转移，则与分离的供体线粒体一起包含的任何杂质将不会影响受体细胞的存活力或功能。在具体的实施方式中，外源线粒体、外源mtDNA或它们的组合的转移不包括非线粒体细胞器的转移。

可以通过一些熟知的技术容易地确定分离的线粒体的数量和质量，所述技术包括(但不限于)本文所述的和所引用的参考文献中的那些。例如，在一些实施方式中，通过总蛋白含量的评价确定分离的线粒体的量。多种方法对于总蛋白含量的测量是可用的，如双缩脲和Lowry程序(参见，例如，Hartwig等人,Proteomics,2009Jun；9(11):3209-14)。在其它实施方式中，通过mtDNA拷贝数确定分离的线粒体的量。

在一些实施方式中，分离的线粒体是功能性线粒体。在其它实施方式中，分离的线粒体是功能障碍的线粒体。在一些实施方式中，可以在分离之前评价供体细胞中的线粒体功能。在其它实施方式中，可以从分离的线粒体测定线粒体功能。

线粒体膜完整性的维持是线粒体分离期间的另一重要因素。在一些实施方式中，在本文所提供的方法中使用的mtDNA来自完整的线粒体。在具体的实施方式中，约10％，约20％，约30％，约40％，约50％，约60％，约70％，约80％，约90％或大于90％的分离的线粒体是完整的。可以通过任何一些熟知的技术来实现线粒体膜的完整性，其包括(但不限于)本文所述的和所引用的参考文献中的那些。例如，TMRM、Rhod123、JC-1和DiOC6是用于测量线粒体膜电位的典型探针(参见，例如，Perry等人,Biotechniques,2011Feb；50(2):98-115)。JC-1是广泛使用的用于测量分离的线粒体的内膜电位的染料，并且其基于线粒体内膜的电化学质子梯度。

在本文所提供的方法的某些实施方式中，将具有内源mtDNA部分减小的受体与来自健康供体的外源线粒体共培育足够的一段时间以将外源线粒体无创转移至所述受体细胞，借此产生线粒体替换的细胞。在其它实施方式中，将具有内源mtDNA部分减小的受体与来自健康供体的外源mtDNA共培育足够的一段时间以将外源线粒体无创转移至所述受体细胞，借此产生线粒体替换的细胞。识别“足够的一段时间”以将外源线粒体和/或外源mtDNA无创转移至受体细胞在本领域技术人员的技术范围内。足够或适当的时间段将根据多种因素而改变，其包括(但不限于)特定类型的细胞、起始材料的量(例如，受体细胞数目和/或要替换的内源mtDNA的量)、供体材料的量(例如，外源mtDNA的数量、质量和/或纯度)和/或培养条件。在多个实施方式中，将外源线粒体和/或外源mtDNA无创转移至受体细胞的足够的一段时间为约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约1-2周、约2-3周或约3-4周。在某些实施方式中，在共培育期结束时，受体细胞将具有大部分外源mtDNA并且基本不含任何外源线粒体细胞器。

本发明的另一特征在于以下发现：相对于原始受体细胞，MirC中的总mtDNA拷贝数基本不升高。相反，已尝试了其它不太有效的方法来附加线粒体而无需在共培育步骤之前调节受体细胞，或者使用离心转移外源线粒体而无需在离心前调节受体细胞。因此，使用无效方法所得到的细胞群体往往具有总mtDNA拷贝数的大量升高。因此，在某些实施方式中，相对于与减少内源mtDNA拷贝数的试剂接触前的受体细胞的总mtDNA拷贝数，所述线粒体替换的细胞具有不大于约1.1倍，约1.2倍，约1.3倍，约1.4倍，约1.5倍或以上的总mtDNA拷贝数。

无创转移的使用是本发明的另一独特方面。上述方法使用创伤性仪器来注入外源线粒体，通过离心物理迫使线粒体进入细胞或者使用了对受体细胞有害的类似苛刻条件。在临床背景中，特别是当所述受体细胞数可能有限时，如使用造血干细胞或T细胞，苛刻的细胞操作是所不期望的。因此，无创转移的使用是本发明的有益特征，其有助于在临床背景中的使用。

如本文所提供的，外源线粒体、外源mtDNA或它们的组合可以对受体细胞是自体同源的或者同种异体的。在一些实施方式中，相对于受体细胞，外源mtDNA是同种异体的。例如，外源mtDNA可以得自与受体细胞相同的物种，并且具有不同于受体细胞的基因型。在其它实施方式中，外源线粒体、外源mtDNA或它们的组合是自体同源的。举例来说，示例性的自体同源的外源mtDNA可以包括来自健康供体细胞，例如，“年轻”供体细胞，如来自脐带血的“年轻”供体细胞的mtDNA，并且所述受体细胞可以来自相同对象并且可以是“老”受体细胞，其中术语“年轻”和“老”表示群体中细胞的总倍增次数或者细胞所来源的对象的年龄。另一种示例性自体同源的外源mtDNA可以包括(例如)分离自与受体细胞相同的对象的供体mtDNA并在用受体细胞替换它之前进行修饰。在某些实施方式中，仅mtDNA和/或线粒体是同种异体的并且受体细胞对需要外源mtDNA和/或外源线粒体的对象是自生的(autogenic)。

在某些实施方式中，可以通过mtDNA的高变区(HVR)DNA序列，例如，D-环的HV1和/或HV2的测序并将其与供体线粒体和受体细胞两者的序列相比较来评价受体细胞中mtDNA的替换。在具体的实施方式中，可以通过单核苷酸多态性测定识别受体细胞和供体线粒体之间的序列差异。例如，可以将来自受体细胞和供体线粒体的mtDNA的扩增序列克隆至质粒以用作定量标准。

在一些实施方式中，所述细胞(即供体细胞和受体细胞)是动物细胞或植物细胞。在具体的实施方式中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方式中，从哺乳动物对象分离细胞，所述哺乳动物对象选自：人、马、狗、猫、小鼠、大鼠、牛和绵羊。在一些实施方式中，所述细胞是人细胞。在一些实施方式中，所述细胞是培养中的细胞。所述细胞可以直接得自哺乳动物(优选地人)或者得自商品化来源，或者得自组织，或者处于(例如)培养细胞的形式，原地制备或购自商品化细胞来源等。在某些实施方式中，所述细胞是原代细胞(即直接得自活组织，例如，活组织检查材料的细胞)。所述细胞可以来自任何器官，其包括(但不限于)血液或淋巴系统，来自肌肉、任何器官、腺体、皮肤或脑。在某些实施方式中，所述细胞是体细胞。在一些实施方式中，所述细胞选自上皮细胞、神经细胞、表皮细胞、角化细胞、造血细胞(例如，骨髓细胞)、黑素细胞、软骨细胞、肝细胞、B细胞、T细胞、红细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞、肌细胞、血管平滑肌细胞、肝细胞、脾细胞和胰腺β细胞。

如本文所提供的，在具体的实施方式中，所述供体细胞是处于现代优良制造规范(cGMP)的可商购的细胞培养物。例如，所述供体细胞可以得自细胞库，如WaismanBiomanufacturing，或者类似的商品化资源，如产生符合cGMP的细胞的商品化来源。在一些实施方式中，所述供体细胞是cGMP生产的骨髓来源的间充质基质细胞(BM-MSC)。在其它实施方式中，所述细胞是cGMP级人肝细胞。照此，还将理解供体细胞可以是在分离线粒体之前融化的冷冻细胞。然而，在细胞冷冻之后不需要分离线粒体，并且线粒体可以分离自新鲜细胞并且立即使用，或者在某些实施方式中，可以分离线粒体，然后在转移至受体细胞之前冷冻。

在一些实施方式中，所述细胞是癌细胞。通常，癌细胞分离自癌症，其选自：乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、皮肤癌、胰腺癌、结肠癌、黑素瘤、恶性黑色素瘤、卵巢癌、脑癌、原发性脑癌、头颈癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、肝癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、头或颈癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、小细胞肺癌、韦尔姆斯氏瘤、宫颈癌、睾丸癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、泌尿生殖器癌、甲状腺癌、食道癌、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、肾上腺癌、肾细胞癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、恶性胰岛腺瘤、恶性类癌、绒毛膜癌、阿利贝尔氏病、恶性高钙血症、宫颈增生、白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性粒细胞白血病、急性粒细胞性白血病、急性髓性白血病、慢性粒性白血病、毛细胞白血病、成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、卡波济氏肉瘤、脾大性红细胞增多、原发性血小板增多症、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、柔组织肉瘤、骨原性肉瘤、原发性巨球蛋白血病和成视网膜细胞瘤。

在一些实施方式中，所述细胞是干细胞。如本文所使用的，术语“干细胞”是指可以诱导增殖的未分化细胞。干细胞能够自维持或自更新，这表示通过每次细胞分裂，一个子代细胞也将是干细胞。干细胞可以得自胚胎、产后、幼体或成年组织。干细胞可以是多潜能或多能的。如本文所使用的，术语“祖细胞”是指来源于干细胞的未分化细胞并且其本身不是干细胞。一些祖细胞可以产生能够分化成不止一种细胞类型的子代。干细胞包括多潜能干细胞，其可以形成任何身体组织系谱的细胞：中胚层、内胚层和外胚层。因此，例如，干细胞可以选自人胚胎干(ES)细胞；人内细胞团(ICM)/外胚层细胞；人原始外胚层细胞、人原始内胚层细胞；人原始中胚层细胞；和人原始胚(EG)细胞。干细胞还包括多能干细胞，其可以形成构成整个组织的多个细胞谱系，如(但不限于)造血干细胞或神经前体细胞。干细胞还包括全能性干细胞，其可以形成整个生物。在一些实施方式中，所述干细胞是间质干细胞。对于未终末分化的成年细胞，术语“间质干细胞”或“MSC”是可互换使用的，基于来自生物活性因子，如细胞因子的多种影响，其可以分裂以获得干细胞或者不可逆分化以产生间充质细胞系谱细胞，例如，脂肪、骨、软骨、弹性和纤维结缔组织、成肌细胞)以及除起源于胚胎中胚层的那些以外的组织(例如，神经细胞)。在一些实施方式中，所述干细胞是部分分化的或分化细胞。在一些实施方式中，所述干细胞是诱导的多潜能干细胞(iPSC)，其已重编程或去分化。在具体的实施方式中，所述受体细胞是iPSC。在其它实施方式中，所述受体细胞是造血干细胞(HSC)或MSC。干细胞可以得自胚胎、胎儿或成年组织。

在其它实施方式中，所述细胞是免疫细胞。在具体的实施方式中，所述受体细胞是免疫细胞。在一些实施方式中，所述免疫细胞选自T细胞、吞噬细胞、小胶质细胞和巨噬细胞。在具体的实施方式中，所述T细胞是CD4+T细胞。在其它实施方式中，所述T细胞是CD8+T细胞。在其它实施方式中，所述T细胞是嵌合抗原受体(CAR)T细胞。在具体的实施方式中，所述受体细胞是处于T细胞功能障碍状态或接近T细胞功能障碍状态的耗竭或近耗竭的T细胞。

5.3提高线粒体转移的方法

本文还提供了用于mtDNA和/或线粒体转移的方法，其包括第二活性剂结合5.2节中所述的任何方法的使用。已报道线粒体转移包括内吞途径，它是ATP-依赖性过程。例如，在某些细胞培养条件下，已观察到线粒体通过巨胞饮被吞没(参见，例如，Kitani等人,JCell Mol Med.,2014,18(8):1694-1703)。因此，本发明还涉及以下新的发现：在受体细胞与外源线粒体和/或外源mtDNA共培育之前，第二活性剂的使用可以促进外源线粒体和/或外源mtDNA的吸收。

多种类型的试剂可以用于促进外源线粒体和/或外源mtDNA的吸收。在一些实施方式中，所述第二活性剂选自大分子、小分子或细胞疗法，并且所述第二活性剂任选地选自雷帕霉素、NR(烟酰胺核糖)、苯扎贝特、艾地苯醌、重酒石酸巯基乙胺(RP103)、艾拉米肽(elamipretide)(MTP131)、奥玛韦隆(omaveloxolone)(RTA408)、KH176、凡替醌酮(Vatiquinone)(Epi743)、硫辛酸、A0001(α-生育醌)、线粒体CoQ10(MitoQ)、SkQ1(Visomitin)、白藜芦醇、姜黄素、生酮治疗、缺氧和内吞激活剂。在具体的实施方式中，所述内吞激活剂是细胞代谢的调节剂。可以使用本领域技术人员已知的多种方法调节细胞代谢。在某些实施方式中，细胞代谢的调节包括营养饥饿、化学抑制剂或小分子。

如上所述，已报道通过内吞途径发生完整线粒体的转移。例如，可以通过经由内吞途径的完整线粒体的吸收来转移所述外源线粒体和/或外源mtDNA。内吞途径可以再分成4类：1)内涵素-介导的内吞，2)细胞膜穴样内陷，3)巨胞饮和4)吞噬。通过小(直径约100nm)囊泡介导内涵素-介导的内吞，所述囊泡具有由主要与细胞溶质蛋白内涵素有关的蛋白复合物组成的形貌特征性外壳(morphologically characteristic coat)。因此，在某些实施方式中，用于线粒体转移的内吞途径是内涵素-依赖性内吞途径。在其它实施方式中，用于线粒体转移的内吞途径是不依赖于内涵素的途径。在具体的实施方式中，所述内吞途径是巨胞饮。

已表明巨胞饮是营养剥夺环境中的重要过程。因此，假设细胞营养物不足或者通过足够营养激活的途径或靶标分子(如mTOR)的抑制可以是提高完整线粒体向胞液的细胞吞没的策略。具体地，如本文所提供的，据发现mTOR的抑制可以提高外源线粒体的吸收。mTOR是氨基酸、能量、氧和生长因子的必要传感器，并且是参与胞外营养物吸收的蛋白、脂质和核苷酸合成的关键调节因子。因此，在一些实施方式中，本文所提供的方法还包括将受体细胞与可以提高巨胞饮的小化合物、肽或蛋白接触。在具体的实施方式中，本文所提供的方法还包括在外源线粒体和/或外源mtDNA转移之前，调节受体细胞的细胞代谢。在某些实施方式中，使用可以提高巨胞饮的相同小化合物、肽或蛋白进行细胞代谢的调节。

可以通过任何一些熟知的技术来实现细胞代谢的调节，其包括(但不限于)本文所述的和所引用的参考文献中的那些。例如，在一些实施方式中，通过营养饥饿或营养剥夺进行细胞代谢的调节。在其它实施方式中，通过化学抑制剂或小分子进行细胞代谢的调节。在具体的实施方式中，所述化学抑制剂或所述小分子是mTOR抑制剂。

已知多种化合物抑制mTOR，包括雷帕霉素，也称为西罗莫司(CAS号53123-88-9；C₅₁H₇₉NO₁₃)和雷帕霉素衍生物(例如，雷帕霉素类似物，也称为“rapalogs”)。雷帕霉素衍生物包括(例如)替西罗莫司(CAS号162635-04-3；C₅₆H₈₇NO₁₆)、依维莫司(CAS号159351-69-6；C₅₃H₈₃NO₁₄)和地磷莫司(CAS号572924-54-0；C₅₃H₈₄NO₁₄P)。因此，在一些实施方式中，本文所提供的用于线粒体转移的方法还包括在外源线粒体和/或外源mtDNA转移之前，使用雷帕霉素或其衍生物调节受体细胞的细胞代谢。应理解如上所述用于调节细胞代谢的实施方式是非限制性的，并且调节细胞代谢不需要包括化合物或小分子。

因此，在一些实施方式中，可以作为单独的方法或者与本文所提供的任何方法(如包括受体细胞的内源线粒体的部分减小的方法)组合使用包括临床批准的药物的雷帕霉素或其衍生物以提高外源线粒体的转移效率。

本领域技术人员将理解其它递送方法也可以用于引入外源线粒体和/或外源mtDNA，并且巨胞饮是示例性途径。在一些实施方式中，可以通过内涵素-依赖性内吞或者不依赖于内涵素的内吞递送mtDNA。在具体的实施方式中，所述不依赖于内涵素的途径可以是(例如)CLIC/GEEC内吞途径、Arf6-依赖性内吞、脂阀结构蛋白-依赖性内吞、巨胞饮、环状膜皱褶(circular doral ruffles)、吞噬或者反式-内吞。还将理解可以通过使用刺激线粒体递送的任何化合物，如内吞激活剂来提高外源线粒体和/或外源mtDNA的递送。适合于激活胞吞的非限制性示例性化合物包括(例如)佛波醇-12-豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)(C₃₆H₅₆O₈)、12-O-十四酰佛波醇13-乙酸酯(TPA)(C₃₆H₅₆O₈)、丹参酮IIA磺酸钠(TSN-SS)(C₁₉H₁₇O₆S.Na)和佛波醇-12,13-二丁酸酯或其衍生物。此外，还将理解可以使用非内吞介导的mtDNA和/或线粒体转移，包括绕过内吞和/或细胞融合的方法。

5.4治疗方法

本文提供了用于治疗与突变mtDNA和/或功能障碍的线粒体有关的病况的多种方法，组合物用于治疗与突变mtDNA和/或功能障碍的线粒体有关的病况的使用和组合物在生产用于治疗与突变mtDNA和/或功能障碍的线粒体有关的病况的药剂中的使用。还提供了治疗方法，其包括使用外源线粒体和/或外源mtDNA来恢复或提高内源线粒体功能，使用组合物恢复或提高内源线粒体功能和组合物在生产用于治疗需要线粒体替换的对象的药剂中的使用。在某些实施方式中，所述治疗包括线粒体功能障碍的预防。

5.4.1治疗年龄相关疾病的方法

在某些实施方式中，本文提供了治疗患有或怀疑患有年龄相关疾病的对象的方法，其包括5.2节和/或5.3节中所述的任何方法。在一些实施方式中，本文提供了治疗患有或怀疑患有年龄相关疾病的对象的方法，其包括通过以下方法离体或体外产生线粒体替换的细胞：将受体细胞与减少内源mtDNA的试剂或降低内源线粒体功能的试剂接触，将所述受体细胞与所述试剂培育足够的一段时间以部分减少所述受体细胞中的mtDNA拷贝数或者部分降低所述内源线粒体功能，将(1)其中内源mtDNA或内源线粒体功能已部分降低的受体细胞和(2)来自健康供体的外源线粒体和/或外源mtDNA共培育足够的一段时间以将外源线粒体无创转移至所述受体细胞，借此产生线粒体替换的细胞，然后向患有或怀疑患有年龄相关疾病的对象施用治疗有效量的线粒体替换的受体细胞。

在某些实施方式中，所述年龄相关疾病包括自体免疫疾病、代谢疾病、遗传疾病、癌症、神经退行性疾病和免疫衰老。所述代谢疾病可以包括糖尿病。可以通过本文所提供的方法治疗的神经退行性疾病的非限制性实例包括阿尔茨海默氏病或帕金森氏病。另外，能够治疗的遗传疾病包括早年衰老综合症、沃纳综合征和亨廷顿病。还考虑了涉及功能障碍的线粒体的其它年龄相关疾病。

在某些实施方式中，治疗患有或怀疑患有年龄相关疾病的对象的方法包括产生MirC，其中用于产生MirC的受体细胞是T细胞或造血干细胞(HSC)。例如，可以替换衰老T细胞或造血干细胞(HSC)中的内源mtDNA、内源线粒体或它们的组合以用于复壮。体外或离体线粒体替换可以是使用人T细胞和/或造血干细胞治疗患病患者的可行选择。因此，在一些实施方式中，本文所提供的方法可以通过以下方法用于在细胞中延缓衰老和/或延长寿命：将来自健康、非衰老细胞的分离的外源线粒体无创转移至衰老或近衰老细胞中以使受体细胞复壮，并且然后可以将所产生的复壮MirC施用于患有或怀疑患有年龄相关疾病的患者。

如本文所证实的，衰老T细胞的复壮是一种可能的实施方式，通过该实施方式本发明可以用于治疗患有年龄相关疾病，如癌症的对象。举例来说，可以通过使用本文所提供的方法使显示出衰老相关分泌表型(SASP)，包括炎性细胞因子、生长因子和蛋白酶、细胞群体倍增速率降低和/或减缓、端粒缩短、DNA损伤应答(DDR)提高或它们的组合的老T细胞复壮，从而无创转移(例如)来自与患有年龄相关疾病，如癌症的对象自体同源的年轻、健康的T细胞的分离的线粒体。然后，可以向所述对象施用具有年轻、非衰老细胞的特征的T细胞-来源的MirC以用于治疗年龄相关疾病。

因此，在具体的实施方式中，治疗患有或怀疑患有年龄相关疾病的对象的方法包括MirC的产生，其中所述受体细胞是T细胞。通过代谢途径调控T细胞命运，其中糖酵解或氧化磷酸化(OXPHOS)负责向T细胞提供大部分能量。选择糖酵解占优势的T细胞来分化成效应因子T细胞，而将OXPHOS占优势的T细胞用于记忆T细胞。因此，外源线粒体和/或mtDNA可以用于调节T细胞命运。例如，就过敏症而言，外源线粒体和/或mtDNA可以用于使超激活T细胞平静。在其它情况下，如在癌症免疫疗法中，外源线粒体和/或mtDNA可以为抗-肿瘤T细胞赋能(empower)以使T细胞持续更长时间或者有利于T细胞溶胞能力和/或降低肿瘤负荷。此外，使用嵌合抗原受体T细胞(CAR T)的新兴治疗使用了自体同源的T细胞。那些CAR T细胞可能由于衰老或营养不良，如在癌症严重病理期中常见的恶病质而处于疲劳。线粒体替换技术可以为CAR T提供能量并使其复壮以提供更多的ATP，从而导致更好的结果。

因此，在某些实施方式中，治疗对象的方法包括作为T细胞的受体细胞。所述T细胞可以是CD4+T细胞，CD8+T细胞或者CAR T细胞。在具体的实施方式中，受体T细胞中的线粒体替换导致产生了具有延长寿命的T细胞。例如，寿命可以提高约1.5倍，约2倍，约3倍，约4倍，约5倍或者大于5倍。在具体的实施方式中，与无线粒体替换的T细胞相比，受体T细胞中的线粒体替换抑制或延缓受体T细胞衰老。如5.2节中所述，可以使用来自比受体细胞年轻的供体细胞的外源线粒体和/或外源mtDNA来实施mtDNA替换，从而延长寿命。在某些实施方式中，供体和受体细胞的PDL差异为约1.5倍，约2倍，约2.5倍，约3倍，约4倍，约5倍或者大于5倍。在其它实施方式中，所述供体和受体细胞来自年龄相差约5年，约10年，约15年，约20年或大于20年的对象。在其它具体的实施方式中，相对于不具有线粒体替换的T细胞，受体T细胞中的线粒体替换导致产生了具有提高的溶胞能力的T细胞。在其它实施方式中，T细胞中的线粒体替换导致肿瘤负荷降低。

尽管在某些实施方式中，质粒-基基因转染可以用于产生具有外源线粒体和/或外源mtDNA的T细胞，但是在其它实施方式中，可以使用mRNA转染。mRNA转染的使用可以降低整合到宿主基因组中的RNA序列的概率，并且还可以具有将引起内源mtDNA减小的最小长期基因表达。

在某些实施方式中，MaxCyte电转化仪可以用于mRNA转染，特别是在临床环境中，其已通过了优良制造规范和优良临床规范的标准。可以根据生产商的规程，使用MaxCyte电转化仪进行转染。

治疗患有或怀疑患有年龄相关疾病的对象的方法还可以包括使用本文所提供的方法的MirC的产生，其中所述受体细胞是造血干细胞(HSC)。造血干细胞(HSC)不仅提供血细胞，而且还提供(例如)通过转分化将受损的固有细胞固定在远端器官的内皮。此外，已报道HSC的机能紊乱参与全身衰老。因此，已考虑HSC-来源的MirC可以在任何年龄相关疾病中用作治疗方法。

另外，同种异体的HSC移植可以导致移植物排斥或甚至移植物抗宿主病。自体同源的HSC移植通常是更安全且更实用的疾病干预措施。例如，自体同源的HSC移植通常不需要通过免疫抑制剂预处理，如辐射和化学试剂。因此，设想了使用本文所提供的方法，在自体同源的HSC中使用来自健康年轻线粒体的外源mtDNA体外或离体产生MirC，然后使其返回患者身体。

在某些实施方式中，HSC对需要线粒体和/或mtDNA替换的对象是自体同源的，并且所述外源mtDNA是同种异体的。如本文所提供的，HSC中的mtDNA替换可以导致产生具有功能性线粒体的分化细胞和/或具有改善的功能的分化细胞。因此，可以在HSC移植的背景中使用本文所提供的方法。

衰老改变生物过程，并且导致发生退行性病症，如阿尔茨海默氏病、动脉粥样硬化、骨质疏松症、2型糖尿病以及造成慢性肾病和慢性阻塞性肺病的组织纤维化。线粒体可以通过由线粒体产生的活性氧在衰老中起作用，其可以影响衰老过程。衰老中的线粒体功能障碍处于与营养感应失调有关的恶性循环，其中由烟酰胺磷酸核糖基转移酶(NAMPT)的下调和聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP1)的超激活所引起的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)不足导致了NAD⁺-依赖性脱乙酰基酶sirtuin 1(SIRT1)的抑制。然后，其转向PGC1α的乙酰化-依赖性失活，因此导致了NAD⁺可用性放大的线粒体生物发生的降低。PGC1α的低活性不仅导致了核中编码的线粒体蛋白表达的下调，而且还导致与线粒体DNA相邻的线粒体转录因子TFAM的表达下调。

除包括p53和p16/Rb的双核心衰老-调控途径之外，其中释放一系列炎性细胞因子、趋化因子和蛋白酶，如IL-1、IL-6/VEGF、IL-8和CXCL9/MMP的衰老-相关分泌表型(SASP)是衰老中最具特征性的现象之一。通过正常条件下的选择性自噬，通过与自噬接头p62的结合使转录因子GATA4降解，然而DNA损伤应答(DDR)激酶ATM(共济失调毛细血管扩张突变的)和ATR(共济失调毛细血管扩张和Rad3-相关的)接收衰老信号以有利于GATA4和p62之间的解离和稳定GATA4，其反过来通过TRAF3IP2(肿瘤坏死因子受体-相关因子相互作用蛋白2)和IL1A激活NF-kB并支持SASP。在rho0细胞中SASP完全受阻(通过受迫的线粒体自噬建立的mtDNA游离细胞)。在实验性IVF中，来源于老对象的卵母细胞的线粒体替换确保促进了接合子形成、胚胎发育和着床以及怀孕的成功率。

蛋白质稳态(蛋白内稳态)受损是衰老的另一种特征。通过翻译调控、蛋白折叠陪护、泛素-蛋白酶体系统(UPS)和自噬-溶酶体系统严格维持蛋白质稳态的完整性。由于侣伴蛋白基于ATP，因此随衰老而降低的生物能损害了修正蛋白折叠的功能。UPS和自噬-溶酶体系统两者，包括线粒体自噬随时间衰退。这3种系统的交替产生了不在胞液中再循环的聚集体，从而导致了退行性病症。在线粒体基质中，异常蛋白的积累不仅会启动所述系统以使其降解，而且还将为恢复线粒体的核通讯功能(称为线粒体未折叠蛋白反应(UPR^mt))提供机会。所有上述途径包括线粒体。体细胞中的线粒体替换可以破坏衰老的有害恶化循环，减缓衰老过程并且甚至使细胞复壮。

因此，本文所提供的方法通过用突变mtDNA，用可以具有自体同源或同种异体来源的年轻和/或健康线粒体替换内源功能障碍的线粒体，如内源线粒体为治疗异质性和/或治疗多种疾病，如与衰老有关的疾病提供了临床可行的方法。

在一些实施方式中，本文所提供的用于线粒体替换的方法可以用于治疗线粒体疾病或病症以及衰老、癌症和免疫系统缺陷症。

5.4.2治疗线粒体疾病或病症的方法

根据5.2节和/或5.3节中所述的任何方法，本文还提供了治疗患有或怀疑患有线粒体疾病或病症的对象的方法。在一些实施方式中，治疗患有或怀疑患有线粒体疾病或病症的对象的方法包括根据5.2节和/或5.3节中所述的任何方法产生MirC，然后向患有或怀疑患有线粒体疾病或病症的对象施用治疗有效量的线粒体替换的受体细胞。

多种线粒体疾病或病症是已知的并且全部能够使用本文所提供的方法治疗。例如，能够使用本文所提供的方法治疗的线粒体疾病或病症可以是复合物I缺乏症(OMIM:252010)。复合物I缺乏症是由其任何亚基中的突变所造成的。在另一个实施方式中，复合物I缺乏症是由选自下列的基因中的突变引起的：NDUFV1(OMIM:161015)、NDUFV2(OMIM:600532)、NDUFS1(OMIM:157655)、NDUFS2(OMIM:602985)、NDUFS3(OMIM:603846)、NDUFS4(OMIM:602694)、NDUFS6(OMIM:603848)、NDUFS7(OMIM:601825)、NDUFS8(OMIM:602141)和NDUFA2(OMIM:602137)。

另外，能够使用本文所提供的方法治疗的线粒体疾病或病症可以是复合物IV缺乏症(细胞色素c氧化酶；OMIM:220110)。复合物IV缺乏症是由其任何亚基中的突变所造成的。在某些情况下，复合物IV缺乏症是由选自下列的基因中的突变引起的：MTCO1(OMIM:516030)、MTCO2(OMIM:516040)、MTCO3(OMIM:516050)、COX10(OMIM:602125)、COX6B1(OMIM:124089)、SCO1(OMIM:603644)、FASTKD2(OMIM:612322)和SCO2(OMIM:604272)。

可以通过突变引起线粒体疾病或病症或者它与突变有关。所述突变可以是点突变、错义突变、缺失和插入。应理解mtDNA或nDNA中的突变的鉴别在本领域技术人员的技术范围内并且本文提供了示例性方法，如(例如)单核苷酸多态性(SNP)测定或者微滴式数字PCR。

能够使用本文所提供的方法治疗的线粒体疾病或病症的具体类型的非限制性实例包括鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症(高氨血)(OTCD)、肉毒碱O-棕榈酰基转移酶II缺乏症(CPT2)、延胡索酸酶缺乏症、与Leigh综合征有关的细胞色素c氧化酶缺乏症、槭糖尿病(MSUD)、中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(MCAD)、极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(LCAD)、三功能蛋白缺乏症、进行性眼外肌麻痹伴线粒体DNA缺失(POLG)、DGUOK、TK2、丙酮酸脱羧酶缺乏症和Leigh综合征(LS)。在另一个实施方式中，线粒体疾病或病症选自阿尔珀斯病；巴斯综合症；β-氧化缺陷；肉碱-酰基-肉碱缺乏症；肉碱缺乏症；辅酶Q10缺乏；复合物II缺乏症(OMIM:252011)、复合物III缺乏症(OMIM:124000)、复合物V缺乏症(OMIM:604273)、LHON-Leber遗传性视神经病变；MM-线粒体肌病；LIMM-致死性婴儿线粒体肌病；MMC-母系肌病和心肌病；NARP-神经源性肌无力、共济失调和视网膜色素变性；Leigh病；FICP-致死性婴儿心肌病加、MELAS-相关心肌病；MELAS-线粒体脑肌病伴乳酸性酸中毒和卒中样发作；LDYT-Leber遗传性视神经病变和张力障碍；MERRF-肌阵挛性癫痫伴碎红肌纤维；MHCM-母系遗传的肥厚型心肌病；CPEO-慢性进行性眼外肌麻痹；KSS-Kearns Sayre综合征；DM-糖尿病；DMDF糖尿病+耳聋；CIPO-慢性小肠假性梗阻伴骨骼肌变性和眼肌麻痹；DEAF-母系遗传的DEAFness；PEM-进行性脑病；SNHL-感觉神经性失聪；脑肌病；线粒体细胞病；DEMCHO-痴呆病和舞蹈病；AMDF-共济失调、肌阵挛；ESOC癫痫症；视神经萎缩；FBSN家族性双侧纹状体坏死；FSGS局灶性节段性肾小球硬化症；LIMM致死性婴儿线粒体肌病；MDM骨骼肌变性和糖尿病；MEPR肌肉阵挛性癫痫和精神运动性退缩；MERME MERRF/MELAS重叠病；MHCM母系遗传的肥厚型心肌病；MICM母系遗传的心肌病；MILS母系遗传的Leigh综合征；线粒体脑心肌病；多系统线粒体病症(骨骼肌变性、脑病、失明、听力丧失、周围神经病)；NAION非动脉炎性前部缺血性视神经病变；PEM进行性脑病；PME进行性肌阵挛性癫痫；RTT Rett综合征；婴儿猝亡综合征；和MIDD母系遗传性糖尿病与耳聋。

在具体的实施方式中，本文所提供的用于治疗线粒体疾病或病症的方法还可以包括由线粒体DNA异常所引起的线粒体疾病或病症，其中所述线粒体DNA异常选自慢性进行性眼外肌麻痹(CPEO)、皮尔逊综合症、科恩-塞亚综合征(Kearns-Sayre Syndrome)(KSS)、糖尿病伴耳聋(DAD)、Leber遗传性视神经病变(LHON)、LHON-加(LHON-plus)、神经病、共济失调和视网膜色素变性综合征(NARP)、母系遗传的Leigh综合征(MILS)、线粒体脑肌病、乳酸性酸中毒和中风样发作(MELAS)、肌阵挛性癫痫伴碎红纤维病(MERRF)、家族性双侧纹状体坏死/纹状体黑质变性(FBSN)、Luft病、氨基糖苷引起的耳聋(AID)和线粒体DNA综合征的多种缺失。

据认为mtDNA中的突变与多种临床病症有关。在成年人中，这些包括神经学疾病(例如，偏头痛、中风、癫痫症、痴呆病、骨骼肌变性、周围神经病、复视、共济失调、言语障碍和感觉神经性耳聋)、胃肠疾病(例如，便秘、肠易激和吞咽困难)、心脏疾病(例如，心力衰竭、心传导阻滞和心肌病)、呼吸疾病(例如，呼吸衰竭、夜间换气不足、复发吸气和肺炎)、内分泌疾病(例如，糖尿病、甲状腺疾病、甲状旁腺疾病和卵巢衰竭)、眼科疾病(例如，视神经萎缩、白内障、眼肌麻痹和上睑下垂)。在儿童中，认为与mtDNA突变有关的病症包括神经学疾病(例如，癫痫症、骨骼肌变性、精神运动性阻滞、共济失调、强直、张力障碍和感觉神经性耳聋)、胃肠疾病(例如，呕吐、发育停滞和吞咽困难)、心脏疾病(例如，双室肥厚型心肌病和节律异常)，呼吸疾病(例如，中枢性通气不足和呼吸暂停)、血液学疾病(例如，贫血症和全血细胞减少症)、肾病(例如，肾小管缺陷)、肝病(例如，肝功能衰竭)、内分泌疾病(例如，糖尿病和肾上腺衰竭)和眼科疾病(例如，视神经萎缩)。因此，本文所提供的方法和组合物计划用于治疗或预防与mtDNA中的突变有关的疾病和病症。

在其它具体的实施方式中，本文所提供的方法使得能够治疗线粒体疾病或病症，其中所述线粒体疾病或病症是由核DNA异常所造成的，并且所述核DNA异常选自线粒体DNA缺失综合征-4A、线粒体隐性共济失调综合征(MIRAS)、线粒体神经胃肠道脑肌病(MNGIE)、线粒体DNA缺失综合征(MTDPS)、DNA聚合酶γ(POLG)-相关病症、感觉性共济失调性神经病伴构音障碍及眼肌麻痹(SANDO)、伴脑干与脊髓受累以及乳酸升高的脑白质病(LBSL)、辅酶Q10缺乏症、Leigh综合征、线粒体复合物异常、延胡索酸酶缺乏症、α-酮戊二醛脱氢酶复合物(KGDHC)缺乏症、琥珀酰辅酶A连接酶缺乏症、丙酮酸脱氢酶复合物缺乏症(PDHC)、丙酮酸羧化酶缺乏症(PCD)、肉毒碱棕榈酰转移酶I(CPT I)缺乏症、肉毒碱棕榈酰转移酶II(CPTII)缺乏症、肉碱-酰基-肉碱(CACT)缺乏症、常染色体显性-/常染色体隐性-进行性眼外肌麻痹(ad-/ar-PEO)、婴儿型脊髓小脑萎缩(IOSCA)、线粒体肌病(MM)、脊髓性肌萎缩(SMA)、生长停滞、氨基酸尿、胆汁郁积、铁过载、早期死亡(GRACILE)和2A型Charcot-Marei-Tooth病(CMT2A)。

具有mtDNA突变的多位个体显示出属于个别临床综合征的一组临床特征，如科恩-塞亚综合征(Kearns-Sayre Syndrome)(KSS)、慢性进行性眼外肌麻痹(CPEO)、线粒体脑肌病伴乳酸性酸中毒和卒中样发作(MELAS)、肌阵挛癫痫伴破碎样红纤维(MERRF)、神经原性无力伴共济失调和视网膜色素变性(NARP)或者Leigh综合征(LS)。然而，存在大量临床差异并且多位个体不能完全匹配到一个具体种类中，这通过疾病表型的重叠谱得到很好的说明(包括由核基因POLG的突变所产生的线粒体隐性共济失调综合征(MIRAS)，其作为线粒体疾病或病症的主要原因出现)。

其中已知线粒体损伤起重要作用的示例性疾病包括(但不限于)多种神经退行性疾病的病理发生，包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏症、亨廷顿病和肌萎缩性侧索硬化。另外，根据症状，而不是突变类型，将线粒体疾病或病症再分到一些综合征中。例如，线粒体综合征包括线粒体肌病、脑肌病、乳酸性酸中毒、卒中-样症状(MELAS)、肌肉阵挛性癫痫伴破碎样红纤维(MERRF)和Leigh综合征。

5.4.3治疗需要线粒体替换的对象的方法

根据5.2节和/或5.3节中所述的任何方法，本文还提供了治疗需要线粒体替换的对象的方法。在一些实施方式中，治疗需要线粒体替换的对象的方法包括根据5.2节和/或5.3节中所述的任何方法产生MirC，然后向需要线粒体替换的对象施用治疗有效量的线粒体替换的受体细胞。

需要线粒体替换的对象包括具有功能障碍的线粒体的任何对象。在某些实施方式中，需要线粒体替换的对象患有年龄相关疾病、线粒体疾病或病症、神经退行性疾病、视网膜疾病、糖尿病、听觉障碍、遗传疾病或它们的组合。可以受益于线粒体替换的神经退行性疾病包括(但不限于)肌萎缩性侧索硬化(ALS)、亨廷顿病、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、弗里德希氏共济失调、腓骨肌萎缩症和脑白质病变。视网膜疾病可以是湿性或干性年龄相关性黄斑变性、黄斑水肿或青光眼。在5.4.1和5.4.2节中更详细地描述了其它示例性疾病，如年龄相关的疾病和/或线粒体疾病或病症。

需要线粒体替换的对象还可以包括易感染线粒体功能障碍且是无症状的对象。例如，所述对象可以具有突变mtDNA，但是无(例如)线粒体疾病的表现，因此所述疾病是成年人-发病的疾病。因此，本文所提供的方法还可以通过治疗需要线粒体替换的对象用于预防本文所述的任何疾病。

5.5产生iPSC的方法

如5.2节和5.3节所述，本发明还提供了用于从非多潜能细胞产生或者提高诱导的多潜能干细胞(iPSC)的产量的方法。已证明使用干性因子，如Oct3/4、Klf4、Sox2和c-Myc的外源表达将从非多潜能细胞产生iPSC。另外，已在未分化的ESC中检测到了少量线粒体DNA(mtDNA)拷贝，同时一旦分化，该数目与线粒体成熟水平一起提高(Facucho-Oliveira JM等人,J Cell Sci 2007；120(Pt 22):4025-4034)。因此，本发明还已鉴别本文所提供的方法可以通过降低非多潜能细胞中的内源mtDNA来用于提高iPSC的产生，所述非多潜能细胞中的内源mtDNA的降低是通过将受体非多潜能细胞与减少内源mtDNA的试剂接触，将所述受体非多潜能细胞与所述试剂培育足够的一段时间以部分降低所述非多潜能细胞中的内源mtDNA，然后引入一个或多个表达盒以用于表达Oct3/4、Klf4、Sox2和c-Myc。在某些实施方式中，将外源mtDNA和/或外源线粒体无创转移至受体细胞中。

应理解用于表达Oct3/4、Klf4、Sox2和c-Myc的一个或多个表达盒的引入可以发生在减少内源mtDNA的试剂引入之前、期间或之后。因此，在一些实施方式中，用于生产iPSC的方法包括引入用于表达Oct3/4、Klf4、Sox2和c-Myc的一个或多个表达盒，将受体非多潜能细胞与减少内源mtDNA的试剂接触并且将受体非多潜能细胞与所述试剂培育足够的一段时间以部分减少所述受体细胞中的内源mtDNA。

在某些实施方式中，所述方法还包括将受体细胞与外源线粒体和/或外源mtDNA培育足够的一段时间以将所述外源线粒体和/或外源mtDNA无创转移至受体细胞。在具体的实施方式中，所述方法还包括将受体细胞与外源线粒体和/或外源mtDNA培育足够的一段时间以替换大部分内源mtDNA。包括转移外源线粒体和/或外源mtDNA和/或外源线粒体的从非多潜能细胞生产iPSC的方法还可以包括5.3节中所述的任何实施方式。

因为已在未分化的胚胎干细胞(ESCs)中检测到了少量的线粒体DNA(mtDNA)拷贝，因此本文所提供的方法还可以用于促进非多潜能干细胞中的多潜能性和减少产生iPSC所需的外源基因数。例如，在一些实施方式中，本文所提供的方法可以通过减少非多潜能细胞中的内源mtDNA用于产生iPSC，所述内源mtDNA的减少是通过将受体非多潜能细胞与减少内源mtDNA的试剂接触，将受体非多潜能细胞与所述试剂培育足够的一段时间以部分减少所述非多潜能细胞中的内源mtDNA，然后将一种或多种Oct3/4、Klf4、Sox2和c-Myc引入非多潜能细胞，借此产生多潜能干细胞。在一些实施方式中，甚至可以仅使用小分子试剂且无外源因子来产生iPSC。

在某些实施方式中，所述iPSC含有突变mtDNA。例如，所述突变mtDNA可以含有点突变，如(例如)tRNA中的点突变(例如，MELAS)。突变mtDNA还可以包括具有mtDNA的长缺失的mtDNA。在其它实施方式中，用于在产生iPSC中使用的非多潜能细胞是异质的。突变mtDNA的掺入可以有利于(例如)疾病模型的产生。

在一些实施方式中，所述非多潜能受体细胞是体细胞。在具体的实施方式中，所述非多潜能细胞是成纤维细胞。

iPSC的培养条件、鉴定和建立在本领域技术人员的技术范围内。例如，方法包括美国专利No.8,058,065和8,278,104中所提供的那些，其以其全部内容作为参考并入本文。

5.6用于测量异质性的测定

如先前所公开的，突变mtDNA和/或异质性可以导致产生功能障碍的线粒体。因此，与本文所提供的用于mtDNA替换的方法结合，用于评价线粒体功能和/或mtDNA突变的测定包括可以用于确定或预测线粒体和/或mtDNA突变的功能性的本领域技术人员已知的任何测定。

举例来说，确定线粒体功能的测定包括(例如)以下中的任一种的测量：与衰老有关的分泌因子(例如，促炎细胞因子、蛋白酶以及生长和血管生成因子，如IL-1、IL-6/VEGF、IL-8和CXCL9/MMP)；通过使用Oroboros的线粒体功能；通过使用Keima-红的线粒体自噬；线粒体渗透性；线粒体膜电位；细胞色素c水平；活性氧；细胞呼吸；用于测量激活的先天免疫、超激活糖酵解的消除、ER应激的缓解、mTOR-S6途径的抑制和细胞周期激活的转录组和蛋白质组学；通过超精度显微镜所观察到和通过专门化软件定量的线粒体动态，如裂殖和融合；或者本领域中已知的测量线粒体功能的任何测定。

多种测序方法可以与本文所提供的任何方法组合使用以(1)检测突变mtDNA，(2)定量异质性，和/或(3)评价或确认外源线粒体和/或外源mtDNA的转移。大致1,100个核苷酸的段是无基因的，并且它被称为D-环、D环和控制区。D-环含有两个区，其中突变的积累比线粒体基因组中的任何其它地方更频繁。该区域分别被称为高变区HV1和HV2。因此，在一些实施方式中，可以通过mtDNA的D-环的高变区(HV)(即HV1和/或HV2)的测序，结合本文所提供的方法鉴别mtDNA突变。可以使用本领域中已知的任何测序方法进行mtDNA测序。在具体的实施方式中，所述测序方法包括单核苷酸多态性(SNP)测定。在其它实施方式中，所述测序方法包括数字PCR。在具体的实施方式中，所述数字PCR是微滴式数字PCR。

5.7组合物

本文还提供了通过5.2-5.5节中所述的任何方法获得的细胞组合物。在某些实施方式中，本文提供了组合物，其包含通过以下方法获得的一种或多种线粒体替换的细胞：(a)将受体细胞与减少内源mtDNA拷贝数的试剂接触；(b)将所述受体细胞与所述试剂培育足够的一段时间以部分减少所述受体细胞中的内源mtDNA拷贝数；和(c)将(1)其中内源mtDNA已部分减少的来自步骤(b)的受体细胞和(2)外源线粒体共培育足够的一段时间以将所述外源线粒体无创转移到所述受体细胞，借此产生线粒体替换的细胞，其中所述线粒体替换的细胞包含大于5％的外源mtDNA。在其它方面，本文提供了组合物，其包含通过以下方法获得的一种或多种线粒体替换的细胞：(a)将受体细胞与减少内源mtDNA拷贝数的试剂接触；(b)将所述受体细胞与所述试剂培育足够的一段时间以部分减少所述受体细胞中的内源mtDNA拷贝数；和(c)将(1)其中内源mtDNA已部分减少的来自步骤(b)的受体细胞和(2)来自健康供体的外源mtDNA共培育足够的一段时间以将外源mtDNA无创转移至所述受体细胞，借此产生线粒体替换的细胞，借此产生线粒体替换的细胞，其中所述线粒体替换的细胞包含大于5％的外源mtDNA。

还可以通过以下方法获得所述组合物，其包括将细胞与降低线粒体功能的试剂接触，然后将所述受体细胞与所述试剂培育足够的一段时间以部分降低所述受体细胞中的内源线粒体功能。在一些实施方式中，具有部分降低的内源线粒体功能的受体细胞然后可以与来自健康供体的外源线粒体共培育足够的一段时间以将外源线粒体无创转移至所述受体细胞，借此产生线粒体替换的细胞。在其它实施方式中，具有部分降低的内源线粒体功能的受体细胞然后可以与来自健康供体的外源mtDNA共培育足够的一段时间以将外源线粒体无创转移至所述受体细胞，借此产生线粒体替换的细胞。在一些实施方式中，通过如上所述的方法产生的线粒体替换的细胞包含大于5％的外源mtDNA。

如上所述，所述外源线粒体可以由外源mtDNA组成。因此，在一些实施方式中，将外源线粒体和外源mtDNA两者转移至所述受体细胞并且MirC具有外源线粒体和外源mtDNA两者。在其它实施方式中，通过外源线粒体将所述外源mtDNA转移至所述受体细胞，并且然后将所述外源mtDNA递送至所述内源线粒体。在特定情况下，在将外源mtDNA递送至内源线粒体之后，从细胞除去外源线粒体。因此，在一些实施方式中，MirC具有外源mtDNA，但不具有外源线粒体。

由于受体细胞的内源mtDNA部分降解，因此包含外源线粒体、外源mtDNA或它们的组合的MirC可以含有外源mtDNA和内源mtDNA两者。类似地，在其中将外源线粒体转移至受体细胞的情况下，MirC可以含有外源线粒体和内源线粒体两者。因此，在具体的实施方式中，通过本文所提供的方法获得的一种或多种线粒体替换的细胞的组合物具有内源和外源线粒体的混合物。在其它实施方式中，通过本文所提供的方法获得的一种或多种线粒体替换的细胞的组合物具有内源mtDNA和外源mtDNA的混合物(即异质mtDNA)。在其它实施方式中，相对于与减少内源mtDNA拷贝数的试剂接触前的受体细胞的总mtDNA拷贝数，所述一种或多种线粒体替换的细胞具有不大于约1.1倍，约1.2倍，约1.3倍，约1.4倍，约1.5倍或以上的总mtDNA拷贝数。

本发明还包括用于在产生线粒体替换的细胞的方法中使用的组合物，所述组合物包含减少内源mtDNA的试剂或降低线粒体功能的试剂和第二活性剂。在某些实施方式中，所述组合物还可以包括外源线粒体、一种或多种受体细胞或它们的组合。在其它实施方式中，所述组合物还可以包括外源mtDNA。

如5.3节所述，多种第二活性剂可以在用于产生一种或多种线粒体替换的细胞的方法中使用。例如，在一些实施方式中，所述第二活性剂包括大分子、小分子或细胞疗法，并且所述第二活性剂任选地选自雷帕霉素、NR(烟酰胺核糖)、苯扎贝特、艾地苯醌、重酒石酸巯基乙胺(RP103)、艾拉米肽(elamipretide)(MTP131)、奥玛韦隆(omaveloxolone)(RTA408)、KH176、凡替醌酮(Vatiquinone)(Epi743)、硫辛酸、A0001(α-生育醌)、线粒体CoQ10(MitoQ)、SkQ1(Visomitin)、白藜芦醇、姜黄素、生酮治疗、缺氧和内吞激活剂。

据发现内吞激活剂的使用提高了MTS-XbaIR质粒处理的细胞中的外源线粒体的吸收，但是对促进使用“附加(add on)”或空转染细胞的吸收无影响，这表明外源线粒体转移的这种机制对于本文所提供的发明是独特的。适合于激活胞吞的非限制性示例性化合物包括(例如)佛波醇-12-豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)(C₃₆H₅₆O₈)、12-O-十四酰佛波醇13-乙酸酯(TPA)(C₃₆H₅₆O₈)、丹参酮IIA磺酸钠(TSN-SS)(C₁₉H₁₇O₆S.Na)和佛波醇-12,13-二丁酸酯或其衍生物。在一些实施方式中，所述内吞激活剂包含细胞代谢的调节剂。

可以通过任何一些熟知的技术来实现细胞代谢的调节，其包括(但不限于)本文所述的和所引用的参考文献中的那些。例如，在一些实施方式中，通过营养饥饿或营养剥夺进行细胞代谢的调节。在其它实施方式中，通过化学抑制剂或小分子进行细胞代谢的调节。在具体的实施方式中，所述化学抑制剂或所述小分子是mTOR抑制剂。

已知多种化合物抑制mTOR，包括雷帕霉素，也称为西罗莫司(CAS号53123-88-9；C₅₁H₇₉NO₁₃)和雷帕霉素衍生物(例如，雷帕霉素类似物，也称为“rapalogs”)。雷帕霉素衍生物包括(例如)替西罗莫司(CAS号162635-04-3；C₅₆H₈₇NO₁₆)、依维莫司(CAS号159351-69-6；C₅₃H₈₃NO₁₄)和地磷莫司(CAS号572924-54-0；C₅₃H₈₄NO₁₄P)。因此，在一些实施方式中，本文提供的组合物包括雷帕霉素或其衍生物。应理解如上所述用于调节细胞代谢的实施方式是非限制性的，并且调节细胞代谢不需要包括化合物或小分子并且可以包括除mTOR以外的其它途径的调节。还将理解所述组合物可以任选地包含内吞激活剂并且它不是必需组分。另外，在一些实施方式中，本文所提供的本发明可以包括非胞吞介导的mtDNA和/或线粒体转移，如在非临床背景中。

如5.5节所述，在某些实施方式中，本发明还提供了用于在从非多潜能细胞产生诱导的多潜能干细胞(iPSC)的方法中使用的组合物，其包括减少内源mtDNA的试剂，用于表达Oct3/4、Klf4、Sox2和c-Myc的一种或多种表达盒和受体细胞，其中所述受体细胞是非多潜能细胞，其中所述减少内源mtDNA的试剂以与未用减少内源mtDNA的试剂处理的非多潜能细胞相比，对于提高从非多潜能细胞产生诱导的多潜能干细胞(iPSC)的效率有效的量存在。在一些实施方式中，所述减少内源mtDNA的试剂以与未用减少内源mtDNA的试剂处理的非多潜能细胞相比，对于提高从非多潜能细胞产生诱导的多潜能干细胞(iPSC)的效率有效的量存在。这部分基于以下观察：多潜能细胞的mtDNA拷贝数减少。在具体的实施方式中，用于在生产iPSC的方法中使用的组合物还包含外源线粒体和/或外源mtDNA。

本发明还包括用于治疗年龄相关疾病、线粒体疾病或病症、神经退行性疾病、糖尿病、遗传疾病或需要线粒体替换的任何对象的药物组合物，如5.4节所述。在某些实施方式中，本文提供了包括具有来自健康供体的外源线粒体的线粒体替换的细胞的分离群体和通过本文所述的方法获得的细胞的药物组合物，如5.2-5.3节中所述。在其它实施方式中，所述药物组合物包括具有来自健康供体的外源线粒体和/或外源mtDNA的线粒体替换的细胞的分离群体和通过本文所述的方法获得的细胞，如5.2-5.3节所述。例如，在一些实施方式中，具有外源mtDNA的线粒体替换的细胞可以任选地还包括外源线粒体。在其它实施方式中，通过外源线粒体将外源mtDNA转移至细胞，递送至内源线粒体，然后从所述受体细胞除去所述外源线粒体。

本发明公开还提供了包含具有来自健康供体的外源线粒体的线粒体替换的细胞的分离群体，其中通过本文所提供的用于获得线粒体替换的细胞的任何方法获得所述细胞。在另一个方面，本发明公开提供了包含具有来自健康供体的外源mtDNA的线粒体替换的细胞的分离群体，其中通过本文所提供的用于获得线粒体替换的细胞的任何方法获得所述细胞。在一些实施方式中，包含具有来自健康供体的外源mtDNA的线粒体替换的细胞的分离群体的药物组合物还包含外源线粒体。

例如，在一些实施方式中，包含来自健康供体的外源线粒体的药物组合物是通过以下方法获得的，其包括：将细胞与减少mtDNA拷贝数的试剂接触，然后将所述受体细胞与所述试剂培育足够的一段时间以部分减少所述受体细胞中的内源mtDNA拷贝数。在一些实施方式中，具有部分减少的内源mtDNA拷贝数的受体细胞然后可以与来自健康供体的外源线粒体共培育足够的一段时间以将外源线粒体无创转移至所述受体细胞，借此产生线粒体替换的细胞。在其它实施方式中，具有部分减少的内源mtDNA拷贝数的受体细胞然后可以与来自健康供体的外源mtDNA共培育足够的一段时间以将外源线粒体无创转移至所述受体细胞，借此产生线粒体替换的细胞。在一些实施方式中，通过如上所述的方法产生的线粒体替换的细胞包含大于5％的外源mtDNA。

在其它实施方式中，通过以下方法获得所述细胞，其包括将细胞与降低线粒体功能的试剂接触，然后将所述受体细胞与所述试剂培育足够的一段时间以部分降低所述受体细胞中的内源线粒体功能。在一些实施方式中，具有部分降低的内源线粒体功能的受体细胞然后可以与来自健康供体的外源线粒体共培育足够的一段时间以将外源线粒体无创转移至所述受体细胞，借此产生线粒体替换的细胞。在其它实施方式中，具有部分降低的内源线粒体功能的受体细胞然后可以与来自健康供体的外源mtDNA共培育足够的一段时间以将外源线粒体无创转移至所述受体细胞，借此产生线粒体替换的细胞。在一些实施方式中，通过如上所述的方法产生的线粒体替换的细胞包含大于5％的外源mtDNA。所述降低线粒体功能的试剂可以短暂或永久降低线粒体功能。确定所述试剂将短暂(例如，可逆抑制剂)或永久(例如，不可逆抑制剂)降低线粒体功能的能力在本领域技术人员的技术范围内。

在本文所提供的药物组合物的某些实施方式中，通过以下方法获得所述细胞，所述方法还包括在将所述受体细胞与外源线粒体和/或外源mtDNA共培育之前，将所述受体细胞与第二活性剂接触。在一些实施方式中，所述第二活性剂选自大分子、小分子或细胞疗法，并且所述第二活性剂任选地选自雷帕霉素、NR(烟酰胺核糖)、苯扎贝特、艾地苯醌、重酒石酸巯基乙胺(RP103)、艾拉米肽(elamipretide)(MTP131)、奥玛韦隆(omaveloxolone)(RTA408)、KH176、凡替醌酮(Vatiquinone)(Epi743)、硫辛酸、A0001(α-生育醌)、线粒体CoQ10(MitoQ)、SkQ1(Visomitin)、白藜芦醇、姜黄素、生酮治疗、缺氧和内吞激活剂。在具体的实施方式中，所述内吞激活剂是细胞代谢的调节剂。在其它实施方式中，细胞代谢的调节剂包括营养饥饿、化学抑制剂或小分子。在其它实施方式中，所述化学抑制剂或所述小分子是mTOR抑制剂。在其它实施方式中，所述mTOR抑制剂包含雷帕霉素或其衍生物。

如以上5.2节中所述，多种类型的细胞可以用作受体细胞和供体细胞。例如，本发明公开描述了其中所述受体细胞是哺乳动物细胞的多种实例。然而，还将理解具有线粒体的任何细胞可以是受体细胞。因此，所述受体细胞还可以是植物细胞。

在一些实施方式中，所述动物细胞是哺乳动物细胞。在具体的实施方式中，所述细胞是体细胞。在其它实施方式中，所述体细胞是上皮细胞。在其它实施方式，所述上皮细胞是胸腺上皮细胞(TECs)。

本发明公开还提供了其中所述体细胞是免疫细胞的组合物。例如，所述组合物可以包含免疫细胞，其中所述免疫细胞是T细胞，如耗竭性T细胞。在一些实施方式中，所述组合物包括含有外源线粒体和/或外源mtDNA的复壮T细胞。例如，衰老T细胞或近衰老T细胞(例如，免疫衰老)可以用作受体细胞并且可以使用本文所提供的方法产生T细胞-来源的MirC以产生具有健康外源线粒体和/或外源mtDNA的T细胞。在具体的实施方式中，所述T细胞是CD4+T细胞。在其它实施方式中，所述T细胞是CD8+T细胞。在一些实施方式中，所述T细胞是嵌合抗原受体(CAR)T细胞。例如，在一些实施方式中，本发明公开提供了作为CAR-T细胞的MirC，它对于杀死癌细胞是有效的。MirC来源的CART可以具有延长的存活以使得能够提高免疫监视和提高癌细胞杀死。在其它实施方式中，所述免疫细胞是吞噬细胞。

如上所述，本文提供的组合物还可以包括用于在细胞中延缓衰老和/或延长寿命的组合物。所述组合物可以包括具有内源线粒体的衰老或近衰老细胞、来自非衰老的细胞的分离的外源线粒体和减少内源mtDNA拷贝数的试剂。所述组合物还可以包括具有内源线粒体的衰老或近衰老细胞、来自非衰老的细胞的分离的外源线粒体和降低线粒体功能的试剂。

本文还提供了包括来源于作为骨髓细胞的受体细胞的一种或多种线粒体替换的细胞的组合物。在具体的实施方式中，所述骨髓细胞是造血干细胞(HSC)或者间质干细胞(MSC)。例如，HSC或MSC可以分离自患有或怀疑患有线粒体疾病、年龄相关疾病或另外需要线粒体替换的对象，并且具有用外源线粒体替换的内源线粒体。随后，HSC或MSC来源的MirC然后可以移植回到需要线粒体替换的对象。在其它实施方式中，所述受体细胞是iPS细胞。所述组合物可以在临床环境中使用，并且可以在治疗年龄相关疾病，治疗线粒体疾病或病症，治疗神经退行性疾病，治疗糖尿病或遗传疾病中是有效的。例如，在一些实施方式中，使用本领域中已知的方法，所述iPSC可以在施用回所述对象之前分化成特定细胞类型。

在其它实施方式中，本文提供了包括具有减少的内源mtDNA的量的多潜能细胞的分离群体的药物组合物，其中所述细胞是通过5.5节中所述的任何实施方式获得的。在具体的实施方式中，多潜能细胞的分离群体是iPS细胞。

本文所述的细胞或化合物的施用是通过通常用于引入药物的任何途径。本发明所述的药物组合物可以包含药物可用的载体。在具体的实施方式中，术语“药物可用的”表示联邦或州政府管理机构批准的或者美国药典或其它通常承认的外国药典中所列的在动物，并且更具体地在人中使用的。术语“载体”是指治疗剂与之一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。部分通过正在施用的具体组合物以及通过用于施用所述组合物的具体方法来确定药物可用的载体。因此，存在本发明的药物组合物的多种适合的制剂(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences，第17版,1985)。

适合于施用的制剂包括水和非水溶液、等渗无菌溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使所述制剂等渗的溶质和可以包括助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水和非水无菌混悬液。在本发明的实践中，可以(例如)口服、鼻部、局部、静脉内、腹膜内、鞘内施用组合物或将组合物施用到眼中(例如，通过滴眼剂或注射剂)。化合物的制剂可以存在于单位剂量或多剂量密封容器，如安瓿瓶和小瓶中。可以从先前所述种类的无菌粉剂、颗粒剂和片剂制备溶液和混悬液。

在本发明的背景中，施用于患者的剂量应足以在所述对象中随时间引起有益反应，即防止、改善或改进对象的病况。任何患者的最优剂量水平将取决于多种因素，其包括所使用的具体的调节剂的效力、患者的年龄、体重、身体活动和膳食情况以及取决于与其它药物的可能组合。还将通过伴随特定化合物或载体在特定对象中的施用的任何不利副作用的存在、性质和程度确定剂量大小。可以通过单一或划分剂量完成施用。

本发明的范围不被本文所述的具体实施方式限制。的确，除了所述那些之外，根据上述描述和附图，本发明的多种改变将对于本领域技术人员来说是显而易见的。这些改变旨在处于所附权利要求的范围内。

本文引用的所有专利、专利申请、公开的专利申请和其它出版物以其全部内容作为参考并入本文。如果所述术语的任何描述与作为参考并入本文的任何文档冲突，则应以本文所述的术语描述为准。

在整个本发明申请中，已参考了多个出版物。在本发明申请中，这些出版物的公开内容以其全部内容作为参考并入本文以更全面地描述本发明所属领域的技术现状。尽管已参考以上提供的实例描述了本发明，但是应理解可以在不背离本发明的精神的情况下，做出多种改变。