阅读说明：本技术 一种基于乳糖通过氨基-环氧开环反应构建肝靶向阳离子基因载体及其制备方法 (Liver-targeted cationic gene vector constructed based on lactose through amino-epoxy ring-opening reaction and preparation method thereof ) 是由 徐福建 祁宇 俞丙然 于 2020-05-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于乳糖通过氨基-环氧开环反应构建肝靶向阳离子基因载体的制备方法,步骤为：1)将氨基化乳糖与异氰尿酸三缩水甘油酯在二甲基亚砜中,在惰性气体保护下进行反应,反应温度40～60℃,反应24～48小时；2)步骤1)反应结束后,加入乙二胺,升温至50～70℃,反应1～3小时,反应结束后透析,得到白色絮状聚合物。基于乳糖通过绿色且反应条件温和的氨基-环氧开环反应制备低毒高效并且具有肝脏靶向效果的阳离子基因载体,不但能够有效实现基因转染,而且可以实现核酸的靶向递,并且能够介导CRIPSR/Cas9基因编辑系统实现有效的基因编辑。(The invention discloses a preparation method for constructing a liver-targeted cationic gene vector based on lactose through amino-epoxy ring-opening reaction, which comprises the following steps: 1) reacting aminated lactose and triglycidyl isocyanurate in dimethyl sulfoxide under the protection of inert gas at the reaction temperature of 40-60 ℃ for 24-48 hours; 2) and (2) after the reaction in the step 1), adding ethylenediamine, heating to 50-70 ℃, reacting for 1-3 hours, and dialyzing after the reaction is finished to obtain a white flocculent polymer. The cationic gene vector with low toxicity, high efficiency and liver targeting effect is prepared by the green amino-epoxy ring-opening reaction with mild reaction conditions based on lactose, not only can effectively realize gene transfection, but also can realize targeted delivery of nucleic acid, and can mediate CRIPSR/Cas9 gene editing system to realize effective gene editing.)

一种基于乳糖通过氨基-环氧开环反应构建肝靶向阳离子基 因载体及其制备方法

技术领域

本发明属于非病毒基因载体领域，涉及一种基于乳糖通过氨基-环氧开环反应构建肝靶向阳离子基因载体及其制备方法。

背景技术

基因载体作为将外源基因导入到细胞的工具，其本身应该低毒性并且不会引起免疫反应；其次，其要能跟基因形成具有稳定结构的复合物，同时也不会导致基因结构的变化；最后，这种载体最好能够具有一定的靶向和降解作用，这样可以针对特定的细胞进行治疗并且可以降低其滞留导致的副作用。目前人们广泛使用的基因载体包括两类：病毒载体(viral vector)和非病毒载体(non-viral vector)。病毒载体主要包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒以及单纯疱疹病毒。这种病毒载体一般能够轻易的客服细胞屏障和免疫防御机制，从而其具有很高的转染效率。但是这种载体缺乏安全性，很容易导致致癌作用与自身免疫反应(unexpected immune response)和白细胞的病毒变化，严重时会造成器官衰竭从而导致死亡。同时病毒载体还会引起插入突变的现象，可能导致宿主细胞的恶性转化，而且病毒载体携带基因的能力有限，不利于大规模工业生产。针对以上病毒载体的缺点，人们将更多的目光投向了非病毒载体。其本身安全性能高，很多具有生物相容性或者具有生物可降解能力的基因载体都是低毒性的，而且具有很低的免疫毒性。相对于病毒载体而言，虽然这种非病毒性载体的转染效率并不是很高，有的时候很难克服细胞内外的各种屏障，但是其能够携带更多的基因，同时还能大规模工业化生产，具有很高的商业潜力。所以其发展潜力推动了非病毒载体的研究与开发。目前而言阳离子聚合物是人们使用频率最高的非病毒载体。这种阳离子非病毒性载体可以有效的通过电荷的相互作用络合上基因，从而形成带正电荷纳米级的复合体(complex)，从而能够保护基因穿过细胞膜以防止被核酸酶所降解，从而保证基因的顺利表达。

天然糖类化合物是自然界中一类广泛存在的天然产物，包括单糖，低聚糖以及多糖。天然糖类化合物由于其优秀的生物相容性，生物可降解性和独特的生物活性特性，已被作为优秀的基因载体材料被全世界范围内广泛研究。乳糖是一种二糖，乳糖分子由一分子葡萄糖和一分子半乳糖分子通过糖苷键相连，根据乳糖中葡萄糖单元的不同，又可以被分为α-乳糖和β-乳糖。根据研究发现，乳糖分子能够依靠分子中的半乳糖单元与去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)进行特异性识别，而ASGPR受体在肝实质细胞表面大量存在，因此乳糖是一种具有肝脏靶向性的天然糖类化合物。另外，在阳离子基因载体中引入二硫键基团，利用二硫键与生物体中的谷胱甘肽的还原响应来实现载体在生物体内的降解的报道已经屡见不鲜，这种方法不仅能够降低载体的毒性，而且有利于核酸释放。

氨基-环氧开环反应是一种新颖的逐步聚合方法。它主要依靠伯胺基团和环氧基团的化学反应。随着环氧环的打开将出现仲胺基和羟基。仲胺基可络合带负电荷的核酸，而羟基可提供亲水性。氨基-环氧开环反应不依赖苛刻的反应条件，反应过程温和绿色。

细胞靶向技术是细胞和分子水平上进行生物学行为研究的一项技术，是近年来发展最快的生命科学和药物学的研究方法。近几年来，随着分子生物学技术的提高，以及从细胞受体的分子水平对肿瘤发病机制的进一步认识，靶向性基因治疗取得了许多新的进展。所谓靶向性是指将目的基因的表达限制在特定的靶细胞、组织或器官内，不影响其他正常细胞、组织过器官的功能。而对于靶向性基因治疗，构建安全、高效以及具有靶向性的基因载体是其成功的关键。构建靶向性基因载体的传统方法是通过酯化、酰胺化等手段对已经构建的载体进行后修饰，修饰策略相对单一，制备过程相对复杂，而且表征难度较大。这些缺陷大大限制了靶向性核酸递送体系的发展。如何突破传统合成方式，建立简便可控，普适性广的制备方法成为了靶向性载体的研究重点。根据前期调研得知，肿瘤细胞会在细胞表面过表达一些能够与特定天然单糖或寡糖特异性识别、结合的受体。随着高分子科学的不断进步，如何将其与现代医学、生物学以及工程学等学科更好的相互交融与渗透成为人们现在重点解决的难题。而在基因治疗方面，高分子材料已经体现出了很高的利用价值。目前，文献报道过一系列的非病毒阳离子基因载体，包括聚-L-赖氨酸(Poly(L-Lysine)，PLL)、聚乙二胺树枝状聚合物(Poly(amid amine)，PAMAM)、聚甲基丙烯酸N,N-二甲氛基乙酯(Poly(2-dimethylaminoethyl methacrylate)，PDMAEMA)、聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)等。其中PEI是阳离子非病毒载体中公认的“金标”。但是PEI该类阳离子基因载体并不能将材料进入细胞的过程完整的展现出来，只能通过转染等表征手段间接展示。所以，将基因载体与细胞成像技术结合成为了现如今研究的热点。

近几年研究者致力于氨基-环氧开环理论和应用的研究工作，已经能够熟练的利用这种聚合手段得到一系列能够用于现代生物医学方面的聚合物材料，同时促进了该反应在医用生物高分子中的应用。乙二胺是一种在室温下无色液体，有胺味。被广泛用作化学试剂、农药、医药、溶剂、染料中间体、橡胶促进剂和表面活性剂等等。利用氨基-环氧开环反应得到阳离子基因载体在研究的过程中还存在很多的问题，例如：这种阳离子载体随着分子量的增大，相应的转染效率更高，但是毒性更大，如何在保证毒性适中的情况下尽量提高转染效率以及保证靶向效果成为人们关注的重点；不同的单体具有不同的特性，有些转染效率较高，有效毒性较小，如何筛选出高效高性能的单体也是人们需要考虑的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种基于乳糖通过氨基-环氧开环反应构建肝靶向阳离子基因载体及其制备方法。本发明具体提供了如下的技术方案：

1、一种基于乳糖通过氨基-环氧开环反应构建肝靶向阳离子基因载体的制备方法，步骤为：

1)将氨基化乳糖与异氰尿酸三缩水甘油酯在二甲基亚砜中，在惰性气体保护下进行反应，反应温度40～60℃，反应24～48小时；

2)步骤1)反应结束后，加入乙二胺，升温至50～70℃，反应1～3小时，反应结束后透析，得到白色絮状聚合物。

进一步，所述透析的截留数均分子量为1000～7500。

进一步，所述透析的截留数均分子量为3000-5000。

进一步，所述的白色絮状聚合物的分子量分布指数为1.8～2.0。

进一步，按质量分数计，所述的氨基化乳糖0.4～0.6份，异氰尿酸三缩水甘油酯0.1～0.4份，乙二胺0.1～0.3份。

进一步，按质量份数计，所述的氨基化乳糖0.5～0.6份，异氰尿酸三缩水甘油酯0.2～0.3

份，乙二胺0.2～0.3份。

进一步，按质量份数计，所述的氨基化乳糖0.57份，异氰尿酸三缩水甘油酯0.22份，乙二胺0.21份。

进一步，步骤1)所述的反应温度为50～55℃，反应时间为24～36小时。

进一步，步骤2)所述的反应温度为55～60℃，反应时间为1～2小时。

2、根据上述制备方法制备得到的一种基于乳糖通过氨基-环氧开环反应构建肝靶向阳离子基因载体。

本发明的有益效果在于：基于乳糖通过绿色且反应条件温和的氨基-环氧开环反应制备低毒高效并且具有肝脏靶向效果的阳离子基因载体，该载体不但能够有效实现基因转染，而且可以实现核酸的靶向递，并且能够介导CRIPSR/Cas9基因编辑系统实现有效的基因编辑。不仅具有研究意义，而且具备广阔的应用前景和潜在的商业价值。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为所制备阳离子载体在HEK293细胞中的转染效率图。

图2为所制备阳离子载体在HEK293细胞中的细胞内毒性图。

图3为所制备阳离子载体介导CRISPR/Cas9基因编辑系统所产生的基因编辑效果图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1

将513mgβ-乳糖放入50mL圆底烧瓶中，加入5mL无水二甲基亚砜将其完全溶解，并用氮气持续排气15min后封口备用。随后将500mg羰基二咪唑溶解在5mL无水二甲基亚砜中，用注射器吸取溶解后的液体，并将其缓慢注入先前已经准备好的β-乳糖溶液中，一边注入一边快速搅拌，待全部注射完后让混合溶液常温状态下反应24h。待反应24h后，将4g胱胺溶解在3mL无水二甲基亚砜中，并用注射器将其缓慢注入反应液中，常温反应24h。反应结束后，将反应液滴加在100-200mL丙酮中沉淀，经过反复洗涤离心，真空干燥后得到白色粉末状固体氨基化乳糖。

实施例2

将349mg氨基化乳糖与100mg异氰尿酸三缩水甘油酯装入50mL圆底烧瓶中，加入10mL二甲基亚砜充分溶解后用氮气排气15min，50℃反应24h。反应结束后再加入0.2mL乙二胺，升温至60℃反应2h。最后将反应液加入到50mL水中，然后用截留分子量为3500的透析袋透析24h，最后经过冷冻干燥后得到白色絮状聚合物，记作LBP²聚合物(LBP²)的数均分子量(M_n)为17500，分子量分布指数(M_w/M_n)为1.85。

实施例3

将438mg氨基化乳糖与150mg异氰尿酸三缩水甘油酯装入50mL圆底烧瓶中，加入10mL二甲基亚砜充分溶解后用氮气排气15min，50℃反应24h。反应结束后再加入0.2mL乙二胺，升温至60℃反应2h。最后将反应液加入到50mL水中，然后用截留分子量为3500的透析袋透析24h，最后经过冷冻干燥后得到白色絮状聚合物LBP³。聚合物(LBP³)的数均分子量(M_n)为19600，分子量分布指数(M_w/M_n)为1.91。

实施例4

将527mg氨基化乳糖与200mg异氰尿酸三缩水甘油酯装入50mL圆底烧瓶中，加入10mL二甲基亚砜充分溶解后用氮气排气15min，50℃反应24h。反应结束后再加入0.2mL乙二胺，升温至60℃反应2h。最后将反应液加入到50mL水中，然后用截留分子量为3500的透析袋透析24h，最后经过冷冻干燥后得到白色絮状聚合物LBP⁴。聚合物(LBP⁴)的数均分子量(M_n)为20000，分子量分布指数(M_w/M_n)为1.83。

实施例5

将HEK293细胞以6×10⁴个细胞每孔的密度种在24孔板中，培养24h。随后将20μLLBP/pDNA络合物按照质量比为10-60加入到每个孔中，每个孔中pDNA的质量为1.0μg。4h后弃去旧培养基，更换新培养基，每孔500μL。再过20h，将旧培养基弃去，每孔用500μL PBS洗一遍，然后加入70μL细胞裂解液，裂解2h后在显微镜下观察，观察不到明显的细胞形态后用细胞刮刀将每个孔中的细胞碎片刮下，然后取10μL加入到25μL底物中，用冷光仪检测化学发光强度。结果如图1所示。

从图1中可以看出，三种LBP阳离子聚合物的转染效率随着质量比的增加而呈上升趋势，而之后LBP的转染效率略有下降。另外，在相同的质量比下，LBP⁴在两种细胞中的转染效率要明显高于LBP²和LBP³。这是由于LBP⁴阳离子聚合物中具有更多的仲胺基团，能够更加有效地络合pDNA，从而促进转染效率，说明了LBP阳离子聚合物能够实现较高的基因转染效率。

实施例6

采用MTT法表征LBP/pDNA复合物在HEK293细胞中的细胞毒性。以2×104个细胞每孔的密度将细胞培养在96孔板中。培养24h后，将事先按照质量比10-60配制好的LBP/pDNA加入到每孔中，4h后移除旧培养基，加MTT溶液。继续培养4h，取出96孔板，将MTT溶液吸出，用PBS洗涤1-2遍，每孔加入100μL二甲基亚砜，震荡10min，放在酶标仪上读出吸光度。结果如图2所示。

从图2中可以看出，随着质量比的升高，LBP并没有表现出明显的细胞毒性。而在相同质量比下，PEI的细胞毒性明显高于LBP。由此说明LBP阳离子聚合物具有较低的细胞内毒性。

实施例7

为了表征所制备阳离子载体介导CRISPR/Cas9基因编辑系统所产生的基因编辑效果，我们将BEL7402细胞以2×10⁵个细胞每孔的密度种在6孔板中，培养24h后，每孔加入80μL LBP⁴/pCas9-surv络合物。48h后，将细胞收集，并从中提取总DNA。用PCR仪将带有编辑位点的序列扩增出来，并用T7E1酶进行酶切实验。金标PEI用来做为阴性对照。

结果如图3所示。从图3中可以看出与对照组与金标PEI相比，经过T7E1酶的处理，LBP⁴实验组在电泳后出现了杂带，证实了所制备阳离子载体介导CRISPR/Cas9基因编辑系统产生了有效的基因编辑效果。由此说明LBP阳离子聚合物能够介导CRIPSR/Cas9基因编辑系统实现有效的基因编辑。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。