用于特定隔室货物递送的组合物和方法
阅读说明：本技术 用于特定隔室货物递送的组合物和方法 (Compositions and methods for compartment-specific cargo delivery ) 是由 G.A.冯马尔特扎恩 J.M.米尔维德 J.R.鲁本斯 M.T.米 N.F.戈登 J.V. 于 2019-11-14 设计创作，主要内容包括：本文描述了融合剂脂质体组合物和方法。(Fusogenic liposome compositions and methods are described herein.)
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年11月14日提交的标题为“《用于特定隔室货物递送的组合物和方法(COMPOSITIONS AND METHODS FOR COMPARTMENT-SPECIFIC CARGO DELIVERY)》”的美国临时申请：62/,767,394的优先权，所述申请的内容为了所有目的以全文引用的方式并入。
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背景技术
细胞-细胞融合是受精、发育、免疫应答和肿瘤发生等多种生物过程中所必需的。
发明内容
本公开提供涉及融合剂脂质体的技术和其将膜蛋白递送到靶细胞的用途。在一些实施例中，融合剂脂质体包括脂质双层、被脂质双层包围的内腔、融合剂和包含膜蛋白有效负载剂的货物。在一些实施例中，此等货物可以是或包括膜蛋白自身；在一些实施例中，此等货物可以是或包括编码膜蛋白的核酸(或为与编码膜蛋白的核酸互补的核酸)。
列举的实施例
膜递送
1.一种融合剂脂质体，其包括：
(a)包括来源于源细胞的多种脂质的脂质双层；
(b)被所述脂质双层包围的内腔(例如包括胞质溶胶)；
(c)相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的融合剂，其中将所述融合剂安置于所述脂质双层中；以及
(d)包括或编码以下中的一种或多种的膜蛋白有效负载剂(例如，其相对于所述源细胞是外源性的或过度表达的)：
i)嵌合抗原受体；
ii)整合素膜蛋白有效负载，例如选自表7；
iii)选自表8的离子通道蛋白；
iv)成孔蛋白，例如选自表9和10；
v)Toll样受体，例如选自表11；
vi)白细胞介素受体有效负载，例如选自表12；
vii)选自表13-14的细胞粘附蛋白；
viii)选自表17的转运蛋白；
ix)相对于天然存在的膜蛋白为异源的信号序列；或
x)表6中所列的信号序列；
其中所述融合剂脂质体不包括核衣壳蛋白或病毒基质蛋白。
2.一种融合剂脂质体，其包括：
(a)包括来源于源细胞的多种脂质的脂质双层；
(b)被所述脂质双层包围的内腔(例如包括胞质溶胶)；
(c)相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的融合剂，其中将所述融合剂安置于所述脂质双层中；以及
(d)包括或编码T细胞受体的膜蛋白有效负载剂(例如，其相对于所述源细胞是外源性的或过度表达的)：
其中任选地所述融合剂脂质体不包括核衣壳蛋白或病毒基质蛋白。
3.一种融合剂脂质体，其包括：
(a)包括来源于源细胞的多种脂质的脂质双层；
(b)被所述脂质双层包围的内腔(例如包括胞质溶胶)；
(c)相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的融合剂，其中将所述融合剂安置于所述脂质双层中；以及
(d)相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的膜蛋白有效负载剂；
以及
其中以下中的一个或多个：
i)所述融合剂脂质体包括细胞生物物质或由其构成；
ii)所述融合剂以每个融合剂脂质体至少或不超过10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数存在，例如如通过实例29的分析所测量；
iii)所述融合剂脂质体以每个融合剂脂质体至少或不超过10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数包括治疗剂，例如如通过实例43的分析所测量；
iv)所述融合剂脂质体包括脂质，其中CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM和TAG中的一个或多个在所述源细胞中的对应脂质水平的75％内；
v)所述融合剂脂质体包括与所述源细胞类似的蛋白质组学组成，例如使用实例42的分析；
vi)所述融合剂脂质体能够进行信号转导，例如传输细胞外信号，例如回应于胰岛素的AKT磷酸化，或回应于胰岛素的葡萄糖(例如经标记的葡萄糖，例如2-NBDG)摄取，例如比阴性对照(例如不存在胰岛素的以其它方式类似的融合剂脂质体)多至少10％，例如使用实例63的分析；
vii)所述融合剂脂质体在向例如小鼠的受试者施用时靶向组织，例如肝脏、肺、心脏、脾脏、胰腺、胃肠道、肾脏、睾丸、卵巢、脑、生殖器官、中枢神经系统、周围神经系统、骨骼肌、内皮、内耳或眼睛，例如其中在24小时之后，施用融合剂脂质体的群体中的至少0.1％或10％的融合剂脂质体存在于靶组织中，例如根据实例87或100的分析；或
viii)所述源细胞是选自嗜中性粒细胞、粒细胞、间质干细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、胚胎干细胞、成髓细胞、成肌细胞、肝细胞或神经元，例如视网膜神经元细胞。
4.一种融合剂脂质体，其包括：
(a)包括来源于源细胞的多种脂质的脂质双层；
(b)被所述脂质双层包围的内腔(例如包括胞质溶胶)；
(c)相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的融合剂，其中将所述融合剂安置于所述脂质双层中；以及
(d)膜蛋白有效负载剂，其为以下：
i)包括编码膜蛋白的DNA；或
ii)包括编码相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的膜蛋白的RNA，例如mRNA，
其中所述融合剂脂质体不包括核衣壳蛋白或病毒基质蛋白。
5.一种融合剂脂质体，其包括：
(a)包括来源于源细胞的多种脂质的脂质双层；
(b)被所述脂质双层包围的内腔(例如包括胞质溶胶)；
(c)相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的非病毒，例如哺乳动物融合剂，其中所述哺乳动物融合剂不是阿尔茨海默β淀粉样肽或致育素；以及
(d)相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的膜蛋白有效负载剂，
其中任选地所述融合剂脂质体不包括核衣壳蛋白或病毒基质蛋白。
6.一种融合剂脂质体，其包括：
(a)包括来源于源细胞的多种脂质的脂质双层；
(b)被所述脂质双层包围的内腔(例如包括胞质溶胶)；
(c)相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的融合剂，其中将所述融合剂安置于所述脂质双层中；以及
(d)相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的膜蛋白有效负载剂；
其中所述融合剂脂质体包括去核细胞，并且
其中任选地所述融合剂脂质体不包括核衣壳蛋白或病毒基质蛋白。
7.一种融合剂脂质体，其包括：
(a)包括来源于源细胞的多种脂质的脂质双层；
(b)被所述脂质双层包围的内腔(例如包括胞质溶胶)；
(c)相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的融合剂，其中将所述融合剂安置于所述脂质双层中；以及
(d)相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的膜蛋白有效负载剂；
以及其中以下中的一个或多个：
i)所述融合剂脂质体包括细胞生物物质或由其构成；
ii)所述融合剂脂质体包括去核细胞；
iii)所述融合剂脂质体包括灭活的细胞核；
iv)所述融合剂脂质体与靶细胞的融合速率高于与非靶细胞，例如高至少至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，例如在实例54的分析中；
v)所述融合剂脂质体与靶细胞的融合速率高于非靶融合剂脂质体，例如高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如在实例54的分析中；
vi)所述融合剂脂质体与靶细胞以使得在24、48或72小时之后所述融合剂脂质体中的膜蛋白有效负载剂递送到至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的靶细胞的速率融合，例如在实例54的分析中；
vii)所述融合剂以每个融合剂脂质体至少或不超过10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数存在，例如如通过实例29的分析所测量；
viii)所述融合剂脂质体以每个融合剂脂质体至少或不超过10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数包括膜蛋白有效负载剂，例如如通过实例43的分析所测量；
ix)所述融合剂的拷贝数与所述膜蛋白有效负载剂的拷贝数的比在1,000,000:1与100,000:1、100,000:1与10,000:1、10,000:1与1,000:1、1,000:1与100:1、100:1与50:1、50:1与20:1、20:1与10:1、10:1与5:1、5:1与2:1、2:1与1:1、1:1与1:2、1:2与1:5、1:5与1:10、1:10与1:20、1:20与1:50、1:50与1:100、1:100与1:1,000、1:1,000与1:10,000、1:10,000与1:100,000或1:100,000与1:1,000,000之间；
x)所述融合剂脂质体包括与所述源细胞基本上类似的脂质组成，或其中CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM和TAG中的一个或多个在源细胞中的对应脂质水平的10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％内；
xi)所述融合剂脂质体包括与所述源细胞类似的蛋白质组学组成，例如使用实例42的分析；
xii)所述融合剂脂质体包括的脂质:蛋白质的比在所述源细胞中的对应比的10％、20％、30％、40％或50％内，例如如使用实例49的分析所测量；
xiii)所述融合剂脂质体包括的蛋白质:核酸(例如DNA)的比在所述源细胞中的对应比的10％、20％、30％、40％或50％内，例如如使用实例50的分析所测量；
xiv)所述融合剂脂质体包括的脂质:核酸(例如DNA)的比在所述源细胞中的对应比的10％、20％、30％、40％或50％内，例如如使用实例51的分析所测量；
xv)所述融合剂脂质体在受试者，例如小鼠中具有的半衰期在参考细胞，例如源细胞的半衰期的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％内，例如根据实例75的分析；
xvi)所述融合剂脂质体跨膜转运葡萄糖(例如经标记的葡萄糖，例如2-NBDG)，例如比阴性对照(例如不存在葡萄糖的以其它方式类似的融合剂脂质体)多至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，例如如使用实例64的分析所测量；
xvii)所述融合剂脂质体在内腔中包括的酯酶活性在参考细胞(例如源细胞或小鼠胚胎成纤维细胞)中的酯酶活性的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内，例如使用实例66的分析；
xviii)所述融合剂脂质体包括的代谢活性(例如柠檬酸合酶活性)水平在参考细胞(例如源细胞)中的代谢活性(例如柠檬酸合酶活性)的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内，例如如实例68中所描述；
xix)所述融合剂脂质体包括的呼吸水平(例如耗氧速率)在参考细胞(例如源细胞)中的呼吸水平(例如耗氧速率)的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内，例如如实例69中所描述；
xx)所述融合剂脂质体包括至多18,000、17,000、16,000、15,000、14,000、13,000、12,000、11,000或10,000MFI的膜联蛋白-V染色水平，例如使用实例70的分析，或其中相比于实例70的分析中的用甲萘醌处理的以其它方式类似的融合剂脂质体的膜联蛋白-V染色水平，所述融合剂脂质体包括低至少5％、10％、20％、30％、40％或50％的膜联蛋白-V染色水平，或其中相比于实例70的分析中的用甲萘醌处理的巨噬细胞的膜联蛋白-V染色水平，所述融合剂脂质体包括低至少5％、10％、20％、30％、40％或50％的膜联蛋白-V染色水平，
xxi)所述融合剂脂质体的miRNA含量水平比所述源细胞的miRNA含量水平大至少至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，例如根据实例39的分析；
xxii)所述融合剂脂质体的可溶:不可溶蛋白质的比在所述源细胞的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大内，例如在所述源细胞的1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％内，例如根据实例47的分析；
xxiii)所述融合剂脂质体的LPS水平小于所述源细胞的LPS含量的5％、1％、0.5％、0.01％、0.005％、0.0001％、0.00001％或更小，例如如通过如实例48中所描述的质谱分析所测量；
xxiv)所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂能够进行信号转导，例如传输细胞外信号，例如回应胰岛素的AKT磷酸化，或回应于胰岛素的葡萄糖(例如经标记的葡萄糖，例如2-NBDG)摄取，例如比阴性对照(例如不存在胰岛素的以其它方式类似的融合剂脂质体)多至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，例如使用实例63的分析；
xxv)所述融合剂脂质体在向例如哺乳动物，例如实验哺乳动物(例如小鼠)、家养动物(例如宠物或家畜)或人类的受试者施用时靶向组织，例如肝脏、肺、心脏、脾脏、胰腺、胃肠道、肾脏、睾丸、卵巢、脑、生殖器官、中枢神经系统、周围神经系统、骨骼肌、内皮、内耳或眼睛，其中在24、48或72小时之后，在施用融合剂脂质体的群体中，至少0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的融合剂脂质体存在于靶组织中，例如根据实例87或100的分析；
xxvi)所述融合剂脂质体的近分泌信号传导水平比由参考细胞(例如源细胞或骨髓基质细胞(BMSC))诱导的近分泌信号传导水平大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如根据实例71的分析；
xxvii)所述融合剂脂质体的旁分泌信号传导水平比由参考细胞(例如源细胞或巨噬细胞)诱导的旁分泌信号传导水平大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，例如根据实例72的分析；
xxviii)相比于参考细胞(例如源细胞或C2C12细胞)中的聚合肌动蛋白的水平，所述融合剂脂质体以在1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内的水平聚合肌动蛋白，例如根据实例73的分析；
xxix)所述融合剂脂质体的膜电位在参考细胞(例如源细胞或C2C12细胞)的膜电位的约1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％内，例如根据实例74的分析，或其中所述融合剂脂质体具有约-20mV到-150mV、-20mV到-50mV、-50mV到-100mV或-100mV到-150mV的膜电位；
xxx)所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂能够从血管外渗，例如以源细胞的外渗速率的至少1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的速率，例如使用实例57的分析，例如其中所述源细胞为嗜中性粒细胞、淋巴细胞、B细胞、巨噬细胞或NK细胞；
xxxi)所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂能够穿过细胞膜，例如内皮细胞膜或血脑屏障；
xxxii)所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂能够分泌蛋白质，例如以比参考细胞(例如小鼠胚胎成纤维细胞或源细胞)大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的速率，例如使用实例62的分析；
xxxiii)所述融合剂脂质体符合药物或良好生产规范(GMP)标准；
xxxiv)所述融合剂脂质体是根据良好生产规范(GMP)制得；
xxxv)包括多种如本文所描述的融合剂脂质体的药物制剂具有低于预定参考值的病原体水平，例如，基本上不含病原体；
xxxvi)包括多种如本文所描述的融合剂脂质体的药物制剂具有低于预定参考值的污染物水平，例如，基本上不含污染物；
xxxvii)包括多种如本文所描述的融合剂脂质体的药物制剂具有低免疫原性，例如如本文所描述；
xxxviii)所述源细胞是选自嗜中性粒细胞、粒细胞、间质干细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、胚胎干细胞、成髓细胞、成肌细胞、肝细胞或神经元，例如视网膜神经元细胞；或
xxxix)所述源细胞不是293细胞、HEK细胞、人类内皮细胞或人类上皮细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或干细胞。
8.一种融合剂脂质体，其包括：
(a)脂质双层，
(b)被所述脂质双层包围的内腔(例如包括胞质溶胶)；
(c)相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的融合剂，其中将所述融合剂安置于所述脂质双层中，
(d)膜蛋白有效负载剂，例如对所述源细胞为外源性的膜蛋白，
其中所述融合剂脂质体来源于源细胞；并且
其中所述融合剂脂质体具有部分或完全的核灭活(例如缺乏如源细胞中所见的完整核、核去除/去核、非功能性核等)。
9.一种融合剂脂质体，其包括：
(a)脂质双层，
(b)被所述脂质双层包围的内腔(例如包括胞质溶胶)；
(c)相对于所述靶细胞为外源性的或过度表达的融合剂，例如其中将所述融合剂安置于所述脂质双层中(例如，其中所述融合剂对于所述源细胞为内源性或外源性的)，以及
(d)膜蛋白有效负载剂(例如，其相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的)，其为以下：
i)包括或编码嵌合抗原受体；
ii)包括或编码整合素膜蛋白有效负载，例如选自表7；
iii)包括或编码选自表8的离子通道蛋白；
iv)包括或编码成孔蛋白，例如选自表9和10；
v)包括或编码Toll样受体，例如选自表11；
vi)包括或编码白细胞介素受体有效负载，例如选自表12；
vii)包括或编码选自表13-14的细胞粘附蛋白；
viii)包括或编码选自表17的转运蛋白；
ix)包括或编码相对于天然存在的膜蛋白为异源的信号序列；
x)包括或编码表6中所列的信号序列；
其中所述融合剂脂质体不包括病毒衣壳或病毒包膜蛋白。
10.一种融合剂脂质体，其包括：
(a)包括来源于源细胞的多种脂质的脂质双层；
(b)被所述脂质双层包围的内腔(例如包括胞质溶胶)；
(c)相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的融合剂，其中将所述融合剂安置于所述脂质双层中；以及
(d)包括或编码以下中的一种或多种的膜蛋白有效负载剂(例如，其相对于所述源细胞是外源性的或过度表达的)：
i)脂质锚定蛋白；
ii)结合跨膜蛋白的细胞外蛋白；
iii)缺乏跨膜域的细胞外蛋白；
iv)部分跨越膜(例如，靶细胞或融合剂脂质体的膜)并且并不完全跨越膜的蛋白质(例如，包括平面内膜螺旋线的蛋白质，或包括并不完全跨越膜的疏水性环的蛋白质)；或
v)所述蛋白质不包括跨膜域，其中所述蛋白质例如通过静电或离子相互作用与膜表面相互作用；
其中所述融合剂脂质体不包括病毒结构蛋白，例如病毒衣壳蛋白或病毒包膜蛋白。
11.一种融合剂脂质体，其包括：
(a)脂质双层，
(b)被所述脂质双层包围的内腔(例如包括胞质溶胶)，
(c)相对于所述源细胞为外源性的融合剂或过度表达的融合剂，例如其中将所述融合剂安置于所述脂质双层中，
(d)膜蛋白有效负载剂，以及
(e)功能性核，
其中所述融合剂脂质体来源于源细胞。
12.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中当在内吞作用抑制剂存在下与靶细胞群体接触时，和当与未用内吞作用抑制剂处理的参考靶细胞群体接触时，相比于参考靶细胞群体，多种所述融合剂脂质体将货物递送到所述靶细胞群体中细胞数目的至少30％、40％、50％、60％、70％或80％中。
13.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中：
(i)当多个融合剂脂质体与包括靶细胞和非靶细胞的细胞群体接触时，存在于靶细胞中的货物比非靶细胞中的多至少2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍，或
(ii)相比于非靶细胞，所述多个融合剂脂质体以高至少至少50％的速率与靶细胞融合。
14.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中：
i)所述融合剂以至少1,000个拷贝的拷贝数存在，例如如通过实例29的分析所测量；或
ii)所述融合剂的拷贝数与所述膜蛋白有效负载剂的拷贝数的比在1,000,000:1与100,000:1、100,000:1与10,000:1、10,000:1与1,000:1、1,000:1与100:1、100:1与50:1、50:1与20:1、20:1与10:1、10:1与5:1、5:1与2:1、2:1与1:1、1:1与1:2、1:2与1:5、1:5与1:10、1:10与1:20、1:20与1:50、1:50与1:100、1:100与1:1,000、1:1,000与1:10,000、1:10,000与1:100,000或1:100,000与1:1,000,000之间。
15.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体以至少1,000个拷贝的拷贝数包括膜蛋白有效负载剂，例如如通过实例43的分析所测量。
16.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述膜蛋白有效负载剂为安置于所述融合剂脂质体脂质双层中的膜蛋白。
17.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述膜蛋白有效负载剂为安置于所述融合剂脂质体内腔中的编码膜蛋白的核酸。
18.根据实施例17所述的融合剂脂质体，其中所述核酸为或包括RNA。
19.根据实施例18所述的融合剂脂质体，其中所述RNA为或包括前mRNA或mRNA。
20.根据实施例17所述的融合剂脂质体，其中所述核酸为或包括DNA。
21.根据实施例20所述的融合剂脂质体，其中所述DNA为或包括gDNA或cDNA。
22.根据实施例17到21中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核酸还包括编码一个或多个信号序列的一个或多个序列，例如其中靶细胞将包括信号序列的蛋白质易位到所述靶细胞的细胞膜。
23.根据实施例22所述的融合剂脂质体，其中所述一个或多个信号序列为或包括选自表6的序列。
24.根据实施例17到23中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核酸包含引导编码所述膜蛋白的序列由所述靶细胞表达的一个或多个调节元件。
25.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述膜蛋白有效负载剂为或包括美国专利公开案第2016/0289674号的SEQ ID NO:8144-16131的序列。
26.根据实施例1到24中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述膜蛋白有效负载剂为或包括美国专利公开案第2016/0289674号的SEQ ID NO:8144-16131的序列的片段、变体或同源物。
27.根据实施例1到24中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述膜蛋白有效负载剂为或包括编码包括美国专利公开案第2016/0289674号的SEQ ID NO:8144-16131的序列的蛋白质的核酸。
28.根据实施例1到24中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述膜蛋白有效负载剂为或包括编码包括美国专利公开案第2016/0289674号的SEQ ID NO:8144-16131的序列的片段、变体或同源物的蛋白质的核酸。
29.根据实施例1到24中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述膜蛋白有效负载剂为或包括选自表7-17的蛋白质。
30.根据实施例1到24中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述膜蛋白有效负载剂为或包括选自表7-17的蛋白质的片段、变体或同源物。
31.根据实施例1到24中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述膜蛋白有效负载剂为或包括编码蛋白质的核酸，所述蛋白质为或包括选自表7-17的蛋白质。
32.根据实施例1到24中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述膜蛋白有效负载剂为或包括编码包括选自表7-17的蛋白质的片段、变体或同源物的蛋白质的核酸。
33.根据实施例1到24中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述膜蛋白有效负载剂为或包括嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包括抗原结合域。
34.根据实施例33所述的融合剂脂质体，其中所述CAR为或包括第一代CAR，所述第一代CAR包括抗原结合域、跨膜域和信号传导域。
35.根据实施例33所述的融合剂脂质体，其中所述CAR为或包括第二代CAR，所述第二代CAR包括抗原结合域、跨膜域和两个信号传导域。
36.根据实施例33所述的融合剂脂质体，其中所述CAR为或包括第三代CAR，所述第三代CAR包括抗原结合域、跨膜域和至少三个信号传导域。
37.根据实施例33所述的融合剂脂质体，其中所述CAR为或包括第四代CAR，所述第四代CAR包括抗原结合域、跨膜域、三个或四个信号传导域，以及在所述CAR的成功信号传导后诱导细胞因子基因的表达的域。
38.根据实施例33到37中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述抗原结合域为或包括scFv或Fab。
39.根据实施例33到38中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述抗原结合域靶向赘生性细胞的抗原特征。
40.根据实施例39所述的融合剂脂质体，其中所述赘生性细胞的抗原特征是选自细胞表面受体、离子通道联接受体、酶联受体、G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酯酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酰基环化酶、组氨酸激酶相关受体、表皮生长因子受体(EGFR)(包含ErbB1/EGFR、ErbB2/HER2、ErbB3/HER3和ErbB4/HER4)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)(包含FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF18和FGF21)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)(包含VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和PIGF)、RET受体和Eph受体家族(包含EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA9、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4和EphB6)、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR8、CFTR、CIC-1、CIC-2、CIC-4、CIC-5、CIC-7、CIC-Ka、CIC-Kb、斑萎蛋白、TMEM16A、GABA受体、甘氨酸受体、ABC转运蛋白、NAV1.1、NAV1.2、NAV1.3、NAV1.4、NAV1.5、NAV1.6、NAV1.7、NAV1.8、NAV1.9、神经鞘氨醇-1-磷酸酯受体(S1P1R)、NMDA通道、跨膜蛋白、多跨跨膜蛋白、T细胞受体基序；T细胞α链；T细胞β链；T细胞γ链；T细胞δ链；CCR7；CD3；CD4；CD5；CD7；CD8；CD11b；CD11c；CD16；CD19；CD20；CD21；CD22；CD25；CD28；CD34；CD35；CD40；CD45RA；CD45RO；CD52；CD56；CD62L；CD68；CD80；CD95；CD117；CD127；CD133；CD137(4-1BB)；CD163；F4/80；IL-4Ra；Sca-1；CTLA-4；GITR；GARP；LAP；颗粒酶B；LFA-1；运铁蛋白受体；NKp46、穿孔素、CD4+；Th1；Th2；Th17；Th40；Th22；Th9；Tfh、典型Treg.FoxP3+；Tr1；Th3；Treg17；TREG；CDCP1、NT5E、EpCAM、CEA、gpA33、粘蛋白、TAG-72、碳酸酐酶IX、PSMA、叶酸结合蛋白、神经节苷脂(例如CD2、CD3、GM2)、Lewis-γ2、VEGF、VEGFR 1/2/3、αVβ3、α5β1、ErbB1/EGFR、ErbB1/HER2、ErB3、c-MET、IGF1R、EphA3、TRAIL-R1、TRAIL-R2、RANKL、FAP、肌腱蛋白、PDL-1、BAFF、HDAC、ABL、FLT3、KIT、MET、RET、IL-1β、ALK、RANKL、mTOR、CTLA-4、IL-6、IL-6R、JAK3、BRAF、PTCH、平滑受体、PIGF、ANPEP、TIMP1、PLAUR、PTPRJ、LTBR或ANTXR1、叶酸受体α(FRa)、ERBB2(Her2/neu)、EphA2、IL-13Ra2、表皮生长因子受体(EGFR)、间皮素、TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、MUC16(CA125)、L1CAM、LeY、MSLN、IL13Rα1、L1-CAM、Tn Ag、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、白细胞介素-11受体a(IL-11Ra)、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、血小板衍生生长因子受体-β(PDGFR-β)、SSEA-4、CD20、MUC1、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-1受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、多唾液酸、PLACl、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、E7、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺蛋白、存活素、端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断裂点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYPIB I、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人类端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、新抗原、CD133、CD15、CD184、CD24、CD56、CD26、CD29、CD44、HLA-A、HLA-B、HLA-C、(HLA-A、B、C)CD49f、CD151 CD340、CD200、tkrA、trkB或trkC，或其抗原片段或抗原部分。
41.根据实施例33到38中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述抗原结合域靶向T细胞的抗原特征。
42.根据实施例41所述的融合剂脂质体，其中T细胞的所述抗原特征是选自细胞表面受体、膜转运蛋白(例如，主动或被动转运蛋白，例如离子通道蛋白、成孔蛋白等)、跨膜受体、膜酶和/或T细胞的细胞粘附蛋白特征。在一些实施例中，T细胞的抗原特征可以是G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酰基环化酶、组氨酸激酶相关受体、AKT1；AKT2；AKT3；ATF2；BCL10；CALM1；CD3D(CD3δ)；CD3E(CD3ε)；CD3G(CD3γ)；CD4；CD8；CD28；CD45；CD80(B7-1)；CD86(B7-2)；CD247(CD3ζ)；CTLA4(CD152)；ELK1；ERK1(MAPK3)；ERK2；FOS；FYN；GRAP2(GADS)；GRB2；HLA-DRA；HLA-DRB1；HLA-DRB3；HLA-DRB4；HLA-DRB5；HRAS；IKBKA(CHUK)；IKBKB；IKBKE；IKBKG(NEMO)；IL2；ITPR1；ITK；JUN；KRAS2；LAT；LCK；MAP2K1(MEK1)；MAP2K2(MEK2)；MAP2K3(MKK3)；MAP2K4(MKK4)；MAP2K6(MKK6)；MAP2K7(MKK7)；MAP3K1(MEKK1)；MAP3K3；MAP3K4；MAP3K5；MAP3K8；MAP3K14(NIK)；MAPK8(JNK1)；MAPK9(JNK2)；MAPK10(JNK3)；MAPK11(p38β)；MAPK12(p38γ)；MAPK13(p38δ)；MAPK14(p38α)；NCK；NFAT1；NFAT2；NFKB1；NFKB2；NFKBIA；NRAS；PAK1；PAK2；PAK3；PAK4；PIK3C2B；PIK3C3(VPS34)；PIK3CA；PIK3CB；PIK3CD；PIK3R1；PKCA；PKCB；PKCM；PKCQ；PLCY1；PRF1(穿孔素)；PTEN；RAC1；RAF1；RELA；SDF1；SHP2；SLP76；SOS；SRC；TBK1；TCRA；TEC；TRAF6；VAV1；VAV2；或ZAP70。
43.根据实施例33到38中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述抗原结合域靶向自身免疫性或发炎性病症的抗原特征。
44.根据实施例43所述的融合剂脂质体，其中所述自身免疫性或发炎性病症是选自慢性移植物抗宿主疾病(GVHD)、狼疮、关节炎、免疫复合物肾小球肾炎、古德帕斯丘综合征(goodpasture)、葡萄膜炎、肝炎、全身性硬化症或硬皮病、I型糖尿病、多发性硬化症、冷凝集素病、寻常天疱疮、格雷弗氏病(Grave's disease)、自身免疫性溶血性贫血、血友病A、原发性舍格伦综合征(Sjogren's Syndrome)、血栓性血小板减少性紫癜、视神经脊髓炎、埃文氏综合征(Evan's syndrome)、IgM介导的神经病、冷球蛋白血症(cyroglobulinemia)、皮肌炎(dermatomyositis)、特发性血小板减少症、强直性脊柱炎、大疱性类天疱疮(bullouspemphigoid)、获得性血管性水肿(acquired angioedema)、慢性荨麻疹、抗磷脂脱髓鞘性多发性神经病(antiphospholipid demyelinating polyneuropathy)和自身免疫性血小板减少症或嗜中性粒细胞减少症或纯红细胞再生障碍(pure red cell aplasias)，然而同种异体免疫性疾病的示例性非限制性实例包含同种致敏作用(allosensitization)(参见例如Blazar等人,2015,《美国移植杂志(Am.J.Transplant)》,15(4):931-41)或由造血或实体器官移植、输血、胎儿同种致敏作用的妊娠、新生儿同种异体免疫性血小板减少症、新生儿溶血性疾病、对外来抗原的致敏作用引起的异种致敏作用，所述外来抗原如可以在用酶或蛋白质替代疗法、血液产品和基因疗法治疗的遗传性或获得性缺陷症的替代时出现。
45.根据实施例43或实施例44所述的融合剂脂质体，其中自身免疫性或发炎性病症的所述抗原特征是选自细胞表面受体、离子通道联接受体、酶联受体、G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酰基环化酶或组氨酸激酶相关受体。在一些实施例中，CAR抗原结合域结合到在以下上表达的配体：B细胞、浆细胞、成浆细胞、CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD27、CD38、CD45R、CD138、CD319、BCMA、CD28、TNF、干扰素受体、GM-CSF、ZAP-70、LFA-1、CD3γ、CD5或CD2。
46.根据实施例33到38中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述抗原结合域靶向感染性疾病的抗原特征。
47.根据实施例46所述的融合剂脂质体，其中所述感染性疾病是选自HIV、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类疱疹病毒、人类疱疹病毒8(HHV-8，卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV))、人类嗜T-淋巴细胞病毒-1(HTLV-1)、梅克尔细胞多瘤病毒(Merkel cellpolyomavirus；MCV)、猴病毒40(SV40)、埃-巴二氏病毒(Eptstein-Barr virus)、CMV、人类乳头瘤病毒。
48.根据实施例46或实施例47所述的融合剂脂质体，其中感染性疾病的所述抗原特征是选自细胞表面受体、离子通道联接受体、酶联受体、G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶受体、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酰基环化酶、组氨酸激酶相关受体、HIV Env、gpl20或HIV-1Env上的CD4诱导的表位。
49.根据实施例33到48中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述跨膜域包括T细胞受体，即CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154的α、β或ξ链的至少跨膜区，或其功能变体。
50.根据实施例33到49中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述跨膜域包括CD8α、CD8β、4-1BB/CD137、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40/CD134、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、TCRβ、TCRζ、CD32、CD64、CD64、CD45、CD5、CD9、CD22、CD37、CD80、CD86、CD40、CD40L/CD154、VEGFR2、FAS和FGFR2B的至少一个或多个跨膜区，或其功能变体。
51.根据实施例33到50中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述CAR包括至少一个信号传导域，所述信号传导域选自以下中的一种或多种：B7-1/CD80；B7-2/CD86；B7-H1/PD-L1；B7-H2；B7-H3；B7-H4；B7-H6；B7-H7；BTLA/CD272；CD28；CTLA-4；Gi24/VISTA/B7-H5；ICOS/CD278；PD-1；PD-L2/B7-DC；PDCD6)；4-1BB/TNFSF9/CD137；4-1BB配体/TNFSF9；BAFF/BLyS/TNFSF13B；BAFF R/TNFRSF13C；CD27/TNFRSF7；CD27配体/TNFSF7；CD30/TNFRSF8；CD30配体/TNFSF8；CD40/TNFRSF5；CD40/TNFSF5；CD40配体/TNFSF5；DR3/TNFRSF25；GITR/TNFRSF18；GITR配体/TNFSF18；HVEM/TNFRSF14；LIGHT/TNFSF14；淋巴毒素-α/TNF-β；OX40/TNFRSF4；OX40配体/TNFSF4；RELT/TNFRSF19L；TACI/TNFRSF13B；TL1A/TNFSF15；TNF-α；TNFRII/TNFRSF1B)；2B4/CD244/SLAMF4；BLAME/SLAMF8；CD2；CD2F-10/SLAMF9；CD48/SLAMF2；CD58/LFA-3；CD84/SLAMF5；CD229/SLAMF3；CRACC/SLAMF7；NTB-A/SLAMF6；SLAM/CD150)；CD2；CD7；CD53；CD82/Kai-1；CD90/Thy1；CD96；CD160；CD200；CD300a/LMIR1；HLA I类；HLA-DR；Ikaros；整合素α4/CD49d；整合素α4β1；整合素α4β7/LPAM-1；LAG-3；TCL1A；TCL1B；CRTAM；DAP12；凝集素-1/CLEC7A；DPPIV/CD26；EphB6；TIM-1/KIM-1/HAVCR；TIM-4；TSLP；TSLP R；淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)；NKG2C、CD3ζ域、基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)、CD27、CD28、4-1BB、CD134/OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体，或其功能片段。
52.根据实施例33到51中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述CAR包括CD3ζ域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能变体。
53.根据实施例33到51中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述CAR包括(i)CD3ζ域，或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能变体；以及(ii)CD28域，或4-1BB域，或其功能变体。
54.根据实施例33到51中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述CAR包括(i)CD3ζ域，或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能变体；(ii)CD28域或其功能变体；以及(iii)4-1BB域，或CD134域，或其功能变体。
55.根据实施例33到53中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述CAR包括(i)CD3ζ域，或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能变体；(ii)CD28域或其功能变体；(iii)4-1BB域，或CD134域，或其功能变体；以及(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。
56.根据实施例33到53中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述CAR还包括一个或多个间隔子。
57.根据实施例56所述的融合剂脂质体，其中所述间隔子为所述抗原结合域与所述跨膜域之间的第一间隔件。
58.根据实施例56或实施例57所述的融合剂脂质体，其中所述第一间隔子包含免疫球蛋白恒定区的至少一部分或其变体或经修饰版本。
59.根据实施例56到58中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述间隔子为所述跨膜域与信号传导域之间的第二间隔子。
60.根据实施例59所述的融合剂脂质体，其中所述第二间隔子为寡肽。
61.根据实施例60所述的融合剂脂质体，其中所述寡肽包括甘氨酸-丝氨酸双联体。
62.根据实施例18到32中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述膜蛋白是选自细胞表面受体、离子通道联接受体、酶联受体、G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酯酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酰基环化酶、组氨酸激酶相关受体、表皮生长因子受体(EGFR)(包含ErbB1/EGFR、ErbB2/HER2、ErbB3/HER3和ErbB4/HER4)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)(包含FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF18和FGF21)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)(包含VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和PIGF)、RET受体和Eph受体家族(包含EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA9、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4和EphB6)、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR8、CFTR、CIC-1、CIC-2、CIC-4、CIC-5、CIC-7、CIC-Ka、CIC-Kb、斑萎蛋白、TMEM16A、GABA受体、甘氨酸受体、ABC转运蛋白、NAV1.1、NAV1.2、NAV1.3、NAV1.4、NAV1.5、NAV1.6、NAV1.7、NAV1.8、NAV1.9、神经鞘氨醇-1-磷酸酯受体(S1P1R)、NMDA通道、跨膜蛋白、多跨跨膜蛋白、T细胞受体基序；T细胞α链；T细胞β链；T细胞γ链；T细胞δ链；CCR7；CD3；CD4；CD5；CD7；CD8；CD11b；CD11c；CD16；CD19；CD20；CD21；CD22；CD25；CD28；CD34；CD35；CD40；CD45RA；CD45RO；CD52；CD56；CD62L；CD68；CD80；CD95；CD117；CD127；CD133；CD137(4-1BB)；CD163；F4/80；IL-4Ra；Sca-1；CTLA-4；GITR；GARP；LAP；颗粒酶B；LFA-1；运铁蛋白受体；NKp46、穿孔素、CD4+；Th1；Th2；Th17；Th40；Th22；Th9；Tfh、典型Treg.FoxP3+；Tr1；Th3；Treg17；TREG；CDCP1、NT5E、EpCAM、CEA、gpA33、粘蛋白、TAG-72、碳酸酐酶IX、PSMA、叶酸结合蛋白、神经节苷脂(例如CD2、CD3、GM2)、Lewis-γ2、VEGF、VEGFR 1/2/3、αVβ3、α5β1、ErbB1/EGFR、ErbB1/HER2、ErB3、c-MET、IGF1R、EphA3、TRAIL-R1、TRAIL-R2、RANKL、FAP、肌腱蛋白、PDL-1、BAFF、HDAC、ABL、FLT3、KIT、MET、RET、IL-1β、ALK、RANKL、mTOR、CTLA-4、IL-6、IL-6R、JAK3、BRAF、PTCH、平滑受体、PIGF、ANPEP、TIMP1、PLAUR、PTPRJ、LTBR或ANTXR1、叶酸受体α(FRa)、ERBB2(Her2/neu)、EphA2、IL-13Ra2、表皮生长因子受体(EGFR)、间皮素、TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、MUC16(CA125)、L1CAM、LeY、MSLN、IL13Rα1、L1-CAM、Tn Ag、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、白细胞介素-11受体a(IL-11Ra)、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、血小板衍生生长因子受体-β(PDGFR-β)、SSEA-4、CD20、MUC1、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-1受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、多唾液酸、PLACl、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、E7、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺蛋白、存活素、端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断裂点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYPIB I、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人类端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、新抗原、CD133、CD15、CD184、CD24、CD56、CD26、CD29、CD44、HLA-A、HLA-B、HLA-C、(HLA-A、B、C)CD49f、CD151CD340、CD200、tkrA、trkB或trkC。
63.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，所述融合剂脂质体通过内吞作用进入所述靶细胞，例如其中相比于用氯奎处理的参考细胞，对于给定融合剂脂质体通过内吞路径递送的膜蛋白有效负载剂的水平大0.01-0.6、0.01-0.1、0.1-0.3或0.3-0.6，或大至少至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，例如使用实例91的分析。
64.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体通过非内吞路径进入靶细胞，例如其中对于给定融合剂脂质体通过非内吞路径递送膜蛋白有效负载剂的水平为0.1-0.95、0.1-0.2、0.2-0.3、0.3-0.4、0.4-0.5、0.5-0.6、0.6-0.7、0.7-0.8、0.8-0.9、0.9-0.95，或相比于用氯奎处理的参考细胞，大至少至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，例如使用实例90的分析。
65.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中：
i)所述膜蛋白质有效负载剂为膜蛋白，或编码膜蛋白(例如嵌合抗原受体(CAR))的核酸(例如，DNA、gDNA、cDNA、RNA、前mRNA、mRNA等)或与编码膜蛋白的核酸互补的核酸；
ii)所述膜蛋白为或包括受体，如抗原受体，其在一些实施例中可为天然受体或经工程改造的受体，例如CAR；
iii)所述膜蛋白为或包括整合素；
iv)所述膜蛋白为或包括T细胞受体；
v)所述膜蛋白为或包括膜转运蛋白，如离子通道蛋白或成孔蛋白(例如溶血素或大肠杆菌素)；
vi)所述膜蛋白为或包括toll样受体；
vii)所述膜蛋白为或包括白细胞介素受体；
viii)所述膜蛋白为或包括膜酶；或
ix)所述膜蛋白为或包括细胞粘附蛋白(例如钙粘蛋白、选择蛋白、粘蛋白等)。
66.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中：
i)所述膜蛋白为完整的膜蛋白；
ii)所述膜蛋白为周围膜蛋白；
iii)将所述膜蛋白与膜暂时结合；
iv)所述膜蛋白为与靶细胞的膜结合和/或完全或部分跨越(例如，作为跨膜蛋白)靶细胞的膜的蛋白质；
v)所述膜蛋白为完整的单位蛋白(即，仅与膜的一侧结合)；
vi)所述膜蛋白与或变得与靶细胞的膜的外表面结合(例如部分或完全存在于其上)；或
vii)所述膜蛋白与或变得与靶细胞的膜的内表面结合(例如部分或完全存在于其上)。
67.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中：
i)所述膜蛋白为治疗性膜蛋白；或
ii)所述膜蛋白为或包括受体(例如细胞表面受体和/或跨膜受体)、细胞表面配体、膜转运蛋白(例如主动或被动转运蛋白，例如离子通道蛋白、成孔蛋白[例如毒素蛋白]等)、膜酶和/或细胞粘附蛋白)。
68.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中：
i)所述膜蛋白包括天然存在的膜蛋白的序列；
ii)所述膜蛋白为或包括天然存在的膜蛋白的变体或经修饰版本；
iii)所述膜蛋白为或包括经工程改造的膜蛋白；或
iv)所述膜蛋白为或包括融合蛋白。
69.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体将膜蛋白有效负载剂递送到靶细胞的膜，例如如本文所描述。
70.根据实施例69所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体还能够将一种或多种药剂(例如蛋白质、核酸(例如，DNA、gDNA、cDNA、RNA、前mRNA、mRNA等)细胞器或和/或代谢物)递送(delivering/delivers)到靶细胞的胞质溶胶。
71.一种融合剂脂质体组合物或制剂，其包括多个融合剂脂质体，其中至少一个融合剂脂质体包括：
(a)包括来源于源细胞的多种脂质的脂质双层；
(b)被所述脂质双层包围的内腔(例如包括胞质溶胶)；
(c)相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的融合剂，其中将所述融合剂安置于所述脂质双层中；
(d)膜蛋白有效负载剂，例如如本文所描述。
72.一种冷冻纯化的融合剂脂质体组合物或制剂，其包括多个融合剂脂质体，所述多个融合剂脂质体包括本文所描述的膜蛋白有效负载剂，其中所述制剂在等于或小于4℃、0℃、-4℃、-10℃、-12℃、-16℃、-20℃、-80℃或-160℃的温度下冷冻。
73.根据实施例71或实施例72所述的融合剂脂质体组合物，其中所述多个融合剂脂质体中的至少一个融合剂脂质体来源于源细胞。
74.根据实施例71到73中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述融合剂脂质体的温度小于4℃、0℃、-4℃、-10℃、-12℃、-16℃、-20℃、-80℃或-160℃。
75.根据实施例71到74中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述多个融合剂脂质体包括至少约103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014或1015个融合剂脂质体。
76.根据实施例71到75中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述多个融合剂脂质体是相同的。
77.根据实施例76所述的融合剂脂质体组合物，其中如果融合剂脂质体组合物中的至少0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％的融合剂脂质体共用至少一种选自以下的特性，那么所述多个融合剂脂质体是相同的：
包括相同的融合剂；
使用相同类型的源细胞产生；或
包括相同的膜蛋白有效负载剂。
78.根据实施例71到75中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述多个融合剂脂质体是不同的。
79.根据实施例71到77中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述多个融合剂脂质体来源于两种或更多种类型的源细胞。
80.根据实施例71到79中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其体积为至少1μL、2μL、5μL、10μL、20μL、50μL、100μL、200μL、500μL、1mL、2mL、5mL或10mL。
81.根据实施例71到80中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述多个融合剂脂质体包括至少0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％的不包括功能性核的融合剂脂质体。
82.根据实施例71到81中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述多个融合剂脂质体包括至少0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％的不包括核的融合剂脂质体。
83.根据实施例71到82中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述多个融合剂脂质体包括至少0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％的基本上不含核DNA的融合剂脂质体。
84.根据实施例71到83中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述多个融合剂脂质体包括至少0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％的不包括功能性线粒体的融合剂脂质体。
85.根据实施例71到84中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述多个融合剂脂质体包括至少0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％的不包括线粒体的融合剂脂质体。
86.根据实施例71到85中任一实施例所述的融合剂脂质体组合物，以蛋白质质量计，所述融合剂脂质体组合物包括小于0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％或10％的源细胞，或小于0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％或10％的具有功能性核的源细胞。
87.根据实施例71到86中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述多个融合剂脂质体包括至少0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％的融合剂脂质体，其中：
i)所述融合剂以每个融合剂脂质体至少1,000个拷贝的拷贝数存在，例如如通过实例29的分析所测量；或
ii)每个融合剂脂质体的所述融合剂的拷贝数与所述膜蛋白有效负载剂的拷贝数的比在1,000,000:1与100,000:1、100,000:1与10,000:1、10,000:1与1,000:1、1,000:1与100:1、100:1与50:1、50:1与20:1、20:1与10:1、10:1与5:1、5:1与2:1、2:1与1:1、1:1与1:2、1:2与1:5、1:5与1:10、1:10与1:20、1:20与1:50、1:50与1:100、1:100与1:1,000、1:1,000与1:10,000、1:10,000与1:100,000或1:100,000与1:1,000,000之间。
88.根据实施例71到87中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述融合剂脂质体组合物包括至少0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％的融合剂脂质体，其中所述膜蛋白有效负载剂以每个融合剂脂质体至少1,000个拷贝的拷贝数存在，例如如通过实例43的分析所测量。
89.根据实施例71到77中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述多个融合剂脂质体的平均直径为至少约50nm、约80nm、约100nm、约200nm、约500nm、约1000nm、约1200nm、约1400nm或约1500nm。
90.根据实施例71到89中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述多个融合剂脂质体包括直径在约10nm到约100μm范围内的融合剂脂质体。
91.根据实施例71到89中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述多个融合剂脂质体包括大小在约20nm到约200nm、约50nm到约200nm、约50nm到约100nm、约50nm到约150nm或约100nm到约150nm范围内的融合剂脂质体。
92.根据实施例71到91中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述多个融合剂脂质体中的至少50％的融合剂脂质体的直径在所述融合剂脂质体组合物中的融合剂脂质体的平均直径的10％、20％、30％、40％或50％内。
93.根据实施例71到92中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述多个融合剂脂质体包括体积在约500nm3到约0.0006mm3或约4,000nm3到约0.005μm3、约65,000nm3到约0.005μm3、约65,000nm3到约0.0006μm3、约65,000nm3到约0.002μm3或约0.0006μm3到约0.002μm3范围内的融合剂脂质体。
94.根据实施例71到93中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述多个融合剂脂质体中的至少50％的融合剂脂质体的体积在所述融合剂脂质体组合物中的融合剂脂质体的平均体积的10％、20％、30％、40％或50％内。
95.根据实施例71到94中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述多个融合剂脂质体中的至少50％的融合剂脂质体的融合剂的拷贝数在所述融合剂脂质体组合物中的融合剂脂质体的平均融合剂拷贝数的10％、20％、30％、40％或50％内。
96.根据实施例71到95中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述多个融合剂脂质体中的至少50％的融合剂脂质体的蛋白质膜有效负载的拷贝数在所述融合剂脂质体组合物中的融合剂脂质体中的平均值蛋白质膜有效负载拷贝数的10％、20％、30％、40％或50％内。
97.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体组合物或药物组合物，其中：
i)将膜蛋白有效负载剂部分或完全安置于融合剂脂质体内腔中；
ii)将膜蛋白有效负载剂与融合剂脂质体的脂质双层结合(例如部分或完全位于融合剂脂质体的脂质双层内)；或
i)将相关膜蛋白与所述融合剂脂质体的外表面结合和/或部分或完全地呈现于所述融合剂脂质体的外表面上。
98.一种制造融合剂脂质体组合物的方法，其包括：
a)提供包括，例如表达融合剂的源细胞；
b)从所述源细胞产生融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体包括脂质双层、内腔、融合剂和膜蛋白有效负载剂，由此制得融合剂脂质体；以及
c)将所述融合剂脂质体配制成例如适合于向受试者施用的药物组合物，其中以下中的一个或多个：
i)所述源细胞不是293细胞、HEK细胞、人类内皮细胞或人类上皮细胞；
ii)所述融合剂不是病毒蛋白；
iii)所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂的密度不在1.08g/mL与1.12g/mL之间，例如，
iv)所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂的密度为1.25g/mL+/-0.05，例如如通过实例33的分析所测量；
v)所述融合剂脂质体未被循环中的清除系统或肝窦中的库普弗(Kupffer)细胞捕获；
vi)所述融合剂脂质体未被受试者的网状内皮系统(RES)捕获，例如根据实例76的分析；
vii)当向受试者施用多个融合剂脂质体时，小于1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的所述多个融合剂脂质体在24小时之后未被RES捕获，例如根据实例76的分析；
viii)所述融合剂脂质体的直径大于5μm、6μm、7μm、8μm、10μm、20μm、50μm、100μm、150μm或200μm。
ix)所述融合剂脂质体包括细胞生物物质；
x)所述融合剂脂质体包括去核细胞；或
xi)所述融合剂脂质体包括灭活的细胞核。
99.根据实施例98所述的方法，其中提供表达融合剂的源细胞包括在所述源细胞中表达外源性融合剂或上调内源性融合剂在所述源细胞中的表达。
100.根据实施例98或实施例99所述的方法，其包括使所述源细胞的细胞核失活。
101.根据实施例98到100中任一项所述的方法，其包括例如通过电穿孔将膜蛋白有效负载(例如，核酸或蛋白质)引入融合剂脂质体中。
102.一种制造融合剂脂质体药品组合物的方法，其包括：
a)提供，例如产生根据实施例1到70中任一项所述的多个融合剂脂质体、根据实施例71到97中任一项所述的融合剂脂质体组合物或根据实施例97所述的药物组合物；以及
b)分析所述多个融合剂脂质体中的一个或多个融合剂脂质体以确定是否符合以下一个或多个(例如2个、3个或全部)标准：
i)所述融合剂脂质体与靶细胞的融合速率高于与非靶细胞，例如，高至少至少10％，例如在实例54的分析中；
ii)所述融合剂脂质体与靶细胞的融合速率高于与其它融合剂脂质体，例如，高至少50％，例如在实例54的分析中；
iii)所述融合剂脂质体与靶细胞以使得在24小时之后所述融合剂脂质体中的药剂递送到至少10％的靶细胞的速率融合，例如在实例54的分析中；
iv)所述融合剂以至少1,000个拷贝的拷贝数存在，例如如通过实例29的分析所测量；
v)所述融合剂脂质体以至少1,000个拷贝的拷贝数包括膜蛋白有效负载剂，例如如通过实例43的分析所测量；
vi)所述融合剂的拷贝数与所述膜蛋白有效负载剂的拷贝数的比在1,000,000:1与100,000:1、100,000:1与10,000:1、10,000:1与1,000:1、1,000:1与100:1、100:1与50:1、50:1与20:1、20:1与10:1、10:1与5:1、5:1与2:1、2:1与1:1、1:1与1:2、1:2与1:5、1:5与1:10、1:10与1:20、1:20与1:50、1:50与1:100、1:100与1:1,000、1:1,000与1:10,000、1:10,000与1:100,000或1:100,000与1:1,000,000之间；
vii)所述融合剂脂质体包括脂质组合物，其中CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM和TAG中的一个或多个在所述源细胞中的对应脂质水平的75％内；
viii)所述融合剂脂质体包括与所述源细胞类似的蛋白质组学组成，例如使用实例42的分析；
ix)所述融合剂脂质体包括的脂质:蛋白质的比在所述源细胞中的对应比的10％、20％、30％、40％或50％内，例如如使用实例49的分析所测量；
x)所述融合剂脂质体包括的蛋白质:核酸(例如DNA)的比在所述源细胞中的对应比的10％、20％、30％、40％或50％内，例如如使用实例50的分析所测量；
xi)所述融合剂脂质体包括的脂质:核酸(例如DNA)的比在所述源细胞中的对应比的10％、20％、30％、40％或50％内，例如如使用实例51的分析所测量；
xii)所述融合剂脂质体在受试者中，例如在小鼠中的半衰期在参考细胞(例如源细胞)的半衰期的90％内，例如根据实例75的分析；
xiii)所述融合剂脂质体将葡萄糖(例如，经标记的葡萄糖，例如2-NBDG)转运跨越膜，例如比阴性对照(例如不存在葡萄糖的以其它方式类似的融合剂脂质体)多至少10％，例如如使用实例64的分析所测量；
xiv)所述融合剂脂质体在内腔中包括的酯酶活性在参考细胞(例如源细胞或小鼠胚胎成纤维细胞)中的酯酶活性的90％内，例如使用实例66的分析；
xv)所述融合剂脂质体包括的代谢活性水平在参考细胞(例如源细胞)中的代谢活性(例如，柠檬酸合酶活性)的90％内，例如如实例68中所描述；
xvi)所述融合剂脂质体包括的呼吸水平(例如，耗氧速率)在参考细胞(例如源细胞)中的呼吸水平的90％内，例如如实例69中所描述；
xvii)所述融合剂脂质体包括至多18,000、17,000、16,000、15,000、14,000、13,000、12,000、11,000或10,000MFI的膜联蛋白-V染色水平，例如使用实例70的分析，或其中相比于实例70的分析中的用甲萘醌处理的以其它方式类似的融合剂脂质体的膜联蛋白-V染色水平，所述融合剂脂质体包括低至少5％、10％、20％、30％、40％或50％的膜联蛋白-V染色水平，或其中相比于实例70的分析中的用甲萘醌处理的巨噬细胞的膜联蛋白-V染色水平，所述融合剂脂质体包括低至少5％、10％、20％、30％、40％或50％的膜联蛋白-V染色水平；
xviii)所述融合剂脂质体具有与所述源细胞的miRNA含量水平相比至少1％的miRNA含量水平，例如根据实例39的分析；
xix)所述融合剂脂质体的可溶性:不可溶性蛋白质的比在源细胞的所述比的90％内，例如根据实例47的分析；
xx)所述融合剂脂质体的LPS水平小于融合剂脂质体的脂质含量的5％，例如如通过实例48的分析所测量；
xxi)所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂能够进行信号转导，例如传输细胞外信号，例如回应于胰岛素的AKT磷酸化，或回应于胰岛素的葡萄糖(例如经标记的葡萄糖，例如2-NBDG)摄取，例如比阴性对照(例如不存在胰岛素的以其它方式类似的融合剂脂质体)多至少10％，例如使用实例63的分析；
xxii)所述融合剂脂质体的近分泌信号传导水平比由参考细胞(例如源细胞或骨髓基质细胞(BMSC))诱导的近分泌信号传导水平大至少5％，例如根据实例71的分析；
xxiii)所述融合剂脂质体的旁分泌信号传导水平比由参考细胞(例如源细胞或巨噬细胞)诱导的旁分泌信号传导水平大至少5％，例如根据实例72的分析；
xxiv)相比于参考细胞(例如源细胞或C2C12细胞)中的聚合肌动蛋白的水平，所述融合剂脂质体以在5％内的水平聚合肌动蛋白，例如根据实例73的分析；
xxv)所述融合剂脂质体的膜电位在参考细胞(例如源细胞或C2C12细胞)的膜电位的约5％内，例如根据实例74的分析，或其中所述融合剂脂质体具有约-20mV到-150mV、-20mV到-50mV、-50mV到-100mV或-100mV到-150mV的膜电位；
xxvi)所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂能够分泌蛋白质，例如以比参考细胞(例如小鼠胚胎成纤维细胞)大至少5％的速率，例如使用实例62的分析；或
xxvii)所述融合剂脂质体具有低免疫原性，例如如本文所描述；以及
c)(任选地)如果符合标准中的一个或多个，那么批准所述多个融合剂脂质体或融合剂脂质体组合物释放；
由此制造融合剂脂质体药品组合物。
103.一种制造融合剂脂质体组合物的方法，其包括：
a)提供包括，例如表达融合剂的源细胞；
b)从所述源细胞产生融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体包括脂质双层、内腔、融合剂和膜蛋白有效负载剂，由此制得融合剂脂质体；以及
c)将所述融合剂脂质体配制成例如适合于向受试者施用的药物组合物。
104.一种制造融合剂脂质体组合物的方法，其包括：
a)提供，例如产生多个本文所描述的融合剂脂质体或融合剂脂质体制剂；以及
b)分析所述多个融合剂脂质体(例如，制剂)的样品以确定是否符合一个或多个(例如2、3或更多个)标准。
105.根据实施例104所述的方法，其中所述一个或多个标准是选自：
i)样品中的融合剂脂质体与靶细胞的融合速率高于与非靶细胞，例如高至少至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，例如在实例54的分析中；
ii)样品中的融合剂脂质体与靶细胞的融合速率高于其它融合剂脂质体，例如，高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如在实例54的分析中；
iii)样品中的融合剂脂质体与靶细胞以使得在24、48或72小时之后所述融合剂脂质体中的膜蛋白有效负载剂递送到至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的靶细胞的速率融合，例如在实例54的分析中；
iv)所述融合剂以每个融合剂脂质体(例如，样品中的平均值)至少或不超过10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数存在，例如如通过实例29的分析所测量；
v)所膜蛋白有效负载剂在样品(例如，样品中的平均值)的融合剂脂质体中以至少或不超过10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数而为可检测到的，例如如通过实例43的分析所测量；
vi)所述融合剂的拷贝数与所述膜蛋白有效负载剂的拷贝数的比在1,000,000:1与100,000:1、100,000:1与10,000:1、10,000:1与1,000:1、1,000:1与100:1、100:1与50:1、50:1与20:1、20:1与10:1、10:1与5:1、5:1与2:1、2:1与1:1、1:1与1:2、1:2与1:5、1:5与1:10、1:10与1:20、1:20与1:50、1:50与1:100、1:100与1:1,000、1:1,000与1:10,000、1:10,000与1:100,000或1:100,000与1:1,000,000之间；
vii)样品的融合剂脂质体的特征在于与源细胞基本上类似的脂质组成，或其中CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM和TAG中的一个或多个在源细胞中的对应脂质水平的10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或75％内；
viii)样品的融合剂脂质体的特征在于与源细胞类似的蛋白质组学组成，例如使用实例42的分析；
ix)样品的融合剂脂质体的特征在于脂质:蛋白质的比在源细胞中的对应比的10％、20％、30％、40％或50％内，例如如使用实例49的分析所测量；
x)样品的融合剂脂质体的特征在于蛋白质:核酸(例如，DNA)的比在源细胞中的对应比的10％、20％、30％、40％或50％内，例如如使用实例50的分析所测量；
xi)样品的融合剂脂质体的特征在于脂质:核酸(例如，DNA)的比在源细胞中的对应比的10％、20％、30％、40％或50％内，例如如使用实例51的分析所测量；
xii)样品的融合剂脂质体的特征在于在受试者，例如在实验动物(如小鼠)中的半衰期在参考细胞组合物(例如源细胞)的半衰期的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％内，例如根据实例75的分析；
xiii)样品的融合剂脂质体的特征在于其跨膜转运葡萄糖(例如经标记的葡萄糖，例如2-NBDG)，例如比阴性对照(例如不存在葡萄糖的以其它方式类似的样品的融合剂脂质体)多至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，例如如使用实例64的分析所测量；
xiv)样品的融合剂脂质体的特征在于在内腔中的酯酶活性在参考细胞(例如源细胞或小鼠胚胎成纤维细胞)中的酯酶活性的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内，例如使用实例66的分析；
xv)样品的融合剂脂质体的特征在于代谢活性(例如柠檬酸合酶活性)水平在参考细胞(例如源细胞)中的代谢活性(例如柠檬酸合酶活性)的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内，例如如实例68中所描述；
xvi)样品的融合剂脂质体的特征在于呼吸水平(例如耗氧速率)在参考细胞(例如源细胞)中的呼吸水平的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内，例如如实例69中所描述；
xvii)样品的融合剂脂质体的特征在于至多18,000、17,000、16,000、15,000、14,000、13,000、12,000、11,000或10,000MFI的膜联蛋白-V染色水平，例如使用实例70的分析，或其中相比于实例70的分析中的用甲萘醌处理的以其它方式类似的融合剂脂质体的膜联蛋白-V染色水平，所述融合剂脂质体包括低至少5％、10％、20％、30％、40％或50％的膜联蛋白-V染色水平，或其中相比于实例70的分析中的用甲萘醌处理的巨噬细胞的膜联蛋白-V染色水平，所述融合剂脂质体包括低至少5％、10％、20％、30％、40％或50％的膜联蛋白-V染色水平，
xviii)样品的融合剂脂质体的特征在于miRNA含量水平比源细胞的miRNA含量水平大至少至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，例如根据实例39的分析；
xix)所述融合剂脂质体的可溶:不可溶蛋白质的比在所述源细胞的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大内，例如在所述源细胞的1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％内，例如根据实例47的分析；
xx)样品的融合剂脂质体的特征在于LPS水平为源细胞或参考细胞的LPS含量的小于5％、1％、0.5％、0.01％、0.005％、0.0001％、0.00001％或更小，例如如通过实例48的分析所测量；
xxi)样品的融合剂脂质体能够进行信号转导，例如传输细胞外信号，例如回应胰岛素的AKT磷酸化，或回应于胰岛素的葡萄糖(例如经标记的葡萄糖，例如2-NBDG)摄取，例如比阴性对照(例如不存在胰岛素的以其它方式类似的融合剂脂质体)多至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，例如使用实例63的分析；
xxii)样品的融合剂脂质体的特征在于近分泌信号传导水平比由参考细胞(例如源细胞或骨髓基质细胞(BMSC))诱导的近分泌信号传导水平大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如根据实例71的分析；
xxiii)样品的融合剂脂质体的特征在于旁分泌信号传导水平比由参考细胞(例如源细胞或巨噬细胞)诱导的旁分泌信号传导水平大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，例如根据实例72的分析；
xxiv)样品的融合剂脂质体的特征在于相比于参考细胞(例如源细胞或C2C12细胞)中的聚合肌动蛋白的水平，所述融合剂脂质体以在1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内的水平聚合肌动蛋白，例如根据实例73的分析；
xxv)样品的融合剂脂质体的特征在于膜电位在参考细胞(例如源细胞或C2C12细胞)的膜电位的约1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％内，例如根据实例74的分析，或其中所述融合剂脂质体具有约-20mV到-150mV、-20mV到-50mV、-50mV到-100mV或-100mV到-150mV的膜电位；
xxvi)样品的融合剂脂质体能够分泌蛋白质，例如以比参考细胞(例如小鼠胚胎成纤维细胞)大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的速率，例如使用实例62的分析；或
xxvii)样品的融合剂脂质体的特征在于低免疫原性，例如如本文所描述。
106.根据实施例104或105所述的方法，其还包括：
c)如果符合所述标准中的一个或多个，那么批准所述多个融合剂脂质体或融合剂脂质体组合物释放，或(任选地)如果符合所述一个或多个标准，那么将所述多个融合剂脂质体或融合剂脂质体制剂配制成药品。
107.一种制造融合剂脂质体组合物的方法，其包括：
a)提供包括，例如表达融合剂的源细胞；
b)从所述源细胞产生融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体包括脂质双层、内腔、融合剂和膜蛋白有效负载剂，由此制得融合剂脂质体；以及
c)将所述融合剂脂质体配制成例如适合于向受试者施用的药物组合物，其中以下中的一个或多个：
i)所述源细胞不是293细胞、HEK细胞、人类内皮细胞或人类上皮细胞；
ii)所述融合剂不是病毒蛋白；
iii)所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂的密度不在1.08g/mL与1.12g/mL之间，例如，
iv)所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂的密度为1.25g/mL+/-0.05，例如如通过实例33的分析所测量；
v)所述融合剂脂质体未被循环中的清除系统或肝窦中的库普弗细胞捕获；
vi)所述融合剂脂质体未被受试者的网状内皮系统(RES)捕获，例如根据实例76的分析；
vii)当向受试者施用多个融合剂脂质体时，小于1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的所述多个融合剂脂质体在24小时之后未被RES捕获，例如根据实例76的分析；
viii)所述融合剂脂质体的直径大于5μm、6μm、7μm、8μm、10μm、20μm、50μm、100μm、150μm或200μm。
ix)所述融合剂脂质体包括细胞生物物质；
x)所述融合剂脂质体包括去核细胞；或
xi)所述融合剂脂质体包括灭活的细胞核。
108.一种制造融合剂脂质体组合物的方法，其包括：
a)提供多种如本文所描述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物或药物组合物；以及
b)分析所述多个融合剂脂质体中的一个或多个融合剂脂质体以确定是否符合以下一个或多个(例如2个、3个或全部)标准：
i)所述融合剂脂质体与靶细胞的融合速率高于与非靶细胞，例如，高至少至少10％，例如在实例54的分析中；
ii)所述融合剂脂质体与靶细胞的融合速率高于与其它融合剂脂质体，例如，高至少50％，例如在实例54的分析中；
iii)所述融合剂脂质体与靶细胞以使得在24小时之后所述融合剂脂质体中的药剂递送到至少10％的靶细胞的速率融合，例如在实例54的分析中；
iv)所述融合剂以至少1,000个拷贝的拷贝数存在，例如如通过实例29的分析所测量；
v)所述融合剂脂质体以至少1,000个拷贝的拷贝数包括膜蛋白有效负载剂，例如如通过实例43的分析所测量；
vi)所述融合剂的拷贝数与所述膜蛋白有效负载剂的拷贝数的比在1,000,000:1与100,000:1、100,000:1与10,000:1、10,000:1与1,000:1、1,000:1与100:1、100:1与50:1、50:1与20:1、20:1与10:1、10:1与5:1、5:1与2:1、2:1与1:1、1:1与1:2、1:2与1:5、1:5与1:10、1:10与1:20、1:20与1:50、1:50与1:100、1:100与1:1,000、1:1,000与1:10,000、1:10,000与1:100,000或1:100,000与1:1,000,000之间；
vii)所述融合剂脂质体包括脂质组合物，其中CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM和TAG中的一个或多个在所述源细胞中的对应脂质水平的75％内；
viii)所述融合剂脂质体包括与所述源细胞类似的蛋白质组学组成，例如使用实例42的分析；
ix)所述融合剂脂质体包括的脂质:蛋白质的比在所述源细胞中的对应比的10％、20％、30％、40％或50％内，例如如使用实例49的分析所测量；
x)所述融合剂脂质体包括的蛋白质:核酸(例如DNA)的比在所述源细胞中的对应比的10％、20％、30％、40％或50％内，例如如使用实例50的分析所测量；
xi)所述融合剂脂质体包括的脂质:核酸(例如DNA)的比在所述源细胞中的对应比的10％、20％、30％、40％或50％内，例如如使用实例51的分析所测量；
xii)所述融合剂脂质体在受试者中，例如在小鼠中的半衰期在参考细胞(例如源细胞)的半衰期的90％内，例如根据实例75的分析；
xiii)所述融合剂脂质体将葡萄糖(例如，经标记的葡萄糖，例如2-NBDG)转运跨越膜，例如比阴性对照(例如不存在葡萄糖的以其它方式类似的融合剂脂质体)多至少10％，例如如使用实例64的分析所测量；
xiv)所述融合剂脂质体在内腔中包括的酯酶活性在参考细胞(例如源细胞或小鼠胚胎成纤维细胞)中的酯酶活性的90％内，例如使用实例66的分析；
xv)所述融合剂脂质体包括的代谢活性水平在参考细胞(例如源细胞)中的代谢活性(例如，柠檬酸合酶活性)的90％内，例如如实例68中所描述；
xvi)所述融合剂脂质体包括的呼吸水平(例如，耗氧速率)在参考细胞(例如源细胞)中的呼吸水平的90％内，例如如实例69中所描述；
xvii)所述融合剂脂质体包括至多18,000、17,000、16,000、15,000、14,000、13,000、12,000、11,000或10,000MFI的膜联蛋白-V染色水平，例如使用实例70的分析，或其中相比于实例70的分析中的用甲萘醌处理的以其它方式类似的融合剂脂质体的膜联蛋白-V染色水平，所述融合剂脂质体包括低至少5％、10％、20％、30％、40％或50％的膜联蛋白-V染色水平，或其中相比于实例70的分析中的用甲萘醌处理的巨噬细胞的膜联蛋白-V染色水平，所述融合剂脂质体包括低至少5％、10％、20％、30％、40％或50％的膜联蛋白-V染色水平；
xviii)所述融合剂脂质体具有与所述源细胞的miRNA含量水平相比至少1％的miRNA含量水平，例如根据实例39的分析；
xix)所述融合剂脂质体的可溶性:不可溶性蛋白质的比在源细胞的所述比的90％内，例如根据实例47的分析；
xx)所述融合剂脂质体的LPS水平小于融合剂脂质体的脂质含量的5％，例如如通过实例48的分析所测量；
xxi)所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂能够进行信号转导，例如传输细胞外信号，例如回应于胰岛素的AKT磷酸化，或回应于胰岛素的葡萄糖(例如经标记的葡萄糖，例如2-NBDG)摄取，例如比阴性对照(例如不存在胰岛素的以其它方式类似的融合剂脂质体)多至少10％，例如使用实例63的分析；
xxii)所述融合剂脂质体的近分泌信号传导水平比由参考细胞(例如源细胞或骨髓基质细胞(BMSC))诱导的近分泌信号传导水平大至少5％，例如根据实例71的分析；
xxiii)所述融合剂脂质体的旁分泌信号传导水平比由参考细胞(例如源细胞或巨噬细胞)诱导的旁分泌信号传导水平大至少5％，例如根据实例72的分析；
xxiv)相比于参考细胞(例如源细胞或C2C12细胞)中的聚合肌动蛋白的水平，所述融合剂脂质体以在5％内的水平聚合肌动蛋白，例如根据实例73的分析；
xxv)所述融合剂脂质体的膜电位在参考细胞(例如源细胞或C2C12细胞)的膜电位的约5％内，例如根据实例74的分析，或其中所述融合剂脂质体具有约-20mV到-150mV、-20mV到-50mV、-50mV到-100mV或-100mV到-150mV的膜电位；
xxvi)所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂能够分泌蛋白质，例如以比参考细胞(例如小鼠胚胎成纤维细胞)大至少5％的速率，例如使用实例62的分析；或
xxvii)所述融合剂脂质体具有低免疫原性，例如如本文所描述；以及
c)任选地，如果符合标准中的一个或多个，那么批准所述多个融合剂脂质体或融合剂脂质体组合物释放；
由此制造融合剂脂质体药品组合物。
109.一种将膜蛋白有效负载剂递送到受试者的方法，其包括向所述受试者施用包括根据实施例1到70中任一项所述的多个融合剂脂质体的融合剂脂质体组合物、根据实施例71到97中任一项所述的融合剂脂质体组合物或根据实施例97所述的药物组合物，其中所述融合剂脂质体组合物以使得递送膜蛋白有效负载剂的量和/或时间施用。
110.一种将包括膜蛋白有效负载剂的例如如本文所描述的融合剂脂质体组合物或制剂递送到人类受试者、靶组织或细胞的方法，所述方法包括向所述人类受试者施用包括多种本文所描述的融合剂脂质体的融合剂脂质体组合物、本文所描述的融合剂脂质体组合物或本文所描述的药物组合物或使所述靶组织或所述细胞与其接触，由此向所述受试者施用所述融合剂脂质体组合物。
111.一种向受试者、靶组织或细胞递送膜蛋白有效负载剂的方法，其包括向所述受试者施用本文所描述的融合剂脂质体组合物或制剂(例如，本文所描述的药物组合物)或使所述靶组织或所述细胞与其接触，其中所述融合剂脂质体组合物或制剂以使得递送膜蛋白有效负载剂的量和/或时间施用。
112.一种向受试者递送膜蛋白有效负载剂的方法，例如其包括：
a)在允许将第一融合剂安置于所述受试者的一个或多个靶细胞中的条件下向所述受试者施用第一融合剂，其中以下中的一个或多个：
i)施用所述第一融合剂包括在允许所述第一融合剂在一个或多个靶细胞中表达的条件下施用编码所述第一融合剂的核酸，或
ii)第一融合剂不包括卷曲螺旋基序，以及
b)向所述人类受试者施用如本文所描述的包括多个融合剂脂质体的融合剂脂质体组合物或制剂，所述多个融合剂脂质体包括第二融合剂和膜蛋白有效负载剂，其中所述第二融合剂与所述第一融合剂相容，其中所述多个融合剂脂质体还包括膜蛋白有效负载剂，
由此向所述受试者递送膜蛋白有效负载剂。
113.一种调控，例如增强受试者的生物功能的方法，其包括：
a)在允许将第一融合剂安置于所述受试者的一个或多个靶细胞中的条件下向所述受试者施用第一融合剂，其中以下中的一个或多个：
i)施用所述第一融合剂包括在允许所述第一融合剂在一个或多个靶细胞中表达的条件下施用编码所述第一融合剂的核酸，或
ii)第一融合剂不包括卷曲螺旋基序，以及
b)向所述人类受试者施用如本文所描述的包括多个融合剂脂质体的融合剂脂质体组合物或制剂，所述多个融合剂脂质体包括第二融合剂，其中所述第二融合剂与所述第一融合剂相容，其中所述多个融合剂脂质体还包括膜蛋白有效负载剂，
由此调控所述受试者的生物功能。
114.一种向受试者递送或靶向膜蛋白功能的方法，其包括向所述受试者施用本文所描述的融合剂脂质体组合物或制剂，所述融合剂脂质体组合物或制剂包括膜蛋白有效负载剂，其中所述融合剂脂质体组合物或制剂是以使得所述膜蛋白功能被递送或靶向所述受试者的量和/或时间施用，任选地其中所述受试者患有癌症、发炎性病症、自身免疫性疾病、慢性疾病、发炎、器官功能受损、感染性疾病、退行性病症、遗传病或损伤。
115.一种向人类受试者施用融合剂脂质体组合物的方法，其包括：
a)在允许将第一融合剂安置于所述受试者的一个或多个靶细胞中的条件下向所述受试者施用第一融合剂，其中以下中的一个或多个：
i)施用所述第一融合剂包括在允许所述第一融合剂在一个或多个靶细胞中表达的条件下施用编码所述第一融合剂的核酸，或
ii)第一融合剂不包括卷曲螺旋基序，以及
b)向所述人类受试者施用包括多个融合剂脂质体的融合剂脂质体组合物，所述多个融合剂脂质体包括第二融合剂，其中所述第二融合剂与所述第一融合剂相容，其中所述多个融合剂脂质体还包括膜蛋白有效负载剂；
由此向所述受试者施用融合剂脂质体组合物。
116.一种向受试者递送膜蛋白有效负载剂的方法，其包括：
a)在允许将第一融合剂安置于所述受试者的一个或多个靶细胞中的条件下向所述受试者施用第一融合剂，其中以下中的一个或多个：
i)施用所述第一融合剂包括在允许所述第一融合剂在一个或多个靶细胞中表达的条件下施用编码所述第一融合剂的核酸，或
ii)第一融合剂不包括卷曲螺旋基序，以及
b)向所述人类受试者施用包括多个融合剂脂质体的融合剂脂质体组合物，所述多个融合剂脂质体包括第二融合剂和治疗剂，其中所述第二融合剂与所述第一融合剂相容，其中所述多个融合剂脂质体还包括膜蛋白有效负载剂；
由此向所述受试者递送膜蛋白有效负载剂。
117.一种调控(例如增强)受试者的生物功能的方法，其包括：
a)在允许将第一融合剂安置于所述受试者的一个或多个靶细胞中的条件下向所述受试者施用第一融合剂，其中以下中的一个或多个：
i)施用所述第一融合剂包括在允许所述第一融合剂在一个或多个靶细胞中表达的条件下施用编码所述第一融合剂的核酸，或
ii)第一融合剂不包括卷曲螺旋基序，以及
b)向所述人类受试者施用包括多个融合剂脂质体的融合剂脂质体组合物，所述多个融合剂脂质体包括第二融合剂，其中所述第二融合剂与所述第一融合剂相容，其中所述多个融合剂脂质体还包括膜蛋白有效负载剂；
由此调控所述受试者的生物功能。
118.根据实施例117所述的方法，其中所述生物功能是选自：
a)调控，例如增加或减少两个细胞之间的相互作用；
b)调控，例如增加或减少免疫应答；
c)调控，例如增加或减少细胞向靶组织的募集；
d)降低癌症的生长速率；或
e)减少受试者中的癌细胞的数目。
119.根据实施例115到118中任一项所述的方法，其中所述膜蛋白有效负载剂相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的。
120.根据实施例115到119中任一项所述的方法，其中所述膜蛋白有效负载剂包括或编码以下中的一个或多个：
i)嵌合抗原受体；
ii)整合素膜蛋白有效负载，例如选自表7；
iii)选自表8的离子通道蛋白；
iv)成孔蛋白，例如选自表9和10；
v)Toll样受体，例如选自表11；
vi)白细胞介素受体有效负载，例如选自表12；
vii)选自表13-14的细胞粘附蛋白；
viii)选自表17的转运蛋白；
ix)相对于天然存在的膜蛋白为异源的信号序列；或
x)表6中所列的信号序列。
121.根据实施例115到120中任一项所述的方法，其中所述膜蛋白有效负载剂不是、不包括、不编码或不与编码以下的序列互补：连接蛋白、CFTR、促甲状腺素受体、髓鞘蛋白零、黑皮质素4、髓鞘蛋白脂质蛋白、低密度脂蛋白受体、ABC转运蛋白、CD81、mCAT-1、CXCR4、CD4、CCR5、富含唾液酸的蛋白质、闭合蛋白(claudin)、CD21、T细胞受体、B细胞受体、TNFR1、CD63、GLUT4、VEGF或ICAM。
122.根据实施例115到121中任一项所述的方法，其中所述膜蛋白有效负载剂包括或编码不结合靶细胞的细胞表面标记或靶细胞部分并且不包括荧光蛋白的嵌合蛋白。
123.根据实施例115到122中任一项所述的方法，其中所述膜蛋白有效负载剂：
a)包括治疗蛋白，例如本文所描述的治疗蛋白；
b)包括高尔基体蛋白、分泌性蛋白或内质网蛋白，或其组合；
c)不包括以下中的一个或多个：二聚体(例如对所述源细胞为外源性的二聚体)、异二聚体(例如对所述源细胞为外源性的异二聚体)或二聚化域(例如对所述源细胞为外源性的多肽中的二聚化域)；
d)包括编码膜蛋白的核酸(例如DNA或RNA)。
124.根据实施例115到123中任一项所述的方法，其中所述膜蛋白有效负载剂包括或编码：
a)包括跨膜域的膜蛋白；
b)脂质锚定蛋白；
c)结合跨膜蛋白的蛋白质(例如结合跨膜蛋白的细胞外部分的细胞外蛋白质或结合跨膜蛋白的细胞内部分的细胞内蛋白质)；
d)缺乏跨膜域的蛋白质；
e)部分跨越膜(例如，靶细胞或融合剂脂质体的膜)并且并不完全跨越膜的蛋白质(例如，包括平面内膜螺旋线的蛋白质，或包括并不完全跨越膜的疏水性环的蛋白质)；或
f)不包括跨膜域的蛋白质，其中所述蛋白质例如通过静电或离子相互作用与膜表面相互作用；
125.根据实施例115到124中任一项所述的方法，其中所述第一融合剂不是脂肽。
126.根据实施例109到125中任一项所述的方法，其还包括以下的步骤：
监测以下中的一个或多个：癌症进展、肿瘤消退、肿瘤体积、赘生性细胞数目的减少、融合细胞的数量、包括膜蛋白有效负载剂的融合细胞的数量、表现核酸蛋白有效负载的融合细胞的数量和安置于融合细胞的膜中的膜蛋白的数量。
127.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述膜蛋白有效负载剂为或包括：
a)美国专利公开案第2016/0289674号的SEQ ID NO:8144-16131的序列；
b)美国专利公开案第2016/0289674号的SEQ ID NO:8144-16131的序列的片段、变体或同源物；
c)编码包括美国专利公开案第2016/0289674号的SEQ ID NO:8144-16131的序列的蛋白质的核酸；或
d)编码包括美国专利公开案第2016/0289674号的SEQ ID NO:8144-16131的序列的片段、变体或同源物的蛋白质的核酸。
128.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述膜蛋白有效负载剂为或包括：
a)选自表7-17的蛋白质；
b)选自表7-17的蛋白质的片段、变体或同源物；
c)编码蛋白质的核酸，所述蛋白质为或包括选自表7-17的蛋白质；或
d)编码包括选自表7-17的蛋白质的片段、变体或同源物的蛋白质的核酸。
129.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述膜蛋白有效负载剂为或包括嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包括抗原结合域。
130.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中由如本文所描述的膜蛋白有效负载剂提供或以如本文所描述的膜蛋白有效负载剂提供的所述膜蛋白为或包括免疫球蛋白部分或实体(例如，抗体、Fab、scFV、scFab、sdAb、duobody、微型抗体、纳米抗体、双链抗体、zybody、骆驼科抗体、BiTE、四源杂交瘤或bsDb)。
131.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中由如本文所描述的膜蛋白有效负载剂提供或以如本文所描述的膜蛋白有效负载剂提供的所述膜蛋白为或包括一种或多种细胞表面配体(例如，1、2、3、4、5、10、20、50或更多种细胞表面配体)，和/或其中由如本文所描述的膜蛋白有效负载剂提供或以如本文所描述的膜蛋白有效负载剂提供的所述膜蛋白例如向靶细胞呈现一种或多种细胞表面配体。
132.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中融合剂脂质体和/或其组合物或制剂包括(例如，能够递送到所述靶细胞)多种药剂(例如，至少2、3、4、5、10、20或50种药剂)，其中至少一种药剂为或包括膜蛋白有效负载；任选地，其中所述药剂中的一种或多种为或包括抑制性核酸(例如，siRNA或miRNA)和/或mRNA。
133.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂包括(例如，能够递送到所述靶细胞)膜蛋白有效负载剂，所述膜蛋白有效负载剂能够重新编程或转分化靶细胞，例如所述融合剂脂质体(和/或其组合物)包括一种或多种诱导靶细胞重新编程或转分化的药剂。
134.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中：
a)所述融合剂脂质体向靶细胞递送至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的融合剂脂质体所包括的膜蛋白有效负载剂(例如治疗剂，例如相对于所述源细胞为内源性的或外源性的治疗剂)。
b)与一个或多个靶细胞融合的所述融合剂脂质体向靶细胞递送平均至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的与一个或多个靶细胞融合的融合剂脂质体所包括的膜蛋白有效负载剂(例如治疗性膜蛋白有效负载剂，例如内源性治疗性膜蛋白有效负载剂或相对于所述源细胞为外源性的治疗性膜蛋白有效负载剂)；和/或
c)所述融合剂脂质体组合物向靶组织递送至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的融合剂脂质体组合物所包括的膜蛋白有效负载剂(例如膜蛋白有效负载剂药剂，例如相对于所述源细胞为外源性的治疗性膜蛋白有效负载剂)。
135.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂递送或能够递送(例如递送)膜蛋白有效负载剂(例如治疗剂)，所述膜蛋白有效负载剂特征在于受试者的半衰期比所述融合剂脂质体的半衰期长，例如长至少10％、20％、50％、2倍、5倍或10倍。
136.根据实施例306所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体向所述靶细胞递送治疗剂，任选地其中所述药剂在所述融合剂脂质体不再存在或可检测到之后存在。
137.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体包括治疗性膜蛋白有效负载剂，例如治疗性膜蛋白有效负载剂，例如相对于所述源细胞为外源性的或内源性的治疗性膜蛋白有效负载剂，任选地其中所述治疗性膜蛋白有效负载剂是选自以下中的一种或多种：蛋白质，例如跨膜蛋白、细胞表面蛋白、分泌性蛋白、受体、抗体；核酸，例如DNA、染色体(例如人类人工染色体)、RNA或mRNA。
递送到细胞核
138.一种融合剂脂质体，其包括：
(a)包括来源于源细胞的多种脂质的脂质双层；
(b)被所述脂质双层包围的内腔(例如包括胞质溶胶)；
(c)相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的融合剂，其中将所述融合剂安置于所述脂质双层中；以及
(d)核有效负载剂，例如核蛋白有效负载剂(例如，其相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的)，其中：
i)当靶细胞与多个融合剂脂质体接触时，所述核蛋白有效负载剂或其中所编码的蛋白质以比所述靶细胞的细胞质中的所述核蛋白有效负载剂的水平高至少10％、20％、50％、100％、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍的水平存在于所述靶细胞的所述细胞核中，例如根据实例117-122中的任一个的分析；
ii)当靶细胞的群体与多个融合剂脂质体接触时，所述核蛋白有效负载剂或其中所编码的蛋白质变得富集(例如，以高于所述靶细胞的细胞质中核蛋白有效负载剂水平的至少50％的水平存在于所述靶细胞的细胞核中)于靶细胞的群体中的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的细胞的细胞核中，例如如实例117-122中的任一个的分析中所测量；
iii)当靶细胞的群体与多个融合剂脂质体接触时，所述核蛋白有效负载剂或其中所编码的蛋白质变得存在于靶细胞群体的亚群(“融合群体”)中，其中所述核蛋白有效负载剂或其中所编码的蛋白质变得富集于融合群体中的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的细胞的细胞核(例如，以高于所述靶细胞的胞质溶胶中的核蛋白有效负载剂水平的至少50％的水平存在于所述靶细胞的细胞核中)中，例如如实例117-122中的任一个的分析中所测量
iv)当靶细胞的群体与多个融合剂脂质体接触时，所述核蛋白有效负载剂或其中所编码的蛋白质变得存在于靶细胞群体的亚群(“接受者细胞群体”)中，其中所述核蛋白有效负载剂或其中所编码的蛋白质变得富集于所述接受者细胞群体的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的细胞的细胞核(例如，以高于所述靶细胞的细胞质中的核蛋白有效负载剂水平的至少50％的水平存在于所述靶细胞的细胞核中)中，例如如实例117-122中的任一个的分析中所测量；
v)至少1、2、5、10、20、50、100、200、500或1,000个拷贝的核蛋白有效负载剂或由核酸核蛋白有效负载剂编码的蛋白质存在于靶细胞中的细胞核中，例如如实例117或118的分析中所测量；
vi)所述核蛋白有效负载剂包括或编码以下中的一种或多种：转录活化子、转录阻遏子、表观遗传修饰剂、组蛋白乙酰基转移酶、组蛋白脱乙酰基酶、组蛋白甲基转移酶、DNA甲基转移酶、DNA切口酶、位点特异性DNA编辑酶，例如脱氨酶、DNA转座酶、DNA整合酶、RNA编辑剂、RNA剪接因子、PIWI蛋白；
vii)所述核蛋白有效负载剂包括或编码以下中的一种或多种：碱性螺旋-环螺旋基序、亮氨酸拉链基序、螺旋-转角-螺旋基序、同源域基序、翼状螺旋基序、翼状螺旋-转角基序、HMG-框域、Wor3域、OB折叠域、锌指基序、TAL效应子或B3域；
viii)所述核蛋白有效负载剂包括复合物，所述复合物包括同型二聚体、异二聚体、同型三聚体、异三聚体、同型四聚体或异四聚体；
ix)所述核蛋白有效负载剂包括或编码异源核定位信号，并且其中所述核蛋白有效负载剂不包括位点特异性核酸酶，如Cre；
x)所述核蛋白有效负载剂包括或编码表6-1中列出的核定位信号，任选地其中NLS包括SEQ ID NO:128-507和605-626中的任一个中所示的氨基酸序列；或
xi)所述核蛋白有效负载剂包括或编码蛋白质，所述蛋白质优先富集于核质、核仁、核仁外周区域、卡哈尔体(Cajal body)、碎晶体(clastosome)、宝石核体、组蛋白基因座体(HLB)、核小点、核应力体、旁斑、PML体、多梳体；或
xii)所述核蛋白有效负载剂包括或编码蛋白质，所述蛋白质包括结合存在(至少部分)于靶细胞的细胞质中的内源性蛋白质的第一域和促进核导入的第二域，例如NLS。
139.根据实施例138所述的融合剂脂质体，其中在内吞囊泡中的有效负载在靶细胞的细胞质中。
140.一种融合剂脂质体，其包括：
(a)包括来源于源细胞的多种脂质的脂质双层；
(b)被所述脂质双层包围的内腔(例如包括胞质溶胶)；
(c)相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的融合剂，其中将所述融合剂安置于所述脂质双层中；以及
(d)核有效负载剂，例如核蛋白有效负载剂(例如，其相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的)，其中：
i)所述融合剂脂质体包括细胞生物物质或由其构成；
ii)所述融合剂以至少1,000个拷贝的拷贝数存在，例如如通过实例29的分析所测量；
iii)所述融合剂脂质体以至少1,000个拷贝的拷贝数包括治疗剂，例如如通过实例43的分析所测量；
iv)所述融合剂脂质体包括脂质，其中CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM和TAG中的一个或多个在所述源细胞中的对应脂质水平的75％内；
v)所述融合剂脂质体包括与所述源细胞类似的蛋白质组学组成，例如使用实例42的分析；
vi)所述融合剂脂质体能够进行信号转导，例如传输细胞外信号，例如回应于胰岛素的AKT磷酸化，或回应于胰岛素的葡萄糖(例如经标记的葡萄糖，例如2-NBDG)摄取，例如比阴性对照(例如不存在胰岛素的以其它方式类似的融合剂脂质体)多至少10％，例如使用实例63的分析；
vii)所述融合剂脂质体在向例如小鼠的受试者施用时靶向组织，例如肝脏、肺、心脏、脾脏、胰腺、胃肠道、肾脏、睾丸、卵巢、脑、生殖器官、中枢神经系统、周围神经系统、骨骼肌、内皮、内耳或眼睛，例如其中在24小时之后，施用融合剂脂质体的群体中的至少0.1％或10％的融合剂脂质体存在于靶组织中，例如根据实例87或100的分析；或
viii)所述源细胞是选自嗜中性粒细胞、粒细胞、间质干细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、胚胎干细胞、成髓细胞、成肌细胞、肝细胞或神经元，例如视网膜神经元细胞。
141.一种融合剂脂质体，其包括：
(a)包括来源于源细胞的多种脂质的脂质双层；
(b)被所述脂质双层包围的内腔(例如包括胞质溶胶)；
(c)相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的融合剂，其中将所述融合剂安置于所述脂质双层中；以及
(d)核有效负载剂，其包括(i)核酸和(ii)促进核酸的核导入的蛋白质。
142.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核蛋白有效负载剂(例如，其相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的)包括或编码以下中的一种或多种：
i)转录活化子，例如表17-1的转录活化子；
ii)转录阻遏子，例如表17-1的转录阻遏子；
iii)表观遗传修饰剂，例如表17-1的表观遗传修饰剂；
iv)组蛋白乙酰基转移酶，例如表17-1的组蛋白乙酰基转移酶；
v)组蛋白脱乙酰基酶，例如表17-1的组蛋白脱乙酰基酶；
vi)组蛋白甲基转移酶，例如表17-1的组蛋白甲基转移酶；
vii)DNA甲基转移酶，例如表17-1的DNA甲基转移酶；
viii)DNA切口酶，例如如本文所描述的DNA切口酶；
ix)位点特异性DNA编辑酶，例如，例如表17-1的脱氨酶；
x)DNA转座酶，例如如本文所描述的DNA转座酶；
xi)DNA整合酶，例如如本文所描述的DNA整合酶；
xii)RNA编辑剂，例如表17-1的RNA编辑剂；
xiii)RNA剪接因子，例如表17-1的RNA剪接因子；或
xiv)PIWI蛋白，例如如本文所描述的PIWI蛋白；
143.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核蛋白有效负载剂包括或编码具有与蛋白质的天然存在的对应物中的NLS相同的NLS的蛋白质。
144.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核蛋白有效负载剂包括或编码具有NLS的蛋白质，所述蛋白质的天然存在的对应物不包括所述NLS。
145.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核蛋白有效负载剂包括或编码：转录因子、核酸酶、重组酶、表观遗传因子、转录后RNA修饰因子(例如，mRNA剪接因子)、非编码RNA(例如，snRNA或snoRNA)或核糖核酸蛋白(例如，snRNP或snoRNP)、结构蛋白(例如，核纤层蛋白或细胞骨架蛋白)。
146.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核蛋白有效负载剂包括或编码抗体分子，例如Fab、scFv、scFab、sdAb、duobody、微型抗体、纳米抗体、双链抗体、zybody、骆驼科抗体、BiTE、四源杂交瘤或bsDb。
147.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核蛋白有效负载剂包括或编码融合蛋白，所述融合蛋白包括效应子域和定位域。
148.根据实施例147所述的融合剂脂质体，其中所述定位域包括TAL域、锌指域、Cas9域或大范围核酸酶域。
149.根据实施例147或148所述的融合剂脂质体，其中所述效应子域包括核酸酶、重组酶、整合酶、碱基编辑剂(脱氨酶)、转录因子或表观遗传修饰剂。
150.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核蛋白有效负载剂包括或编码基因编辑蛋白或核酸，例如，Cas9或向导RNA。
151.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核有效负载剂包括功能性RNA。
152.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核有效负载剂包括核蛋白有效负载剂，例如蛋白质或编码蛋白质的mRNA。
153.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核有效负载剂包括(i)核酸，和(ii)促进所述核酸的核导入的蛋白质。
154.根据实施例153所述的融合剂脂质体，其中所述核酸包括结合位点，并且促进核导入的所述蛋白质与所述结合位点结合。
155.根据实施例154所述的融合剂脂质体，其中所述结合位点包括TetR结合位点并且所述蛋白质包括TetR。
156.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核有效负载剂包括合成转录因子，所述合成转录因子为包括以下的融合蛋白：(i)DNA结合域，例如特定的DNA结合域，例如TAL域、ZF域或Cas9域和(ii)转录活化子域或转录阻遏子域。
157.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核有效负载剂包括合成表观遗传修饰剂，例如包括以下的融合蛋白：(i)DNA结合域和(ii)表观遗传修饰剂域。
158.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，所述核蛋白有效负载剂为或包括选自表17-1的蛋白质。
159.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核蛋白有效负载剂为或包括选自表17-1的蛋白质的片段、变体或同源物。
160.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核蛋白有效负载剂为或包括编码蛋白质的核酸，所述蛋白质为或包括选自表17-1的蛋白质。
161.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核蛋白有效负载剂为或包括编码蛋白质的核酸，所述蛋白质包括选自表17-1的蛋白质的片段、变体或同源物。
细胞器递送
162.一种融合剂脂质体，其包括：
(a)包括来源于源细胞的多种脂质的脂质双层；
(b)被所述脂质双层包围的内腔；
(c)相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的融合剂，其中将所述融合剂安置于所述脂质双层中；以及
(d)细胞器有效负载剂，例如细胞器蛋白有效负载剂(例如，其相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的)，其中当靶细胞与多个融合剂脂质体接触时，所述细胞器蛋白有效负载剂或其中所编码的多肽以高于细胞质或靶细胞质膜中的细胞器蛋白有效负载剂水平的至少10％、20％、50％、100％、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍的水平富集于所述靶细胞的线粒体中。
163.一种融合剂脂质体，其包括：
(a)包括来源于源细胞的多种脂质的脂质双层；
(b)被所述脂质双层包围的内腔；
(c)相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的融合剂，其中将所述融合剂安置于所述脂质双层中；以及
(d)包括或编码到细胞器蛋白有效负载剂(例如，表6或6-1的信号序列)的异源信号序列的细胞器蛋白有效负载剂，所述异源信号序列足以将细胞器蛋白有效负载剂或其中所编码的多肽富集于所述靶细胞的细胞质细胞器中，任选地其中所述异源信号序列在SEQID NO:39-127和605-626中的任一个中示出。
164.一种融合剂脂质体，其包括：
(a)包括来源于源细胞的多种脂质的脂质双层；
(b)被所述脂质双层包围的内腔，其中所述内腔不包括细胞器；
(c)相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的融合剂，其中将所述融合剂安置于所述脂质双层中；以及
(d)细胞器蛋白有效负载剂(例如，其相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的)，其中当靶细胞与多个融合剂脂质体接触时，所述细胞器蛋白有效负载剂或其中所编码的多肽变得相对于所述靶细胞的细胞质基质或质膜富集于以下所述靶细胞中的一个或多个中：高尔基体、内质网、液泡、顶体、自噬体、中心粒、糖酵解酶体(glycosome)、乙醛酸循环体(glyoxysome)、氢化酶体(hydrogenosome)、黑素体、纺锤剩体(mitosome)、刺丝囊(cnidocyst)、过氧化物酶体(peroxisome)、蛋白酶体、囊泡或应激颗粒。
165.一种融合剂脂质体，其包括：
(a)包括来源于源细胞的多种脂质的脂质双层；
(b)被所述脂质双层包围的内腔，其中所述内腔不包括细胞器；
(c)相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的融合剂，其中将所述融合剂安置于所述脂质双层中；以及
(d)包括编码多肽的核酸的细胞器蛋白有效负载剂，其中当靶细胞与多个融合剂脂质体接触时，相对于靶细胞的胞质溶胶或质膜，所编码的多肽变得富集于溶酶体和/或内体中。
166.一种融合剂脂质体，其包括：
(a)包括来源于源细胞的多种脂质的脂质双层；
(b)被所述脂质双层包围的内腔；
(c)相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的融合剂，其中将所述融合剂安置于所述脂质双层中；以及
(d)外源性或过度表达的细胞器蛋白有效负载剂，其中所述细胞器有效负载剂包括或编码选自以下的多肽：线粒体膜蛋白、线粒体外膜蛋白、线粒体内膜蛋白、线粒体内边界膜蛋白、线粒体嵴膜蛋白、线粒体DNA蛋白、线粒体膜间间隙蛋白、线粒体基质蛋白、线粒体基质颗粒蛋白、线粒体嵴蛋白、线粒体核糖体蛋白、线粒体嵴内蛋白、线粒体周围间隙蛋白、过氧化物酶体膜蛋白、过氧化物酶体晶体核心蛋白、过氧化物酶体基质蛋白、过氧化体。
167.一种融合剂脂质体，其包括：
(a)包括来源于源细胞的多种脂质的脂质双层；
(b)被所述脂质双层包围的内腔；
(c)相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的融合剂，其中将所述融合剂安置于所述脂质双层中；以及
(d)外源性的或过度表达的细胞器蛋白有效负载剂，其中所述细胞器蛋白有效负载剂包括或编码选自以下的多肽：
i)代谢蛋白(例如电子传递链蛋白或ATP合酶)
ii)蛋白酶；
iii)伴随蛋白；
iv)蛋白质转运蛋白；
v)线粒体核糖体蛋白；
vi)线粒体转录蛋白；或
vii)线粒体复制蛋白。
168.一种融合剂脂质体，其包括：
(a)包括来源于源细胞的多种脂质的脂质双层；
(b)被所述脂质双层包围的内腔；
(c)相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的融合剂，其中将所述融合剂安置于所述脂质双层中；以及
(d)细胞器蛋白有效负载剂(例如，其相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的)，其包括或编码结合存在(至少部分)于靶细胞的胞质溶胶或细胞核中的内源性蛋白的第一域和促进导入靶细胞的细胞质细胞器中的第二域。
169.一种融合剂脂质体，其包括：
(a)包括来源于源细胞的多种脂质的脂质双层；
(b)被所述脂质双层包围的内腔；
(c)相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的融合剂，其中将所述融合剂安置于所述脂质双层中；以及
(d)包括以下的细胞器蛋白有效负载剂：(i)核酸，和(ii)促进核酸导入细胞质细胞器中的蛋白质。
170.一种融合剂脂质体，其包括：
(a)包括来源于源细胞的多种脂质的脂质双层；
(b)被所述脂质双层包围的内腔；
(c)相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的融合剂，其中将所述融合剂安置于所述脂质双层中；以及
(d)细胞器蛋白有效负载剂(例如，其相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的)，其中所述细胞器蛋白有效负载剂包括核酸(例如，DNA或RNA)，例如功能性RNA或编码蛋白质的核酸。
171.一种融合剂脂质体，其包括：
(a)包括来源于源细胞的多种脂质的脂质双层；
(b)被所述脂质双层包围的内腔(例如包括胞质溶胶)；
(c)相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的融合剂，其中将所述融合剂安置于所述脂质双层中；以及
(d)细胞器有效负载剂，例如细胞器蛋白有效负载剂(例如，其相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的)，其中：
ix)所述融合剂脂质体包括细胞生物物质或由其构成；
x)所述融合剂以至少1,000个拷贝的拷贝数存在，例如如通过实例29的分析所测量；
xi)所述融合剂脂质体以至少1,000个拷贝的拷贝数包括治疗剂，例如如通过实例43的分析所测量；
xii)所述融合剂脂质体包括脂质，其中CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM和TAG中的一个或多个在所述源细胞中的对应脂质水平的75％内；
xiii)所述融合剂脂质体包括与所述源细胞类似的蛋白质组学组成，例如使用实例42的分析；
xiv)所述融合剂脂质体能够进行信号转导，例如传输细胞外信号，例如回应于胰岛素的AKT磷酸化，或回应于胰岛素的葡萄糖(例如经标记的葡萄糖，例如2-NBDG)摄取，例如比阴性对照(例如不存在胰岛素的以其它方式类似的融合剂脂质体)多至少10％，例如使用实例63的分析；
xv)所述融合剂脂质体在向例如小鼠的受试者施用时靶向组织，例如肝脏、肺、心脏、脾脏、胰腺、胃肠道、肾脏、睾丸、卵巢、脑、生殖器官、中枢神经系统、周围神经系统、骨骼肌、内皮、内耳或眼睛，例如其中在24小时之后，施用融合剂脂质体的群体中的至少0.1％或10％的融合剂脂质体存在于靶组织中，例如根据实例87或100的分析；或
xvi)所述源细胞是选自嗜中性粒细胞、粒细胞、间质干细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、胚胎干细胞、成髓细胞、成肌细胞、肝细胞或神经元，例如视网膜神经元细胞。
172.一种融合剂脂质体，其包括：
(a)包括来源于源细胞的多种脂质的脂质双层；
(b)被所述脂质双层包围的内腔(例如包括胞质溶胶)；
(c)相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的融合剂，其中将所述融合剂安置于所述脂质双层中；以及
(d)细胞器有效负载剂，例如细胞器蛋白有效负载剂(例如，其相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的)，其中：
i)所述融合剂脂质体包括细胞生物物质或由其构成；
ii)所述融合剂脂质体包括去核细胞；
iii)所述融合剂脂质体包括灭活的细胞核；
iv)所述融合剂脂质体与靶细胞的融合速率高于与非靶细胞，例如高至少至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍，例如在实例54的分析中；
v)所述融合剂脂质体与靶细胞融合的速率高于与其它融合剂脂质体，例如高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍，例如在实例54的分析中；
vi)所述融合剂脂质体与靶细胞以使得在24、48或72小时之后所述融合剂脂质体中的药剂递送到至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的靶细胞的速率融合，例如在实例54的分析中；
vii)所述融合剂以至少或不超过10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数存在，例如如通过实例29的分析所测量；
viii)所述融合剂脂质体以至少或不超过10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数包括治疗剂，例如如通过实例43或156的分析所测量；
ix)融合剂的拷贝数与治疗剂的拷贝数的比在1,000,000:1与100,000:1、100,000:1与10,000:1、10,000:1与1,000:1、1,000:1与100:1、100:1与50:1、50:1与20:1、20:1与10:1、10:1与5:1、5:1与2:1、2:1与1:1、1:1与1:2、1:2与1:5、1:5与1:10、1:10与1:20、1:20与1:50、1:50与1:100、1:100与1:1,000、1:1,000与1:10,000、1:10,000与1:100,000或1:100,000与1:1,000,000之间；
x)所述融合剂脂质体包括与所述源细胞基本上类似的脂质组成，或其中CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM和TAG中的一个或多个在源细胞中的对应脂质水平的10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％内；
xi)所述融合剂脂质体包括与所述源细胞类似的蛋白质组学组成，例如使用实例42或155的分析；
xii)所述融合剂脂质体包括的脂质:蛋白质的比在所述源细胞中的对应比的10％、20％、30％、40％或50％内，例如如使用实例49的分析所测量；
xiii)所述融合剂脂质体包括的蛋白质:核酸(例如DNA)的比在所述源细胞中的对应比的10％、20％、30％、40％或50％内，例如如使用实例50的分析所测量；
xiv)所述融合剂脂质体包括的脂质:核酸(例如DNA)的比在所述源细胞中的对应比的10％、20％、30％、40％或50％内，例如如使用实例51或159的分析所测量；
xv)所述融合剂脂质体在受试者，例如小鼠中具有的半衰期在参考细胞，例如源细胞的半衰期的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％内，例如根据实例75的分析；
xvi)所述融合剂脂质体跨膜转运葡萄糖(例如经标记的葡萄糖，例如2-NBDG)，例如比阴性对照(例如不存在葡萄糖的以其它方式类似的融合剂脂质体)多至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％(例如多约11.6％)，例如如使用实例64的分析所测量；
xvii)所述融合剂脂质体在内腔中包括的酯酶活性在参考细胞(例如源细胞或小鼠胚胎成纤维细胞)中的酯酶活性的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内，例如使用实例66的分析；
xviii)所述融合剂脂质体包括的代谢活性水平在参考细胞(例如源细胞)中的柠檬酸合酶活性的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内，例如如实例68中所描述；
xix)所述融合剂脂质体包括的呼吸水平(例如耗氧速率)在参考细胞(例如源细胞)中的呼吸水平的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内，例如如实例69中所描述；
xx)所述融合剂脂质体包括至多18,000、17,000、16,000、15,000、14,000、13,000、12,000、11,000或10,000MFI的膜联蛋白-V染色水平，例如使用实例70的分析，或其中相比于实例70的分析中的用甲萘醌处理的以其它方式类似的融合剂脂质体的膜联蛋白-V染色水平，所述融合剂脂质体包括低至少5％、10％、20％、30％、40％或50％的膜联蛋白-V染色水平，或其中相比于实例70的分析中的用甲萘醌处理的巨噬细胞的膜联蛋白-V染色水平，所述融合剂脂质体包括低至少5％、10％、20％、30％、40％或50％的膜联蛋白-V染色水平，
xxi)所述融合剂脂质体的miRNA含量水平比所述源细胞的miRNA含量水平大至少至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，例如根据实例39的分析；
xxii)所述融合剂脂质体的可溶:不可溶蛋白质的比在所述源细胞的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大内，例如在所述源细胞的1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％内，例如根据实例47的分析；
xxiii)所述融合剂脂质体的LPS水平为源细胞的LPS含量的小于5％、1％、0.5％、0.01％、0.005％、0.0001％、0.00001％或更小，例如如通过质谱分析所测量，例如在实例48的分析中；
xxiv)所述融合剂脂质体能够进行信号转导，例如传输细胞外信号，例如回应胰岛素的AKT磷酸化，或回应于胰岛素而摄取葡萄糖(例如经标记的葡萄糖，例如2-NBDG)，例如比阴性对照(例如不存在胰岛素的以其它方式类似的融合剂脂质体)多至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，例如使用实例63的分析；
xxv)所述融合剂脂质体在向例如小鼠的受试者施用时靶向组织，例如肝脏、肺、心脏、脾脏、胰腺、胃肠道、肾脏、睾丸、卵巢、脑、生殖器官、中枢神经系统、周围神经系统、骨骼肌、内皮、内耳或眼睛，例如其中在24、48或72小时之后，在施用融合剂脂质体的群体中，至少0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的融合剂脂质体存在于靶组织中，例如根据实例87或100的分析；
xxvi)所述融合剂脂质体的近分泌信号传导水平比由参考细胞(例如源细胞或骨髓基质细胞(BMSC))诱导的近分泌信号传导水平大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如根据实例71的分析；
xxvii)所述融合剂脂质体的旁分泌信号传导水平比由参考细胞(例如源细胞或巨噬细胞)诱导的旁分泌信号传导水平大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，例如根据实例72的分析；
xxviii)相比于参考细胞(例如源细胞或C2C12细胞)中聚合肌动蛋白的水平，融合剂脂质体以在1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内的水平聚合肌动蛋白，例如根据实例73的分析；
xxix)所述融合剂脂质体的膜电位在参考细胞(例如源细胞或C2C12细胞)的膜电位的约1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％内，例如根据实例74的分析，或其中所述融合剂脂质体具有约-20mV到-150mV、-20mV到-50mV、-50mV到-100mV或-100mV到-150mV的膜电位；
xxx)所述融合剂脂质体能够从血管外渗，例如以源细胞或与源细胞相同类型的细胞的外渗率的至少1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的速率，例如使用实例57的分析，例如其中源细胞为嗜中性粒细胞、淋巴细胞、B细胞、巨噬细胞或NK细胞；
xxxi)所述融合剂脂质体能够穿过细胞膜，例如内皮细胞膜或血脑屏障；
xxxii)所述融合剂脂质体能够分泌蛋白质，例如以比参考细胞(例如小鼠胚胎成纤维细胞)大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的速率，例如使用实例62的分析；
xxxiii)所述融合剂脂质体符合药物或良好生产规范(GMP)标准；
xxxiv)所述融合剂脂质体是根据良好生产规范(GMP)制得；
xxxv)所述融合剂脂质体的病原体水平低于预定参考值，例如基本上不含病原体；
xxxvi)所述融合剂脂质体的污染物水平低于预定参考值，例如基本上不含污染物；
xxxvii)所述融合剂脂质体具有低免疫原性，例如如本文所描述；
xxxviii)所述源细胞是选自嗜中性粒细胞、粒细胞、间质干细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、胚胎干细胞、成髓细胞、成肌细胞、肝细胞或神经元，例如视网膜神经元细胞；或
xxxix)所述源细胞不是293细胞、HEK细胞、人类内皮细胞或人类上皮细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或干细胞。
173.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述细胞质细胞器是选自线粒体、高尔基体、溶酶体、内质网、液泡、内体、顶体、自噬体、中心粒、糖酵解酶体、乙醛酸循环体、氢化酶体、黑素体、纺锤剩体、刺丝囊、过氧化物酶体、蛋白酶体、囊泡和应激颗粒。
174.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述细胞质细胞器为膜结合细胞器。
10a.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述细胞器有效负载剂变得富集于以下中的一个或多个中：线粒体基质、线粒体膜间间隙、线粒体外膜、线粒体内膜或线粒体脊。
175.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述细胞器蛋白有效负载剂或其中所编码的多肽包括表17-2的蛋白质。
176.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中当靶细胞的群体与多个融合剂脂质体接触时，其中所述细胞器蛋白有效负载剂或其中所编码的多肽变得富集于靶细胞群体中的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的细胞的细胞质细胞器中(例如，以高于靶细胞的胞质溶胶中的细胞器蛋白有效负载剂水平的至少50％的水平存在于靶细胞的细胞质细胞器中)，例如如实例123或124的分析中所测量。
177.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中当靶细胞群体与多个融合剂脂质体接触时，所述细胞器蛋白有效负载剂或其中所编码的多肽变得存在于靶细胞群体的亚群(“融合群体”)中，其中所述细胞器有效负载剂或其中所编码的蛋白质变得富集于融合群体中的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的细胞的细胞质细胞器中(例如，以高于靶细胞的胞质溶胶中的细胞器蛋白有效负载剂或其中所编码的多肽水平的至少50％的水平存在于靶细胞的细胞质中)，例如如实例123或124的分析中所测量。
178.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中至少1、2、5、10、20、50、100、200、500或1,000个拷贝的细胞器蛋白有效负载剂或其中所编码的多肽存在于与多个融合剂脂质体接触的靶细胞中的细胞质细胞器中。
179.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述细胞器蛋白有效负载剂包括或编码以下中的一种或多种：碱性螺旋-环螺旋基序、亮氨酸拉链基序、螺旋-转角-螺旋基序、同源域基序、翼状螺旋基序、翼状螺旋-转角基序、HMG-框域、Wor3域、OB折叠域、锌指基序、TAL效应子或B3域。
180.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述细胞器蛋白有效负载剂包括或编码蛋白质复合物，所述蛋白质复合物包括同型二聚体、异二聚体、同型三聚体、异三聚体、同型四聚体或异四聚体。
181.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述细胞器蛋白有效负载剂包括或编码具有信号序列的蛋白质，所述信号序列与蛋白质的天然存在的对应物中的信号序列相同。
182.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述细胞器蛋白有效负载剂包括或编码具有信号序列的蛋白质，所述蛋白质的天然存在的对应物不包括所述信号序列。
183.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述细胞器蛋白有效负载剂包括或编码抗体分子，例如Fab、scFv、scFab、sdAb、duobody、微型抗体、纳米抗体、双链抗体、zybody、骆驼科抗体、BiTE、四源杂交瘤或bsDb。
184.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述细胞器有效负载剂包括功能性RNA。
185.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述细胞器有效负载剂包括细胞器蛋白有效负载剂，例如蛋白质或编码蛋白质的mRNA。
186.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述细胞器有效负载剂不包括或编码报告蛋白或荧光蛋白，例如GFP。
187.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述内腔不包括细胞器。
188.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述细胞器蛋白有效负载剂或其中所编码的蛋白质不是细胞膜蛋白或分泌性蛋白。
189.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体组合物中的病毒衣壳蛋白的量小于总蛋白的1％。
190.一种融合剂脂质体，其包括软骨体和融合剂。
191.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其具有部分或完全核灭活(例如核去除)。
192.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述源细胞为在粘附或悬浮条件下生长的细胞。
193.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述源细胞为原代细胞、经培养的细胞、永生化细胞或细胞系(例如原始粒细胞系，例如C2C12)。
194.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述源细胞为内皮细胞、成纤维细胞、血细胞(例如巨噬细胞、嗜中性粒细胞、粒细胞、白细胞)、干细胞(例如间质干细胞、脐带干细胞、骨髓干细胞、造血干细胞、诱导多能干细胞，例如衍生自受试者的细胞的诱导多能干细胞)、胚胎干细胞(例如来自胚胎卵黄囊、胎盘、脐带、胎儿皮肤、青少年皮肤、血液、骨髓、脂肪组织、红细胞生成组织、造血组织的干细胞)、成肌细胞、实质细胞(例如肝细胞)、肺泡细胞、神经元(例如视网膜神经元细胞)、前体细胞(例如视网膜前体细胞、成髓细胞、骨髓前体细胞、胸腺细胞、性母细胞、成巨核细胞、幼巨核细胞、成黑素细胞、成淋巴细胞、骨髓前体细胞、正成红细胞或成血管细胞)、祖细胞(例如心肌祖细胞、卫星细胞、放射状胶质细胞、骨髓基质细胞、胰腺祖细胞、内皮祖细胞、胚细胞)或永生化细胞(例如HeLa、HEK293、HFF-1、MRC-5、WI-38、IMR 90、IMR 91、PER.C6、HT-1080或BJ细胞)。
195.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述源细胞为同种异体的，例如从与所述靶细胞相同的物种的不同生物体获得。
196.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述源细胞为自体的，例如从与所述靶细胞相同的生物体获得。
197.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述源细胞为异源的，例如从与所述靶细胞不同的物种的生物体获得。
198.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述源细胞是选自白细胞或干细胞。
199.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述源细胞是选自嗜中性粒细胞、淋巴细胞(例如T细胞、B细胞、自然杀伤细胞)、巨噬细胞、粒细胞、间质干细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、胚胎干细胞或成髓细胞。
200.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述源细胞不是293细胞、HEK细胞、人类内皮细胞或人类上皮细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或干细胞。
201.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中：
i)所述源细胞未被转化或永生化；或
ii)源细胞经转化，或使用除腺病毒介导的永生化以外的方法来永生化，例如通过自发突变或端粒酶表达来永生化。
202.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体是来自具有经修饰的基因组的源细胞，例如具有降低的免疫原性(例如，通过基因组编辑来去除MHC复合物)。
203.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述源细胞是来自用抗炎信号处理的细胞培养物。
204.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述源细胞为基本上非免疫原性的，例如使用本文所描述的分析。
205.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述源细胞是重组细胞。
206.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述源细胞包括还包括对所述源细胞为外源性的第二药剂，例如治疗剂，例如蛋白质或核酸(例如RNA，例如mRNA或miRNA)。
207.根据实施例206所述的融合剂脂质体，其中所述第二药剂以由所述融合剂脂质体构成的至少或不超过10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000或1,000,000个拷贝存在，或以每个融合剂脂质体至少或不超过10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000或1,000,000个拷贝的平均水平存在。
208.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中相比于源细胞，所述融合剂脂质体具有改变的(例如增加或降低的)一种或多种内源性分子水平，所述内源性分子例如蛋白质或核酸，例如由于处理源细胞所致，例如由于用siRNA或基因编辑酶处理哺乳动物源细胞所致。
209.根据实施例208所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体包括至少或不超过10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000或1,000,000个内源性分子的拷贝，或以每个融合剂脂质体至少或不超过10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000或1,000,000个内源性分子的拷贝的平均水平存在。
210.根据实施例208或实施例209所述的融合剂脂质体，其中所述内源性分子(例如RNA或蛋白质)是以比其在源细胞中的浓度大至少1、2、3、4、5、10、20、50、100、500、103、5.0×103、104、5.0×104、105、5.0×105、106、5.0×106、1.0×107、5.0×107或1.0×108的浓度存在。
211.根据实施例208或实施例209所述的融合剂脂质体，其中所述内源性分子(例如RNA或蛋白质)是以比其在源细胞中的浓度大至少1、2、3、4、5、10、20、50、100、500、103、5.0×103、104、5.0×104、105、5.0×105、106、5.0×106、1.0×107、5.0×107或1.0×108的浓度存在。
212.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体具有与所述源细胞的miRNA含量水平相比至少1％的miRNA含量水平，例如根据实例39的分析。
213.根据实施例206或207所述的融合剂脂质体，其中所述第二药剂(例如治疗剂)是选自蛋白质、蛋白质复合物(例如包括至少2、3、4、5、10、20或50种蛋白质，例如至少至少2、3、4、5、10、20或50种不同的蛋白质)多肽、核酸(例如，DNA、染色体或RNA，例如mRNA、siRNA或miRNA)或小分子。
214.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体包括与源细胞类似的蛋白质组学组成，例如使用实例42的分析。
215.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体的可溶:不可溶蛋白质的比在所述源细胞的90％内，例如根据实例47的分析。
216.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其具有源细胞的大小的小于约0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％的直径，例如如通过实例30的分析所测量。
217.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体具有比所述源细胞的直径小约0.01％或1％的直径，例如如通过实例30的分析所测量。
218.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其具有所述源细胞的体积的小于约0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％％的体积。
219.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂是蛋白质融合剂。
220.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂为哺乳动物融合剂或病毒融合剂。
221.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂并不促使从源细胞形成囊泡。
222.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂包括去核细胞。
223.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂：
i)不是病毒蛋白；
ii)所述融合剂不是融合糖蛋白；
iii)所述融合剂为除致育素-β以外的哺乳动物蛋白质；
iv)融合剂不是VSVG、SNARE蛋白或分泌性颗粒蛋白；或
v)所述融合剂不是TAT、TAT-HA2、HA-2、gp41、阿尔茨海默氏β-淀粉样肽(Alzheimer's beta-amyloid peptide)、仙台病毒蛋白或两亲性净阴性肽(WAE 11)。
224.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中：
i)所述融合剂以至少1,000个拷贝的拷贝数存在，例如如通过实例29的分析所测量；或
ii)所述融合剂的拷贝数与所述有效负载(例如，膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂)的拷贝数的比在1,000,000:1与100,000:1、100,000:1与10,000:1、10,000:1与1,000:1、1,000:1与100:1、100:1与50:1、50:1与20:1、20:1与10:1、10:1与5:1、5:1与2:1、2:1与1:1、1:1与1:2、1:2与1:5、1:5与1:10、1:10与1:20、1:20与1:50、1:50与1:100、1:100与1:1,000、1:1,000与1:10,000、1:10,000与1:100,000或1:100,000与1:1,000,000之间。
225.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中：
i)所述融合剂脂质体不是通过用治疗性或诊断性物质装载所述融合剂脂质体而制成；
ii)所述源细胞并不负载有治疗性或诊断性物质；
iii)所述融合剂脂质体不包括小红莓、地塞米松(dexamethasone)、环糊精、聚乙二醇、微RNA(例如miR125)、VEGF受体、ICAM-1、E-选择素、氧化铁、荧光蛋白(例如GFP或RFP)、纳米粒子或RNA酶，或不包括前述中对所述源细胞为外源性的任一种的形式；或
iv)所述融合剂脂质体还包括对所述源细胞呈外源性并且包括一种或多种翻译后修饰，例如糖基化的治疗剂。
226.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂为病毒融合剂，例如HA、HIV-1ENV、gp120或VSV-G，或其中所述融合剂为哺乳动物融合剂，例如SNARE、合胞素(Syncytin)、成肌蛋白、肌混合蛋白、肌合并蛋白或FGFRL1。
227.一种融合剂脂质体或根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂在4-5、5-6、6-7、7-8、8-9或9-10的pH下具有活性。
228.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂在4-5、5-6、6-7、7-8、8-9或9-10的pH下不具有活性。
229.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述为脂质融合剂，例如油酸、单油酸甘油酯、甘油酯、二酰甘油或经改性的不饱和脂肪酸。
230.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂为化学融合剂，例如PEG。
231.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂为小分子融合剂，例如氟烷、NSAID，诸如美洛昔康(meloxicam)、吡罗昔康(piroxicam)、替诺昔康(tenoxicam)和氯丙嗪(chlorpromazine)。
232.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂为重组的。
233.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂以生物化学方式并入，例如所述融合剂以纯化的蛋白质提供并且在允许所述融合剂与脂质双层缔合的条件下与融合剂脂质体脂质双层接触，或以生物合成方式并入，例如在允许所述融合剂与所述融合剂脂质体脂质双层缔合的条件下在源细胞中表达。
234.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体具有以下特性中的一个或多个：
i)所述融合剂脂质体包括细胞生物物质或由其构成；
ii)所述融合剂脂质体包括去核细胞或由其构成；或
iii)所述融合剂脂质体包括灭活的细胞核。
234A.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体以至少1,000个拷贝的拷贝数包括有效负载(例如，膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂)，例如如通过实例43的分析所测量。
235.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体具有以下特性中的一个或多个：
i)所述融合剂脂质体包括脂质，其中CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM和TAG中的一个或多个在所述源细胞中的对应脂质水平的75％内；
ii)所述融合剂脂质体包括的脂质:蛋白质的比在所述源细胞中的对应比的10％、20％、30％、40％或50％内，例如如使用实例49的分析所测量；
iii)所述融合剂脂质体包括的蛋白质:核酸(例如DNA)的比在所述源细胞中的对应比的10％、20％、30％、40％或50％内，例如如使用实例50的分析所测量；或
iv)所述融合剂脂质体包括的脂质:核酸(例如DNA)的比在所述源细胞中的对应比的10％、20％、30％、40％或50％内，例如如使用实例51的分析所测量；
236.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中以下中的一或多个：
i)所述融合剂脂质体与靶细胞的融合速率高于与非靶细胞，例如高至少至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％(例如，10％)，例如在实例54的分析中；
ii)所述融合剂脂质体与靶细胞的融合速率高于与其它融合剂脂质体，例如高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(例如，50％)，例如在实例54的分析中；
iii)所述融合剂脂质体与靶细胞以使得在24、48或72小时之后所述融合剂脂质体中的药剂递送到至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(例如，10％)的靶细胞的速率融合，例如在实例54的分析中；
vi)所述融合剂脂质体将葡萄糖(例如，经标记的葡萄糖，例如2-NBDG)转运跨越膜，例如比阴性对照(例如不存在葡萄糖的以其它方式类似的融合剂脂质体)多至少10％，例如如使用实例64的分析所测量；
v)所述融合剂脂质体在内腔中包括的酯酶活性在参考细胞(例如源细胞或小鼠胚胎成纤维细胞)中的酯酶活性的90％内，例如使用实例66的分析；
vi)所述融合剂脂质体包括的代谢活性水平在参考细胞(例如源细胞)中的代谢活性(例如，柠檬酸合酶活性)的90％内，例如如实例68中所描述；
vii)所述融合剂脂质体包括的呼吸水平(例如，耗氧速率)在参考细胞(例如源细胞)中的呼吸水平的90％内，例如如实例69中所描述；
viii)所述融合剂脂质体包括至多18,000、17,000、16,000、15,000、14,000、13,000、12,000、11,000或10,000MFI的膜联蛋白-V染色水平，例如使用实例70的分析，或其中相比于实例70的分析中的用甲萘醌处理的以其它方式类似的融合剂脂质体的膜联蛋白-V染色水平，所述融合剂脂质体包括低至少5％、10％、20％、30％、40％或50％的膜联蛋白-V染色水平，或其中相比于实例70的分析中的用甲萘醌处理的巨噬细胞的膜联蛋白-V染色水平，所述融合剂脂质体包括低至少5％、10％、20％、30％、40％或50％的膜联蛋白-V染色水平；
ix)所述融合剂脂质体的LPS水平小于融合剂脂质体的脂质含量的5％，例如如通过实例48的分析所测量；
x)所述融合剂脂质体的近分泌信号传导水平比由参考细胞(例如源细胞或骨髓基质细胞(BMSC))诱导的近分泌信号传导水平大至少5％，例如根据实例71的分析；
xi)所述融合剂脂质体的旁分泌信号传导水平比由参考细胞(例如源细胞或巨噬细胞)诱导的旁分泌信号传导水平大至少5％，例如根据实例72的分析；
xii)相比于参考细胞(例如源细胞或C2C12细胞)中的聚合肌动蛋白的水平，所述融合剂脂质体以在5％内的水平聚合肌动蛋白，例如根据实例73的分析；或
xiii)所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂能够分泌蛋白质，例如以比参考细胞(例如小鼠胚胎成纤维细胞)大至少5％的速率，例如使用实例62的分析。
237.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中以下中的一或多个：
i)所述融合剂脂质体的膜电位在参考细胞(例如源细胞或C2C12细胞)的膜电位的约5％内，例如根据实例74的分析，或其中所述融合剂脂质体具有约-20mV到-150mV、-20mV到-50mV、-50mV到-100mV或-100mV到-150mV的膜电位；
ii)所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂能够从血管外渗，例如以与所述源细胞相同类型的细胞的外渗速率的至少1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的速率，例如使用实例57的分析，例如其中所述源细胞为嗜中性粒细胞、淋巴细胞、B细胞、巨噬细胞或NK细胞；
iii)所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂能够穿过细胞膜，例如内皮细胞膜或血脑屏障，例如以与所述源细胞相同类型的细胞的速率的至少1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的速率；
iv)所述融合剂脂质体符合药物或良好生产规范(GMP)标准；
v)所述融合剂脂质体是根据良好生产规范(GMP)制得；
vi)所述融合剂脂质体的病原体水平低于预定参考值，例如基本上不含病原体；
vii)所述融合剂脂质体的污染物水平低于预定参考值，例如基本上不含污染物；
viii)所述融合剂脂质体具有低免疫原性，例如如本文所描述。
238.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体为或包括软骨体。
239.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体在受试者中，例如在小鼠中具有半衰期，所述半衰期在参考细胞(例如源细胞)的半衰期的90％内，例如根据实例75的分析。
240.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中：
i)所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂的密度不在1.08g/mL与1.12g/mL之间；
ii)所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂的密度>1.12g/mL，例如1.25g/mL+/-0.1、1.25g/mL+/-0.05，例如如通过实例33的分析所测量；或
iii)所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂的密度为<1、1-1.1、1.05-1.15、1.1-1.2、1.15-1.25、1.2-1.3、1.25-1.35或>1.35g/mL，例如根据实例33的分析。
241.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中以下中的一或多个：
i)所述融合剂脂质体未被循环中的清除系统或肝窦中的库普弗细胞捕获；
ii)所述融合剂脂质体未被受试者的网状内皮系统(RES)捕获，例如根据实例76的分析；或
iii)当向受试者施用多个融合剂脂质体时，小于1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的所述多个融合剂脂质体在24小时之后未被RES捕获，例如根据实例76的分析。
242.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中：
i)所述融合剂脂质体符合药物或良好生产规范(GMP)标准；
ii)所述融合剂脂质体是根据良好生产规范(GMP)制得；
iii)所述融合剂脂质体的病原体水平低于预定参考值，例如基本上不含病原体；或
iv)所述融合剂脂质体的污染物水平低于预定参考值，例如基本上不含污染物。
243.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中：
i)所述融合剂脂质体的直径大于5μm、6μm、7μm、8μm、10μm、20μm、50μm、100μm、150μm或200μm。
ii)所述融合剂脂质体的直径不在40nm与150nm之间，例如大于150nm、200nm、300nm、400nm或500nm；
iii)所述融合剂脂质体的直径为至少80nm、100nm、200nm、500nm、1000nm、1200nm、1400nm或1500nm；
iv)所述融合剂脂质体的直径小于80nm、100nm、200nm、500nm、1000nm、1200nm、1400nm或1500nm；或
v)所述融合剂脂质体的直径为至少约10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、150nm或200nm，例如如通过实例32的分析所测量。
244.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体在其内腔中还包括选自以下的多肽：酶、抗体或抗病毒多肽。
245.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体不包括CD63或GLUT4。
246.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体：
i)不包括病毒、无感染性或不在宿主细胞中繁殖；
ii)不是病毒样粒子(virus like particle；VLP)；
iii)不包括病毒结构蛋白，例如病毒衣壳蛋白，例如病毒核衣壳蛋白，或其中病毒衣壳蛋白的量小于总蛋白的10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％，例如根据实例53的分析；
iv)不包括病毒基质蛋白；
v)不包括病毒非结构蛋白；
vi)包括小于10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、1,000,000,000个病毒结构蛋白的拷贝；或
vii)不是病毒体。
247.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体包括病毒结构蛋白和/或病毒基质蛋白。
248.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中：
i)所述融合剂脂质体上的所述融合剂的拷贝数与病毒结构蛋白的拷贝数的比为至少1,000,000:1、100,000:1、10,000:1、1,000:1、100:1、50:1 1、20:1、10:1、5:1或1:1；
ii)所述融合剂脂质体上的所述融合剂的拷贝数与病毒基质蛋白的拷贝数的比为至少1,000,000:1、100,000:1、10,000:1、1,000:1、100:1、50:1、20:1、10:1、5:1或1:1。
249.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体为单层或多层的。
250.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中：
i)所述融合剂脂质体不包括水不可混溶的液滴；
ii)所述融合剂脂质体包括水性内腔和亲水性外部；
251.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体基本上不含以下细胞器中的一种或多种：线粒体、高尔基体、溶酶体、内质网、液泡、内体、顶体、自噬体、中心粒、糖酵解酶体、乙醛酸循环体、氢化酶体、黑素体、纺锤剩体、刺丝囊、过氧化物酶体、蛋白酶体、囊泡和应激颗粒。
252.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中相比于所述源细胞，所述融合剂脂质体具有较低数目的细胞器，其中所述细胞器是选自：线粒体、高尔基体、溶酶体、内质网、液泡、内体、顶体、自噬体、中心粒、糖酵解酶体、乙醛酸循环体、氢化酶体、黑素体、纺锤剩体、刺丝囊、过氧化物酶体、蛋白酶体、囊泡和应激颗粒。
253.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中：
i)所述融合剂脂质体不是外泌体；
ii)所述融合剂脂质体为微囊泡；
iii)所述融合剂脂质体包括非哺乳动物融合剂；
iv)所述融合剂脂质体已经工程改造以并入融合剂；
v)所述融合剂脂质体包括对所述源细胞为外源性的融合剂；
vi)所述融合剂脂质体包括一个或多个细胞器，例如线粒体、高尔基体、溶酶体、内质网、液泡、内体、顶体、自噬体、中心粒、糖酵解酶体、乙醛酸循环体、氢化酶体、黑素体、纺锤剩体、刺丝囊、过氧化物酶体、蛋白酶体、囊泡、应激颗粒或其组合；
vii)所述融合剂脂质体包括细胞骨架或其组分，例如肌动蛋白、Arp2/3、形成蛋白、冠蛋白、肌缩蛋白、角蛋白、肌球蛋白或微管蛋白；
viii)所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂不具有1.08-1.22g/ml的浮动密度或具有至少1.18-1.25g/ml或1.05-1.12g/ml的密度，例如在蔗糖梯度离心分析中，例如如Théry等人,“外泌体从细胞培养上清液和生物学流体的分离和表征(Isolation andcharacterization of exosomes from cell culture supernatants and biologicalfluids.)”《细胞生物学实验指南(Curr Protoc Cell Biol.)》2006年4月；第3章：第3.22节中所描述；
ix)相比于所述源细胞，所述融合剂脂质体脂质双层富含神经酰胺或鞘磷脂或其组合，或相比于所述源细胞，所述融合剂脂质体脂质双层不富含(例如耗尽)糖脂、游离脂肪酸或磷脂酰丝氨酸或其组合；
x)所述融合剂脂质体包括磷脂酰丝氨酸(PS)或CD40配体或PS和CD40配体两者，例如当在实例52的分析中测量时；
xi)相比于所述源细胞，所述融合剂脂质体富含PS，例如在多个融合剂脂质体中至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％对PS为阳性的；
xii)所述融合剂脂质体基本上不含乙酰胆碱酯酶(AChE)，或含有小于0.001、0.002、0.005、0.01,0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500或1000个AChE活性单元/μg蛋白质，例如根据实例67的分析；
xiii)所述融合剂脂质体基本上不含四跨膜蛋白家族蛋白(例如CD63、CD9或CD81)、ESCRT相关蛋白(例如TSG101、CHMP4A-B或VPS4B)、Alix、TSG101、MHCI、MHCII、GP96、辅肌动蛋白-4、线粒体内膜蛋白(mitofilin)、同线蛋白-1(syntenin-1)、TSG101、ADAM10、EHD4、同线蛋白-1、TSG101、EHD1、脂阀结构蛋白-1(flotillin-1)、热休克70kDa蛋白(HSC70/HSP73、HSP70/HSP72)或其任何组合，或含有小于0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、5％或10％的任何个别外泌体标记蛋白和/或小于0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％或25％的任何所述蛋白的总外泌体标记蛋白，或相比于所述源细胞脱富集这些蛋白质中的任一种或多种，或不富含这些蛋白质中的任一种或多种，例如根据实例44的分析；
xiv)所述融合剂脂质体包括水平低于500、250、100、50、20、10、5或1ng GAPDH/ug总蛋白或低于源细胞中的GAPDH水平的甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，例如比源细胞中以ng/μg为单位的GAPDH/总蛋白水平低了小于1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如使用实例45的分析；
xv)所述融合剂脂质体富含一种或多种内质网蛋白(例如钙连蛋白)、一种或多种蛋白酶体蛋白或一种或多种线粒体蛋白，或其任何组合，例如其中钙连蛋白的量大于500、250、100、50、20、10、5或1ng钙连蛋白/μg总蛋白，或其中相比于所述源细胞，所述融合剂脂质体包括以ng/μg为单位的每总蛋白的更多的钙连蛋白，高1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如使用实例46的分析；
xvi)所述融合剂脂质体包括对源细胞(例如，蛋白质、mRNA或siRNA)为外源性的药剂，例如如使用实例39或40的分析所测量；或
xvii)所述融合剂脂质体可以通过原子力显微镜固定在云母表面上至少30分钟。
254.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中：
i)所述融合剂脂质体是外泌体；
ii)所述融合剂脂质体不是微囊泡；
iii)所述融合剂脂质体不包括细胞器；
iv)所述融合剂脂质体不包括细胞骨架或其组分，例如肌动蛋白、Arp2/3、形成蛋白、冠蛋白、肌缩蛋白、角蛋白、肌球蛋白或微管蛋白；
v)所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂的浮动密度为1.08-1.22g/mL，例如在蔗糖梯度离心分析中；
vi)相比于所述源细胞，所述融合剂脂质体脂质双层并不富含(例如耗尽)神经酰胺或鞘磷脂或其组合，或相比于所述源细胞，所述融合剂脂质体脂质双层富含糖脂、游离脂肪酸或磷脂酰丝氨酸或其组合；
vii)相对于所述源细胞，所述融合剂脂质体不包括或耗尽磷脂酰丝氨酸(PS)或CD40配体或PS和CD40配体两者，例如当在实例52的分析中测量时；
viii)相比于所述源细胞，所述融合剂脂质体并不富含(例如耗尽)PS，例如在多个融合剂脂质体中小于20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％对PS为阳性的；
ix)所述融合剂脂质体包括乙酰胆碱酯酶(AChE)，例如至少0.001、0.002、0.005、0.01,0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500或1000个AChE活性单位/μg蛋白质，例如根据实例67的分析；
x)所述融合剂脂质体包括四跨膜蛋白家族蛋白(例如CD63、CD9或CD81)、ESCRT相关蛋白(例如TSG101、CHMP4A-B或VPS4B)、Alix、TSG101、MHCI、MHCII、GP96、辅肌动蛋白-4、线粒体内膜蛋白、同线蛋白-1、TSG101、ADAM10、EHD4、同线蛋白-1、TSG101、EHD1、脂阀结构蛋白-1、热休克70kDa蛋白(HSC70/HSP73、HSP70/HSP72)或其任何组合，或含有大于0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、5％或10％的任何个别外泌体标记蛋白和/或小于0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％或25％的任何所述蛋白的总外泌体标记蛋白，或相比于源细胞富含这些蛋白质中的任何一种或多种，例如根据实例44的分析；
xi)所述融合剂脂质体包括水平高于500、250、100、50、20、10、5或1ng GAPDH/μg总蛋白或低于源细胞中的GAPDH水平的甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，例如比源细胞中以ng/μg为单位的GAPDH/总蛋白水平大至少1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如使用实例45的分析；
xii)所述融合剂脂质体并不富含(例如耗尽)一种或多种内质网蛋白(例如钙连蛋白)、一种或多种蛋白酶体蛋白或一种或多种线粒体蛋白，或其任何组合，例如其中钙连蛋白的量小于500、250、100、50、20、10、5或1ng钙连蛋白/μg总蛋白，或其中相比于所述源细胞，所述融合剂脂质体包括以ng/μg为单位的每总蛋白的更少的钙连蛋白，低1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如使用实例46的分析；或
xiii)所述融合剂脂质体无法通过原子力显微镜固定在云母表面上至少30分钟。
255.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中：
i)所述融合剂脂质体不包括VLP；
ii)所述融合剂脂质体不包括病毒；
iii)所述融合剂脂质体不包括复制胜任型病毒；
iv)所述融合剂脂质体不包括病毒蛋白，例如病毒结构蛋白，例如衣壳蛋白或病毒基质蛋白；
v)所述融合剂脂质体不包括来自包膜病毒的衣壳蛋白；
vi)所述融合剂脂质体不包括核衣壳蛋白；或
vii)所述融合剂不是病毒融合剂。
256.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体包括胞质溶胶。
257.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中：
i)所述融合剂脂质体在植入受试者体内时不形成畸胎瘤，例如根据实例102的分析；
ii)相比于参考细胞，例如巨噬细胞，所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂能够例如以至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的速度具有趋化性，例如使用实例58的分析；
iii)所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂能够在例如损伤部位处归巢，其中所述融合剂脂质体是来自人类细胞，例如使用实例59的分析，例如其中所述源细胞为嗜中性粒细胞；或
iv)所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂能够进行吞噬作用，例如其中通过所述融合剂脂质体的吞噬作用在使用实例60的分析中在0.5、1、2、3、4、5或6小时内可检测到，例如其中所述源细胞为巨噬细胞。
258.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体具有以下特征中的一个或多个：
a)包括来自源细胞的一种或多种内源蛋白，例如膜蛋白或胞质蛋白；
b)包括至少10、20、50、100、200、500、1000、2000或5000种不同的蛋白质；
c)包括至少1、2、5、10、20、50或100种不同的糖蛋白；
d)所述融合剂脂质体中至少10质量％、20质量％、30质量％、40质量％、50质量％、60质量％、70质量％、80质量％或90质量％的蛋白质为天然存在的蛋白质；
e)包括至少10、20、50、100、200、500、1000、2000或5000种不同的RNA；或
f)包括至少2、3、4、5、10或20种不同的脂质，例如选自CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM和TAG。
259.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体经操控以具有，或其中所述融合剂脂质体不是天然存在的细胞并且具有，或其中细胞核并不天然地具有以下特性中的一个、两个、三个、四个、五个或更多个：
i)部分核灭活导致核功能降低至少50％、60％、70％、80％、90％或更多，例如转录或DNA复制降低或两者均降低，例如其中根据实例19的分析来测量转录并根据实例20的分析来测量DNA复制；
ii)所述融合剂脂质体不能够转录或具有参考细胞(例如源细胞)的转录活性的小于1％、2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的转录活性，例如使用实例19的分析；
iii)所述融合剂脂质体不能够进行核DNA复制或具有参考细胞(例如源细胞)的核DNA复制的小于1％、2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的核DNA复制，例如使用实例20的分析；
iv)所述融合剂脂质体缺乏染色质或具有为参考细胞(例如源细胞)的染色质含量的小于1％、2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的染色质含量，例如使用实例37的分析；
v)所述融合剂脂质体缺乏核膜或具有为参考细胞(例如源细胞或杰卡特细胞(Jurkat cell))的核膜量的小于50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的核膜量，例如根据实例36的分析；
vi)所述融合剂脂质体缺乏功能性核孔复合物或具有降低的核输入或输出活性，例如根据实例36的分析降低了至少50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％，或所述融合剂脂质体缺乏一种或多种核孔蛋白，例如NUP98或输入蛋白(Importin)7；
vii)所述融合剂脂质体不包括组蛋白或具有为源细胞(例如，H1、H2a、H2b、H3或H4)的组蛋白水平的小于1％的组蛋白含量，例如根据实例37的分析；
viii)所述融合剂脂质体包括小于20、10、5、4、3、2或1个染色体；
ix)核功能被消除；
x)所述融合剂脂质体为去核的哺乳动物细胞；
xi)通过机械力、通过辐射或通过化学消融将核去除或灭活(例如挤出)；或
xii)所述融合剂脂质体是来自例如在分裂间期或有丝分裂期间具有完全或部分去除的DNA的哺乳动物细胞。
260.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体包括mtDNA或载体DNA。
261.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其不包括DNA或基本上不含DNA。
262.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体不包括功能性核。
263.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体不包括核。
264.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体基本上不含核DNA。
265.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中：
ii)所述融合剂脂质体不包括Cre或GFP，例如EGFP；或
iii)所述融合剂脂质体还包括对源细胞为外源性的蛋白质并且不是Cre或GFP，例如EGFP。
266.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体还包括核酸(例如，DNA、gDNA、cDNA、RNA、前mRNA、mRNA、miRNA或siRNA)或蛋白质(例如，抗体)，其中所述核酸或蛋白质对源细胞为外源性的，例如在内腔中。
267.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体不包括线粒体或基本上不含线粒体。
268.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其在施用到受试者，例如人类受试者之后保持任何特征中的一个、二个、三个、四个、五个、六个或更多个5天或更短，例如4天或更短、3天或更短、2天或更短、1天或更短，例如约12-72小时。
269.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其与靶细胞或靶细胞的表面特征缔合和/或结合靶细胞或靶细胞的表面特征。
270.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其在靶细胞表面处与靶细胞融合。
271.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其以溶酶体非依赖性方式促进与靶细胞的融合。
272.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体和/或融合剂脂质体内容物通过内吞作用或通过非内吞路径进入靶细胞。
273.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体脂质双层的至少一部分变得并入靶细胞膜中。
274.根据实施例273所述的融合剂脂质体，所述融合剂脂质体通过内吞作用进入所述靶细胞，例如其中对于给定融合剂脂质体通过内吞路径递送的有效负载(例如，膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂)的水平为0.01-0.6、0.01-0.1、0.1-0.3或0.3-0.6，或相比于用氯奎处理的参考细胞，大至少至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，例如使用实例91的分析。
275.根据实施例273所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体通过非内吞路径进入靶细胞，例如其中对于给定融合剂脂质体通过非内吞路径递送有效负载(例如，膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂)的水平为0.1-0.95、0.1-0.2、0.2-0.3、0.3-0.4、0.4-0.5、0.5-0.6、0.6-0.7、0.7-0.8、0.8-0.9、0.9-0.95，或相比于用氯奎处理的参考细胞，大至少至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，例如使用实例90的分析。
276.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述靶细胞在生物体中。
277.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述靶细胞为从生物体分离的原代细胞。
278.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述靶细胞是选自内皮细胞、成纤维细胞、血细胞(例如巨噬细胞、嗜中性粒细胞、粒细胞、白细胞)、干细胞(例如间质干细胞、脐带干细胞、骨髓干细胞、造血干细胞、诱导多能干细胞，例如衍生自受试者的细胞的诱导多能干细胞)、胚胎干细胞(例如来自胚胎卵黄囊、胎盘、脐带、胎儿皮肤、青少年皮肤、血液、骨髓、脂肪组织、红细胞生成组织、造血组织的干细胞)、成肌细胞、实质细胞(例如肝细胞)、肺泡细胞、神经元(例如视网膜神经元细胞)、前体细胞(例如视网膜前体细胞、成髓细胞、骨髓前体细胞、胸腺细胞、性母细胞、成巨核细胞、幼巨核细胞、成黑素细胞、成淋巴细胞、骨髓前体细胞、正成红细胞或成血管细胞)、祖细胞(例如心肌祖细胞、卫星细胞、放射状胶质细胞、骨髓基质细胞、胰腺祖细胞、内皮祖细胞、胚细胞)或永生化细胞(例如HeLa、HEK293、HFF-1、MRC-5、WI-38、IMR 90、IMR 91、PER.C6、HT-1080或BJ细胞)。
279.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述靶细胞不是HeLa细胞，或所述靶细胞不是经转化的或永生化的。
280.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述靶细胞是经转化的或永生化的。
281.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述靶细胞是选自白细胞或干细胞。
282.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述靶细胞是选自嗜中性粒细胞、淋巴细胞(例如T细胞、B细胞、自然杀伤细胞)、巨噬细胞、粒细胞、间质干细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、胚胎干细胞或成髓细胞。
283.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体包括将所述融合剂脂质体定位到靶细胞的靶向域。
284.根据实施例283所述的融合剂脂质体，其中所述靶向域与所述靶细胞上的靶细胞部分相互作用。
285.根据实施例284所述的融合剂脂质体，其中所述靶细胞部分是细胞表面特征。
286.根据实施例284或实施例285所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体不包括所述靶细胞部分。
287.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体包括与靶细胞上的融合剂结合搭配物相互作用的融合剂，由此使得所述融合剂脂质体与所述靶细胞结合或融合。
288.根据实施例287所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体不包括所述融合剂结合搭配物。
289.根据实施例283到288中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述靶向域不是融合剂的一部分。
290.根据实施例283到288中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂包括靶向域。
291.根据实施例283到289中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂结合搭配物为与靶细胞部分不同的实体或为其一部分。
292.根据实施例283到289中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂结合搭配物为靶细胞部分或为其一部分。
293.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其还包括安置于内腔中的细胞器，例如治疗有效数目的细胞器。
294.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中：
i)所述源细胞不是树突状细胞或肿瘤细胞，例如所述源细胞是选自内皮细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、粒细胞、白细胞、干细胞(例如间叶干细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、胚胎干细胞)、成髓细胞、成肌细胞、肝细胞或神经元，例如视网膜神经元细胞；
ii)所述融合剂不是融合糖蛋白；
iii)所述融合剂为除致育素-β以外的哺乳动物蛋白质；
iv)所述融合剂脂质体具有低免疫原性，例如如本文所描述；
v)所述融合剂脂质体符合药物或良好生产规范(GMP)标准；
vi)包括多个融合剂脂质体的药物制剂是根据良好生产规范(GMP)制得；
vii)包括多个融合剂脂质体的药物制剂具有低于预定参考值的病原体水平，例如，基本上不含病原体；或
viii)包括多个融合剂脂质体的药物制剂具有低于预定参考值的污染物水平，例如，基本上不含污染物。
295.一种融合剂脂质体组合物或融合剂脂质体制剂，其包括多种根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体。
296.一种包括多个融合剂脂质体的融合剂脂质体组合物，其中至少一个融合剂脂质体包括：
(a)包括来源于源细胞的多种脂质的脂质双层；
(b)被所述脂质双层包围的内腔(例如包括胞质溶胶)；
(c)相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的融合剂，其中将所述融合剂安置于所述脂质双层中；
(d)有效负载(例如，膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂)，例如膜蛋白有效负载剂、核蛋白质有效负载剂或细胞器蛋白有效负载剂，例如如本文所描述。
297.根据实施例295或实施例296所述的融合剂脂质体组合物，其中多个融合剂脂质体中的至少一个融合剂脂质体衍生自源细胞。
298.根据实施例295到297中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述融合剂脂质体的温度小于4℃、0℃、-4℃、-10℃、-12℃、-16℃、-20℃、-80℃或-160℃。
299.根据实施例295到298中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中多个融合剂脂质体包括至少约103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014或1015个融合剂脂质体。
300.根据实施例295到299中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述多个融合剂脂质体是相同的。
301.根据实施例300所述的融合剂脂质体组合物，其中如果融合剂脂质体组合物中的至少0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％的融合剂脂质体共用至少一种选自以下的特性，那么所述多个融合剂脂质体是相同的：
包括相同的融合剂；
使用相同类型的源细胞产生；或
包括相同的有效负载(例如，膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂)。
302.根据实施例295到299中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述多个融合剂脂质体是不同的。
303.根据实施例295到302中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述多个融合剂脂质体衍生自两种或更多种类型的源细胞。
304.根据实施例295到303中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其体积为至少1μL、2μL、5μL、10μL、20μL、50μL、100μL、200μL、500μL、1mL、2mL、5mL或10mL。
305.根据实施例295到304中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述多个融合剂脂质体包括至少0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％的不包括功能性核的融合剂脂质体。
306.根据实施例295到305中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述多个融合剂脂质体包括至少0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％的不包括核的融合剂脂质体。
307.根据实施例295到306中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述多个融合剂脂质体包括至少0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％的基本上不含核DNA的融合剂脂质体。
308.根据实施例295到307中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述多个融合剂脂质体包括至少0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％的不包括功能性线粒体的融合剂脂质体。
309.根据实施例295到308中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述多个融合剂脂质体包括至少0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％的不包括线粒体的融合剂脂质体。
310.根据实施例295到309中任一实施例所述的融合剂脂质体组合物，以蛋白质质量计，所述融合剂脂质体组合物包括小于0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％或10％的源细胞，或小于0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％或10％的具有功能性核的源细胞。
311.根据实施例295到310中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述多个融合剂脂质体包括至少0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％的融合剂脂质体，其中：
i)所述融合剂以每个融合剂脂质体至少1,000个拷贝的拷贝数存在，例如如通过实例29的分析所测量；或
ii)每个融合剂脂质体的所述融合剂的拷贝数与所述有效负载(例如，膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂)的拷贝数的比在1,000,000:1与100,000:1、100,000:1与10,000:1、10,000:1与1,000:1、1,000:1与100:1、100:1与50:1、50:1与20:1、20:1与10:1、10:1与5:1、5:1与2:1、2:1与1:1、1:1与1:2、1:2与1:5、1:5与1:10、1:10与1:20、1:20与1:50、1:50与1:100、1:100与1:1,000、1:1,000与1:10,000、1:10,000与1:100,000或1:100,000与1:1,000,000之间。
312.根据实施例295到311中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述融合剂脂质体组合物包括至少0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％的融合剂脂质体，其中所述有效负载(例如，膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂)以每个融合剂脂质体至少1,000个拷贝的拷贝数存在，例如如通过实例43的分析所测量。
313.根据实施例295到312中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述多个融合剂脂质体的平均直径为至少约50nm、约80nm、约100nm、约200nm、约500nm、约1000nm、约1200nm、约1400nm或约1500nm。
314.根据实施例295到313中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述多个融合剂脂质体包括直径在约10nm到约100μm范围内的融合剂脂质体。
315.根据实施例295到314中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述多个融合剂脂质体包括大小在约20nm到约200nm、约50nm到约200nm、约50nm到约100nm、约50nm到约150nm或约100nm到约150nm范围内的融合剂脂质体。
316.根据实施例295到315中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述多个融合剂脂质体中的至少50％的融合剂脂质体的直径在所述融合剂脂质体组合物中的融合剂脂质体的平均直径的10％、20％、30％、40％或50％内。
317.根据实施例295到316中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述多个融合剂脂质体包括体积在约500nm3到约0.0006mm3或约4,000nm3到约0.005μm3、约65,000nm3到约0.005μm3、约65,000nm3到约0.0006μm3、约65,000nm3到约0.002μm3或约0.0006μm3到约0.002μm3范围内的融合剂脂质体。
318.根据实施例295到317中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述多个融合剂脂质体中的至少50％的融合剂脂质体的体积在所述融合剂脂质体组合物中的融合剂脂质体的平均体积的10％、20％、30％、40％或50％内。
319.根据实施例295到318中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述多个融合剂脂质体中的至少50％的融合剂脂质体的融合剂的拷贝数在所述融合剂脂质体组合物中的融合剂脂质体的平均融合剂拷贝数的10％、20％、30％、40％或50％内。
320.根据实施例295到319中任一项所述的融合剂脂质体组合物，其中所述多个融合剂脂质体中的至少50％的融合剂脂质体的有效负载(例如，膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂)的拷贝数在所述融合剂脂质体组合物中的融合剂脂质体中的平均有效负载(例如，膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂)拷贝数的10％、20％、30％、40％或50％内。
321.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述组合物中的小于10％、5％、4％、3％、2％或1％的融合剂脂质体包括在内腔中的细胞器，例如内腔不包括以下中的一种或多种：线粒体、高尔基体、溶酶体、内质网、线粒体、液泡、内体、顶体、自噬体、中心粒、糖酵解酶体、乙醛酸循环体、氢化酶体、黑素体、纺锤剩体、刺丝囊、过氧化物酶体、蛋白酶体、囊泡或应激颗粒。
322.一种药物组合物，其包括根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体组合物或制剂以及药学上可接受的载剂。
323.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体组合物或药物组合物，其已保持在预定温度下至少1、2、3、6或12小时；1、2、3、4、5或6天；1、2、3或4周；1、2、3或6个月；或1、2、3、4或5年。
324.根据实施例323所述的融合剂脂质体组合物或药物组合物，其中所述预定温度是选自约4℃、0℃、-4℃、-10℃、-12℃、-16℃、-20℃、-80℃或-160℃。
325.根据实施例323或实施例324所述的融合剂脂质体组合物或药物组合物，在保持在所述温度下之前，例如通过以下中的一个或多个，其具有所述多个融合剂脂质体的活性的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的活性：
i)所述融合剂脂质体与靶细胞的融合速率高于与非靶细胞，例如，高至少至少10％，例如在实例54的分析中；
ii)所述融合剂脂质体与靶细胞的融合速率高于与其它融合剂脂质体，例如，高至少50％，例如在实例54的分析中；
iii)所述融合剂脂质体与靶细胞以使得在24小时之后所述融合剂脂质体中的药剂递送到至少10％的靶细胞的速率融合，例如在实例54的分析中；或
iv)在保持在所述温度下之前，所述融合剂以所述多个融合剂脂质体的融合剂拷贝数的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的拷贝数存在，例如如通过实例29的分析所测量。
326.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体组合物或药物组合物，其已在小于4℃的温度下存储时稳定至少1、2、3、6或12小时；1、2、3、4、5或6天；1、2、3或4周；1、2、3或6个月；或1、2、3、4或5年。
327.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体组合物或药物组合物，其已在-20℃的温度下存储时稳定至少1、2、3、6或12小时；1、2、3、4、5或6天；1、2、3或4周；1、2、3或6个月；或1、2、3、4或5年。
328.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体组合物或药物组合物，其已在-80℃的温度下存储时稳定至少1、2、3、6或12小时；1、2、3、4、5或6天；1、2、3或4周；1、2、3或6个月；或1、2、3、4或5年。
329.根据实施例326到328中任一项所述的融合剂脂质体组合物或药物组合物，其中如果所述组合物在所述温度下存储所述时段之前，例如以下中的一个或多个，如果所述组合物具有所述多个融合剂脂质体的活性的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的活性，那么所述组合物视为稳定的：
i)所述融合剂脂质体与靶细胞的融合速率高于与非靶细胞，例如，高至少至少10％，例如在实例54的分析中；
ii)所述融合剂脂质体与靶细胞的融合速率高于与其它融合剂脂质体，例如，高至少50％，例如在实例54的分析中；
iii)所述融合剂脂质体与靶细胞以使得在24小时之后所述融合剂脂质体中的药剂递送到至少10％的靶细胞的速率融合，例如在实例54的分析中；或
iv)在保持在所述温度下之前，所述融合剂以所述多个融合剂脂质体的融合剂拷贝数的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的拷贝数存在，例如如通过实例29的分析所测量。
330.根据实施例322到329中任一项所述的药物组合物，其具有以下特征中的一个或多个：
a)所述药物组合物符合药物或良好生产规范(GMP)标准；
b)所述药物组合物是根据良好生产规范(GMP)制得；
c)所述药物组合物的病原体水平低于预定参考值，例如基本上不含病原体；
d)所述药物组合物的污染物水平低于预定参考值，例如基本上不含污染物；或
e)所述药物组合物具有低免疫原性，例如如本文所描述。
331.一种制造融合剂脂质体组合物的方法，其包括：
a)提供包括，例如表达融合剂的源细胞；
b)从源细胞产生融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体包括脂质双层、内腔、融合剂和有效负载(例如膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂)，例如膜蛋白有效负载剂、核蛋白有效负载剂或细胞器蛋白有效负载剂，由此制备融合剂脂质体；以及
c)将所述融合剂脂质体配制成例如适合于向受试者施用的药物组合物，其中以下中的一个或多个：
xii)所述源细胞不是293细胞、HEK细胞、人类内皮细胞或人类上皮细胞；
xiii)所述融合剂不是病毒蛋白；
xiv)所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂的密度不在1.08g/mL与1.12g/mL之间，例如，
xv)所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂的密度为1.25g/mL+/-0.05，例如如通过实例33的分析所测量；
xvi)所述融合剂脂质体未被循环中的清除系统或肝窦中的库普弗细胞捕获；
xvii)所述融合剂脂质体未被受试者的网状内皮系统(RES)捕获，例如根据实例76的分析；
xviii)当向受试者施用多个融合剂脂质体时，小于1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的所述多个融合剂脂质体在24小时之后未被RES捕获，例如根据实例76的分析；
xix)所述融合剂脂质体的直径大于5μm、6μm、7μm、8μm、10μm、20μm、50μm、100μm、150μm或200μm。
xx)所述融合剂脂质体包括细胞生物物质；
xxi)所述融合剂脂质体包括去核细胞；或
xxii)所述融合剂脂质体包括灭活的细胞核。
332.根据实施例331所述的方法，其中提供表达融合剂的源细胞包括在所述源细胞中表达外源性融合剂或上调内源性融合剂在所述源细胞中的表达。
333.根据实施例331或实施例332所述的方法，其包括使所述源细胞的细胞核失活。
334.一种制造融合剂脂质体组合物的方法，其包括：
a)提供根据实施例1到70中任一项所述的多个融合剂脂质体、根据实施例71到97中任一项所述的融合剂脂质体组合物或根据实施例97所述的药物组合物；以及
ii)配制所述多个融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物或药物组合物，例如呈适用于向受试者施用的融合剂脂质体药品形式。
335.根据实施例331到334中任一项所述的方法，其中所述融合剂脂质体组合物包括至少103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014或1015个融合剂脂质体。
336.根据实施例331到335中任一项所述的方法，其中所述融合剂脂质体组合物包括至少10mL、20mL、50mL、100mL、200mL、500mL、1L、2L、5L、10L、20L或50L的体积。
337.根据实施例331到336中任一项所述的方法，其包括例如通过化学去核术、使用机械力，例如使用过滤器或离心机，最少部分破坏细胞骨架来使源细胞(例如哺乳动物细胞)去核。
338.根据实施例331到337中任一项所述的方法，其包括在源细胞中表达融合剂或其它膜蛋白。
339.根据实施例331到338中任一项所述的方法，其包括以下中的一个或多个：囊泡化、低渗处理、挤压或离心。
340.根据实施例331到339中任一项所述的方法，其包括在细胞中以基因方式表达外源药剂或将所述外源药剂装载到所述源细胞或融合剂脂质体中。
341.根据实施例331到340中任一项所述的方法，其包括例如在灭活细胞核，例如使源细胞去核之前，使所述源细胞与编码多肽药剂的DNA接触。
342.根据实施例331到341中任一项所述的方法，其包括例如在灭活细胞核，例如使源细胞去核之前或之后，使所述源细胞与编码多肽药剂的RNA接触。
343.根据实施例331到342中任一项所述的方法，其包括例如通过电穿孔将有效负载，例如膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂(例如，核酸或蛋白质)引入融合剂脂质体中。
344.根据实施例331到343中任一项所述的方法，其中所述源细胞为内皮细胞、成纤维细胞、血细胞(例如巨噬细胞、嗜中性粒细胞、粒细胞、白细胞)、干细胞(例如间质干细胞、脐带干细胞、骨髓干细胞、造血干细胞、诱导多能干细胞，例如衍生自受试者的细胞的诱导多能干细胞)、胚胎干细胞(例如来自胚胎卵黄囊、胎盘、脐带、胎儿皮肤、青少年皮肤、血液、骨髓、脂肪组织、红细胞生成组织、造血组织的干细胞)、成肌细胞、实质细胞(例如肝细胞)、肺泡细胞、神经元(例如视网膜神经元细胞)、前体细胞(例如视网膜前体细胞、成髓细胞、骨髓前体细胞、胸腺细胞、性母细胞、成巨核细胞、幼巨核细胞、成黑素细胞、成淋巴细胞、骨髓前体细胞、正成红细胞或成血管细胞)、祖细胞(例如心肌祖细胞、卫星细胞、放射状胶质细胞、骨髓基质细胞、胰腺祖细胞、内皮祖细胞、胚细胞)或永生化细胞(例如HeLa、HEK293、HFF-1、MRC-5、WI-38、IMR 90、IMR 91、PER.C6、HT-1080或BJ细胞)。
345.根据实施例331到344中任一项所述的方法，其中所述融合剂脂质体来自具有经修饰的基因组的哺乳动物细胞，例如具有降低的免疫原性(例如，通过基因组编辑来去除MHC复合物)。
346.根据实施例331到345中任一项所述的方法，其中所述源细胞是来自用抗炎信号处理的细胞培养物。
347.根据实施例331到346中任一项所述的方法，其还包括例如在使细胞核灭活，例如使细胞去核之前或之后，使步骤a)的源细胞与抗炎信号接触。
348.一种制造融合剂脂质体药品组合物的方法，其包括：
a)提供，例如产生根据实施例1到70中任一项所述的多个融合剂脂质体、根据实施例71到97中任一项所述的融合剂脂质体组合物或根据实施例97所述的药物组合物；以及
b)分析所述多个融合剂脂质体中的一个或多个融合剂脂质体以确定是否符合以下一个或多个(例如2个、3个或全部)标准：
i)所述融合剂脂质体与靶细胞的融合速率高于与非靶细胞，例如，高至少至少10％，例如在实例54的分析中；
ii)所述融合剂脂质体与靶细胞的融合速率高于与其它融合剂脂质体，例如，高至少50％，例如在实例54的分析中；
iii)所述融合剂脂质体与靶细胞以使得在24小时之后所述融合剂脂质体中的药剂递送到至少10％的靶细胞的速率融合，例如在实例54的分析中；
iv)所述融合剂以至少1,000个拷贝的拷贝数存在，例如如通过实例29的分析所测量；
v)所述融合剂脂质体以至少1,000个拷贝的拷贝数包括有效负载(例如，膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂)，如通过实例43的分析所测量；
vi)所述融合剂的拷贝数与所述有效负载(例如，膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂)的拷贝数的比在1,000,000:1与100,000:1、100,000:1与10,000:1、10,000:1与1,000:1、1,000:1与100:1、100:1与50:1、50:1与20:1、20:1与10:1、10:1与5:1、5:1与2:1、2:1与1:1、1:1与1:2、1:2与1:5、1:5与1:10、1:10与1:20、1:20与1:50、1:50与1:100、1:100与1:1,000、1:1,000与1:10,000、1:10,000与1:100,000或1:100,000与1:1,000,000之间；
vii)所述融合剂脂质体包括脂质组合物，其中CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM和TAG中的一个或多个在所述源细胞中的对应脂质水平的75％内；
viii)所述融合剂脂质体包括与所述源细胞类似的蛋白质组学组成，例如使用实例42的分析；
ix)所述融合剂脂质体包括的脂质:蛋白质的比在所述源细胞中的对应比的10％、20％、30％、40％或50％内，例如如使用实例49的分析所测量；
x)所述融合剂脂质体包括的蛋白质:核酸(例如DNA)的比在所述源细胞中的对应比的10％、20％、30％、40％或50％内，例如如使用实例50的分析所测量；
xi)所述融合剂脂质体包括的脂质:核酸(例如DNA)的比在所述源细胞中的对应比的10％、20％、30％、40％或50％内，例如如使用实例51的分析所测量；
xii)所述融合剂脂质体在受试者中，例如在小鼠中的半衰期在参考细胞(例如源细胞)的半衰期的90％内，例如根据实例75的分析；
xiii)所述融合剂脂质体将葡萄糖(例如，经标记的葡萄糖，例如2-NBDG)转运跨越膜，例如比阴性对照(例如不存在葡萄糖的以其它方式类似的融合剂脂质体)多至少10％，例如如使用实例64的分析所测量；
xiv)所述融合剂脂质体在内腔中包括的酯酶活性在参考细胞(例如源细胞或小鼠胚胎成纤维细胞)中的酯酶活性的90％内，例如使用实例66的分析；
xv)所述融合剂脂质体包括的代谢活性水平在参考细胞(例如源细胞)中的代谢活性(例如，柠檬酸合酶活性)的90％内，例如如实例68中所描述；
xvi)所述融合剂脂质体包括的呼吸水平(例如，耗氧速率)在参考细胞(例如源细胞)中的呼吸水平的90％内，例如如实例69中所描述；
xvii)所述融合剂脂质体包括至多18,000、17,000、16,000、15,000、14,000、13,000、12,000、11,000或10,000MFI的膜联蛋白-V染色水平，例如使用实例70的分析，或其中相比于实例70的分析中的用甲萘醌处理的以其它方式类似的融合剂脂质体的膜联蛋白-V染色水平，所述融合剂脂质体包括低至少5％、10％、20％、30％、40％或50％的膜联蛋白-V染色水平，或其中相比于实例70的分析中的用甲萘醌处理的巨噬细胞的膜联蛋白-V染色水平，所述融合剂脂质体包括低至少5％、10％、20％、30％、40％或50％的膜联蛋白-V染色水平；
xviii)所述融合剂脂质体具有与所述源细胞的miRNA含量水平相比至少1％的miRNA含量水平，例如根据实例39的分析；
xix)所述融合剂脂质体的可溶性:不可溶性蛋白质的比在源细胞的所述比的90％内，例如根据实例47的分析；
xx)所述融合剂脂质体的LPS水平小于融合剂脂质体的脂质含量的5％，例如如通过实例48的分析所测量；
xxi)所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂能够进行信号转导，例如传输细胞外信号，例如回应于胰岛素的AKT磷酸化，或回应于胰岛素的葡萄糖(例如经标记的葡萄糖，例如2-NBDG)摄取，例如比阴性对照(例如不存在胰岛素的以其它方式类似的融合剂脂质体)多至少10％，例如使用实例63的分析；
xxii)所述融合剂脂质体的近分泌信号传导水平比由参考细胞(例如源细胞或骨髓基质细胞(BMSC))诱导的近分泌信号传导水平大至少5％，例如根据实例71的分析；
xxiii)所述融合剂脂质体的旁分泌信号传导水平比由参考细胞(例如源细胞或巨噬细胞)诱导的旁分泌信号传导水平大至少5％，例如根据实例72的分析；
xxiv)相比于参考细胞(例如源细胞或C2C12细胞)中的聚合肌动蛋白的水平，所述融合剂脂质体以在5％内的水平聚合肌动蛋白，例如根据实例73的分析；
xxv)所述融合剂脂质体的膜电位在参考细胞(例如源细胞或C2C12细胞)的膜电位的约5％内，例如根据实例74的分析，或其中所述融合剂脂质体具有约-20mV到-150mV、-20mV到-50mV、-50mV到-100mV或-100mV到-150mV的膜电位；
xxvi)所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂能够分泌蛋白质，例如以比参考细胞(例如小鼠胚胎成纤维细胞)大至少5％的速率，例如使用实例62的分析；或
xxvii)所述融合剂脂质体具有低免疫原性，例如如本文所描述；以及
c)(任选地)如果符合标准中的一个或多个，那么批准所述多个融合剂脂质体或融合剂脂质体组合物释放；
由此制造融合剂脂质体药品组合物。
349.一种制造融合剂脂质体药品组合物的方法，其包括：
a)提供，例如产生，提供根据实施例1到70中任一项所述的多个融合剂脂质体、根据实施例71到97中任一项所述的融合剂脂质体组合物或根据实施例97所述的药物组合物；以及
b)分析所述多个融合剂脂质体中的一个或多个融合剂脂质体以确定以下因素中的一个或多个的存在或水平：
i)免疫原性分子，例如免疫原性蛋白，例如如本文所描述；
ii)病原体，例如细菌或病毒；或
iii)污染物；
c)(任选地)如果因素中的一个或多个低于参考值，那么批准所述多个融合剂脂质体或融合剂脂质体组合物释放；
由此制造融合剂脂质体药品组合物。
350.根据实施例349所述的方法，其中如果确定可检测水平，例如高于参考值的值，那么丢弃含有多个融合剂脂质体或融合剂脂质体组合物的样品。
351.一种制造融合剂脂质体组合物的方法，其包括：
a)提供多种本文所描述的融合剂脂质体或本文所描述的融合剂脂质体组合物；以及
b)将所述融合剂脂质体配制成例如适合于向受试者施用的药物组合物。
352.一种制造融合剂脂质体组合物的方法，其包括：
a)提供，例如产生多种本文所描述的融合剂脂质体或融合剂脂质体制剂；以及
b)分析所述多个融合剂脂质体(例如，制剂)的样品以确定是否符合一个或多个(例如2、3或更多个)标准。
353.一种制造融合剂脂质体组合物的方法，其包括：
a)提供，例如产生多种本文所描述的融合剂脂质体或本文所描述的融合剂脂质体组合物或制剂；以及
b)分析所述多个融合剂脂质体或制剂的样品以确定以下因素中的一个或多个的存在或水平：
i)免疫原性分子，例如免疫原性蛋白，例如如本文所描述；
ii)病原体，例如细菌或病毒；或
iii)污染物(例如，核结构或组分，如核DNA)；以及
c)(任选地)如果因素中的一个或多个显著偏离(例如，大于规定量)参考值，那么批准所述多个融合剂脂质体或融合剂脂质体制剂释放，或(任选地)如果因素中的一个或多个并不显著偏离(例如，并不偏离大于规定量)参考值，那么将所述多个融合剂脂质体或融合剂脂质体制剂配制成药品。
354.一种制造融合剂脂质体组合物的方法，其包括：
i)提供多种如本文所描述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物或药物组合物；以及
ii)配制所述多个融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物或药物组合物，例如呈适用于向受试者施用的融合剂脂质体药品形式。
355.一种制造融合剂脂质体组合物的方法，其包括：
a)提供多种如本文所描述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物或药物组合物；以及
b)分析所述多个融合剂脂质体中的一个或多个融合剂脂质体以确定以下因素中的一个或多个的存在或水平：
i)免疫原性分子，例如免疫原性蛋白，例如如本文所描述；
ii)病原体，例如细菌或病毒；或
iii)污染物；
c)(任选地)如果因素中的一个或多个低于参考值，那么批准所述多个融合剂脂质体或融合剂脂质体组合物释放；
由此制造融合剂脂质体药品组合物。
356.根据实施例102到356中任一项所述的方法，其中存在以下中的一个或多个：
i)所述源细胞不是293细胞、HEK细胞、人类内皮细胞或人类上皮细胞；
ii)所述融合剂不是病毒蛋白；
iii)包括多个融合剂脂质体的制剂的密度不在1.08g/mL与1.12g/mL之间；
iv)包括多个融合剂脂质体的制剂的密度为1.25g/mL+/-0.05，例如如通过实例33的分析所测量；
v)所述融合剂脂质体基本上未被循环中的清除系统或肝窦中的库普弗细胞捕获；
vi)所述融合剂脂质体基本上未被受试者的网状内皮系统(RES)捕获，例如根据实例76的分析；
vii)当向受试者施用多个融合剂脂质体时，小于1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的所述多个融合剂脂质体在24、48或72小时之后被RES捕获，例如根据实例76的分析；
viii)所述融合剂脂质体的直径大于5μm、6μm、7μm、8μm、10μm、20μm、50μm、100μm、150μm或200μm。
ix)所述融合剂脂质体包括细胞生物物质；
x)所述融合剂脂质体包括去核细胞；或
xi)所述融合剂脂质体包括灭活的细胞核。
357.一种向受试者施用融合剂脂质体组合物的方法，例如向人类受试者，所述方法包括向所述受试者施用包括根据实施例1到70中任一项所述的多个融合剂脂质体的融合剂脂质体组合物、根据实施例71到97中任一项所述的融合剂脂质体组合物或根据实施例97所述的药物组合物，由此向所述受试者施用所述融合剂脂质体组合物。
358.一种将有效负载(例如，膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂)递送到受试者的方法，其包括向所述受试者施用包括根据实施例1到70中任一项所述的多个融合剂脂质体的融合剂脂质体组合物、根据实施例71到97中任一项所述的融合剂脂质体组合物或根据实施例97所述的药物组合物，其中所述融合剂脂质体组合物以使得递送有效负载的量和/或时间施用。
359.一种调控，例如增强受试者的生物功能的方法，其包括向所述受试者施用以下或使靶组织或细胞与以下接触：多种根据根据实施例1到70中任一项所述的融合剂脂质体、根据实施例71到97中任一项所述的融合剂脂质体组合物或根据实施例97所述的药物组合物，由此调控所述受试者的生物功能。
360.根据实施例359所述的方法，其中所述生物功能是选自：
a)调控，例如增加或减少两个细胞之间的相互作用；
b)调控，例如增加或减少免疫应答；
c)调控，例如增加或减少细胞向靶组织的募集；
d)降低癌症的生长速率；或
e)减少受试者中的癌细胞的数目。
361.一种向受试者递送功能的方法，其包括向所述受试者施用多种根据实施例1到70中任一项所述的融合剂脂质体、根据实施例71到97中任一项所述的融合剂脂质体组合物或根据实施例97所述的药物组合物，其中所述融合剂脂质体组合物以使得递送所述受试者中的功能的量和/或时间施用。
362.一种靶向受试者功能的方法，其包括向所述受试者施用多种根据实施例1到70中任一项所述的融合剂脂质体、根据实施例71到97中任一项所述的融合剂脂质体组合物或根据实施例97所述的药物组合物，其中所述融合剂脂质体组合物以使得靶向所述受试者中的功能的量和/或时间施用。
363.一种向受试者递送或靶向受试者功能的方法，其包括向所述受试者施用包括多个融合剂脂质体的融合剂脂质体组合物、如本文所描述的融合剂脂质体组合物或药物组合物，其中所述融合剂脂质体组合物以使得所述受试者中的功能递送或靶向的量和/或时间施用。
364.一种治疗患者的疾病或病症的方法，其包括向受试者施用多种根据实施例1到70中任一项所述的融合剂脂质体、根据实施例71到97中任一项所述的融合剂脂质体组合物或根据实施例97所述的药物组合物，其中所述融合剂脂质体组合物以使得治疗所述疾病或病症的量和/或时间施用。
365.根据实施例364所述的方法，其中所述疾病或病症是选自癌症、自身免疫病症或感染性疾病。
366.根据实施例357到365中任一项所述的方法，其中所述多个融合剂脂质体具有局部作用。
367.根据实施例357到365中任一项所述的方法，其中所述多个融合剂脂质体具有远端作用。
368.根据实施例357到365中任一项所述的方法，其中所述多个融合剂脂质体具有全身性作用。
369.根据实施例357到368中任一项所述的方法，其中所述受试者患有癌症。
370.根据实施例369所述的方法，其中所述受试者患有癌症并且所述融合剂脂质体包括新抗原。
371.根据实施例357到370中任一项所述的方法，其中所述融合剂脂质体组合物向所述受试者施用至少1、2、3、4或5次。
372.根据实施例357到370中任一项所述的方法，其中所述融合剂脂质体组合物向所述受试者全身性(例如，口服、肠胃外、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内)或局部施用。
373.根据实施例357到372中任一项所述的方法，其中所述融合剂脂质体组合物向所述受试者施用，使得融合剂脂质体组合物到达选自以下的靶组织：肝脏、肺、心脏、脾脏、胰腺、胃肠道、肾脏、睾丸、卵巢、脑、生殖器官、中枢神经系统、周围神经系统、骨骼肌、内皮、内耳或眼睛。
374.根据实施例357到373中任一项所述的方法，其中所述融合剂脂质体组合物与免疫抑制剂共施用，例如糖皮质激素、细胞生长抑制、抗体或免疫亲和素调控子。
375.根据实施例357到374中任一项所述的方法，其中所述融合剂脂质体组合物与免疫刺激剂共施用，例如佐剂、白细胞介素、细胞因子或趋化因子。
376.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中所述方法包括将药剂递送到靶细胞的胞质溶胶，任选地其中所述递送胞质溶胶的药剂为蛋白质(或编码蛋白质的核酸或与一个编码蛋白质的核酸互补的核酸，例如编码蛋白质的DNA、gDNA、cDNA、RNA、前mRNA、mRNA等)。
377.一种向人类受试者施用融合剂脂质体组合物的方法，其包括：
a)在允许将第一融合剂安置于所述受试者的一个或多个靶细胞中的条件下向所述受试者施用第一融合剂，其中以下中的一个或多个：
i)施用所述第一融合剂包括在允许所述第一融合剂在一个或多个靶细胞中表达的条件下施用编码所述第一融合剂的核酸，或
ii)第一融合剂不包括卷曲螺旋基序，以及
b)向所述人类受试者施用包括多个融合剂脂质体的融合剂脂质体组合物，所述多个融合剂脂质体包括第二融合剂，其中所述第二融合剂与所述第一融合剂相容，其中所述多个融合剂脂质体还包括有效负载(例如，膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂)；
由此向所述受试者施用融合剂脂质体组合物。
378.一种向受试者递送有效负载(例如，膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂)的方法，其包括：
a)在允许将第一融合剂安置于所述受试者的一个或多个靶细胞中的条件下向所述受试者施用第一融合剂，其中以下中的一个或多个：
i)施用所述第一融合剂包括在允许所述第一融合剂在一个或多个靶细胞中表达的条件下施用编码所述第一融合剂的核酸，或
ii)第一融合剂不包括卷曲螺旋基序，以及
b)向所述人类受试者施用包括多个融合剂脂质体的融合剂脂质体组合物，所述多个融合剂脂质体包括第二融合剂和治疗剂，其中所述第二融合剂与所述第一融合剂相容，其中所述多个融合剂脂质体还包括有效负载(例如，膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂)；
由此向所述受试者递送所述有效负载(例如，膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂)。
379.一种调控，例如增强受试者的生物功能的方法，其包括：
a)在允许将第一融合剂安置于所述受试者的一个或多个靶细胞中的条件下向所述受试者施用第一融合剂，其中以下中的一个或多个：
i)施用所述第一融合剂包括在允许所述第一融合剂在一个或多个靶细胞中表达的条件下施用编码所述第一融合剂的核酸，或
ii)第一融合剂不包括卷曲螺旋基序，以及
b)向所述人类受试者施用包括多个融合剂脂质体的融合剂脂质体组合物，所述多个融合剂脂质体包括第二融合剂，其中所述第二融合剂与所述第一融合剂相容，其中所述多个融合剂脂质体还包括有效负载(例如，膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂)；
由此调控所述受试者的生物功能。
380.根据实施例377到379中任一项所述的方法，其中所述有效负载(例如，膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂)相对于源细胞为外源性的或过度表达的。
381.根据实施例377到379中任一项所述的方法，其中所述有效负载(例如，膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂)包括或编码以下中的一个或多个：
i)转录活化子，例如表17-1的转录活化子；
ii)转录阻遏子，例如表171的转录阻遏子；
iii)表观遗传修饰剂，例如表17-1的表观遗传修饰剂；
iv)组蛋白乙酰基转移酶，例如表17-1的组蛋白乙酰基转移酶；
v)组蛋白脱乙酰基酶，例如表17-1的组蛋白脱乙酰基酶；
vi)组蛋白甲基转移酶，例如表17-1的组蛋白甲基转移酶；
vii)DNA甲基转移酶，例如表17-1的DNA甲基转移酶；
viii)DNA切口酶，例如如本文所描述的DNA切口酶；
ix)位点特异性DNA编辑酶，例如，例如表17-1的脱氨酶；
x)DNA转座酶，例如如本文所描述的DNA转座酶；
xi)DNA整合酶，例如如本文所描述的DNA整合酶；
xii)RNA编辑剂，例如表17-1的RNA编辑剂；
xiii)RNA剪接因子，例如表17-1的RNA剪接因子；或
xiv)PIWI蛋白，例如如本文所描述的PIWI蛋白。
382.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中所述多个融合剂脂质体具有局部作用或具有远端作用。
383.根据前述实施例中任一项所述的方法，其包括提供表达融合剂的源细胞包括在所述源细胞中表达外源性融合剂或上调内源性融合剂在所述源细胞中的表达。
384.根据前述实施例中任一项所述的方法，其包括使所述源细胞的细胞核灭活。
385.根据前述实施例中任一项所述的方法，其包括例如通过化学去核、使用机械力(例如使用过滤器或离心机)、至少部分破坏细胞骨架或其组合来使哺乳动物细胞去核。
386.根据前述实施例中任一项所述的方法，其包括在所述源细胞中表达融合剂或其它膜蛋白。
387.根据前述实施例中任一项所述的方法，其包括以下中的一个或多个：囊泡化、低渗处理、挤压或离心。
388.根据前述实施例中任一项所述的方法，其包括在所述源细胞中以基因方式表达外源药剂或将所述外源药剂装载到所述源细胞或融合剂脂质体中。
389.根据前述实施例中任一项所述的方法，其包括例如在灭活细胞核，例如使细胞去核之前，使所述细胞与编码多肽药剂的DNA接触。
390.根据前述实施例中任一项所述的方法，其包括例如在灭活细胞核，例如使细胞去核之前或之后，使所述细胞与编码多肽药剂的RNA接触。
391.根据前述实施例中任一项所述的方法，其包括将治疗剂(例如核酸或蛋白质)引入融合剂脂质体中，例如通过电穿孔。
392.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中所述融合剂脂质体使来自具有经修改的基因组的哺乳动物细胞，例如以降低免疫原性(例如，通过基因组编辑，例如以去除MHC蛋白)；任选地其中例如在灭活细胞核，例如使细胞去核之前或之后，所述方法还包括使步骤a)的源细胞与免疫抑制剂接触。
393.根据前述实施例中任一项所述的方法，其中如果确定可检测水平，例如高于参考值的值，那么丢弃含有多个融合剂脂质体或融合剂脂质体组合物或制剂的样品。
394.根据前述实施例中任一项所述的方法，其还包括以下步骤：
a)监测以下中的一个或多个：癌症进展、肿瘤消退、肿瘤体积、赘生性细胞数目的减少、融合细胞的数量、包括有效负载(例如，膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂)的融合细胞的数量、表达核酸蛋白有效负载的融合细胞的数量以及安置于融合细胞的膜中的膜蛋白的数量；和/或
b)监测生物体中的不良事件；任选地其中所述不良事件包含以下中的一个或多个：细胞因子释放综合征、发热、心动过速、发冷、厌食、恶心、呕吐、肌痛、头痛、毛细管渗漏综合征、低血压、肺水肿、凝血病、肾功能障碍、肾脏损伤、巨噬细胞活化综合征、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症、器官衰竭、脑水肿、T细胞活化引起的旁观者炎症、神经症状、脑病、意识模糊、幻觉、谵妄、迟钝失语、癫痫、B细胞发育不全、肿瘤溶解综合征和移植物抗宿主疾病。
395.根据实施例377到379中任一项所述的方法，其中所述第一融合剂不是脂肽。
396.根据实施例357到395中任一项所述的方法，其还包括以下的步骤：
监测以下中的一个或多个：融合细胞的数量、包括有效负载(例如，膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂)的融合细胞的数量、表达有效负载(例如，膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂)的融合细胞的数量以及安置于融合细胞的细胞核中的膜蛋白的数量。
397.根据实施例357到396中任一项所述的方法，其还包括监测生物体中的不良事件的步骤。
398.根据实施例397所述的方法，其中所述不良事件包含以下中的一个或多个：细胞因子释放综合征、发热、心动过速、发冷、厌食、恶心、呕吐、肌痛、头痛、毛细管渗漏综合征、低血压、肺水肿、凝血病、肾功能障碍、肾脏损伤、巨噬细胞活化综合征、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症、器官衰竭、脑水肿、T细胞活化引起的旁观者炎症、神经症状、脑病、意识模糊、幻觉、谵妄、迟钝失语、癫痫、B细胞发育不全、肿瘤溶解综合征和移植物抗宿主疾病。
399.根据实施例357到398中任一项所述的方法，其中所述生物体是人类。
400.根据实施例399所述的方法，其中所述人类患有疾病、病症或病状。
401.根据实施例400所述的方法，其中所述靶细胞的细胞膜脂质双层中的所述有效负载(例如，膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂，例如膜蛋白有效负载剂、核蛋白有效负载剂或细胞器蛋白有效负载剂)的存在改善所述疾病、病症或病状的一种或多种症状。
402.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中CAR为或包括：
a)第一代CAR，其包括抗原结合域、跨膜域和信号传导域(例如，一个、两个或三个信号传导域)；
b)第三代CAR，其包括抗原结合域、跨膜域和至少三个信号传导域；
c)第四代CAR，其包括抗原结合域、跨膜域、三个或四个信号传导域，和CAR成功信号传导后诱导细胞因子基因表达的域；
任选地其中所述抗原结合域为或包括scFv或Fab。
403.根据实施例401或402所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中CAR抗原结合域与表达于以下上的配体结合：B细胞、浆细胞、成浆细胞、CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD27、CD38、CD45R、CD138、CD319、BCMA、CD28、TNF、干扰素受体、GM-CSF、ZAP-70、LFA-1、CD3γ、CD5或CD2。
404.根据实施例401到403中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述CAR跨膜域包括以下的α、β或ζ链的至少跨膜区：T细胞受体、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154或其功能变体。
405.根据实施例401到404中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述跨膜域包括CD8α、CD8β、4-1BB/CD137、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40/CD134、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、TCRβ、TCRζ、CD32、CD64、CD64、CD45、CD5、CD9、CD22、CD37、CD80、CD86、CD40、CD40L/CD154、VEGFR2、FAS和FGFR2B的至少一个或多个跨膜区，或其功能变体。
406.根据实施例401到405中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述CAR包括至少一个信号传导域，所述信号传导域选自以下中的一种或多种：B7-1/CD80；B7-2/CD86；B7-H1/PD-L1；B7-H2；B7-H3；B7-H4；B7-H6；B7-H7；BTLA/CD272；CD28；CTLA-4；Gi24/VISTA/B7-H5；ICOS/CD278；PD-1；PD-L2/B7-DC；PDCD6)；4-1BB/TNFSF9/CD137；4-1BB配体/TNFSF9；BAFF/BLyS/TNFSF13B；BAFF R/TNFRSF13C；CD27/TNFRSF7；CD27配体/TNFSF7；CD30/TNFRSF8；CD30配体/TNFSF8；CD40/TNFRSF5；CD40/TNFSF5；CD40配体/TNFSF5；DR3/TNFRSF25；GITR/TNFRSF18；GITR配体/TNFSF18；HVEM/TNFRSF14；LIGHT/TNFSF14；淋巴毒素-α/TNF-β；OX40/TNFRSF4；OX40配体/TNFSF4；RELT/TNFRSF19L；TACI/TNFRSF13B；TL1A/TNFSF15；TNF-α；TNF RII/TNFRSF1B)；2B4/CD244/SLAMF4；BLAME/SLAMF8；CD2；CD2F-10/SLAMF9；CD48/SLAMF2；CD58/LFA-3；CD84/SLAMF5；CD229/SLAMF3；CRACC/SLAMF7；NTB-A/SLAMF6；SLAM/CD150)；CD2；CD7；CD53；CD82/Kai-1；CD90/Thy1；CD96；CD160；CD200；CD300a/LMIR1；HLA I类；HLA-DR；Ikaros；整合素α4/CD49d；整合素α4β1；整合素α4β7/LPAM-1；LAG-3；TCL1A；TCL1B；CRTAM；DAP12；凝集素-1/CLEC7A；DPPIV/CD26；EphB6；TIM-1/KIM-1/HAVCR；TIM-4；TSLP；TSLP R；淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)；NKG2C、CD3ζ域、基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)、CD27、CD28、4-1BB、CD134/OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体，或其功能片段。
407.根据实施例401到406中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述CAR包括CD3ζ域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能变体。在一些实施例中，所述CAR包括(i)CD3ζ域，或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能变体；(ii)CD28域，或4-1BB域，或其功能变体；和/或(iii)4-1BB域，或CD134域，或其功能变体。
408.根据实施例401到407中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述CAR还包括一种或多种间隔子，例如其中所述间隔子为所述抗原结合域与所述跨膜域之间的第一间隔子，任选地其中所述第一间隔子包含免疫球蛋白恒定区或其变体或经修饰版本的至少一部分，任选地其中所述间隔子为所述跨膜域与信号传导域之间的第二间隔子，任选地其中所述第二间隔子为寡肽，例如其中所述寡肽包括甘氨酸-丝氨酸双联体。
409.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述抗原结合域靶向赘生性细胞的抗原特征。
410.根据实施例409所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中赘生性细胞的抗原特征是选自细胞表面受体、离子通道联接受体、酶联受体、G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酯酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酰基环化酶、组氨酸激酶相关受体、表皮生长因子受体(EGFR)(包含ErbB1/EGFR、ErbB2/HER2、ErbB3/HER3和ErbB4/HER4)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)(包含FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF18和FGF21)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)(包含VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和PIGF)、RET受体和Eph受体家族(包含EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA9、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4和EphB6)、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR8、CFTR、CIC-1、CIC-2、CIC-4、CIC-5、CIC-7、CIC-Ka、CIC-Kb、斑萎蛋白、TMEM16A、GABA受体、甘氨酸受体、ABC转运蛋白、NAV1.1、NAV1.2、NAV1.3、NAV1.4、NAV1.5、NAV1.6、NAV1.7、NAV1.8、NAV1.9、神经鞘氨醇-1-磷酸酯受体(S1P1R)、NMDA通道、跨膜蛋白、多跨跨膜蛋白、T细胞受体基序；T细胞α链；T细胞β链；T细胞γ链；T细胞δ链；CCR7；CD3；CD4；CD5；CD7；CD8；CD11b；CD11c；CD16；CD19；CD20；CD21；CD22；CD25；CD28；CD34；CD35；CD40；CD45RA；CD45RO；CD52；CD56；CD62L；CD68；CD80；CD95；CD117；CD127；CD133；CD137(4-1BB)；CD163；F4/80；IL-4Ra；Sca-1；CTLA-4；GITR；GARP；LAP；颗粒酶B；LFA-1；运铁蛋白受体；NKp46、穿孔素、CD4+；Th1；Th2；Th17；Th40；Th22；Th9；Tfh、典型Treg.FoxP3+；Tr1；Th3；Treg17；TREG；CDCP1、NT5E、EpCAM、CEA、gpA33、粘蛋白、TAG-72、碳酸酐酶IX、PSMA、叶酸结合蛋白、神经节苷脂(例如CD2、CD3、GM2)、Lewis-γ2、VEGF、VEGFR 1/2/3、αVβ3、α5β1、ErbB1/EGFR、ErbB1/HER2、ErB3、c-MET、IGF1R、EphA3、TRAIL-R1、TRAIL-R2、RANKL、FAP、肌腱蛋白、PDL-1、BAFF、HDAC、ABL、FLT3、KIT、MET、RET、IL-1β、ALK、RANKL、mTOR、CTLA-4、IL-6、IL-6R、JAK3、BRAF、PTCH、平滑受体、PIGF、ANPEP、TIMP1、PLAUR、PTPRJ、LTBR或ANTXR1、叶酸受体α(FRa)、ERBB2(Her2/neu)、EphA2、IL-13Ra2、表皮生长因子受体(EGFR)、间皮素、TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、MUC16(CA125)、L1CAM、LeY、MSLN、IL13Rα1、L1-CAM、Tn Ag、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、白细胞介素-11受体a(IL-11Ra)、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、血小板衍生生长因子受体-β(PDGFR-β)、SSEA-4、CD20、MUC1、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-1受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、多唾液酸、PLACl、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、E7、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺蛋白、存活素、端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断裂点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYPIB I、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人类端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、新抗原、CD133、CD15、CD184、CD24、CD56、CD26、CD29、CD44、HLA-A、HLA-B、HLA-C、(HLA-A、B、C)CD49f、CD151CD340、CD200、tkrA、trkB或trkC，或其抗原片段或抗原部分。
411.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述抗原结合域靶向T细胞的抗原特征。
412.根据实施例411所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述T细胞的抗原特征是选自细胞表面受体、膜转运蛋白(例如，主动或被动转运蛋白，例如离子通道蛋白、成孔蛋白等)、跨膜受体、膜酶和/或T细胞的细胞粘附蛋白特征。
413.根据实施例411或412所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述T细胞的抗原特征可以是G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酰基环化酶、组氨酸激酶相关受体、AKT1；AKT2；AKT3；ATF2；BCL10；CALM1；CD3D(CD3δ)；CD3E(CD3ε)；CD3G(CD3γ)；CD4；CD8；CD28；CD45；CD80(B7-1)；CD86(B7-2)；CD247(CD3ζ)；CTLA4(CD152)；ELK1；ERK1(MAPK3)；ERK2；FOS；FYN；GRAP2(GADS)；GRB2；HLA-DRA；HLA-DRB1；HLA-DRB3；HLA-DRB4；HLA-DRB5；HRAS；IKBKA(CHUK)；IKBKB；IKBKE；IKBKG(NEMO)；IL2；ITPR1；ITK；JUN；KRAS2；LAT；LCK；MAP2K1(MEK1)；MAP2K2(MEK2)；MAP2K3(MKK3)；MAP2K4(MKK4)；MAP2K6(MKK6)；MAP2K7(MKK7)；MAP3K1(MEKK1)；MAP3K3；MAP3K4；MAP3K5；MAP3K8；MAP3K14(NIK)；MAPK8(JNK1)；MAPK9(JNK2)；MAPK10(JNK3)；MAPK11(p38β)；MAPK12(p38γ)；MAPK13(p38δ)；MAPK14(p38α)；NCK；NFAT1；NFAT2；NFKB1；NFKB2；NFKBIA；NRAS；PAK1；PAK2；PAK3；PAK4；PIK3C2B；PIK3C3(VPS34)；PIK3CA；PIK3CB；PIK3CD；PIK3R1；PKCA；PKCB；PKCM；PKCQ；PLCY1；PRF1(穿孔素)；PTEN；RAC1；RAF1；RELA；SDF1；SHP2；SLP76；SOS；SRC；TBK1；TCRA；TEC；TRAF6；VAV1；VAV2；或ZAP70。
414.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述抗原结合域靶向自身免疫或发炎性病症的抗原特征。
415.根据实施例414所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述自身免疫或发炎性病症是选自慢性移植物抗宿主疾病(GVHD)、狼疮、关节炎、免疫复合物肾小球肾炎、古德帕斯丘综合征、葡萄膜炎、肝炎、全身性硬化症或硬皮病、I型糖尿病、多发性硬化症、冷凝集素病、寻常天疱疮、格雷弗氏病、自身免疫性溶血性贫血、血友病A、原发性舍格伦综合征、血栓性血小板减少性紫癜、视神经脊髓炎、埃文氏综合征、IgM介导的神经病、冷球蛋白血症、皮肌炎、特发性血小板减少症、强直性脊柱炎、大疱性类天疱疮、获得性血管性水肿、慢性荨麻疹、抗磷脂脱髓鞘性多发性神经病和自身免疫性血小板减少症或嗜中性粒细胞减少症或纯红细胞再生障碍，然而同种异体免疫性疾病的示例性非限制性实例包含同种致敏作用(参见例如Blazar等人,2015,《美国移植杂志》,15(4):931-41)或由造血或实体器官移植、输血、胎儿同种致敏作用的妊娠、新生儿同种异体免疫性血小板减少症、新生儿溶血性疾病、对外来抗原的致敏作用引起的异种致敏作用，所述外来抗原如可以在用酶或蛋白质替代疗法、血液产品和基因疗法治疗的遗传性或获得性缺陷症的替代时出现，任选地其中所述自身免疫或发炎性病症的抗原特征是选自细胞表面受体、离子通道联接受体、酶联受体、G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酰基环化酶或组氨酸激酶相关受体。
416.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述抗原结合域靶向感染性疾病的抗原特征。
417.根据实施例416所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述感染性疾病是选自HIV、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类疱疹病毒、人类疱疹病毒8(HHV-8，卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV))、人类嗜T-淋巴细胞病毒-1(HTLV-1)、梅克尔细胞多瘤病毒(MCV)、猴病毒40(SV40)、埃-巴二氏病毒、CMV、人类乳头瘤病毒，任选地其中所述感染性疾病的抗原特征是选自细胞表面受体、离子通道联接受体、酶联受体、G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酰基环化酶、组氨酸激酶相关受体、HIV Env、gpl20或HIV-1Env上的CD4诱导的表位。
418.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述靶细胞包括聚集或错误折叠的膜蛋白。
419.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂能够降低靶细胞种的所述聚集或错误折叠的蛋白质的含量(例如，降低含量)，或本文中的方法包括降低靶细胞种的所述聚集或错误折叠的蛋白质的含量。
420.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂能够将膜蛋白递送(例如，递送)到靶细胞的细胞膜。
421.根据实施例420所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中递送所述蛋白质包括递送编码所述蛋白质的核酸(例如，DNA a gDNA、cDNA、RNA、前mRNA、mRNA等)到所述靶细胞，使得靶细胞产生所述蛋白质并且将其定位到所述膜。
422.根据实施例420或421所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体包括所述蛋白质或所述方法还包括递送所述蛋白质，并且所述融合剂脂质体与所述靶细胞的融合将所述蛋白质转移到所述靶细胞的细胞膜。
423.根据实施例420到422中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述蛋白质包括细胞表面配体或结合细胞表面受体的抗体。
424.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体还包括第二药剂或所述方法还包括递送第二药剂，所述第二药剂包括或编码第二细胞表面配体或结合细胞表面受体的抗体，并且任选地还包括或编码一种或多种额外的细胞表面配体或结合细胞表面受体的抗体(例如，1、2、3、4、5、10、20、50或更多种)。
425.根据实施例424所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述第一药剂与所述第二药剂形成复合物，其中任选地所述复合物还包括一种或多种额外的细胞表面配体。
426.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述药剂包括或编码细胞表面受体，例如相对于所述源细胞为外源性的或过度表达的细胞表面。
427.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体还包括第二药剂，或所述方法还包括递送第二药剂，所述第二药剂包括或编码第二细胞表面受体，并且任选地还包括或编码一种或多种额外的细胞表面受体(例如，1、2、3、4、5、10、20、50或更多种细胞表面受体)。
428.根据实施例427所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述第二药剂，例如治疗剂是选自蛋白质、蛋白质复合物(例如，包括至少2、3、4、5、10、20或50种蛋白质，例如至少至少2、3、4、5、10、20或50种不同的蛋白质)、多肽、核酸(例如，DNA、染色体或RNA，例如mRNA、siRNA或miRNA)或小分子。
429.根据实施例427或428所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述第一药剂与所述第二药剂形成复合物，其中任选地所述复合物还包括一种或多种额外的细胞表面受体，任选地其中所述所述药剂包括或编码抗原或抗原呈递蛋白。
430.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂递送或能够递送(例如，递送)分泌性药剂，例如将分泌性蛋白递送到靶部位(例如，细胞外区)，例如通过在允许靶细胞产生并且分泌所述蛋白质的条件下将编码蛋白质的核酸(例如，DNA、gDNA、cDNA、RNA、前mRNA、mRNA等)递送到靶细胞。
431.根据实施例430所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述分泌性蛋白相对于所述源细胞或相对于所述靶细胞为内源性或外源性的。
432.根据实施例430或431所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述分泌性蛋白包括蛋白质治疗性，例如抗体分子、细胞因子、酶、自分泌信号传导分子、旁分泌信号传导分子或分泌颗粒。
433.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂递送或能够递送(例如，递送)为或包括抗原的膜蛋白或分泌性蛋白。
434.根据实施例433所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂递送或能够递送(例如，递送)为或包括抗原抗原呈递蛋白，任选地与抗原一起(例如，作为复合物)的膜蛋白或分泌性蛋白。
435.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂供给或能够供给(例如，供给)一种或多种细胞表面受体到靶细胞(例如，免疫细胞)。
436.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述靶细胞为或包括肿瘤细胞。
437.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂递送或能够递送(例如，递送)为或包括免疫刺激配体的膜或分泌性蛋白、抗原呈递蛋白、肿瘤抑制蛋白、促细胞凋亡蛋白或前述任一个的受体或结合搭配物。
438.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体包括为免疫调控，例如免疫刺激的药剂(例如，膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂，并且任选地至少一种第二药剂)。
439.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂引起或能够引起(例如，引起)靶细胞呈现抗原。
440.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂递送或能够递送(例如，递送)核酸到靶细胞，例如以短暂修饰靶细胞中的基因表达或以例如通过整合到靶细胞的基因组种来修饰，例如以引起如本文所描述的膜蛋白(或分泌性蛋白)的表达。
441.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂递送或能够递送(例如，递送)蛋白质(例如，膜蛋白，如转运蛋白或分泌性蛋白，如免疫抑制蛋白)到靶细胞，使得靶细胞的蛋白质缺陷得以至少短暂地挽救。
442.根据实施例441所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，所述膜蛋白可以包含一个或多个共价缔合的非肽部分，例如一个或多个碳水化合物部分、脂质部分、聚乙二醇部分、小分子等，和其组合。
443.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂引起或能够引起(例如，引起)靶细胞分泌蛋白质，例如治疗蛋白。
444.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中具有细胞表面配体的所述融合剂脂质体是来自选自以下的源细胞：嗜中性粒细胞(例如，并且靶细胞是肿瘤浸润性淋巴细胞)、树突状细胞(例如，并且靶细胞是初始T细胞)或嗜中性粒细胞(例如，并且靶标是肿瘤细胞或病毒感染的细胞)。
445.根据实施例444所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体包括膜复合物，例如包括至少2、3、4或5种蛋白质的复合物，例如同型二聚体、异二聚体、同型三聚体、异三聚体、同型四聚体或异四聚体。
446.根据实施例444或445所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体包括抗体，例如毒性抗体，例如所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂能够递送(例如，递送)抗体到靶部位，例如通过归巢到靶部位。
447.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述源细胞为NK细胞或嗜中性粒细胞。
448.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中膜蛋白是选自细胞表面受体、离子通道联接受体、酶联受体、G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酯酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酰基环化酶、组氨酸激酶相关受体、表皮生长因子受体(EGFR)(包含ErbB1/EGFR、ErbB2/HER2、ErbB3/HER3和ErbB4/HER4)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)(包含FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF18和FGF21)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)(包含VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和PIGF)、RET受体和Eph受体家族(包含EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA9、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4和EphB6)、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR8、CFTR、CIC-1、CIC-2、CIC-4、CIC-5、CIC-7、CIC-Ka、CIC-Kb、斑萎蛋白、TMEM16A、GABA受体、甘氨酸受体、ABC转运蛋白、NAV1.1、NAV1.2、NAV1.3、NAV1.4、NAV1.5、NAV1.6、NAV1.7、NAV1.8、NAV1.9、神经鞘氨醇-1-磷酸酯受体(S1P1R)、NMDA通道、跨膜蛋白、多跨跨膜蛋白、T细胞受体基序；T细胞α链；T细胞β链；T细胞γ链；T细胞δ链；CCR7；CD3；CD4；CD5；CD7；CD8；CD11b；CD11c；CD16；CD19；CD20；CD21；CD22；CD25；CD28；CD34；CD35；CD40；CD45RA；CD45RO；CD52；CD56；CD62L；CD68；CD80；CD95；CD117；CD127；CD133；CD137(4-1BB)；CD163；F4/80；IL-4Ra；Sca-1；CTLA-4；GITR；GARP；LAP；颗粒酶B；LFA-1；运铁蛋白受体；NKp46、穿孔素、CD4+；Th1；Th2；Th17；Th40；Th22；Th9；Tfh、典型Treg.FoxP3+；Tr1；Th3；Treg17；TREG；CDCP1、NT5E、EpCAM、CEA、gpA33、粘蛋白、TAG-72、碳酸酐酶IX、PSMA、叶酸结合蛋白、神经节苷脂(例如CD2、CD3、GM2)、Lewis-γ2、VEGF、VEGFR 1/2/3、αVβ3、α5β1、ErbB1/EGFR、ErbB1/HER2、ErB3、c-MET、IGF1R、EphA3、TRAIL-R1、TRAIL-R2、RANKL、FAP、肌腱蛋白、PDL-1、BAFF、HDAC、ABL、FLT3、KIT、MET、RET、IL-1β、ALK、RANKL、mTOR、CTLA-4、IL-6、IL-6R、JAK3、BRAF、PTCH、平滑受体、PIGF、ANPEP、TIMP1、PLAUR、PTPRJ、LTBR或ANTXR1、叶酸受体α(FRa)、ERBB2(Her2/neu)、EphA2、IL-13Ra2、表皮生长因子受体(EGFR)、间皮素、TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、MUC16(CA125)、L1CAM、LeY、MSLN、IL13Rα1、L1-CAM、Tn Ag、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、白细胞介素-11受体a(IL-11Ra)、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、血小板衍生生长因子受体-β(PDGFR-β)、SSEA-4、CD20、MUC1、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-1受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、多唾液酸、PLACl、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、E7、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺蛋白、存活素、端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断裂点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYPIB I、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人类端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、新抗原、CD133、CD15、CD184、CD24、CD56、CD26、CD29、CD44、HLA-A、HLA-B、HLA-C、(HLA-A、B、C)CD49f、CD151CD340、CD200、tkrA、trkB或trkC。
449.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体与靶细胞或靶细胞的表面特征缔合和/或结合靶细胞或靶细胞的表面特征。
450.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂引起或能够引起蛋白质从靶细胞分泌或配体在靶细胞的表面上呈现。
451.根据实施例450所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂引起或能够引起靶细胞的细胞死亡。
452.根据实施例450或451所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体是来自NK源细胞。
453.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂感测和/或回应以下，或能够传送以下和/或对以下作出回应：一个或多个局部环境特征，例如代谢物、白细胞介素、抗原等或其组合。
454.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂具有趋化性、外渗和/或一个或多个代谢活性(例如，犬尿氨酸、葡糖新生、前列腺素脂肪酸氧化、腺苷代谢、脲循环和产热呼吸)。
455.根据实施例454所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述源细胞是：
a)嗜中性粒细胞和所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂能够归巢到损伤部位；
b)巨噬细胞和融合剂脂质体和/或其组合物或制剂能够进行吞噬作用或
c)棕色脂肪组织细胞和融合剂脂质体和/或其组合物或制剂能够脂肪分解。
456.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体：
a)所述融合剂脂质体与靶细胞的融合速率高于与非靶细胞，例如高至少至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，例如在实例54的分析中；
b)所述融合剂脂质体与靶细胞的融合速率高于其它融合剂脂质体，例如高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如在实例54的分析中；和/或
c)所述融合剂脂质体与靶细胞以使得在24、48或72小时之后所述融合剂脂质体中的药剂递送到至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的靶细胞的速率融合，例如在实例54的分析中。
457.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体：
a)以每个融合剂脂质体至少或不超过10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数存在，例如如通过实例29的分析所测量；或
b)以至少1,000个拷贝的拷贝数存在，例如如通过实例29的分析所测量。
458.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中将由融合剂脂质体构成的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的融合剂安置于细胞膜中。
459.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体还在内部包括融合剂，例如在细胞质或细胞器中。
460.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体包括：
a)在每个融合剂脂质体至少或不超过10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数下的治疗剂(例如，治疗性膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂)，例如如通过实例43的分析所测量；
b)在至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数下的蛋白质治疗剂，例如如通过实例43的分析所测量；
c)在至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数下的核酸治疗剂；
d)在至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数下的DNA治疗剂；
e)在至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数下的RNA治疗剂；
f)在至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数下的相对于源细胞为外源性的治疗剂；
g)在至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数下的相对于源细胞为外源性的蛋白质治疗剂；和/或
h)在至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数下的相对于源细胞为外源性的核酸(例如，DNA或RNA)治疗剂。
461.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂的拷贝数与所述治疗剂的拷贝数的比在1,000,000:1与100,000:1、100,000:1与10,000:1、10,000:1与1,000:1、1,000:1与100:1、100:1与50:1、50:1与20:1、20:1与10:1、10:1与5:1、5:1与2:1、2:1与1:1、1:1与1:2、1:2与1:5、1:5与1:10、1:10与1:20、1:20与1:50、1:50与1:100、1:100与1:1,000、1:1,000与1:10,000、1:10,000与1:100,000或1:100,000与1:1,000,000之间。
462.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体递送到靶细胞：
a)至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个治疗剂(例如，治疗性膜有效负载剂核有效负载剂或细胞器有效负载剂)的拷贝；
b)至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个蛋白质治疗剂的拷贝；
c)至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个核酸治疗剂的拷贝；
d)至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个RNA治疗剂的拷贝；和/或
e)至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个DNA治疗剂的拷贝。
463.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂包括：
a)0.00000001mg融合剂到1mg融合剂/mg融合剂脂质体中的总蛋白，例如0.00000001-0.0000001、0.0000001-0.000001、0.000001-0.00001、0.00001-0.0001、0.0001-0.001、0.001-0.01、0.01-0.1或0.1-1mg融合剂/mg融合剂脂质体中的总蛋白；或
b)0.00000001mg融合剂到5mg融合剂/mg融合剂脂质体中的脂质，例如0.00000001-0.0000001、0.0000001-0.000001、0.000001-0.00001、0.00001-0.0001、0.0001-0.001、0.001-0.01、0.01-0.1、0.1-1或1-5mg融合剂/mg融合剂脂质体中的脂质。
464.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂的特征在于与源细胞基本上类似的脂质组成，或其中CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM和TAG中的一个或多个在源细胞中对应脂质水平的10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％内，75％内。
465.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂的特征在于心磷脂:神经酰胺的比在源细胞中的心磷脂:神经酰胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂:二酰甘油的比在源细胞中的心磷脂:二酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂:己糖基神经酰胺的比在源细胞中的心磷脂:己糖基神经酰胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂:溶血磷脂酸酯的比在源细胞中的心磷脂:溶血磷脂酸酯的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂:溶血磷脂酰胆碱的比在源细胞中的心磷脂:溶血磷脂酰胆碱的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂:溶血磷脂酰乙醇胺的比在源细胞中的心磷脂:溶血磷脂酰乙醇胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂:溶血磷脂酰甘油的比在源细胞中的心磷脂:溶血磷脂酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂:溶血磷脂酰肌醇的比在源细胞中的心磷脂:溶血磷脂酰肌醇的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂∶溶血磷脂酰丝氨酸的比在源细胞中的心磷脂:溶血磷脂酰丝氨酸的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂:磷脂酸酯的比在源细胞中的心磷脂:磷脂酸酯的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂:磷脂酰胆碱的比在源细胞中的心磷脂:磷脂酰胆碱的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂:磷脂酰乙醇胺的比在源细胞中的心磷脂:磷脂酰乙醇胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂:磷脂酰甘油的比在源细胞中的心磷脂:磷脂酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂:磷脂酰肌醇的比在源细胞中的心磷脂:磷脂酰肌醇的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂:磷脂酰丝氨酸的比在源细胞中的心磷脂:磷脂酰丝氨酸的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂:胆固醇酯的比在源细胞中的心磷脂:胆固醇酯的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂:鞘磷脂的比在源细胞中的心磷脂:鞘磷脂的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂:三酰甘油的比在源细胞中的心磷脂:三酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱:神经酰胺的比在源细胞中的磷脂酰胆碱:神经酰胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱:二酰甘油的比在源细胞中的磷脂酰胆碱:二酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱:己糖基神经酰胺的比在源细胞中的磷脂酰胆碱:己糖基神经酰胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱:溶血磷脂酸酯的比在源细胞中的磷脂酰胆碱:溶血磷脂酸酯的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱:溶血磷脂酰胆碱的比在源细胞中的磷脂酰胆碱:溶血磷脂酰胆碱的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱:溶血磷脂酰乙醇胺的比在源细胞中的磷脂酰胆碱:溶血磷脂酰乙醇胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱:溶血磷脂酰甘油的比在源细胞的磷脂酰胆碱:溶血磷脂酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱:溶血磷脂酰肌醇的比在源细胞中的磷脂酰胆碱:溶血磷脂酰肌醇的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱:溶血磷脂酰丝氨酸的比在源细胞中的磷脂酰胆碱:溶血磷脂酰丝氨酸的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱:磷脂酸酯的比在源细胞中的心磷脂:磷脂酸酯的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱:磷脂酰乙醇胺的比在源细胞中的磷脂酰胆碱:磷脂酰乙醇胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂:磷脂酰甘油的比在源细胞中的磷脂酰胆碱:磷脂酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱:磷脂酰肌醇的比在源细胞中的磷脂酰胆碱:磷脂酰肌醇的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱:磷脂酰丝氨酸的比在源细胞中的磷脂酰胆碱:磷脂酰丝氨酸的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱:胆固醇酯的比在源细胞中的磷脂酰胆碱:胆固醇的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱:鞘磷脂的比在源细胞中的磷脂酰胆碱:鞘磷脂的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱:三酰甘油的比在源细胞中的磷脂酰胆碱:三酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺:神经酰胺的比在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:神经酰胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺:二酰甘油的比在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:二酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺:己糖基神经酰胺的比在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:己糖基神经酰胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺:溶血磷脂酸酯的比在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:溶血磷脂酸酯的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺:溶血磷脂酰胆碱的比在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:溶血磷脂酰胆碱的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺:溶血磷脂酰乙醇胺的比在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:溶血磷脂酰乙醇胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺:溶血磷脂酰甘油的比在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:溶血磷脂酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺:溶血磷脂酰肌醇的比在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:溶血磷脂酰肌醇的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺:溶血磷脂酰丝氨酸的比在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:溶血磷脂酰丝氨酸的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺:磷脂酸酯的比在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:磷脂酸酯的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺:磷脂酰甘油的比在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:磷脂酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺:磷脂酰肌醇的比在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:磷脂酰肌醇的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺:磷脂酰丝氨酸的比在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:磷脂酰丝氨酸的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺:胆固醇酯的比在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:胆固醇酯的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺:鞘磷脂的比在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:鞘磷脂的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺:三酰甘油的比在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:三酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸:神经酰胺的比在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:神经酰胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸:二酰甘油的比在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:二酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸:己糖基神经酰胺的比在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:己糖基神经酰胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸:溶血磷脂酸酯的比在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:溶血磷脂酸酯的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸:溶血磷脂酰胆碱的比在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:溶血磷脂酰胆碱的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸:溶血磷脂酰乙醇胺的比在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:溶血磷脂酰乙醇胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸:溶血磷脂酰甘油的比在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:溶血磷脂酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸:溶血磷脂酰肌醇的比在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:溶血磷脂酰肌醇的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸:溶血磷脂酰丝氨酸的比在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:溶血磷脂酰丝氨酸的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸:磷脂酸酯的比在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:磷脂酸酯的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸:磷脂酰甘油的比在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:磷脂酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸:磷脂酰肌醇的比在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:磷脂酰肌醇的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸:胆固醇酯的比在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:胆固醇酯的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸:鞘磷脂的比在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:鞘磷脂的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸:三酰甘油的比在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:三酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂:神经酰胺的比在源细胞中的鞘磷脂:神经酰胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂:二酰甘油的比在源细胞中的鞘磷脂:二酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂:己糖基神经酰胺的比在源细胞中的鞘磷脂:己糖基神经酰胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂:溶血磷脂酸酯的比在源细胞中的鞘磷脂:溶血磷脂酸酯的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂:溶血磷脂酰胆碱的比在源细胞中的鞘磷脂:溶血磷脂酰胆碱的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂:溶血磷脂酰乙醇胺的比在源细胞中的鞘磷脂:溶血磷脂酰乙醇胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂:溶血磷脂酰甘油的比在源细胞中的鞘磷脂:溶血磷脂酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂:溶血磷脂酰肌醇的比在源细胞中的鞘磷脂:溶血磷脂酰肌醇的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂:溶血磷脂酰丝氨酸的比在源细胞中的鞘磷脂:溶血磷脂酰丝氨酸的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂:磷脂酸酯的比在源细胞中的鞘磷脂:磷脂酸酯的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂:磷脂酰甘油的比在源细胞中的鞘磷脂:磷脂酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂:磷脂酰肌醇的比在源细胞中的鞘磷脂:磷脂酰肌醇的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂:胆固醇酯的比在源细胞中的鞘磷脂:胆固醇的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂:三酰甘油的比在源细胞中的鞘磷脂:三酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯:神经酰胺的比在源细胞中的胆固醇酯:神经酰胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯:二酰甘油的比在源细胞中的胆固醇酯:二酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯:己糖基神经酰胺的比在源细胞中的胆固醇酯:己糖基神经酰胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯:溶血磷脂酸酯的比在源细胞中的胆固醇酯:溶血磷脂酸酯的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯:溶血磷脂酰胆碱的比在源细胞中的胆固醇酯:溶血磷脂酰胆碱的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯:溶血磷脂酰乙醇胺的比在源细胞中的胆固醇酯:溶血磷脂酰乙醇胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯:溶血磷脂酰甘油的比在源细胞中的胆固醇酯:溶血磷脂酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯:溶血磷脂酰肌醇的比在源细胞中的胆固醇酯:溶血磷脂酰肌醇的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯:溶血磷脂酰丝氨酸的比在源细胞中的胆固醇酯:溶血磷脂酰丝氨酸的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯:磷脂酸酯的比在源细胞中的胆固醇酯:磷脂酸酯的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯:磷脂酰甘油的比在源细胞中的胆固醇酯:磷脂酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯:磷脂酰肌醇的比在源细胞中的胆固醇酯:磷脂酰肌醇的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯:三酰甘油的比在源细胞中的胆固醇酯:三酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内。
466.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂的特征在于：
a)类似于源细胞的蛋白质组学组成，例如使用实例42的分析；
b)脂质:蛋白质的比在源细胞中的对应比的10％、20％、30％、40％或50％内，例如如使用实例49的分析所测量；
c)蛋白质:核酸(例如DNA或RNA)的比在源细胞中的对应比的10％、20％、30％、40％或50％内，例如如使用实例50的分析所测量；
d)蛋白质:DNA的比大于源细胞中的对应比，例如大至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如如使用实例50的分析所测量；
e)脂质:核酸(例如DNA)的比在源细胞中的对应比的10％、20％、30％、40％或50％内，例如如使用实例51的分析所测量；和/或
f)脂质:核酸(例如DNA)的比大于源细胞中的对应比，例如大至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如如使用实例51的分析所测量。
467.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂的特征在于：
a)在受试者，例如小鼠中的半衰期在参考细胞，例如源细胞的半衰期的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％内，例如根据实例75的分析；或
b)在受试者，例如小鼠中的半衰期为至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时或24小时，例如在人类受试者或小鼠中，例如根据实例75的分析。
468.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂转运或能够输送葡萄糖(例如，经标记的葡萄糖，例如2-NBDG)跨越膜，例如比阴性对照(例如不存在葡萄糖的以其它方式类似的融合剂脂质体)多至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，例如如使用实例64的分析所测量。
469.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂的特征在于：
a)内腔中的酯酶活性在参考细胞(例如源细胞或小鼠胚胎成纤维细胞)中的酯酶活性的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内，例如使用实例66的分析；
b)代谢活性水平(例如柠檬酸合酶活性)在参考细胞(例如源细胞)中的代谢活性水平的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内，例如如实例68中所描述；
c)代谢活性水平(例如柠檬酸合酶活性)在参考细胞(例如源细胞)中的代谢活性水平的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内，例如如实例68中所描述；
d)呼吸水平(例如耗氧速率)在参考细胞(例如源细胞)中的呼吸水平的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内，例如如实例69中所描述；
e)呼吸水平(例如耗氧速率)在参考细胞(例如源细胞)中的呼吸水平的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内，例如如实例69中所描述；和/或
f)膜联蛋白-V染色水平为至多18,000、17,000、16,000、15,000、14,000、13,000、12,000、11,000或10,000MFI，例如使用实例70的分析，或其中所述融合剂脂质体包括比经实例70的分析中的甲萘醌处理的以其它方式类似的融合剂脂质体或其一种组成物或制剂的膜联蛋白-V染色水平低至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的膜联蛋白-V染色水平。
470.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂，其中所述融合剂脂质体包括比经实例70的分析中的甲萘醌处理的巨噬细胞的膜联蛋白-V染色水平低至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的膜联蛋白-V染色水平。
471.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂的特征在于：
a)miRNA含量水平比所述源细胞的miRNA含量水平大至少至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，例如根据实例39的分析；
b)miRNA含量水平为源细胞的所述miRNA含量水平的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大(例如源细胞的miRNA含量水平的至多100％)，例如根据实例39的分析；
c)总RNA含量水平为源细胞的总RNA含量水平的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大(例如源细胞的总RNA含量水平的至多100％)，例如如通过实例108的分析所测量；
d)可溶:不可溶蛋白质的比在所述源细胞的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大内，例如在所述源细胞的1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％内，例如根据实例47的分析；和/或
e)LPS水平小于融合剂脂质体的脂质含量的5％、1％、0.5％、0.01％、0.005％、0.0001％、0.00001％或更小，例如如通过实例48的分析所测量。
472.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂能够进行信号转导，例如传输细胞外信号，例如回应于胰岛素的AKT磷酸化或回应于胰岛素的葡萄糖(例如，经标记的葡萄糖，例如2-NBDG)摄取，例如比阴性对照(例如不存在胰岛素的以其它方式类似的融合剂脂质体)大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，例如使用实例63的分析。
473.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中当时向受试者，例如小鼠施用时，所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂，其中所述融合剂脂质体靶向组织，例如肝脏、肺、心脏、脾脏、胰腺、胃肠道、肾脏、睪丸、卵巢、脑、生殖器官、中枢神经系统、周围神经系统、骨骼肌、内皮、内耳或眼睛，例如其中在24、48或72小时之后所施用的融合剂脂质体的群体中的至少0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的融合剂脂质体存在于靶组织中，例如根据实例87或100的分析。
474.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂的特征在于：
a)近分泌信号传导水平比由参考细胞(例如源细胞或骨髓基质细胞(BMSC))诱导的近分泌信号传导水平大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如根据实例71的分析；
b)近分泌信号传导水平为由参考细胞(例如源细胞或骨髓基质细胞(BMSC))诱导的近分泌信号传导水平的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(例如，直至100％)，例如根据实例71的分析；
c)旁分泌信号传导水平比由参考细胞(例如源细胞或巨噬细胞)诱导的旁分泌信号传导水平大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，例如根据实例72的分析；
d)旁分泌信号传导水平为由参考细胞(例如源细胞或巨噬细胞)诱导的旁分泌信号传导水平的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(例如，直至100％)，例如根据实例72的分析；
e)相比于参考细胞(例如源细胞或C2C12细胞)中的聚合肌动蛋白的水平，以在1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内的水平聚合肌动蛋白，例如根据实例73的分析；和/或
f)膜电位在参考细胞(例如源细胞或C2C12细胞)的膜电位的约1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％内，例如根据实例74的分析，或其中所提供的融合剂脂质体和/或其组合物或制剂的特征在于膜电位约-20mV到-150mV、-20mV到-50mV、-50mV到-100mV或-100mV到-150mV，或其中所述融合剂脂质体的膜电位小于-1mv、-5mv、-10mv、-20mv、-30mv、-40mv、-50mv、-60mv、-70mv、-80mv、-90mv、-100mv。
475.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂能够从血管外渗，例如以源细胞的外渗速率的至少1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的速率，例如使用实例57的分析，例如其中所述源细胞为嗜中性粒细胞、淋巴细胞、B细胞、巨噬细胞或NK细胞，任选地其中所提供的融合剂脂质体和/或其组合物或制剂能够具有趋化性，例如相比于参考细胞(例如巨噬细胞)为至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(例如直至100％)，例如使用实例58的分析。
476.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂能够进行吞噬作用，例如相比于参考细胞(例如巨噬细胞)的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(例如直至100％)，例如使用实例60的分析。
477.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂能够穿过细胞膜，例如内皮细胞膜或血脑屏障。
478.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂能够：
a)分泌蛋白质，例如以比参考细胞(例如小鼠胚胎成纤维细胞)大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的速率，例如使用实例62的分析；或
b)分泌蛋白质，例如相比于参考细胞(例如小鼠胚胎成纤维细胞)，以至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(例如直至100％)的速率，例如使用实例62的分析。
479.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂不能够：
a)转录或具有参考细胞(例如源细胞)的转录活性的小于1％、2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的转录活性，例如使用实例19的分析；或
b)进行核DNA复制或具有参考细胞(例如源细胞)的核DNA复制的小于1％、2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的核DNA复制，例如使用实例20的分析。
480.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂缺乏染色质或具有参考细胞(例如源细胞)的染色质含量的小于1％、2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的染色质含量，例如使用实例37的分析。
481.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂符合药物或良好生产规范(GMP)标准或是根据GMP制得。
482.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂：
a)特征在于病原体水平低于预定参考值，例如基本上不含病原体；
b)包括低于预定参考值的污染物(例如，核组分，如核DNA)，例如基本上不含一种或多种指定污染物；和/或
c)特征在于低免疫原性，例如如本文所描述。
483.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述源细胞或靶细胞为内皮细胞、成纤维细胞、血细胞(例如巨噬细胞、嗜中性粒细胞、粒细胞、白细胞)、干细胞(例如间质干细胞、脐带干细胞、骨髓干细胞、造血干细胞、诱导多能干细胞，例如衍生自受试者的细胞的诱导多能干细胞)、胚胎干细胞(例如来自胚胎卵黄囊、胎盘、脐带、胎儿皮肤、青少年皮肤、血液、骨髓、脂肪组织、红细胞生成组织、造血组织的干细胞)、成肌细胞、实质细胞(例如肝细胞)、肺泡细胞、神经元(例如视网膜神经元细胞)、前体细胞(例如视网膜前体细胞、成髓细胞、骨髓前体细胞、胸腺细胞、性母细胞、成巨核细胞、幼巨核细胞、成黑素细胞、成淋巴细胞、骨髓前体细胞、正成红细胞或成血管细胞)、祖细胞(例如心肌祖细胞、卫星细胞、放射状胶质细胞、骨髓基质细胞、胰腺祖细胞、内皮祖细胞、胚细胞)或永生化细胞(例如HeLa、HEK293、HFF-1、MRC-5、WI-38、IMR90、IMR 91、PER.C6、HT-1080或BJ细胞)，任选地其中所述源细胞不是293细胞、HEK细胞、人类内皮细胞或人类上皮细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或干细胞，任选地其中所述源细胞或靶细胞为白细胞或干细胞，任选地其中所述源细胞或靶细胞是选自嗜中性粒细胞、淋巴细胞(例如，T细胞、B细胞、自然杀伤细胞)、巨噬细胞、粒细胞、间质干细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、胚胎干细胞或成髓细胞。
484.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述源细胞为：
a)在粘附或悬浮条件下生长的细胞
b)原代细胞、经培养的细胞、永生化细胞或细胞系(例如原始粒细胞系，例如C2C12)；
c)同种异体的，例如从与靶细胞相同的物种的不同生物体获得；
d)自体的，例如从与靶细胞相同的生物体获得；或
e)异源的，例如从与靶细胞不同的物种的生物体获得。
485.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述源细胞包括对源细胞为外源性的第二药剂，例如治疗剂，例如蛋白质a核酸(例如RNA，例如mRNA或miRNA)。
486.根据实施例485所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述第二药剂以由所述融合剂脂质体构成的至少或不超过10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000或1,000,000个拷贝存在，或以每个融合剂脂质体至少或不超过10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000或1,000,000个拷贝的平均水平存在。
487.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述靶细胞在生物体中，例如从生物体分离的原代细胞。
488.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述靶向域与靶细胞上的靶细胞部分相互作用，例如细胞表面特征。
489.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体不包括所述靶细胞部分。
490.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体包括与靶细胞上的融合剂结合搭配物相互作用的融合剂，由此使得所述融合剂脂质体与靶细胞结合或融合，任选地其中所述融合剂脂质体不包括所述融合剂结合搭配物。
491.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述靶向域不是融合剂的一部分或其中所述融合剂包括所述靶向域。
492.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂结合搭配物为与靶细胞部分不同的实体或为与靶细胞部分不同的实体的一部分，或其中所述融合剂结合搭配物为靶细胞部分或为靶细胞部分的一部分。
493.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体通过内吞作用进入靶细胞，例如其中通过内吞路径所递送的药剂(例如，膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂，并且任选地第二药剂)的水平为0.01-0.6、0.01-0.1、0.1-0.3或0.3-0.6，或比与类似的融合剂脂质体接触的经氯奎处理的参考细胞大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，例如使用实例91的分析。
494.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中进入靶细胞的融合剂脂质体组合物或制剂中的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的融合剂脂质体通过非内吞路径进入，例如融合剂脂质体通过与细胞表面融合进入靶细胞，任选地其中进入靶细胞的融合剂脂质体组合物或制剂中的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的融合剂脂质体进入细胞质(例如，并不进入内体或溶酶体)。
495.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中进入靶细胞的融合剂脂质体组合物或制剂中的小于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的融合剂脂质体进入内体或溶酶体。
496.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体通过非内吞路径进入靶细胞，例如其中所递送的药剂(例如，膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂，并且任选地第二药剂)的水平为经氯奎处理的参考细胞的至少90％、95％、98％或99％，例如使用实例91的分析。
497.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体通过发动蛋白介导的路径将药剂(例如，膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂，并且任选地第二药剂)递送到靶细胞，例如其中通过发动蛋白介导的路径所递送的药剂(例如，膜蛋白有效负载剂和/或第二药剂)的水平在0.01-0.6范围内，或比与类似的融合剂脂质体接触的经Dynasore处理的靶细胞大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，例如如实例92的分析中所测量。
498.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体通过微胞饮将药剂(例如，膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂，并且任选地第二药剂)递送到靶细胞，例如通过巨胞饮所递送的药剂(例如，膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂，并且任选地第二药剂)的水平在0.01-0.6范围内，或比与类似的融合剂脂质体接触的经EIPA处理的靶细胞大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，例如如实例92的分析中所测量。
499.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体通过肌动蛋白介导的路径将药剂(例如，膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂，并且任选地第二药剂)递送到靶细胞，例如其中通过肌动蛋白介导的路径所递送的药剂(例如，膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂，并且任选地第二药剂)的水平在0.01-0.6范围内，或比与类似的融合剂脂质体接触的经Latrunculin B处理的靶细胞大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，例如如实例92的分析中所测量。
500.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂的密度为<1、1-1.1、1.05-1.15、1.1-1.2、1.15-1.25、1.2-1.3、1.25-1.35或>1.35g/mL，例如根据实例33的分析。
501.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中以蛋白质质量计，所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂包括小于0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％或10％的源细胞，其中小于0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％或10％的细胞具有功能性核。
502.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中融合剂脂质体组合物或制剂中的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的融合剂脂质体包括细胞器，例如线粒体。
503.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂包括相对于源细胞为外源性的治疗剂。
504.根据实施例503所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中：
a)所述治疗剂相对于靶细胞为外源性的；和/或
b)所述外源性治疗剂是选自以下中的一种或多种：蛋白质，例如跨膜蛋白、细胞表面蛋白、分泌性蛋白、受体、抗体；核酸，例如DNA、染色体(例如人类人工染色体)、RNA、mRNA、siRNA、miRNA或小分子。
505.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体通过内吞作用或通过非内吞路径进入细胞。
506.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂不包括核。
507.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体基本上不含核DNA。
508.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂：
a)经冷藏或冷冻；
b)不包括功能性核，和/或所提供的融合剂脂质体组合物或制剂包括一种或多种不具有功能性核的融合剂脂质体；
c)按蛋白质质量计，包括小于0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％或10％的源细胞，或小于0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％或10％的细胞具有功能性核。
d)已在所述温度下保持至少1、2、3、6或12小时；1、2、3、4、5或6天；1、2、3或4周；1、2、3或6个月；或1、2、3、4或5年；和/或
e)特征在于活性为在维持于所述温度下之前的群体的活性的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％，例如通过以下中的一个或多个：
i)与靶细胞的融合速率高于与非靶细胞，例如高至少至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，例如在实例54的分析中；
ii)与靶细胞的融合速率高于与其它融合剂脂质体，例如高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如在实例54的分析中；
iii)与靶细胞以使得在24、48或72小时之后所述融合剂脂质体中的药剂递送到至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的靶细胞的速率融合，例如在实例54的分析中；或
iv)至少或不超过10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000或1,000,000个拷贝的拷贝数的融合剂水平，例如如通过实例29的分析所测量。
509.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂在以下温度下：
a)小于4℃下稳定至少1、2、3、6或12；1、2、3、4、5或6天；1、2、3或4周；1、2、3或6个月；或1、2、3、4或5年；
b)小于-20℃下稳定至少1、2、3、6或12小时；1、2、3、4、5或6天；1、2、3或4周；1、2、3或6个月；或1、2、3、4或5年；或
c)小于-80℃下稳定至少1、2、3、6或12；1、2、3、4、5或6天；1、2、3或4周；1、2、3或6个月；或1、2、3、4或5年。
510.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中以下中的一个或多个为真实的：
i)源细胞不是293细胞；
ii)源细胞未被转化或永生化；
iii)源细胞是使用除腺病毒介导的永生化以外的方法来转化或永生化，例如通过自发突变或端粒酶表达来永生化；
iv)融合剂不是VSVG、SNARE蛋白或分泌性颗粒蛋白；
v)治疗剂不是Cre或GFP，例如EGFP；
vi)治疗剂为对源细胞(例如抗体，例如抗体)为外源性的核酸(例如RNA，例如mRNA、miRNA或siRNA)或蛋白质，例如在内腔中；或
vii)所述融合剂脂质体不包括线粒体。
511.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中以下中的一个或多个为真实的：
i)源细胞不是293或HEK细胞；
ii)源细胞未被转化或永生化；
iii)源细胞是使用除腺病毒介导的永生化以外的方法来转化或永生化，例如通过自发突变或端粒酶表达来永生化；
iv)融合剂不是病毒融合剂；或
v)所述融合剂脂质体的直径不在40nm与150nm之间，例如大于150nm、200nm、300nm、400nm或500nm。
512.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中以下中的一个或多个为真实的：
i)所述膜蛋白由源细胞表达；
ii)所述融合剂不是TAT、TAT-HA2、HA-2、gp41、阿尔茨海默氏β-淀粉样肽、仙台病毒蛋白或两亲性净阴性肽(WAE 11)；
iii)所述融合剂是哺乳动物融合剂；
iv)所述融合剂脂质体在其内腔中包括选自酶、抗体或抗病毒多肽的多肽；
v)所述融合剂脂质体不包括治疗性跨膜蛋白，例如相对于源细胞为外源性的治疗性跨膜蛋白；或
vi)所述融合剂脂质体不包括CD63或GLUT4。
513.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中以下中的一个或多个为真实的：
i)不包括病毒、无感染性或不在宿主细胞中繁殖；
ii)不是病毒样粒子(VLP)；
iii)不包括病毒结构蛋白，例如病毒衣壳蛋白，例如病毒核衣壳蛋白，或其中病毒衣壳蛋白的量小于总蛋白的10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％，例如根据实例53的分析；
iv)不包括病毒基质蛋白；
v)不包括病毒非结构蛋白；
vi)病毒结构蛋白的每个囊泡小于10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000、1,000,000,000个拷贝；或
vii)所述融合剂脂质体不是病毒体。
514.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体上的所述融合剂的拷贝数与病毒结构蛋白的拷贝数的比为至少1,000,000:1、100,000:1、10,000:1、1,000:1、100:1、50:1 1、20:1、10:1、5:1或1:1；或其中所述融合剂脂质体上的所述融合剂的拷贝数与病毒基质蛋白的拷贝数的比为至少1,000,000:1、100,000:1、10,000:1、1,000:1、100:1、50:1、20:1、10:1、5:1或1:1。
515.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中以下中的一个或多个为真实的：
i)融合剂脂质体不包括水不可混溶的液滴；
ii)所述融合剂脂质体包括水性内腔和亲水性外部；
iii)所述融合剂为蛋白质融合剂。
516.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中以下中的一个或多个为真实的：
i)所述融合剂为哺乳动物融合剂或病毒融合剂；
ii)所述融合剂脂质体不是通过用治疗性或诊断性物质装载所述融合剂脂质体而制成；
iii)所述源细胞不负载有治疗性或诊断性物质；
iv)所述融合剂脂质体不包括小红莓、地塞米松、环糊精；聚乙二醇、微RNA(例如miR125)、VEGF受体、ICAM-1、E-选择素、氧化铁、荧光蛋白(例如GFP或RFP)、纳米粒子或RNA酶，或不包括前述中对源细胞为外源性的任一种的外源性形式；或
v)所述融合剂脂质体还包括对源细胞为外源性的，具有一种或多种翻译后修饰，例如糖基化的治疗剂。
517.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体为单层或多层的。
518.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物或融合剂脂质体制剂的特征在于：
a)直径在源细胞直径的约0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％内，例如如通过实例30的分析所测量；
b)直径为源细胞直径的小于约0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，例如如通过实例30的分析所测量；
c)直径在源细胞直径的约0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％内，例如如通过实例30的分析所测量；
d)直径为源细胞直径的小于约0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％，如通过实例30的分析所测量；
e)直径为至少约10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、150nm、200nm或250nm，例如如通过实例32的分析所测量；
f)直径为至少约10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、150nm、200nm或250nm(例如±20％)，例如如通过实例32的分析所测量；
g)直径为至少约500nm、750nm、1,000nm、1,500nm、2,000nm、2,500nm、3,000nm、5,000nm、10,000nm或20,000nm，例如如通过实例32的分析所测量；
h)直径为约500nm、750nm、1,000nm、1,500nm、2,000nm、2,500nm、3,000nm、5,000nm、10,000nm或20,000nm(例如±20％)，如通过实例32的分析所测量；和/或
i)直径大于5μm、6μm、7μm、8μm、10μm、20μm、50μm、100μm、150μm或200μm。
519.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物或融合剂脂质体制剂的体积为源细胞体积的小于约0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％％。
520.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物或融合剂脂质体制剂的密度不在1.08g/mL与1.12g/mL之间，任选地其中所述密度为1.25g/mL+/-0.05，例如如通过实例33的分析所测量，任选地其中所述密度为<1、1-1.1、1.05-1.15、1.1-1.2、1.15-1.25、1.2-1.3、1.25-1.35或>1.35g/mL，例如根据实例33的分析。
521.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中以下中的一个或多个为真实的：
i)所述融合剂脂质体不是外泌体；
ii)所述融合剂脂质体为微囊泡；
iii)所述融合剂脂质体包括非哺乳动物融合剂；
iv)所述融合剂脂质体已经工程改造以包括融合剂；
v)所述融合剂脂质体包括相对于源细胞为外源性的融合剂或过度表达的融合剂；
vi)所述融合剂脂质体的直径为至少80nm、100nm、200nm、500nm、1000nm、1200nm、1400nm或1500nm，或多个融合剂脂质体群体的平均直径为至少80nm、100nm、200nm、500nm、1000nm、1200nm、1400nm或1500nm；
vii)所述融合剂脂质体包括一个或多个细胞器，例如线粒体、高尔基体、溶酶体、内质网、液泡、内体、顶体、自噬体、中心粒、糖酵解酶体、乙醛酸循环体、氢化酶体、黑素体、纺锤剩体、刺丝囊、过氧化物酶体、蛋白酶体、囊泡和应激颗粒；
viii)所述融合剂脂质体包括细胞骨架或其组分，例如肌动蛋白、Arp2/3、形成蛋白、冠蛋白、肌缩蛋白、角蛋白、肌球蛋白或微管蛋白；
ix)包括多个融合剂脂质体的制剂不具有1.08-1.22g/ml的浮动密度或具有至少1.18-1.25g/ml或1.05-1.12g/ml的密度，例如在蔗糖梯度离心分析中，例如如Théry等人,“外泌体从细胞培养上清液和生物学流体的分离和表征”《细胞生物学实验指南》2006年4月；第3章：第3.22节中所描述；
x)相比于源细胞，脂质双层富含神经酰胺或鞘磷脂或其组合，或相比于源细胞，脂质双层不富含(例如耗尽)糖脂、游离脂肪酸或磷脂酰丝氨酸或其组合；
xi)所述融合剂脂质体包括磷脂酰丝氨酸(PS)或CD40配体或PS和CD40配体两者，例如当在实例52的分析中测量时；
xii)相比于源细胞，融合剂脂质体富含PS，例如在融合剂脂质体群体中，至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％对PS呈阳性，例如根据Kanada M等人(2015)通过细胞外囊泡递送到靶细胞的生物分子的差异性命运(Differential fates ofbiomolecules delivered to target cells via extracellular vesicles.)《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)》112:E1433-E1442；
xiii)所述融合剂脂质体基本上不含乙酰胆碱酯酶(AChE)，或含有小于0.001、0.002、0.005、0.01,0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500或1000个AChE活性单元/μg蛋白质，例如根据实例67的分析；
xiv)所述融合剂脂质体基本上不含四跨膜蛋白家族蛋白(例如CD63、CD9或CD81)、ESCRT相关蛋白(例如TSG101、CHMP4A-B或VPS4B)、Alix、TSG101、MHCI、MHCII、GP96、辅肌动蛋白-4、线粒体内膜蛋白、同线蛋白-1、TSG101、ADAM10、EHD4、同线蛋白-1、TSG101、EHD1、脂阀结构蛋白-1、热休克70kDa蛋白(HSC70/HSP73、HSP70/HSP72)或其任何组合，或含有小于0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、5％或10％的任何个别外泌体标记蛋白和/或小于0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％或25％的任何所述蛋白的总外泌体标记蛋白，或相比于所述源细胞脱富集这些蛋白质中的任一种或多种，或不富含这些蛋白质中的任一种或多种，例如根据实例44的分析；
xv)所述融合剂脂质体包括水平低于500、250、100、50、20、10、5或1ng GAPDH/ug总蛋白或低于源细胞中的GAPDH水平的甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，例如比源细胞中以ng/μg为单位的GAPDH/总蛋白水平低了小于1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如使用实例45的分析；
xvi)所述融合剂脂质体富含一种或多种内质网蛋白(例如钙连蛋白)、一种或多种蛋白酶体蛋白或一种或多种线粒体蛋白，或其任何组合，例如其中钙连蛋白的量小于500、250、100、50、20、10、5或1ng钙连蛋白/μg总蛋白，或其中相比于所述源细胞，所述融合剂脂质体包括以ng/μg为单位的每总蛋白的更少的钙连蛋白，少1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如使用实例46的分析；
xvii)所述融合剂脂质体包括相对于源细胞为外源性的药剂(例如，蛋白质、mRNA或siRNA)，例如如使用实例39或40的分析所测量；或
xviii)所述融合剂脂质体可以通过原子力显微镜固定于云母表面上至少30分钟，例如根据Kanada M等人(2015)通过细胞外囊泡递送到靶细胞的生物分子的差异性命运《美国国家科学院院刊》112:E1433-E1442。
522.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中以下中的一个或多个为真实的：
i)所述融合剂脂质体为外泌体；
ii)所述融合剂脂质体不是微囊泡；
vi)所述融合剂脂质体的直径小于80nm、100nm、200nm、500nm、1000nm、1200nm、1400nm或1500nm，或多个融合剂脂质体群体的平均直径为至少80nm、100nm、200nm、500nm、1000nm、1200nm、1400nm或1500nm；
iv)所述融合剂脂质体不包括细胞器；
v)所述融合剂脂质体不包括细胞骨架或其组分，例如肌动蛋白、Arp2/3、形成蛋白、冠蛋白、肌缩蛋白、角蛋白、肌球蛋白或微管蛋白；
vi)包括多个融合剂脂质体的制剂具有1.08-1.22g/ml的浮动密度，例如在蔗糖梯度离心分析中，例如如Théry等人,“外泌体从细胞培养上清液和生物体液的分离和表征”《细胞生物学实验指南》2006年4月；第3章：第3.22节中所描述；
vii)相比于源细胞，脂质双层并不富含(例如耗尽)神经酰胺或鞘磷脂或其组合，或相比于源细胞，脂质双层富含糖脂、游离脂肪酸或磷脂酰丝氨酸或其组合；
viii)相对于源细胞，所述融合剂脂质体不包括或耗尽磷脂酰丝氨酸(PS)或CD40配体或PS和CD40配体两者，例如当在实例52的分析中测量时；
ix)相比于源细胞，融合剂脂质体不富含(例如耗尽)PS，例如在融合剂脂质体群体中，小于20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％对PS呈阳性，例如根据Kanada M等人(2015)通过细胞外囊泡递送到靶细胞的生物分子的差异性命运《美国国家科学院院刊》112:E1433-E1442；
x)所述融合剂脂质体包括乙酰胆碱酯酶(AChE)，例如至少0.001、0.002、0.005、0.01,0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500或1000个AChE活性单位/μg蛋白质，例如根据实例67的分析；
xi)所述融合剂脂质体包括四跨膜蛋白家族蛋白(例如CD63、CD9或CD81)、ESCRT相关蛋白(例如TSG101、CHMP4A-B或VPS4B)、Alix、TSG101、MHCI、MHCII、GP96、辅肌动蛋白-4、线粒体内膜蛋白、同线蛋白-1、TSG101、ADAM10、EHD4、同线蛋白-1、TSG101、EHD1、脂阀结构蛋白-1、热休克70kDa蛋白(HSC70/HSP73、HSP70/HSP72)或其任何组合，或含有大于0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、5％或10％的任何个别外泌体标记蛋白和/或小于0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％或25％的任何所述蛋白的总外泌体标记蛋白，或相比于源细胞富含这些蛋白质中的任何一种或多种，例如根据实例44的分析；
xii)所述融合剂脂质体包括水平高于500、250、100、50、20、10、5或1ng GAPDH/μg总蛋白或低于源细胞中的GAPDH水平的甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，例如比源细胞中以ng/μg为单位的GAPDH/总蛋白水平大至少1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如使用实例45的分析；
xiii)所述融合剂脂质体并不富含(例如耗尽)一种或多种内质网蛋白(例如钙连蛋白)、一种或多种蛋白酶体蛋白或一种或多种线粒体蛋白，或其任何组合，例如其中钙连蛋白的量小于500、250、100、50、20、10、5或1ng钙连蛋白/μg总蛋白，或其中相比于所述源细胞，所述融合剂脂质体包括以ng/μg为单位的每总蛋白的更少的钙连蛋白，低1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如使用实例46的分析；或
xiv)所述融合剂脂质体可以不通过原子力显微镜固定于云母表面上至少30分钟，例如根据Kanada M等人(2015)通过细胞外囊泡递送到靶细胞的生物分子的差异性命运《美国国家科学院院刊》112:E1433-E1442。
523.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中以下中的一个或多个为真实的：
i)所述融合剂脂质体不包括VLP；
ii)所述融合剂脂质体不包括病毒；
iii)所述融合剂脂质体不包括复制胜任型病毒；
iv)所述融合剂脂质体不包括病毒蛋白，例如病毒结构蛋白，例如衣壳蛋白或病毒基质蛋白；
v)所述融合剂脂质体不包括来自包膜病毒的衣壳蛋白；
vi)所述融合剂脂质体不包括核衣壳蛋白；或
vii)所述融合剂不是病毒融合剂。
524.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体包括胞质溶胶。
525.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体包括或由细胞生物物质构成。
526.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体包括或由去核细胞构成。
527.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体包括或由软骨体构成。
528.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中以下中的一个或多个为真实的：
i)所述融合剂脂质体或所述源细胞在植入受试者体内时不形成畸胎瘤，例如根据实例102的分析；
ii)所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂能够具有趋化性，例如在相比于参考细胞(例如巨噬细胞)的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大内，例如使用实例58的分析；
iii)所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂能够在例如损伤部位处归巢，其中所述融合剂脂质体是来自人类细胞，例如使用实例59的分析，例如其中源细胞为嗜中性粒细胞；或
iv)所述融合剂脂质体和/或其组合物或制剂能够进行吞噬作用，例如其中通过所述融合剂脂质体的吞噬作用在使用实例60的分析中在0.5、1、2、3、4、5或6小时内可检测到，例如其中所述源细胞为巨噬细胞。
529.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物或融合剂脂质体制剂在向受试者，例如人类受试者施用之后，保持任何特征中的一个、二个、三个、四个、五个、六个或更多个5天或更短，例如4天或更短、3天或更短、2天或更短、1天或更短，例如约12-72小时。
530.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体具有以下特征中的一个或多个：
a)包括来自源细胞的一种或多种内源蛋白，例如膜蛋白或胞质蛋白；
b)包括至少10、20、50、100、200、500、1000、2000或5000种不同的蛋白质；
c)包括至少1、2、5、10、20、50或100种不同的糖蛋白；
d)所述融合剂脂质体中至少10质量％、20质量％、30质量％、40质量％、50质量％、60质量％、70质量％、80质量％或90质量％的蛋白质为天然存在的蛋白质；
e)包括至少10、20、50、100、200、500、1000、2000或5000种不同的RNA；或
f)包括至少2、3、4、5、10或20种不同的脂质，例如选自CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM和TAG。
531.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体经操控以具有，或其中所述融合剂脂质体不是天然存在的细胞并且具有，或其中细胞核并不天然地具有以下特性中的一个、两个、三个、四个、五个或更多个：
a)部分核灭活导致核功能降低至少50％、60％、70％、80％、90％或更多，例如转录或DNA复制降低或两者均降低，例如其中根据实例19的分析来测量转录并根据实例20的分析来测量DNA复制；
b)所述融合剂脂质体不能够转录或具有参考细胞(例如源细胞)的转录活性的小于1％、2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的转录活性，例如使用实例19的分析；
c)所述融合剂脂质体不能够进行核DNA复制或具有参考细胞(例如源细胞)的核DNA复制的小于1％、2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的核DNA复制，例如使用实例20的分析；
d)所述融合剂脂质体缺乏染色质或具有为参考细胞(例如源细胞)的染色质含量的小于1％、2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的染色质含量，例如使用实例37的分析；
e)所述融合剂脂质体缺乏核膜或具有为参考细胞(例如源细胞或杰卡特细胞)的核膜量的小于50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的核膜量，例如根据实例36的分析；
f)所述融合剂脂质体缺乏功能性核孔复合物或具有降低的核输入或输出活性，例如根据实例36的分析降低了至少50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％，或所述融合剂脂质体缺乏一种或多种核孔蛋白，例如NUP98或输入蛋白7。
g)所述融合剂脂质体不包括组蛋白或具有为源细胞(例如H1、H2a、H2b、H3或H4)的组蛋白水平的小于1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的组蛋白水平，例如根据实例37的分析；
h)所述融合剂脂质体包括小于20、10、5、4、3、2或1个染色体；
i)核功能被消除；
j)所述融合剂脂质体为去核的哺乳动物细胞；
k)通过机械力、通过辐射或通过化学消融将核去除或灭活(例如挤出)；或
l)所述融合剂脂质体是来自例如在分裂间期或有丝分裂期间具有完全或部分去除的DNA的哺乳动物细胞。
532.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中融合剂脂质体包括mtDNA或载体DNA，例如其中所述融合剂脂质体不包括DNA或基本上不含DNA。
533.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述源细胞为原代细胞、永生化细胞或细胞系(例如原始粒细胞系，例如C2C12)。
534.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体是来自具有经修饰的基因组的源细胞，例如具有降低的免疫原性(例如，通过基因组编辑，例如以去除MHC蛋白，例如MHC复合物)。
535.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述源细胞是来自经免疫抑制剂处理的细胞培养物。
536.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述源细胞基本上为非免疫原性的，例如使用本文所描述的分析
537.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述源细胞包括外源药剂，例如治疗剂。
538.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述源细胞为重组细胞。
539.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述源细胞是来自经抗炎信号处理的细胞培养物。
540.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体还包括相对于源细胞为外源性的药剂，例如治疗性膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂，例如蛋白质或核酸(例如，DNA、染色体(例如人类人工染色体)、RNA，例如mRNA或miRNA)；例如其中所述外源药剂以至少或不超过10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝存在。
541.根据实施例381所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体具有更改的，例如增加或降低的一种或多种内源性分子的水平，例如蛋白质或核酸(例如，在一些实施例中，相对于源细胞为内源性的，并且在一些实施例中，相对于靶细胞为内源性的)，例如由于源细胞的处理，例如用siRNA或基因编辑酶处理的哺乳动物源细胞。
542.根据实施例540或541所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述内源性分子是：
a)以至少或不超过10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝存在；
b)以比其在源细胞中的浓度大至少1、2、3、4、5、10、20、50、100、500、103、5.0×103、104、5.0×104、105、5.0×105、106、5.0×106、1.0×107、5.0×107或1.0×108的浓度存在；
c)以比其在源细胞中的浓度小至少1、2、3、4、5、10、20、50、100、500、103、5.0×103、104、5.0×104、105、5.0×105、106、5.0×106、1.0×107、5.0×107或1.0×108的浓度存在。
543.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂：
a)为病毒融合剂，例如HA、HIV-1ENV、gp120或VSV-G；
b)为哺乳动物融合剂，例如勒除器、合胞素、成肌蛋白、肌混合蛋白、肌合并蛋白或FGFRL1；
c)在4-5、5-6、6-7、7-8、8-9或9-10的pH下具有活性；
d)在4-5、5-6、6-7、7-8、8-9或9-10的pH下不具有活性；
e)在靶细胞的表面处与靶细胞融合；
f)以溶酶体非依赖性方式促进融合；
g)为蛋白质融合剂；
h)为脂质融合剂，例如油酸、单油酸甘油酯、甘油酯、二酰甘油或经改性的不饱和脂肪酸；
i)为化学融合剂，例如PEG；任选地其中所述融合剂为小分子融合剂，例如氟烷，如美洛昔康、吡罗昔康、替诺昔康和氯丙嗪的NSAID；
j)为重组的；
k)以生物化学方式并入，例如融合剂以纯化蛋白的形式提供并在允许融合剂与脂质双层缔合的条件下与脂质双层接触；和/或
l)以生物合成方式并入，例如在允许融合剂与脂质双层缔合的条件下在源细胞中表达。
544.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂结合靶细胞，例如除HeLa细胞以外的靶细胞，例如靶细胞未经转化或永生化。
545.根据实施例544所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中未经转化的细胞显示接触抑制和/或其生长取决于与相同类型的正常细胞相同的存活因子或生长因子。
546.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体组合物或融合剂脂质体制剂，其中多个融合剂脂质体是相同的或是不同的。
547.根据实施例546所述的融合剂脂质体组合物或融合剂脂质体制剂，其中多个融合剂脂质体是：
a)来自一种、两种或更多种类型的源细胞；和/或
b)如果融合剂脂质体组合物中的至少0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％的融合剂脂质体共用至少一个选自以下的特性，那么为相同有的：包括相同的融合剂；使用相同类型的源细胞产生；或包括相同的有效负载(例如，膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂)。
548.根据实施例546或547所述的融合剂脂质体组合物或融合剂脂质体制剂，其中：
a)多个融合剂脂质体中的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的融合剂脂质体直径在融合剂脂质体组合物或制剂中的融合剂脂质体的平均直径的10％、20％、30％、40％或50％内；或
b)多个融合剂脂质体中的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的融合剂脂质体的体积在融合剂脂质体组合物或制剂中的融合剂脂质体的平均体积的10％、20％、30％、40％或50％内。
549.根据实施例546到548中任一项所述的融合剂脂质体组合物或融合剂脂质体制剂，其中所述融合剂脂质体组合物或制剂的小于约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％的直径分布变化率在源细胞群体的直径分布变化率的10％、50％或90％内，例如基于实例31。
550.根据实施例546到549中任一项所述的融合剂脂质体组合物或融合剂脂质体制剂，其中多个融合剂脂质体中的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的融合剂脂质体的融合剂的拷贝数在融合剂脂质体组合物或制剂中的融合剂脂质体中的平均融合剂拷贝数的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％内。
551.根据实施例546到550中任一项所述的融合剂脂质体组合物或融合剂脂质体制剂，其中多个融合剂脂质体中的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的融合剂脂质体的治疗剂的拷贝数在融合剂脂质体组合物或制剂中的融合剂脂质体中的平均治疗剂拷贝数的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％内。
552.根据实施例546到551中任一项所述的融合剂脂质体组合物或融合剂脂质体制剂，其中所述融合剂脂质体组合物或制剂包括至少105、106、107、108、109或1010个或更多个融合剂脂质体。在一些实施例中，所述融合剂脂质体组合物或制剂体积为至少1μL、2μL、5μL、10μL、20μL、50μL、100μL、200μL、500μL、1mL、2mL、5mL或10mL。
553.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体组合物或融合剂脂质体制剂，其中所述多个融合剂脂质体包括至少0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％的具有以下特征中的一个或多个的融合剂脂质体：
(i)不包括核或功能性核；
(ii)基本上不含核DNA；或
(iii)不包括线粒体或功能性线粒体。
554.根据前述实施例中任一项所述的药物组合物，其中以下中的一个或多个为真实的：
a)所述药物组合物符合药物或良好生产规范(GMP)标准；
b)所述药物组合物是根据良好生产规范(GMP)制得；
c)所述药物组合物的病原体水平低于预定参考值，例如基本上不含病原体；
d)所述药物组合物的污染物水平(例如核DNA)低于预定参考值，例如基本上不含污染物；或
e)所述药物组合物具有低免疫原性，例如如本文所描述。
555.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述生物功能是选自：
a)调控，例如抑制或刺激酶；
b)调控，例如增加或降低受试者中分子(例如蛋白质、核酸或代谢物、药物或毒素)的水平，例如通过抑制或刺激合成或通过抑制或刺激因子降解；
c)调控，例如增加或降低靶细胞或组织的活力；或
d)调控蛋白质状态，例如增加或降低蛋白质的磷酸化，或调控蛋白质构象；
e)促进损伤愈合；
f)调控，例如增加或减少两个细胞之间的相互作用；
g)调控，例如促进或抑制细胞分化；
h)改变受试者中因子(例如蛋白质、核酸、代谢物、药物或毒素)的分布；
i)调控，例如增加或减少免疫应答；或
j)调控，例如增加或减少细胞向靶组织的募集；
556.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述受试者患有癌症、发炎性病症、自身免疫性疾病、慢性疾病、发炎、器官功能受损、感染性疾病、代谢疾病、退行性病症、遗传病(例如遗传缺陷或显性遗传病症)或损伤。
557.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述受试者患有感染性疾病并且所述融合剂脂质体包括针对感染性疾病的抗原。
558.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述受试者患有遗传缺陷并且所述融合剂脂质体包括受试者缺乏的蛋白质或编码所述蛋白质的核酸(例如DNA、gDNA、cDNA、RNA、前mRNA、mRNA等)，或编码所述蛋白质的DNA，或编码所述蛋白质的染色体，或包括编码所述蛋白质的核酸的核。
559.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述受试者患有显性遗传病症，并且所述融合剂脂质体包括显性突变等位基因的核酸抑制剂(例如siRNA或miRNA)。
560.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述受试者患有显性遗传病症，并且所述融合剂脂质体包括显性突变等位基因的核酸抑制剂(例如siRNA或miRNA)，并且所述融合剂脂质体还包括编码突变基因的非突变等位基因的mRNA，所述突变基因的非突变等位基因不由核酸抑制剂靶向。
561.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述受试者需要接种疫苗和/或需要再生，例如损伤部位再生。
562.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体包括还包括一个或多个编码一个或多个信号序列的序列的核酸，例如其中靶细胞将包括信号序列的蛋白质易位到靶细胞的细胞膜。
563.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体组合物或制剂是：
a)向所述受试者施用至少1、2、3、4或5次；
b)向所述受试者全身性(例如，口服、肠胃外、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内)或局部施用；
c)向所述受试者施用，使得所述融合剂脂质体组合物或制剂到达选自以下的靶组织：肝脏、肺、心脏、脾脏、胰脏、胃肠道、肾脏、睾丸、卵巢、脑、生殖器官、中枢神经系统、周围神经系统、骨骼肌、内皮、内耳或眼睛；
d)与免疫抑制剂，例如糖皮质激素、细胞生长抑制、抗体或免疫亲和素调控子共施用；和/或
e)与免疫刺激剂，例如佐剂、白细胞介素、细胞因子或趋化因子共施用。
564.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体组合物或制剂的施用引起受试者中靶细胞中的基因的上调或下调，例如其中所述融合剂脂质体包括转录活化子或阻遏子、翻译活化子或阻遏子，或表观遗传活化子或阻遏子。
565.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体制剂包括：
a)至少105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014或1015个融合剂脂质体；和/或
b)至少10mL、20mL、50mL、100mL、200mL、500mL、1L、2L、5L、10L、20L或50L的总体积。
566.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中第一融合剂不是脂肽。
567.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物或融合剂脂质体制剂具有部分或完全核灭活(例如核去除)。
568.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述源细胞为：
a)在粘附或悬浮条件下生长的细胞；
b)原代细胞、经培养的细胞、永生化细胞或细胞系(例如原始粒细胞系，例如C2C12)；
c)同种异体的，例如从与靶细胞相同的物种的不同生物体获得；
d)异源的，例如从与靶细胞不同的物种的生物体获得。
569.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体不被以下捕获：
a)循环中的清除系统或肝窦中的库普弗细胞；或
b)受试者中的网状内皮系统(RES)，例如根据实例76的分析。
570.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中当向受试者施用多个融合剂脂质体时，在24小时之后，小于1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的所述多个融合剂脂质体未被RES捕获，例如根据实例76的分析。
571.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体包括病毒结构蛋白和/或病毒基质蛋白。
572.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体基本上不含或具有较低数目的以下细胞器中的一种或多种：线粒体、高尔基体、溶酶体、内质网、液泡、内体、顶体、自噬体、中心粒、糖酵解酶体、乙醛酸循环体、氢化酶体、黑素体、纺锤剩体、刺丝囊、过氧化物酶体、蛋白酶体、囊泡和应激颗粒，例如相比于源细胞。
573.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体不包括Cre或GFP，例如EGFP。
574.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体组合物或药物组合物在预定温度下保持至少1、2、3、6或12小时；1、2、3、4、5或6天；1、2、3或4周；1、2、3或6个月；或1、2、3、4或5年；和/或其中所述预定温度是选自约4℃、0℃、-4℃、-10℃、-12℃、-16℃、-20℃、-80℃或-160℃。
575.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体组合物或药物组合物在保持在所述温度下之前具有所述多个融合剂脂质体的活性的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的活性，例如通过以下中的一个或多个：
i)所述融合剂脂质体与靶细胞的融合速率高于与非靶细胞，例如，高至少至少10％，例如在实例54的分析中；
ii)所述融合剂脂质体与靶细胞的融合速率高于与其它融合剂脂质体，例如，高至少50％，例如在实例54的分析中；
iii)所述融合剂脂质体与靶细胞以使得在24小时之后所述融合剂脂质体中的药剂递送到至少10％的靶细胞的速率融合，例如在实例54的分析中；或
iv)在保持在所述温度下之前，所述融合剂以所述多个融合剂脂质体的融合剂拷贝数的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的拷贝数存在，例如如通过实例29的分析所测量。
576.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中如果所述融合剂脂质体组合物或药物组合物在存储在所述温度下所述时段之前具有所述多个融合剂脂质体的活性的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的活性，那么所述融合剂脂质体组合物或药物组合物视为稳定的，例如通过以下中的一个或多个：
i)所述融合剂脂质体与靶细胞的融合速率高于与非靶细胞，例如，高至少至少10％，例如在实例54的分析中；
ii)所述融合剂脂质体与靶细胞的融合速率高于与其它融合剂脂质体，例如，高至少50％，例如在实例54的分析中；
iii)所述融合剂脂质体与靶细胞以使得在24小时之后所述融合剂脂质体中的药剂递送到至少10％的靶细胞的速率融合，例如在实例54的分析中；或
iv)在保持在所述温度下之前，所述融合剂以所述多个融合剂脂质体的融合剂拷贝数的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的拷贝数存在，例如如通过实例29的分析所测量。
577.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述疾病或病症是选自癌症、自身免疫病症或感染性疾病。
578.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体包括新抗原。
579.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体组合物：
a)施用受试者至少1、2、3、4或5次；
b)全身性(例如，口服、肠胃外、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内)或局部施用受试者；和/或
c)施用受试者，使得所述融合剂脂质体组合物到达选自以下的靶组织：肝脏、肺、心脏、脾脏、胰脏、胃肠道、肾脏、睾丸、卵巢、脑、生殖器官、中枢神经系统、周围神经系统、骨骼肌、内皮、内耳或眼睛。
580.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述融合剂脂质体组合物与以下共施用：
d)免疫抑制剂，例如糖皮质激素、细胞生长抑制、抗体或免疫亲和素调控子；和/或
b)免疫刺激剂，例如佐剂、白细胞介素、细胞因子或趋化因子。
581.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述多个融合剂脂质体具有局部、远端或全身性作用。
582.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中所述生物体是人类，例如其中人类患有疾病、病症或病状。
583.根据实施例582所述的融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、融合剂脂质体制剂或方法，其中在靶细胞的细胞膜脂质双层中存在膜有效负载剂、核有效负载剂或细胞器有效负载剂改善疾病、病症或病状的一种或多种症状。
本文中的任一个方面，例如上述融合剂脂质体、融合剂脂质体组合物、制剂和方法可以与本文中的实施例中的一个或多个，例如本文所描述的实施例中的一个或多个组合。
本发明的其它特征、目标和优势将在
具体实施方式
和附图以及权利要求书中显而易见。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。本文所提及的所有公开、专利申请、专利和其它参考文献都以全文引用的方式并入。举例来说，本文中(例如本文的任何表中)所提及的所有GenBank、Unigene和Entrez序列都以引用的方式并入。除非另外说明，否则本文中(包含本文的任何表中)所指定的序列登录号都指截至2018年2月17日的当前数据库条目。当一种基因或蛋白质参考多个序列登录号时，涵盖所有的序列变体。另外，材料、方法和实例仅是说明性的并且并不意欲是限制性的。
附图说明
当结合附图阅读时将更好地理解本发明的以下详细描述。出于说明本发明的目的，在本文所描述的图式中示出了某些实施例，其为当前示例的。然而，应理解，本发明不限于图式中示出的实施例的精确布置和手段。
图1定量了对于内质网，用染料对融合剂脂质体的染色。
图2定量了对于线粒体，用染料对融合剂脂质体的染色。
图3定量了对于溶酶体，用染料对融合剂脂质体的染色。
图4定量了对于F-肌动蛋白，用染料对融合剂脂质体的染色。
图5是示出在对与表达Cre和GFP的融合剂脂质体接触的细胞进行光漂白后，GFP荧光的恢复的图示。
图6是示出在与融合剂脂质体或阴性对照接触后，表达RFP的靶细胞的百分比的图示。
图7是通过供体与接受者HeLa细胞之间的融合的阳性细胞器递送的图像。以白色指示的细胞内区域指示供体与接受者线粒体之间的重叠。灰色的细胞内区域指示供体与接受者细胞器不重叠的区域。
图8是通过供体与接受者HeLa细胞之间的融合的阳性细胞器递送的图像。以白色指示的细胞内区域指示供体与接受者线粒体之间的重叠。灰色的细胞内区域指示供体与接受者细胞器不重叠的区域。
图9示出来自注射了融合剂脂质体的小鼠的指定组织的显微镜图像。白色指示代表RFP荧光细胞，指示将蛋白质货物体内递送到细胞。
图10为一系列图像，展示通过指定的施用途径将融合剂脂质体成功地体内递送到鼠类组织，引起通过靶向细胞表达荧光素酶。
图11展示鼠类肌肉组织中的tdTomato荧光的显微镜图像，其指示通过细胞生物制剂将蛋白质货物递送到肌肉细胞。
具体实施方式
本发明描述包含膜蛋白有效负载剂的融合剂脂质体和相关方法。
定义
药剂：一般来说，如本文所使用，术语“药剂”可以用于指代化合物或包含例如肽、多肽、核酸(例如DNA、染色体(例如人类人工染色体)、RNA、mRNA、siRNA、miRNA)、醣或多醣、脂质、小分子或其组合或复合物的实体。术语可以指是或包括细胞器或其洗脱份、提取物或组分的实体。
抗体：如本文所使用，术语“抗体”是指包含足以赋予特定目标抗原特异性结合的典型免疫球蛋白序列元件的多肽。出于本发明的目的，在某些实施例中，包含足够的免疫球蛋白域序列以赋予抗原特异性结合的任何多肽或多肽复合物可以指和/或用作“抗体”，无论这类多肽是天然产生的(例如由与抗原反应的生物体产生)，还是通过重组工程改造、化学合成或其它人工系统或方法产生。在一些实施例中，抗体是多克隆的；在一些实施例中，抗体是单克隆的。在一些实施例中，抗体具有恒定区序列，其具有小鼠、兔、灵长类动物或人类抗体的特征。在一些实施例中，抗体序列元件是人类化的、灵长类化的、嵌合的等。在实施例中，根据本发明利用的抗体呈选自(但不限于)以下的形式：完整IgA、IgG、IgE或IgM抗体；双特异性或多特异性抗体(例如等)；抗体片段，如Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fd'片段、Fd片段和分离的CDR或其集合；单链Fv；多肽-Fc融合物；单域抗体(例如鲨鱼单域抗体，如IgNAR或其片段)；骆驼抗体；被遮蔽的抗体(例如)；小型模块化免疫药物(“SMIPsTM”)；单链或串联双链抗体VHH； 微型抗体；锚蛋白重复蛋白或DART；TCR样抗体；MicroProteins；以及在一些实施例中，抗体可能缺乏在其天然产生情况下将具有的共价修饰(例如聚糖的粘附)。在一些实施例中，抗体可以含有共价修饰(例如聚糖、有效负载[例如可检测部分、治疗性部分、催化部分等]或其它侧基[例如聚乙二醇等]的粘附)。在一些实施例中，上文所描述的形式中的任一个的抗体包括一个或多个互补决定区，例如CDR1、CD2和/或CDR3。
抗原结合域：如本文所使用，术语“抗原结合域”是指抗体的所述部分或结合抗原的嵌合抗原受体。在一些实施例中，抗原结合域结合到细胞的细胞表面抗原。在一些实施例中，抗原结合域结合癌症的抗原特征，例如赘生性细胞中的肿瘤相关抗原。在一些实施例中，抗原结合域结合感染性疾病的抗原特征，例如病毒感染细胞中的病毒相关抗原。在一些实施例中，抗原结合域结合被自身免疫性疾病中的受试者的免疫系统靶向的细胞的抗原特征，例如自身抗原。在一些实施例中，抗原结合域为或包括抗体或其抗原结合部分。在一些实施例中，抗原结合域为或包括scFv或Fab。
与...缔合：在一些实施例中，如果两个或更多个实体直接或间接相互作用，使得其彼此具有和/或保持物理接近性，那么其彼此以物理方式“缔合”。在一些实施例中，以物理方式彼此缔合的两个或更多个实体彼此共价连接；在一些实施例中，以物理方式彼此缔合的两个或更多个实体不彼此共价连接，而是以非共价形式缔合，例如借助于氢键、凡得瓦尔力相互相用(van der Waals interaction)、疏水性相互作用、磁性和其组合。
癌症：本文所使用的术语“癌症”、“恶性肿瘤”、“赘瘤”、“肿瘤”及“癌瘤”指代展现相对较异常、不受控制和/或自主性生长，使其展现以明显失去控制的细胞增殖为特征的异常生长表型的细胞。在一些实施例中，肿瘤可以是或包括癌前(例如良性)、恶性、转移前、转移性和/或非转移性的细胞。本公开明确地说鉴别其教示内容肯呢个特别相关的某些癌症。在一些实施例中，相关癌症可以通过实体肿瘤表征。在一些实施例中，肿瘤可以是分散肿瘤或液体肿瘤。在一些实施例中，相关癌症可以通过血液肿瘤表征。一般来说，所属领域中已知的不同类型的癌症的实例包含例如白血病；淋巴瘤(霍奇金氏和霍奇金氏)；骨髓瘤和骨髓增生性病症；肉瘤；黑素瘤；腺瘤；实体组织癌瘤；口腔、咽、喉和肺的鳞状细胞癌；肝癌；泌尿生殖道癌，如前列腺癌、宫颈癌、膀胱癌、子宫癌和子宫内膜癌；以及肾细胞癌、骨癌、胰脏癌、皮肤癌、皮肤或眼内黑素瘤、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、头颈癌、乳腺癌、胃肠道癌和神经系统癌、良性病变，如乳头状瘤等。
货物：如本文所使用，“货物”或“有效负载”包括可以由融合剂脂质体递送到靶细胞的药剂。在一些实施例中，货物包括一种或多种治疗剂，例如于源细胞为内源性或外源性的治疗剂。在一些实施例中，治疗剂是选自以下中的一种或多种：蛋白质，例如酶、跨膜蛋白、受体、抗体；核酸，例如DNA、染色体(例如人类人工染色体)、RNA、mRNA、siRNA、miRNA或小分子。在一些实施例中，货物为或包括膜蛋白有效负载剂。在一些实施例中，货物为或包括细胞器。
CDR：如本文所使用，“CDR”是指互补决定区，例如，其可以位于抗体可变区内。在重链和轻链的可变区中的每一个中有三个CDR，对于可变区中的每一个，其被命名为CDR1、CDR2和CDR3。“CDR的组”或“CDR组”是指在能够结合抗原的单一可变区中存在的三个或六个CDR群组或能够结合抗原的同源重链和轻链可变区的CDR。所属领域中已确立用于定义CDR边界的某些系统(例如，Kabat、Chothia等)；所属领域的技术人员了解这些系统之间的差异，并且能够以理解和实践所要求的发明所需的程度理解CDR边界。
细胞膜：如本文所使用，“细胞膜”是指源自细胞，例如源细胞或靶细胞的膜。
细胞生物物质：如本文所使用，“细胞生物物质”是指包括内腔和细胞膜的细胞的一部分，或具有部分或完全核灭活的细胞。在一些实施例中，细胞生物物质包括细胞骨架组分、细胞器和核糖体中的一种或多种。在实施例中，细胞生物物质为去核细胞、微囊泡或细胞影。
胞质溶胶：如本文所使用，“胞质溶胶”是指细胞的细胞质的水性组分。胞质溶胶可以包括蛋白质、RNA、代谢物和离子。
内源性：如本文所使用，术语“内源性”是指药剂，例如天然地发现于相关系统(例如，细胞、组织、生物体、源细胞或靶细胞等)中的蛋白质或脂质。举例来说，在一些实施例中，当相关脂质和/或蛋白质天然地发现于获得或衍生融合剂脂质体或膜封闭制剂的源细胞(例如融合剂脂质体或膜封闭制剂的源细胞)中时，融合剂脂质体或膜封闭制剂可以称为含有一种或多种“内源性”脂质和/或蛋白质。在一些实施例中，内源药剂在源细胞中过度表达。
外源性：如本文所使用，术语“外源性”是指不是天然地发现于相关系统(例如，细胞、组织、生物体、源细胞或靶细胞等)中的药剂(例如蛋白质或脂质)。在实施例中，药剂经工程改造和/或引入相关系统中，举例来说，在一些实施例中，当相关脂质和/或蛋白质并非天然地发现于获得或衍生融合剂脂质体或膜封闭制剂的源细胞(例如，融合剂脂质体或膜封闭制剂的源细胞)中时，融合剂脂质体或膜封闭制剂可以称为含有一种或多种“外源性”脂质和/或蛋白质。在一些实施例中，外源药剂为内源药剂的变体，如在一个或多个结构方面(如氨基酸序列、翻译后修饰等)与参考内源性蛋白质等不同的蛋白质变体。
功能性变体：术语“功能性变体”是指具有与参考氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列或由基本上相同的核苷酸序列编码并且能够具有参考氨基酸序列的一个或多个活性的多肽。
融合细胞：如本文所使用，“融合细胞”是指通过使一个或多个融合剂脂质体与靶细胞接触产生的细胞。在融合细胞的一些实施例中，一个或多个融合剂脂质体的脂质双层的至少一部分与靶细胞的膜缔合。
融合剂：如本文所使用，“融合剂”是指在两个膜封闭内腔之间产生相互作用的药剂或分子。在实施例中，融合剂促进膜的融合。在其它实施例中，融合剂在两个内腔(例如融合剂脂质体与靶细胞的细胞质的内腔)之间产生连接，例如孔隙。在一些实施例中，融合剂包括两种或更多种蛋白质的复合物，例如其中两种蛋白质都不具有单独的融合活性。
融合剂结合搭配物：如本文所使用，“融合剂结合搭配物”是指与融合剂相互作用以促进两个膜之间的融合的药剂或分子。在一些实施例中，融合剂结合搭配物可以为或包括细胞的表面特征。
融合剂脂质体组合物：如本文所使用，“融合剂脂质体组合物”是指包括一个或多个融合剂脂质体的组合物。
膜蛋白有效负载剂：如本文所使用，“膜蛋白有效负载剂”是指为或包括膜蛋白和/或编码膜蛋白的核酸的货物，所述货物可以包含于如本文所描述的融合剂脂质体或膜封闭制剂中(例如，用于递送到靶细胞)。膜蛋白为与细胞膜缔合(例如，定位于细胞膜中和/或细胞膜上)或能够与细胞膜缔合的蛋白质。在一些实施例中，膜蛋白为跨膜蛋白。在一些实施例中，膜蛋白包括至少部分(例如完全)跨越膜(例如细胞膜)的域。在一些实施例中，膜蛋白与膜脂质双层的内部(例如，胞质)部分缔合。在一些实施例中，膜蛋白与膜脂质双层的外部部分缔合(例如，与细胞表面或与如本文所描述的融合剂脂质体或膜封闭制剂的表面缔合)。在一些实施例中，与膜脂质双层的外部部分缔合的膜蛋白是细胞表面蛋白。在一些实施例中，膜蛋白穿过膜脂质双层并且是分泌性的。在一些实施例中，膜蛋白为天然存在的蛋白质。在一些实施例中，膜蛋白为经工程改造和/或合成蛋白(例如嵌合抗原受体)。在一些实施例中，膜蛋白为治疗剂。
核有效负载剂：如本文所使用，“核有效负载剂”是指为或包括或编码定位到细胞核的药剂的货物，所述货物可以包含于如本文所描述的融合剂脂质体或膜封闭制剂中(例如，用于递送到靶细胞)。在一些实施例中，核有效负载剂变得优先富集于核质、核仁、核仁外周区域、卡哈尔体、碎晶体、宝石核体、组蛋白基因座体(HLB)、核小点、核应力体、旁斑、PML体、多梳体。在一些实施例中，核有效负载剂为核蛋白有效负载剂。在一些实施例中，核有效负载剂包括功能性核酸和/或非编码核酸。
核蛋白有效负载剂：如本文所使用，“核蛋白有效负载剂”是指为或包括核蛋白和/或编码核蛋白的核酸的货物，所述货物可以包含于如本文所描述的融合剂脂质体或膜封闭制剂中(例如，用于递送到靶细胞)。核蛋白为与细胞核缔合或能够与细胞核缔合的蛋白质。在一些实施例中，核蛋白变得优先富集于核质、核仁、核仁外周区域、卡哈尔体、碎晶体、宝石核体、组蛋白基因座体(HLB)、核小点、核应力体、旁斑、PML体、多梳体。在一些实施例中，核蛋白为天然存在的蛋白质。在一些实施例中，核蛋白为经工程改造和/或合成蛋白。在一些实施例中，核蛋白为治疗剂。
细胞器有效负载剂：如本文所使用，“细胞器有效负载剂”是指为或包括或编码定位到胞质细胞器的药剂的货物，所述货物可以包含于如本文所描述的融合剂脂质体或膜封闭制剂中(例如，用于递送到靶细胞)。细胞核不是胞质细胞器。在一些实施例中，细胞器是膜结合细胞器。在其它实施例中，细胞器不是膜结合细胞器。在一些实施例中，胞质细胞器为线粒体、高尔基体、内质网、液泡、顶体、自噬体、中心粒、糖酵解酶体、乙醛酸循环体、氢化酶体、黑素体、纺锤剩体、刺丝囊、过氧化物酶体、蛋白酶体、囊泡、应激颗粒、溶酶体或内体。在一些实施例中，细胞器有效负载剂为细胞器蛋白有效负载剂。在一些实施例中，细胞器有效负载剂包括功能性核酸和/或非编码核酸。
细胞器蛋白有效负载剂：如本文所使用，“细胞器蛋白有效负载剂”是指为或包括变得优先富集于胞质细胞器的蛋白质和/或编码所述蛋白质的核酸的货物，所述货物可以包含于如本文所描述的融合剂脂质体或膜封闭制剂中(例如，用于递送到靶细胞)。在一些实施例中，蛋白质为经工程改造和/或合成蛋白。在一些实施例中，蛋白质为治疗剂。
药物组合物：如本文所使用，术语“药物组合物”是指与一种或多种药学上可接受的载体一起配制的活性剂。在一些实施例中，活性剂以适合于以治疗方案向相关受试者施用的单位剂量量存在。在一些实施例中，药物组合物可以专门配制成用于肠胃外施用，例如以例如无菌溶液或悬浮液或持续释放配制物通过皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射。
药学上可接受的载剂：如本文所使用，术语“药学上可接受的载剂”意指药学上可接受的材料、组合物或媒剂，如液体或固体填充剂、稀释剂或赋形剂。
优先富集：如本文所使用，“优先富含”于靶细胞的特定区域中的药剂是指以相比于细胞的至少一个参考区域的更高的浓度存在于特定区域的药剂。在一些实施例中，参考区域为胞质溶胶。在一些实施例中，优先富含于靶细胞的特定区域中的药剂以相比于细胞的每个其它区域更高的浓度存在于特定区域中。在一些实施例中，优先富集于靶细胞的特定区域中的药剂以比参考区域(例如胞质溶胶或质膜)中的浓度高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、5倍或10倍的浓度存在。“优先富集”和“富集”在本文中可互换地使用。
纯化：如本文所使用，术语“纯化”意指从自然状态改变或去除。举例来说，天然存在于活体动物中的细胞或细胞片段不是“纯化的”，但从其自然状态的共存材料部分或完全分离的相同细胞或细胞片段是“纯化的”。纯化的融合剂脂质体组合物可以基本上纯的形式存在，或可以存在于非天然环境，例如培养基，如包括细胞的培养基中。
源细胞：如本文所使用，“源细胞”是指衍生(例如获得)融合剂脂质体的细胞。在一些实施例中，衍生包含从源细胞获得膜封闭制剂并且添加融合剂。
基本上一致：在核苷酸序列的情形下，术语“基本上一致”在本文中用以指第一核酸序列，所述第一核酸序列含有与第二核酸序列中的所比对的核苷酸一致的足够或最小数目的核苷酸，使得第一和第二核苷酸序列编码具有共同功能活性的多肽或编码共同结构多肽域或共同功能性多肽活性，举例来说，核苷酸序列与参考序列(例如本文所提供的序列)具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的一致性。本文中的组合物和方法涵盖具有指定序列或与其基本上一致或类似的序列的多肽和核酸，例如与指定序列至少85％、90％或95％一致或更高的序列。在氨基酸序列的情形下，术语“基本上一致”在本文中用以指第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列含有i)与第二氨基酸序列中的所比对氨基酸残基一致，或ii)第二氨基酸序列中的所比对氨基酸残基的保守性取代的足够或最小数目的氨基酸残基，使得第一和第二氨基酸序列可以具有共同结构域和/或共同功能活性，举例来说，含有共同结构域的氨基酸序列与参考序列(例如本文所提供的序列)具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的一致性。
靶细胞部分：如本文所使用，术语“靶细胞部分”用以指可以用于将融合剂脂质体特异性地(相对于相关系统中的至少一种其它细胞)靶向细胞的细胞(例如靶细胞)的特征。在一些实施例中，靶细胞部分为靶细胞的表面特征。在一些实施例中，靶细胞部分为与靶细胞的细胞膜缔合的蛋白质或为与靶细胞的细胞膜缔合的蛋白质的一部分。在一些实施例中，靶细胞部分为与靶细胞的膜缔合的肽或蛋白质或为与靶细胞的膜缔合的肽或蛋白质的一部分。在一些实施例中，靶细胞部分为与靶细胞的膜缔合的脂质或为与靶细胞的膜缔合的脂质的一部分。在一些实施例中，靶细胞部分为与靶细胞的膜缔合的醣或为与靶细胞的膜缔合的醣的一部分。
靶向域：如本文所使用，术语“靶向域”为与靶细胞部分缔合或相互作用的融合剂脂质体的特征。在一些实施例中，靶向域特异性地(在暴露的条件下)与靶细胞部分缔合或相互作用。在一些实施例中，靶向域特异性地结合到呈现于靶细胞上的靶细胞部分。在一些实施例中，靶向域为或包括融合剂的域，例如共价连接到融合剂，例如为融合剂多肽的一部分。在一些实施例中，靶向域为与任何融合剂分离的实体，例如不与融合剂共价连接，例如不为融合剂多肽的一部分。
稳定：术语“稳定”当应用于本文中的组合物时，意指组合物在一组指定条件下在一段时间内维持其物理结构和/或活性的一个或多个方面。在一些实施例中，指定条件是在冷藏下(例如处于或低于约4℃、-20℃或-80℃下)。
靶细胞：如本文所使用，“靶细胞”是指与融合剂脂质体融合的细胞。
变体：术语“变体”是指具有与参考氨基酸序列基本上一致的氨基酸序列或由基本上一致的核苷酸序列编码的多肽。在一些实施例中，变体是功能性变体。
融合剂脂质体
本文所描述的融合剂脂质体组合物和方法包括(a)脂质双层；(B)被所述脂质双层包围的内腔(例如包括胞质溶胶)；(c)相对于源细胞为外源性的或过度表达的融合剂，例如其中将所述融合剂安置于脂质双层中；以及(d)膜蛋白有效负载剂。在实施例中，融合剂脂质体来源于非植物细胞，例如哺乳动物细胞或其衍生物(例如线粒体、软骨体、细胞器、囊泡或去核细胞)，并且包括融合剂，例如蛋白质、脂质和化学融合剂。
包封
在本文所述的组合物和方法的一些实施例中包含融合剂脂质体，例如具有融合剂的天然衍生的两亲性脂质的双层。融合剂脂质体可以包括若干不同类型的脂质，例如两亲性脂质，如磷脂。融合剂脂质体可以包括脂质双层作为最外表面。这类组合物可以出人意料地用于本发明的方法中。在一些情况下，膜可以采取自体、同种异体、异种或经工程改造的细胞的形式，如Ahmad等人2014Miro1调控细胞间线粒体转运并增强间质干细胞救援功效(Miro1 regulates intercellular mitochondrial transport&enhances mesenchymalstem cell rescue efficacy).《欧洲分子生物学学会杂志(EMBO Journal.)》33(9):994-1010。在一些实施例中，组合物包含经工程改造的膜，如例如Orive等人2015.细胞包封：技术和临床发展(Cell encapsulation:technical and clinical advances).《药理学趋势(Trends in Pharmacology Sciences》；36(8):537-46；和Mishra.2016.包封和控制释放手册(Handbook of Encapsulation and Controlled Release).CRC出版社中所描述。在一些实施例中，组合物包含天然存在的膜(McBride等人2012.囊泡转运路径将货物从线粒体穿梭运送到溶酶体(A Vesicular Transport Pathway Shuttles Cargo from mitochondriato lysosomes.)《现代生物学》22：135-141)。
在一些实施例中，本文所描述的组合物包含天然衍生的膜，例如由细胞或组织制备的膜囊泡。在一些实施例中，融合剂脂质体为衍生自MSC或星形胶质细胞的囊泡。
在一些实施例中，融合剂脂质体为外泌体。
示例性外泌体和其它膜封闭体描述于例如US2016137716中，其以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，融合剂脂质体包括例如可获自细胞的囊泡，例如微囊泡、外泌体、细胞凋亡体(来自凋亡细胞)、微粒(其可以衍生自例如血小板)、核外粒体(可衍生自例如血清中的嗜中性粒细胞和单核细胞)、前列腺体(可获自前列腺癌细胞)、心脏体(可衍生自心肌细胞)等。
示例性外泌体和其它膜封闭体还描述于WO/2017/161010、WO/2016/077639、US20160168572、US20150290343和US20070298118中，其中的每一个以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，融合剂脂质体包括细胞外囊泡、微型小泡或外泌体。在一些实施例中，融合剂脂质体包括细胞外囊泡，例如细胞衍生的囊泡，所述囊泡包括封闭内部空间并且直径比衍生其的细胞小的膜。在实施例中，细胞外囊泡的直径为20nm到1000nm。在实施例中，融合剂脂质体包括细胞凋亡体、细胞片段、通过直接或间接操纵衍生自细胞的囊泡、小泡状细胞器和由活细胞产生的囊泡(例如通过具有质膜的晚期内体的直接质膜出芽或融合)。在实施例中，细胞外囊泡衍生自活的或死的生物体、外植的组织或器官或经培养的细胞。在实施例中，融合剂脂质体包括微型小泡，例如细胞衍生的小(例如直径在20-250nm之间，或直径在30-150nm之间)囊泡，所述囊泡包括封闭内部空间的膜，并且通过直接或间接操纵由所述细胞产生。在一些情况下，纳米囊泡的产生可以导致源细胞的破坏。纳米囊泡可以包括脂质或脂肪酸和多肽。在实施例中，融合剂脂质体包括外泌体。在实施例中，外泌体为细胞衍生的小(例如直径在20-300nm之间，或直径在40-200nm之间)囊泡，所述囊泡包括封闭内部空间的膜，并且通过直接质膜出芽或通过晚期内体与质膜的融合由所述细胞产生。在实施例中，外泌体的产生不会导致源细胞的破坏。在实施例中，外泌体包括脂质或脂肪酸和多肽。
示例性外泌体和其它膜封闭体还描述于US 20160354313中，其以全文引用的方式并入本文中。在实施例中，融合剂脂质体包括生物相容性递送模块、外泌体(例如直径为约30nm到约200nm)、微囊泡(例如直径为约100nm到约2000nm)、细胞凋亡体(例如直径为约300nm到约2000nm)、膜粒子、膜囊泡、外泌体样囊泡、核外粒体样囊泡、核外粒体或外型囊泡。
在一些实施例中，融合剂脂质体为微囊泡。在一些实施例中，融合剂脂质体为细胞影。在一些实施例中，囊泡为质膜囊泡，例如巨型质膜囊泡。
融合剂脂质体可以由若干不同类型的脂质，例如两亲性脂质，如磷脂制成。融合剂脂质体可以包括脂质双层作为最外表面。这个双层可以由一个或多个相同或不同类型的脂质构成。实例包含(但不限于)磷脂，如磷酸胆碱和肌醇磷脂。特定实例包含(但不限于)DMPC、DOPC和DSPC。
融合剂
在一些实施例中，本文所描述的融合剂脂质体(例如包括囊泡或细胞的一部分)包含一种或多种融合剂，例如以促进融合剂脂质体与膜融合，例如细胞膜。此外，这些组合物可以包含在合成期间或之后进行的表面修饰以包含一种或多种融合剂。表面修饰可以包括对膜的修饰，例如将脂质或蛋白质插入膜中。
在一些实施例中，融合剂脂质体在其外表面上包括一种或多种融合剂(例如整合到细胞膜中)以靶向特定细胞或组织类型(例如心肌细胞)。融合剂脂质体可以包括靶向域。融合剂包含(但不限于)：基于蛋白质、基于脂质和基于化学物质的融合剂。融合剂可以结合搭配物，例如靶细胞表面上的特征。在一些实施例中，靶细胞表面上的搭配物为靶细胞部分。在一些实施例中，包括融合剂的融合剂脂质体会将膜整合到靶细胞的脂质双层中。
在一些实施例中，本文所描述的融合剂中的一种或多种可以包含于融合剂脂质体中。
蛋白质融合剂
在一些实施例中，融合剂是蛋白质融合剂，例如哺乳动物蛋白质或哺乳动物蛋白质同源物(例如具有50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的一致性)；非哺乳动物蛋白质，如病毒蛋白质或病毒蛋白质同源物(例如具有50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的一致性)；原生蛋白质或原生蛋白质衍生物；合成蛋白；其片段；其变体；包括一种或多种融合剂或片段的蛋白质融合物，以及其任何组合。
在一些实施例中，融合剂引起融合剂脂质体中的脂质与靶细胞中的脂质之间的混合。在一些实施例中，融合剂引起在融合剂脂质体的内腔与靶细胞的胞质溶胶之间形成一个或多个孔，例如融合剂脂质体为或包括如本文所描述的连接蛋白。
(i)哺乳动物蛋白质
在一些实施例中，融合剂可以包含哺乳动物蛋白质，参见表1。哺乳动物融合剂的实例可以包含(但不限于)：SNARE家族蛋白，如vSNARE和tSNARE；合胞素蛋白，例如合胞素-1(DOI：10.1128/JVI.76.13.6442-6452.2002)和合胞素-2；成肌蛋白(biorxiv.org/content/early/2017/04/02/123158，doi.org/10.1101/123158，doi：10.1096/fj.201600945R，doi:10.1038/nature12343)、肌混合蛋白(www.nature.com/nature/journal/v499/n7458/full/nature12343.html，doi:10.1038/nature12343)、肌合并蛋白(science.sciencemag.org/content/early/2017/04/05/science.aam9361，DOI：10.1126/science.aam9361)；纤维母细胞生长因子受体样1(fibroblast growth factor receptor-like 1；FGFRL1)、咪啉(Minion)(doi.org/10.1101/122697)；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的异构体(例如如US 6,099,857A中所公开)；间隙连接蛋白，如连接蛋白43、连接蛋白40、连接蛋白45、连接蛋白32或连接蛋白37(例如如US 2007/0224176中所公开)；Hap2；能够诱导异源细胞之间形成合胞体的任何蛋白质(参见表2)；具有融合剂特性的任何蛋白质(参见表3)；其同源物；其片段；其变体；以及包括一种或多种蛋白质或其片段的蛋白质融合物。在一些实施例中，融合剂是由人类基因组中发现的人类内源逆转录病毒元件(hERV)编码。其它示例性融合剂公开于US 6,099,857A和US 2007/0224176中，其全部内容特此以引用的方式并入。
表1：人类和非人类融合剂的非限制性实例.
表2：编码具有融合剂特性的蛋白质的基因。
表3：人类融合剂候选物
在一些实施例中，融合剂脂质体包括产生曲率的蛋白质，例如Epsin1、发动蛋白或包括BAR域的蛋白质。参见例如Kozlov等人，《结构生物学评论(CurrOp StrucBio)》2015；Zimmerberg等人，《自然评论(Nat Rev)》2006；Richard等人，《生物化学杂志(Biochem J)》2011。
(ii)非哺乳动物蛋白质
病毒蛋白
在一些实施例中，融合剂可以包含非哺乳动物蛋白质，例如病毒蛋白。在一些实施例中，病毒融合剂是I类病毒膜融合蛋白、III类病毒膜融合蛋白、病毒膜糖蛋白或其它病毒融合蛋白，或其同源物、其片段、其变体或包括一种或多种蛋白质或其片段的蛋白质融合物。
在一些实施例中，I类病毒膜融合蛋白包含(但不限于)杆状病毒F蛋白，例如核型多角体病毒(NPV)属的F蛋白，例如甜菜夜蛾MNPV(Spodoptera exigua MNPV；SeMNPV)F蛋白和舞毒蛾MNPV(Lymantria dispar MNPV；LdMNPV)。
在一些实施例中，III类病毒膜融合蛋白包含(但不限于)棒状病毒G(例如水泡性口炎病毒的融合蛋白G(VSV-G))、疱疹病毒糖蛋白B(例如单纯疱疹病毒1(HSV-1)gB))、埃-巴二氏病毒糖蛋白B(EBV gB)、索戈托病毒G(thogotovirus G)、杆状病毒gp64(例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa California)多NPV(AcMNPV)gp64)和博纳病(Borna disease)病毒(BDV)糖蛋白(BDV G)。
其它病毒融合剂的实例(例如膜糖蛋白和病毒融合蛋白)包含(但不限于)：病毒合胞体蛋白，如流感血球凝集素(HA)或突变体，或其融合蛋白；人类免疫缺陷病毒1型包膜蛋白(HIV-1ENV)、来自HIV结合LFA-1以形成淋巴细胞合胞体的gp120、HIV gp41、HIV gp160或HIV反式转录活化子(TAT)；病毒糖蛋白VSV-G、来自棒状病毒科的水泡性口炎病毒的病毒糖蛋白；水痘-带状疱疹病毒(VZV)的糖蛋白gB和gH-gL；鼠类白血病病毒(MLV)-10A1；长臂猿白血病病毒糖蛋白(GaLV)；狂犬病、莫科拉(Mokola)、水泡性口炎病毒和披膜病毒中的G型糖蛋白；鼠类肝炎病毒JHM表面突出蛋白；猪呼吸道冠状病毒纤突和膜糖蛋白；禽类传染性支气管炎纤突糖蛋白和其前体；牛肠道冠状病毒纤突蛋白；麻疹病毒的F和H、HN或G基因；犬瘟热病毒、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、人类副流感病毒3、猴病毒41、仙台病毒和人类呼吸道合胞病毒；人类疱疹病毒1和猴水痘病毒的gH，具有伴随蛋白gL；人类、牛和猕猴疱疹病毒gB；弗里德鼠(Friend murine)白血病病毒和梅森-辉瑞猴病毒的包膜糖蛋白；流行性腮腺炎病毒血球凝集素神经氨酸酶，以及糖蛋白F1和F2；委内瑞拉马脑脊髓炎的膜糖蛋白；副粘病毒F蛋白；SIV gp160蛋白；埃博拉病毒G蛋白；或仙台病毒融合蛋白，或其同源物、其片段、其变体，以及包括一种或多种蛋白质或其片段的蛋白质融合物。
非哺乳动物融合剂包含病毒融合剂、其同源物、其片段和包括一种或多种蛋白质或其片段的融合蛋白。病毒融合剂包含I类融合剂、II类融合剂、III类融合剂和IV类融合剂。在实施例中，I类融合剂(如人类免疫缺陷病毒(HIV)gp41)具有特征性的融合后构象，其具有中心卷绕的卷曲结构的α-螺旋发夹的标志三聚体。I类病毒融合蛋白包含具有中心融合后六螺旋束的蛋白质。I类病毒融合蛋白包含流感HA、副流感F、HIV Env、埃博拉GP、来自正粘病毒的血球凝集素、来自副粘病毒的F蛋白(例如麻疹(Katoh等人，《BMC生物技术(BMCBiotechnology)》2010，10:37))、来自逆转录病毒的ENV蛋白，以及丝状病毒和冠状病毒的融合剂。在实施例中，II类病毒融合剂(如登革热E糖蛋白)的结构标志是β片，其形成细长的胞外域，所述胞外域再折叠以产生发夹三聚体。在实施例中，II类病毒融合剂缺乏中心卷绕的卷曲。II类病毒融合剂可以发现于α病毒(例如E1蛋白)和黄病毒(例如E糖蛋白)中。II类病毒融合剂包含来自胜利基森林病毒(Semliki Forest virus)、辛比斯(Sinbis)、风疹病毒和登革热病毒的融合剂。在实施例中，III类病毒融合剂(如水泡性口炎病毒G糖蛋白)将I类和II类中发现的结构标志组合。在实施例中，III类病毒融合剂包括α螺旋(例如与I类病毒融合剂一样形成六螺旋束以折叠蛋白质)和在其末端具有两亲性融合肽的β片，使人联想到II类病毒融合剂。III类病毒融合剂可以发现于棒状病毒和疱疹病毒中。在实施例中，IV类病毒融合剂是融合相关的小跨膜(FAST)蛋白(doi：10.1038/sj.emboj.7600767，Nesbitt,Rae L.，“使用以多官能FAST蛋白配制的脂质体进行的靶向细胞内治疗性递送(Targeted Intracellular Therapeutic Delivery Using Liposomes Formulated withMultifunctional FAST proteins)”(2012).电子论文和学位论文库(Electronic Thesisand Dissertation Repository).论文388)，其由非包膜呼肠孤病毒编码。在实施例中，IV类病毒融合剂足够小以致其不形成发夹(doi：10.1146/annurev-cellbio-101512-122422，doi：10.1016/j.devcel.2007.12.008)。
其它示例性融合剂公开于US 9,695,446、US 2004/0028687、US 6,416,997、US 7,329,807、US 2017/0112773、US 2009/0202622、WO 2006/027202和US 2004/0009604中，所述文献的全部的完整内容特此以引用的方式并入。
在一些实施例中，本文所描述的融合剂包括表4的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或与所述序列的一部分(例如长度为100、200、300、400、500或600个氨基酸的部分)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。举例来说，在一些实施例中，本文所描述的融合剂脂质体包括与表4的任何氨基酸序列具有至少80％一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文所描述的核酸序列编码表4的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或与所述序列的一部分(例如长度为40、50、60、80、100、200、300、400、500或600个氨基酸的部分)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文所描述的融合剂包括SEQ ID NO:627-683中的任一个中所示的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或与所述序列的一部分(例如长度为100、200、300、400、500或600个氨基酸的部分)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。举例来说，在一些实施例中，本文所描述的融合剂包括与SEQ ID NO:627-683中的任一个中所示的氨基酸序列具有至少80％一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文所描述的核酸序列编码SEQ ID NO:627-683中的任一个中所示的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或与所述序列的一部分(例如长度为40、50、60、80、100、200、300、400、500或600个氨基酸的部分)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
表4.副粘病毒F序列群集.第1列：基因库ID，包含病毒的完整基因组序列的基因库ID，所述完整基因组序列是群集的中心序列。第2列：CDS核苷酸，提供了与完整基因组中的基因的CDS对应的核苷酸。第3列：全基因名称，提供了基因的全称，包含基因库ID、病毒物种、病毒株和蛋白质名称。第4列：序列，提供了基因的氨基酸序列。第5列：序列/群集编号，提供了以这个中心序列群集的序列的编号。
在一些实施例中，本文所描述的融合剂包括表5的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或与所述序列的一部分(例如长度为100、200、300、400、500或600个氨基酸的部分)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。举例来说，在一些实施例中，本文所描述的融合剂包括与表5的任何氨基酸序列具有至少80％一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文所描述的核酸序列编码表5的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或与所述序列的一部分(例如长度为40、50、60、80、100、200、300、400、500或600个氨基酸的部分)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文所描述的融合剂包括SEQ ID NO:684-759中的任一个中所示的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或与所述序列的一部分(例如长度为100、200、300、400、500或600个氨基酸的部分)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。举例来说，在一些实施例中，本文所描述的融合剂包括与SEQ ID NO:684-759中的任一个中所示的氨基酸序列具有至少80％一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文所描述的核酸序列编码SEQ ID NO:684-759中的任一个中所示的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或与所述序列的一部分(例如长度为40、50、60、80、100、200、300、400、500或600个氨基酸的部分)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
表5.副粘病毒蛋白G、H和HN序列群集.第1列：基因库ID，包含病毒的完整基因组序列的基因库ID，所述完整基因组序列是群集的中心序列。第2列：CDS核苷酸，提供了与完整基因组中的基因的CDS对应的核苷酸。第3列：全基因名称，提供了基因的全称，包含基因库ID、病毒物种、病毒株和蛋白质名称。第4列：序列，提供了基因的氨基酸序列。第5列：序列/群集编号，提供了以这个中心序列群集的序列的编号。
(iii)其它蛋白质
在一些实施例中，融合剂可以包含pH依赖性(例如，如在缺血性损伤的情况下)蛋白、其同源物、其片段以及包括一种或多种蛋白质或其片段的蛋白质融合物。融合剂可以介导细胞表面或内体中或另一细胞膜结合空间中的膜融合。
在一些实施例中，融合剂包含EFF-1、AFF-1、间隙连接蛋白，例如连接蛋白(如Cn43、GAP43、CX43)(DOI：10.1021/jacs.6b05191)、其它肿瘤连接蛋白、其同源物、其片段、其变体，以及包括一种或多种蛋白质或其片段的蛋白质融合物。
对蛋白质融合剂的修饰
在一些实施例中，蛋白质融合剂可以被改变以降低免疫反应性。举例来说，蛋白质融合剂可以用减少免疫相互作用的分子(如PEG)装饰(DOI：10.1128/JVI.78.2.912-921.2004)。因此，在一些实施例中，融合剂包括PEG，例如为PEG化的多肽。免疫系统靶向的融合剂中的氨基酸残基可以改变成不被免疫系统识别(doi：10.1016/j.virol.2014.01.027，doi：10.1371/journal.pone.0046667)。在一些实施例中，融合剂的蛋白质序列经改变以类似于人类中所发现的氨基酸序列(人类化)。在一些实施例中，融合剂的蛋白质序列被改变为结合MHC复合物的强度较弱的蛋白质序列。在一些实施例中，蛋白质融合剂来源于未感染人类的病毒或生物体(并且人类尚未接种针对其的疫苗)，从而增加患者免疫系统未接触蛋白质融合剂的可能性(例如针对融合剂的体液或细胞介导性适应性免疫应答可以忽略不计)(doi：10.1006/mthe.2002.0550，doi：10.1371/journal.ppat.1005641，doi：10.1038/gt.2011.209，DOI 10.1182/blood-2014-02-558163)。不希望被理论所束缚，在一些实施例中，来源于未感染人类的病毒或生物体的蛋白质融合剂在患者中并不具有天然融合靶标，并且因此具有高特异性。
脂质融合剂
在一些实施例中，可以用融合脂质，如饱和脂肪酸来处理融合剂脂质体。在一些实施例中，饱和脂肪酸具有10-14个碳原子。在一些实施例中，饱和脂肪酸具有更长链的羧酸。在一些实施例中，饱和脂肪酸为单酯。
在一些实施例中，融合剂脂质体可以用不饱和脂肪酸处理。在一些实施例中，不饱和脂肪酸具有C16与C18之间的不饱和脂肪酸。在一些实施例中，不饱和脂肪酸包含油酸、单油酸甘油酯、甘油酯、二酰甘油、经改性的不饱和脂肪酸和其任何组合。
不希望被理论所束缚，在一些实施例中，负曲率脂质促进膜融合。在一些实施例中融合剂脂质体在膜中包括一种或多种负曲率脂质，例如相对于源细胞为外源性的负曲率脂质。在实施例中，将负曲率脂质或其前体添加到包括源细胞或融合剂脂质体的培养基中。在实施例中，源细胞经工程改造以表达或过度表达一种或多种脂质合成基因。负曲率脂质可以为例如二酰甘油(DAG)、胆固醇、磷脂酸(PA)、磷脂酰乙醇胺(PE)或脂肪酸(FA)。
不希望受理论所束缚，在一些实施例中，正曲率脂质抑制膜融合。在一些实施例中，融合剂脂质体在膜中包括降低水平的一种或多种正曲率脂质，例如外源性正曲率脂质。在实施例中，通过抑制脂质合成，例如通过源细胞中的脂质合成基因的基因敲除或基因敲落来降低水平。正曲率脂质可以是例如溶血磷脂酰胆碱(LPC)、磷脂酰肌醇(PtdIn)、溶血磷脂酸(LPA)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)或单酰基甘油(MAG)。
化学融合剂
在一些实施例中，融合剂脂质体可以用融合化学物质处理。在一些实施例中，融合化学物质为聚乙二醇(PEG)或其衍生物。
在一些实施例中，化学融合剂诱导两个膜之间的局部脱水，导致双层的不利分子堆积。在一些实施例中，化学融合剂诱导脂质双层附近区域的脱水，引起细胞之间的水分子移位并允许两个膜之间的共同相互作用。
在一些实施例中，化学融合剂为阳离子。阳离子的一些非限制性实例包含Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、La3+、Sr3+和H+。
在一些实施例中，化学融合剂通过改变表面极性而结合到靶膜，其改变了水合依赖性膜间排斥。
在一些实施例中，化学融合剂为可溶脂溶性的。一些非限制性实例包含油酰甘油、二油酰甘油、三油酰甘油以及其变体和衍生物。
在一些实施例中，化学融合剂为水溶性化学物质。一些非限制性实例包含聚乙二醇、二甲亚砜以及其变体和衍生物。
在一些实施例中，化学融合剂为有机小分子。非限制性实例包含正己基溴化物。
在一些实施例中，化学融合剂不改变融合剂或靶膜的构成、细胞活力或离子迁移特性。
在一些实施例中，化学融合剂为激素或维生素。一些非限制性实例包含脱落酸、视黄醇(维生素A1)、生育酚(维生素E)以及其变体和衍生物。
在一些实施例中，融合剂脂质体包括肌动蛋白和使聚合的肌动蛋白稳定的药剂。不希望被理论所束缚，融合剂脂质体中的稳定的肌动蛋白可以促进与靶细胞的融合。在实施例中，使聚合的肌动蛋白稳定的药剂是选自肌动蛋白、肌球蛋白、生物素-抗生蛋白链菌素、ATP、神经元韦斯考特-奥德里奇综合征(Wiskott-Aldrich syndrome)蛋白(N-WASP)或形成蛋白，参见例如Langmuir.2011年8月16日；27(16):10061-71和Wen等人，《自然通信(Nat Commun.)》2016年8月31日；7。在实施例中，融合剂脂质体包括相对于来源细胞为外源性的或过度表达的肌动蛋白，例如，野生型肌动蛋白或包括促进聚合的突变的肌动蛋白。在实施例中，融合剂脂质体包括ATP或磷酸肌酸，例如外源性ATP或磷酸肌酸。
小分子融合剂
在一些实施例中，融合剂脂质体可以用融合小分子处理。一些非限制性实例包含氟烷、非类固醇消炎药(NSAID)，如美洛昔康、吡罗昔康、替诺昔康和氯丙嗪。
在一些实施例中，小分子融合剂可以胶束状聚集体存在或不含聚集体。
融合剂修饰
在一些实施例中，融合剂与可裂解蛋白连接。在某些情况下，可裂解蛋白可通过暴露于蛋白酶而裂解。经工程改造的融合蛋白可以结合跨膜蛋白的任何域。经工程改造的融合蛋白可以通过裂解肽与位于膜间空间内的蛋白质域连接。裂解肽可以通过一种膜间蛋白酶或膜间蛋白酶的组合(例如HTRA2/OMI，其在位置P1处需要非极性脂肪族氨基酸-缬氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸是优选的，并且在P2和P3位置处需要亲水性残基-精氨酸是优选的)而裂解。
在一些实施例中，融合剂蛋白通过所属领域中已知的任何方法或本文所描述的任何方法工程改造以包括蛋白水解降解序列，例如线粒体或胞质降解序列。融合剂蛋白可以经工程改造的以包含(但不限于)蛋白水解降解序列，例如胱天蛋白酶2蛋白质序列(例如Val-Asp-Val-Ala-Asp-|-)(SEQ ID NO:604)或其它蛋白水解序列(参见例如Gasteiger等人,《蛋白质组学协议手册(The Proteomics Protocols Handbook)》；2005:571-607)、与野生型蛋白水解降解序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或更大一致性的修饰的蛋白水解降解序列、胞质蛋白水解降解序列(例如泛素)或与野生型蛋白水解降解序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或更大一致性的经修饰的胞质蛋白水解降解序列。在一个实施例中，组合物包括源细胞中的线粒体或包括蛋白质的软骨体，所述蛋白质经以下修饰：例如与野生型蛋白水解降解序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或更大一致性的蛋白水解降解序列；胞质蛋白水解降解序列，例如泛素；或与野生型蛋白水解降解序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或更大一致性的经修饰的胞质蛋白水解降解序列。
在一些实施例中，融合剂可以经识别特定蛋白质的蛋白酶域修饰，例如蛋白酶的过度表达，例如具有蛋白酶活性的经工程改造的融合蛋白。例如，蛋白酶或来自蛋白酶的蛋白酶域，如MMP、线粒体加工肽酶、线粒体中间肽酶、内膜肽酶。
参见Alfonzo,J.D.和Soll,D.线粒体tRNA输入-理解的挑战才刚刚开始(Mitochondrial tRNA import-the challenge to understand has just begun.)《生物化学(Biological Chemistry)》390:717-722。2009；Langer,T.等人从线粒体释放的肽的表征(Characterization of Peptides Released from Mitochondria.)《生物化学杂志(THEJOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY)》.第280卷,第4号.2691-2699,2005；Vliegh,P.等人,合成治疗肽：科学和市场(Synthetic therapeutic peptides:science and market.)《今日药物发现(Drug Discovery Today)》.15(1/2).2010；Quiros P.M.m等人,线粒体蛋白酶在健康，衰老和疾病中的新作用(New roles for mitochondrial proteases in health,ageing and disease.)《自然评论分子细胞生物学(Nature Reviews Molecular CellBiology)》.2015年第16卷；Weber-Lotfi,F.等人,DNA输入能力与线粒体遗传学(DNAimport competence and mitochondrial genetics.)《生物聚合物和细胞(Biopolymersand Cell)》.第30卷.N 1.71-73,2014。
非内吞进入靶细胞
在一些实施例中，本文所描述的融合剂脂质体或融合剂脂质体组合物通过非内吞路径将货物递送到靶细胞。不希望受理论所束缚，非内吞递送途径可以改进递送到细胞的货物的量或百分比，例如递送到细胞的所要隔室。
因此，在一些实施例中，当在内吞作用抑制剂存在下与靶细胞群体接触时，和当与未用内吞作用抑制剂处理的参考靶细胞群体接触时，相比于参考靶细胞群体，本文所描述的多个融合剂脂质体将货物递送到靶细胞群体中细胞数目的至少30％、40％、50％、60％、70％或80％中。
在一些实施例中，低于10％的货物通过内吞作用进入细胞。
在一些实施例中，内吞作用抑制剂为溶酶体酸化抑制剂，例如巴弗洛霉素A1。
在一些实施例中，使用内吞作用抑制分析，例如实例125的分析来确定所递送的货物。
在一些实施例中，货物通过发动蛋白非依赖性路径或溶酶体酸化非依赖性路径、巨胞饮非依赖性路径或肌动蛋白非依赖性路径进入细胞。
在一些实施例(例如用于分析货物的非内吞递送的实施例)中，使用以下步骤中的一个或多个(例如全部)来分析货物递送：(a)将30,000个HEK-293T靶细胞安置于包括100nM巴弗洛霉素A1的96孔板的第一孔中，和将类似数目的类似细胞安置于缺乏巴弗洛霉素A1的96孔板的第二孔中，(b)在DMEM培养基中在37℃和5％CO2下培养靶细胞四小时，(c)使靶细胞与10μg包括货物的融合剂脂质体接触，(d)在37℃和5％CO2下培育靶细胞和融合剂脂质体24小时，以及(e)确定第一孔和第二孔中包括货物的细胞的百分比。步骤(e)可以包括使用显微镜，例如使用免疫荧光来检测货物。步骤(e)可以包括间接检测货物，例如检测货物的下游效应，例如报告蛋白的存在。在一些实施例中，如实例125中所描述地进行以上步骤(a)-(e)中的一个或多个。
在一些实施例中，内吞作用的抑制剂(例如氯奎或巴弗洛霉素A1)抑制抑制内体酸化。在一些实施例中，货物递送与溶酶体酸化无关。在一些实施例中，内吞作用的抑制剂(例如Dynasore)抑制发动蛋白。在一些实施例中，货物递送与发动蛋白活性无关。
在一些实施例中，融合剂脂质体通过内吞作用进入靶细胞，例如其中通过内吞路径递送的治疗剂的水平为0.01-0.6、0.01-0.1、0.1-0.3或0.3-0.6，或比与类似融合剂脂质体接触的经氯奎处理的参考细胞大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，例如使用实例91的分析。在一些实施例中，进入靶细胞的融合剂脂质体组合物中至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的融合剂脂质体通过非内吞路径进入，例如融合剂脂质体通过与细胞表面融合而进入靶细胞。在一些实施例中，对于给定融合剂脂质体通过非内吞路径递送的治疗剂的水平为0.1-0.95、0.1-0.2、0.2-0.3、0.3-0.4、0.4-0.5、0.5-0.6、0.6-0.7、0.7-0.8、0.8-0.9、0.9-0.95，或比经氯奎处理的参考细胞大至少至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，例如使用实例90的分析。在一些实施例中，进入靶细胞的融合剂脂质体组合物中至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的融合剂脂质体进入细胞质(例如并不进入内体或溶酶体)。在一些实施例中，进入靶细胞的融合剂脂质体组合物中小于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的融合剂脂质体进入内体或溶酶体。在一些实施例中，融合剂脂质体通过非内吞路径进入靶细胞，例如其中所递送的治疗剂的水平为经氯奎处理的参考细胞的至少90％、95％、98％或99％，例如使用实例91的分析。在一个实施例中，融合剂脂质体通过发动蛋白介导的路径将药剂递送到靶细胞。在一个实施例中，通过发动蛋白介导的路径递送的药剂的水平在0.01-0.6范围内，或比与类似的融合剂脂质体接触的经Dynasore处理的靶细胞大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，例如如实例92的分析中所测量。在一个实施例中，融合剂脂质体通过巨胞饮将药剂递送到靶细胞。在一个实施例中，通过巨胞饮递送的药剂的水平在0.01-0.6范围内，或比与类似的融合剂脂质体接触的经EIPA处理的靶细胞大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，例如如实例92的分析中所测量。在一个实施例中，融合剂脂质体通过肌动蛋白介导的路径将药剂递送到靶细胞。在一个实施例中，通过肌动蛋白介导的路径递送的药剂的水平在0.01-0.6范围内，或比与类似d融合剂脂质体接触的经Latrunculin B处理的靶细胞大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，例如如实例92的分析中所测量。
在一些实施例中，递送到靶细胞的货物是使用内吞作用抑制分析来确定，例如实例90、92或125的分析。
在一些实施例中，货物通过发动蛋白非依赖性路径或溶酶体酸化非依赖性路径、巨胞饮非依赖性路径(例如，其中内吞作用的抑制剂为巨胞饮抑制剂，例如5-(N-乙基-N-异丙基)胺氯吡脒(EIPA)，例如浓度为25μM)或肌动蛋白非依赖性路径(例如，其中内吞作用的抑制剂为肌动蛋白聚合抑制剂，例如Latrunculin B，例如浓度为6μM)进入靶细胞。
在一些实施例中，当与靶细胞群体接触时，融合剂脂质体将货物递送到除内体或溶酶体以外的靶细胞位置，例如递送到胞质溶胶、细胞器或细胞膜。在实施例中，将少于50％、40％、30％、20％或10％的货物递送到内体或溶酶体。
特异性递送到靶细胞
在一些实施例中，相比于非靶细胞，本文所描述的融合剂脂质体组合物将货物优先递送到靶细胞。因此，在某些实施例中，本文所描述的融合剂脂质体具有以下特性中的一个或两个：(i)当多个融合剂脂质体与包括靶细胞和非靶细胞的细胞群体接触时，货物以比非靶细胞高至少2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍的靶细胞存在，或(ii)多个融合剂脂质体的融合剂脂质体以比非靶细胞更高的速率与靶细胞融合，高至少至少50％。
在一些实施例中，通过显微镜，例如使用实例126的分析来测量货物的存在。在一些实施例中，通过显微镜，例如使用实例54的分析来测量融合。在一些实施例中，靶向部分对靶细胞上的细胞表面标记具有特异性。在一些实施例中，细胞表面标记为皮肤细胞、心肌细胞、肝细胞、肠细胞(例如小肠细胞)、胰脏细胞、脑细胞、前列腺细胞、肺细胞、结肠细胞或骨髓细胞的细胞表面标记。
在一些实施例(例如用于相对于非靶细胞，向靶细胞特异性递送货物的实施例)中，使用以下步骤中的一个或多个(例如全部)来分析货物递送：(a)将30,000个过度表达CD8a和CD8b的HEK-293T靶细胞安置于96孔板的第一孔中，并将不过度表现CD8a和CD8b的30,000个HEK-293T非靶细胞安置于96孔板的第二孔中，(b)在DMEM培养基中在37℃和5％CO2下培养靶细胞四小时，(c)使靶细胞与10μg包括货物的融合剂脂质体接触，(d)在37℃和5％CO2下培育靶细胞和融合剂脂质体24小时，以及(e)确定第一孔和第二孔中包括货物的细胞的百分比。步骤(e)可以包括使用显微镜，例如使用免疫荧光来检测货物。步骤(e)可以包括间接检测货物，例如检测货物的下游效应，例如报告蛋白的存在。在一些实施例中，如实例126中所描述地进行以上步骤(a)-(e)中的一个或多个。
在一些实施例中，融合剂脂质体与靶细胞的融合速率高于与非靶细胞，例如高至少至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍，例如在实例54的分析中。在一些实施例中，融合剂脂质体与靶细胞的融合速率高于与其它融合剂脂质体，例如高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如在实例54的分析中。在一些实施例中，融合剂脂质体与靶细胞以使得在24、48或72小时之后融合剂脂质体中的药剂递送到至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的靶细胞的速率融合，例如在实例54的分析中。在实施例中，靶向融合的量为约30％-70％、35％-65％、40％-60％、45％-55％或45％-50％，例如约48.8％，例如在实例54的分析中。在实施例中，靶向融合的量为约20％-40％、25％-35％或30％-35％，例如约32.2％，例如在实例55的分析中。
在一些实施例中，相比于参考靶细胞群体或非靶细胞群体，融合剂脂质体组合物将至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的货物递送到靶细胞群体中。在一些实施例中，相比于参考靶细胞群体或非靶细胞群体，融合剂脂质体组合物将多至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的货物递送到靶细胞群体中。
融合剂脂质体产生
从细胞产生的融合剂脂质体
融合剂脂质体的组合物可以从培养的细胞，例如经培养的哺乳动物细胞，例如经培养的人类细胞产生。细胞可以为祖细胞或非祖(例如分化的)细胞。细胞可以为原代细胞或细胞系(例如本文所描述的哺乳动物，例如人类细胞系)。在实施例中，经培养的细胞为祖细胞，例如骨髓基质细胞、骨髓源性成年祖细胞(MAPC)、内皮祖细胞(EPC)、胚细胞、在室管膜下区中形成的中间祖细胞、神经干细胞、肌肉干细胞、卫星细胞、肝干细胞、造血干细胞、骨髓基质细胞、表皮干细胞、胚胎干细胞、间质干细胞、脐带干细胞、前体细胞、肌肉前体细胞、成肌细胞、心肌细胞、神经前体细胞、神经胶质前体细胞、神经元前体细胞、成肝细胞。
在一些实施例中，源细胞为内皮细胞、成纤维细胞、血细胞(例如巨噬细胞、嗜中性粒细胞、粒细胞、白细胞)、干细胞(例如间质干细胞、脐带干细胞、骨髓干细胞、造血干细胞、诱导多能干细胞，例如衍生自个体的细胞的诱导多能干细胞)、胚胎干细胞(例如来自胚胎卵黄囊、胎盘、脐带、胎儿皮肤、青少年皮肤、血液、骨髓、脂肪组织、造红细胞组织、造血组织的干细胞)、成肌细胞、实质细胞(例如肝细胞)、肺泡细胞、神经元(例如视网膜神经元细胞)、前体细胞(例如视网膜前体细胞、成髓细胞、骨髓前体细胞、胸腺细胞、性母细胞、成巨核细胞、幼巨核细胞、成黑素细胞、成淋巴细胞、骨髓前体细胞、正成红细胞或成血管细胞)、祖细胞(例如心肌祖细胞、卫星细胞、放射状胶质细胞、骨髓基质细胞、胰腺祖细胞、内皮祖细胞、胚细胞)或永生化细胞(例如HeLa、HEK293、HFF-1、MRC-5、WI-38、IMR 90、IMR 91、PER.C6、HT-1080或BJ细胞)。
经培养的细胞可以来自上皮、结缔组织、肌肉或神经组织或细胞和其组合。融合剂脂质体可以由来自任何真核(例如哺乳动物)器官系统的经培养的细胞产生，例如来自心血管系统(心脏、血管系统)；消化系统(食道、胃、肝脏、胆囊、胰脏、肠、结肠、直肠和肛门)；内分泌系统(下丘脑、脑下垂体、松果体或松果体腺体、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺)；排泄系统(肾脏、输尿管、膀胱)；淋巴系统(淋巴、淋巴结、淋巴管、扁桃体、腺样体、胸腺、脾脏)；皮肤系统(皮肤、毛发、指甲)；肌肉系统(例如骨骼肌)；神经系统(脑、脊髓、神经)；生殖系统(卵巢、子宫、乳腺、睾丸、输精管、精囊、前列腺)；呼吸系统(咽、喉、气管、支气管、肺、隔膜)；骨骼系统(骨骼、软骨)和其组合。在实施例中，细胞来自高度有丝分裂的组织(例如高度有丝分裂的健康组织，如上皮、胚胎组织、骨髓、肠隐窝)。在实施例中，组织样品为高代谢组织(例如骨骼组织、神经组织、心肌细胞)。
在一些实施例中，细胞为悬浮细胞。在一些实施例中，细胞为粘附细胞。
在一些实施例中，细胞来自年轻的供体，例如25岁、20岁、18岁、16岁、12岁、10岁、8岁、5岁、1岁或更年幼的供体。在一些实施例中，细胞来自胎儿组织。
在一些实施例中，细胞来源于个体并施用相同个体或具有类似基因特征(例如MHC匹配的)的个体。
在某些实施例中，细胞具有平均大小为长度大于3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000个核苷酸(例如长度在4,000-10,000个核苷酸之间、长度在6,000-10,000个核苷酸之间)的端粒。
融合剂脂质体可以从总体上根据所属领域中已知的方法培养的细胞产生。在一些实施例中，细胞可以在2个或更多个“分期”中培养，例如生长期，其中在一定条件下培养细胞以倍增和增加培养物的生物量，和“生产”期，其中细胞在一定条件下培养以改变细胞表型(例如以最大化线粒体表型、以增加线粒体的数目或直径、以增加氧化磷酸化状态)。还可以存在“表达”期，其中在一定条件下培养细胞，以使蛋白质融合剂或相对于源细胞为外源性的药剂在细胞膜上的表达最大化并限制其它分期中不期望的融合。
在一些实施例中，从例如在生长期或生产期期间同步化的细胞产生融合剂脂质体。举例来说，可以通过从培养基消除血清(例如持续约12-24小时)或通过在培养基中使用DNA合成抑制剂，如胸苷、氨基喋呤、羟基脲和胞嘧啶阿拉伯糖苷而使细胞在G1期同步化。用于哺乳动物细胞周期同步化的其它方法为已知的并且公开于例如Rosner等人2013.《自然实验手册(Nature Protocols)》8:602-626中(特别是Rosner中的表1)。
在一些实施例中，可以评估细胞并且任选地富集所需表型或基因型，以用作如本文所描述的融合剂脂质体组合物的来源。举例来说，可以评估细胞并且任选地例如在培养之前、在培养期间(例如在生长期或生产期期间)或在培养之后但在融合剂脂质体产生之前富集例如以下中的一个或多个：膜电位(例如-5mV到-200mV的膜电位；心磷脂含量(例如在总脂质的1％-20％之间)；胆固醇、磷脂酰乙醇胺(PE)、甘油二酯(DAG)、磷脂酸(PA)或脂肪酸(FA)含量；遗传质量>80％、>85％、>90％；融合剂表达或含量；货物表达或含量。
在一些实施例中，从细胞克隆产生融合剂脂质体，所述细胞克隆基于用作本文所描述的融合剂脂质体组合物的来源所期望的表型或基因型而鉴别、选择或挑选。举例来说，基于低线粒体突变负荷、长端粒长度、分化状态或特定基因特征(例如与接受者匹配的基因特征)而鉴别、选择或挑选细胞克隆。
本文所描述的融合剂脂质体组合物可以由来自一种细胞或组织来源或来源组合的融合剂脂质体构成。举例来说，融合剂脂质体组合物可以包括来自异种来源(例如动物，前述物种的细胞的组织培养物)、同种异体、自体、来自产生不同蛋白质浓度和分布的特定组织(肝脏、骨骼、神经、脂肪等)、来自不同代谢状态(例如糖酵解、呼吸)的细胞的融合剂脂质体。组合物还可以包括处于不同代谢状态(例如偶联或非偶联)的融合剂脂质体，如本文中其它地方所描述。
在一些实施例中，融合剂脂质体由表达融合剂，例如本文所描述的融合剂的源细胞产生。在一些实施例中，融合剂被安置于源细胞的膜，例如脂质双层膜，例如细胞表面膜，或亚细胞膜(例如溶酶体膜)中。在一些实施例中，融合剂脂质体由源细胞产生，其中融合剂被安置于细胞表面膜中。
在一些实施例中，通过诱导外泌体、微囊泡、膜囊泡、细胞外膜囊泡、质膜囊泡、巨质膜囊泡、细胞凋亡体、溶酶体、线粒体粒子(mitoparticle)、核细胞(pyrenocyte)或其它膜封闭囊泡的出芽来产生融合剂脂质体。
在一些实施例中，通过诱导细胞去核而产生融合剂脂质体。可以使用如遗传、化学(例如使用放线菌素D，参见Bayona-Bafaluy等人,“用于将线粒体DNA转移到ρ°细胞的化学去核方法(A chemical enucleation method for the transfer of mitochondrial DNAtoρ°cells)”《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》2003年8月15日；31(16):e98)、机械方法(例如挤压或抽吸，参见Lee等人,“两种去核方法在猪体细胞核转移中的效率的比较研究：挤压和抽吸方法的效果(A comparative study on the efficiency of two enucleationmethods in pig somatic cell nuclear transfer:effects of the squeezing and theaspiration methods.)”《动物生物技术(Anim Biotechnol.)》2008；19(2):71-9)或其组合的分析来进行去核。去核不仅是指完全去除细胞核，而且还指将细胞核从其典型位置移开，使得细胞含有细胞核但其是无功能的。
在实施例中，制造融合剂脂质体包括产生细胞影、巨质膜囊泡或细胞凋亡体。在实施例中，融合剂脂质体组合物包括细胞影、巨质膜囊泡和细胞凋亡体中的一个或多个。
在一些实施例中，通过诱导细胞片段化来产生融合剂脂质体。在一些实施例中，细胞片段化可以使用以下方法进行，所述方法包含(但不限于)：化学方法、机械方法(例如离心(例如超速离心或密度离心)、冻融或超声处理)或其组合。
在一些实施例中，融合剂脂质体可以通过以下方法中的任一种、全部或组合由例如如本文所描述的表达融合剂的源细胞产生：
i)诱导线粒体粒子、外泌体或其它膜封闭囊泡的出芽；
ii)通过以下方法中的任一种或其组合来诱导核灭活，例如去核：
a)遗传方法；
b)化学方法，例如使用放线菌素D；或
c)机械方法，例如挤压或抽吸；或
iii)通过以下方法中的任一种或其组合来诱导细胞片段化：
a)化学方法；
b)机械方法，例如离心(例如超速离心或密度离心)；冻融；或超声处理。
为了避免疑问，应理解，在许多情况下，实际用于制备融合剂脂质体的源细胞在制得融合剂脂质体之后将不可用于测试。因此，源细胞与融合剂脂质体之间的比较不需要分析经实际上被修饰(例如去核)以制备融合剂脂质体的源细胞。更确切地，可以替代地分析与源细胞以其它方式类似的细胞，例如来自相同培养物、相同基因型、相同组织类型或其任何组合。
在融合剂脂质体产生之前对细胞的修饰
在一些方面中，在融合剂脂质体产生之前对细胞进行修饰，如对受试者、组织或细胞的修饰。这类修饰可以有效地例如改良融合、融合剂表达或活性、货物的结构或功能或靶细胞的结构或功能。
(i)物理修饰
在一些实施例中，细胞在产生融合剂脂质体之前经物理修饰。举例来说，如本文中其它地方所描述，融合剂可以与细胞表面连接。
在一些实施例中，在产生融合剂脂质体之前用化学剂处理细胞。举例来说，可以用化学或脂质融合剂处理细胞，使得化学或脂质融合剂与细胞表面非共价或共价相互作用或嵌入细胞表面内。在一些实施例中，用药剂处理细胞以增强脂质于细胞膜中的融合特性。
在一些实施例中，细胞在产生具有一个或多个共价或非共价附着位点的融合剂脂质体之前经物理修饰，所述附着位点用于细胞表面上的增强融合剂脂质体对器官、组织或细胞类型的靶向的合成或内源性小分子或脂质。
在实施例中，融合剂脂质体包括增加或降低水平的内源性分子。例如，融合剂脂质体可以包括内源性分子，所述内源性分子也天然存在于天然存在的源细胞中，但其水平高于或低于融合剂脂质体中的水平。在一些实施例中，多肽由源细胞或融合剂脂质体中的外源核酸表达。在一些实施例中，多肽从来源分离并且被装载或缀合到源细胞或融合剂脂质体。
在一些实施例中，细胞在产生融合剂脂质体之前用化学剂(例如小分子)处理以增加细胞中内源性融合剂的表达或活性(例如在一些实施例中，相对于源细胞为内源性的，并且在一些实施例中，相对于靶细胞为内源性的)。在一些实施例中，小分子可以增加内源性融合剂的转录活化子的表达或活性。在一些实施例中，小分子可以降低内源性融合剂的转录阻遏子的表达或活性。在一些实施例中，小分子为增加内源性融合剂表达的表观遗传修饰剂。
在一些实施例中，融合剂脂质体是由用融合遏制化合物，例如溶血磷脂酰胆碱处理的细胞产生。在一些实施例中，融合剂脂质体是由用不裂解融合剂的解离试剂(例如细胞消化液(Accutase))处理的细胞产生。
在一些实施例中，在产生融合剂脂质体之前用例如CRISPR活化子对源细胞进行物理修饰，以增加或提高融合剂的浓度。
在一些实施例中，细胞经物理修饰以增加或减少细胞器，例如线粒体、高尔基体、内质网、细胞内囊泡(如溶酶体、自噬体)的数量，或增强所述细胞器的结构或功能。
(ii)遗传修饰
在一些实施例中，细胞在产生融合剂脂质体之前经遗传修饰以增加细胞中内源性融合剂的表达(例如，在一些实施例中，相对于源细胞为内源性的，并且在一些实施例中，相对于靶细胞为内源性的)。在一些实施例中，遗传修饰可以增加内源性融合剂的转录活化子的表达或活性。在一些实施例中，遗传修饰可以降低内源性融合剂的转录阻遏子的表达或活性。在一些实施例中，活化子或阻遏子是与通过向导RNA靶向内源性融合剂的转录活化子或阻遏子连接的核酸酶无活性的cas9(dCas9)。在一些实施例中，遗传修饰表观遗传修饰内源性融合剂基因以增加其表达。在一些实施例中，表观遗传活化子或阻遏子是与通过向导RNA靶向内源性融合剂的表观遗传修饰剂连接的核酸酶无活性的cas9(dCas9)。
在一些实施例中，在产生融合剂脂质体之前对细胞进行遗传修饰，以增加外源性融合剂在细胞中的表达，例如转基因的递送。在一些实施例中，在产生融合剂脂质体之前将核酸，例如DNA、mRNA或siRNA转移到细胞，例如以增加或减少用于器官、组织或细胞靶向的细胞表面分子(蛋白质、聚糖、脂质或低分子量分子)的表达。在一些实施例中，核酸靶向融合剂的阻遏子，例如shRNA、siRNA构建体。在一些实施例中，核酸编码融合剂阻遏子的抑制剂。
在一些实施例中，所述方法包括将相对于编码融合剂的源细胞为外源性的核酸引入源细胞中。外源核酸可以是例如DNA或RNA。在一些实施例中，外源核酸可以是例如DNA、gDNA、cDNA、RNA、前mRNA、mRNA、miRNA、siRNA等。在一些实施例中，外源性DNA可以是线性DNA、环状DNA或人工染色体。在一些实施例中，游离地维持DNA。在一些实施例中，DNA被整合到基因组中。外源性RNA可以为经化学修饰的RNA，例如可以包括一种或多种骨架修饰、糖修饰、非规范碱基或帽。骨架修饰包含例如硫代磷酸酯、N3′氨基亚磷酸酯、硼烷磷酸酯、膦酰基乙酸酯、硫代-PACE、吗啉代氨基亚磷酸酯或PNA。糖修饰包含例如2'-O-Me、2′F、2′F-ANA、LNA、UNA和2'-O-MOE。非规范碱基包含例如5-溴-U和5-碘-U、2,6-二氨基嘌呤、C-5丙炔基嘧啶、二氟甲苯、二氟苯、二氯苯、2-硫尿苷、假尿苷和二氢尿苷。帽包含例如ARCA。另外的修饰讨论于例如Deleavey等人,“设计用于靶基因沉默的化学修饰的寡核苷酸(DesigningChemically Modified Oligonucleotides for Targeted Gene Silencing)”《化学与生物学(Chemistry&Biology)》第19卷,第8期,2012年8月24日,第937-954页，其以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，在产生融合剂脂质体之前用化学剂(例如小分子)处理细胞以增加融合剂的表达或活性，所述融合剂相对于细胞中的源细胞是外源性的。在一些实施例中，小分子可以增加外源性融合剂的转录活化子的表达或活性。在一些实施例中，小分子可以降低外源性融合剂的转录阻遏子的表达或活性。在一些实施例中，小分子为增加外源性融合剂表达的表观遗传修饰剂。
在一些实施例中，核酸编码经修饰的融合剂。举例来说，具有可调节的融合活性，例如特定细胞类型、组织类型或局部微环境活性的融合剂。这类可调节的融合活性可以包含通过低pH、高pH、热、红外光、细胞外酶活性(真核或原核)或暴露于小分子、蛋白质或脂质来活化和/或引发融合活性。在一些实施例中，小分子、蛋白质或脂质显示于靶细胞上。
在一些实施例中，在产生融合剂脂质体之前对细胞进行遗传修饰，以改变(即，上调或下调)信号传导路径(例如Wnt/β-连环蛋白路径)的表达。在一些实施例中，在产生融合剂脂质体之前对细胞进行遗传修饰，以改变(例如上调或下调)一种或多种所关注基因的表达。在一些实施例中，在产生融合剂脂质体之前对细胞进行遗传修饰，以改变(例如上调或下调)一种或多种所关注核酸(例如miRNA或mRNA)的表达。在一些实施例中，在产生融合剂脂质体之前将核酸，例如DNA、mRNA或siRNA转移到细胞，例如以增加或减少信号传导路径、基因或核酸的表达。在一些实施例中，核酸靶向信号传导路径、基因或核酸的阻遏子，或抑制信号传导路径、基因或核酸。在一些实施例中，核酸编码上调或下调信号传导路径、基因或核酸的转录因子。在一些实施例中，活化子或阻遏子是与通过向导RNA靶向信号传导路径、基因或核酸的转录活化子或阻遏子连接的核酸酶无活性的cas9(dCas9)。在一些实施例中，遗传修饰表观遗传修饰内源性信号传导路径、基因或核酸以使其表达。在一些实施例中，表观遗传活化子是与通过向导RNA靶向信号传导路径、基因或核酸的表观遗传修饰剂连接的核酸酶无活性的cas9(dCas9)。在一些实施例中，在产生融合剂脂质体之前对细胞的DNA进行编辑，以改变(例如上调或下调)信号传导路径(例如Wnt/β-连环蛋白路径)、基因或核酸的表达。在一些实施例中，使用向导RNA和CRISPR-Cas9/Cpf1或其它基因编辑技术编辑DNA。
可以使用重组方法对细胞进行遗传修饰。可以使用重组方法获得编码所需基因的核酸序列，例如通过从表达基因的细胞筛选库、通过从已知包含基因的载体衍生基因或通过从含有其的细胞和组织直接分离(使用标准技术)。替代地，可以合成方式产生所关注基因，而不是克隆所述基因。
天然或合成核酸的表达通常是通过将编码所关注基因的核酸与启动子可操作地连接，并且将构建体并入表达载体中来实现。载体可以适用于在真核细胞中进行复制和整合。典型的克隆载体含有适用于表达所需核酸序列的转录与翻译终止子、起始序列和启动子。
在一些实施例中，可以用一个或多个表达区，例如基因对细胞进行遗传修饰。在一些实施例中，可以用外源基因(例如能够表达外源基因产物，如RNA或多肽产物)和/或外源调节核酸对细胞进行遗传修饰。在一些实施例中，可以用编码相对于靶细胞为内源性的基因产物的外源序列和/或能够调控内源基因表达的外源调节核酸对细胞进行遗传修饰。在一些实施例中，可以用外源基因和/或调控外源基因表达的调节核酸对细胞进行遗传修饰。在一些实施例中，可以用外源基因和/或调控内源基因表达的调节核酸对细胞进行遗传修饰。所属领域的技术人员应理解，本文所描述的细胞可以经遗传修饰以表达多种编码蛋白质或调节分子的外源基因，其可以例如作用于靶细胞的内源性或外源性基因组的基因产物。在一些实施例中，这类基因赋予融合剂脂质体特征，例如调控与靶细胞的融合。在一些实施例中，可以对细胞进行遗传修饰以表达内源基因和/或调节核酸。在一些实施例中，内源基因或调节核酸调控其它内源基因的表达。在一些实施例中，细胞可以经遗传修饰以表达内源基因和/或调节核酸，所述内源基因和/或调节核酸与其它染色体上的内源基因和/或调节核酸型式不同地(例如诱导性地、组织特异性地、组成性地或以更高或更低水平)表达。
启动子元件(例如增强子)调控转录起始的频率。通常，这些元件位于起始位点上游30-110bp的区域，尽管最近已展示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间距通常是灵活的，使得当元件相对于彼此倒置或移动时，启动子功能得以保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间距可以在活性开始下降之前增加到50bp。取决于启动子，似乎个别元件可以协同或独立地起作用以活化转录。
合适的启动子的一个实例是即刻早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。这一启动子序列为强组成型启动子序列，能够驱动与其可操作地连接的任何聚核苷酸序列的高水平表达。合适的启动子的另一实例为延伸生长因子-1α(EF-1α)。但是，还可以使用其它组成型启动子序列，包含(但不限于)：猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、埃-巴二氏病毒即刻早期启动子、劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)启动子、以及人类基因启动子，如(但不限于)肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。
另外，本发明不应限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被认为是本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了一种分子开关，所述分子开关能够在需要这类表达时接通与其可操作地连接的聚核苷酸序列的表达，或在不需要表达时关断所述表达。诱导型启动子的实例包含(但不限于)：组织特异性启动子、金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。在一些实施例中，在产生融合剂脂质体之前，例如在产生融合剂脂质体之前3、6、9、12、24、26、48、60或72小时上调融合剂的表达。
引入源中的表达载体还可以含有可选标记基因或报告基因或二者，以便于从寻求被转染或通过病毒载体感染的细胞群体鉴别和选择表达细胞。在其它方面中，可选标记可以携带在单独的DNA片段上并且用于共转染程序。可选标记和报告基因两者都可以侧接有适当的调节序列，以使得能够在宿主细胞中表达。适用的可选标记包含例如抗生素抗性基因，如neo等。
报告基因可以用于鉴别潜在转染的细胞和评估调节序列的功能。一般来说，报告基因是如下的基因：接受者来源中不存在或不被受体来源表达，并且编码通过一些易于检测的特性(例如酶活性)来体现表达的多肽。在DNA已引入接受者细胞之后的合适的时间分析报告基因的表达。合适的报告基因可以包含编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基转移酶、分泌的碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因的基因(例如Ui-Tei等人,2000《FEBS快报(FEBS Letters)》479:79-82)。合适的表达系统是众所周知的并且可使用已知技术制备或商业上获得。一般来说，将具有最小5'侧接区，展示最高水平的报告基因表达的构建体鉴别为启动子。这类启动子区可以与报告基因连接并且用于评估药剂调控启动子驱动的转录的能力。
在一些实施例中，细胞可以经遗传修饰以改变一种或多种蛋白质的表达。一种或多种蛋白质的表达可以在特定时间内被修饰，例如来源的发育或分化状态。在一些实施例中，融合剂脂质体是由经遗传修饰的细胞来源产生以改变一种或多种影响融合活性、结构或功能的蛋白质，例如融合剂蛋白或非融合剂蛋白的表达。一种或多种蛋白质的表达可能局限于一个或多个特定位置或遍及整个来源。
在一些实施例中，融合剂蛋白的表达经修饰。在一些实施例中，融合剂脂质体是由具有经修饰的融合剂蛋白表达，例如融合剂表达增加或减少至少10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、90％或更多的细胞产生。
在一些实施例中，细胞可以经工程改造以表达靶向融合剂蛋白的胞质酶(例如蛋白酶、磷酸酶、激酶、脱甲基酶、甲基转移酶、乙酰基酶)。在一些实施例中，胞质酶通过改变翻译后修饰来影响一种或多种融合剂。蛋白质的翻译后蛋白质修饰可以影响对养分可用性和氧化还原条件的反应性，以及蛋白质-蛋白质相互作用。在一些实施例中，融合剂脂质体包括一种具有改变的翻译后修饰，例如翻译后修饰增加或减少至少10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、90％或更多的融合剂。
将修饰引入细胞中的方法包含物理、生物和化学方法。参见例如Geng.和Lu,用于细胞分析和递送的微流体电穿孔(Microfluidic electroporation for cellularanalysis and delivery.)《芯片实验室(Lab on a Chip.)》13(19):3803-21.2013；Sharei,A.等人用于细胞内递送的无载体微流体平台(A vector-free microfluidicplatform for intracellular delivery.)《美国国家科学院院刊(PNAS)》第110卷第6号.2013；Yin,H.等人,用于基于基因的疗法的非病毒载体(Non-viral vectors for gene-based therapy).《遗传学自然评论(Nature Reviews Genetics.)》15:541-555.2014。修饰用于产生本文所描述的融合剂脂质体的细胞的合适方法包含例如扩散、渗透、渗透脉冲、渗透压休克、低渗溶解、低渗透析、离子电泳作用、电穿孔、超声处理、显微注射、钙沉淀、膜插层、脂质介导的转染、清洁剂处理、病毒感染、受体介导的内吞作用、蛋白质转导域的使用、粒子发射、膜融合、冻融、机械破坏和过滤。
确认遗传修饰的存在包含多种分析。这类分析包含例如分子生物学分析，如DNA印迹法和RNA印迹法、RT-PCR和PCR；生物化学分析，如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫学方法(ELISA和蛋白质印迹)或通过本文所描述的分析。
融合剂脂质体修饰
在一些方面中，对融合剂脂质体进行修饰。这类修饰可以有效地，例如改良靶向、功能或结构。
在一些实施例中，融合剂脂质体用可以非共价或共价连接到膜表面的融合剂，例如本文所描述的化学融合剂处理。在一些实施例中，融合剂脂质体用可以将自身非共价或共价连接或嵌入于膜中的融合剂，例如蛋白质或脂质融合剂处理。
在一些实施例中，配体通过存在于融合剂脂质体表面上的官能性化学基团(羧酸、醛、胺、硫氢基和羟基)缀合到融合剂脂质体表面。
这类反应性基团包含(但不限于)顺丁烯二酰亚胺基团。作为实例，可以合成融合剂脂质体以包含顺丁烯二酰亚胺缀合的磷脂，如(但不限于)DSPE-MaL-PEG2000。
在一些实施例中，合成或天然的小分子或脂质可以共价或非共价连接到融合剂脂质体表面。在一些实施例中，融合剂脂质体中的膜脂质可以经修饰以促进、诱导或增强融合特性。
在一些实施例中，融合剂脂质体通过装载经修饰的蛋白质而修饰(例如实现新颖的功能性、改变翻译后修饰、结合到线粒体膜和/或线粒体膜蛋白、形成具有异源功能的可裂解蛋白质、形成指定用于蛋白水解降解的蛋白质、分析药剂的位置和水平或将药剂以载剂形式递送)。在一些实施例中，融合剂脂质体负载有一种或多种经修饰的蛋白质。
在一些实施例中，相对于源细胞为外源性的蛋白质非共价结合到融合剂脂质体。蛋白质可以包含用于释放的可裂解域。在一些实施例中，本发明包含一种融合剂脂质体，其包括具有可裂解域的外源性蛋白质。
在一些实施例中，融合剂脂质体用指定用于蛋白水解降解的蛋白质修饰。多种蛋白酶识别特定的蛋白质氨基酸序列并且靶向蛋白质以进行降解。这些蛋白质降解酶可以用于特异性降解具有蛋白水解降解序列的蛋白质。在一些实施例中，融合剂脂质体包括调控的水平的一种或多种蛋白质降解酶，例如蛋白质降解酶增加或减少至少10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、90％或更大。
如本文所描述，可以将非融合剂添加剂添加到融合剂脂质体以对其结构和/或特性进行修饰。举例来说，可以将胆固醇或鞘磷脂添加到膜，以帮助稳定结构并且防止内部货物泄漏。另外，可以由氢化的卵磷脂酰胆碱或卵磷脂酰胆碱、胆固醇和磷酸二鲸蜡酯制备膜。(关于综述，参见例如Spuch和Navarro,《药物递送杂志(Journal of Drug Delivery)》,第2011卷,文章编号469679,第12页,2011.doi:10.1155/2011/469679)。
在一些实施例中，融合剂脂质体在外表面上包括一个或多个靶向基团(例如靶向蛋白)以靶向特定的细胞或组织类型(例如心肌细胞)。这些靶向基团包含(但不限于)受体、配体、抗体等。这些靶向基团在靶细胞的表面上结合其搭配物。在实施例中，靶向蛋白质对本文所描述的靶细胞，例如皮肤细胞、心肌细胞、肝细胞、肠细胞(例如小肠细胞)、胰脏细胞、脑细胞、前列腺细胞、肺细胞、结肠细胞或骨髓细胞上的细胞表面标记具有特异性。
在一些实施例中，本文所描述的融合剂脂质体经诊断剂官能化。诊断剂的实例包含(但不限于)：正电子发射断层扫描(positron emissions tomography；PET)、计算机辅助断层扫描(computer assisted tomography；CAT)、单光子发射计算机断层扫描、x射线、荧光透视法以及磁共振成像(magnetic resonance imaging；MRI)中所用的市售成像剂；以及造影剂。适用作MRI中的造影剂的材料的实例包含钆螯合物，以及铁、镁、锰、铜和铬。
将官能团引入融合剂脂质体的另一实例为在制备后期间，通过将融合剂脂质体和配体与同双官能或异双官能交联剂直接交联。这一程序可以使用合适的化学物质和一类交联剂(如本文所讨论的CDI、EDAC、戊二醛等)或在制备之后通过融合剂脂质体表面的化学修饰将配体偶联到融合剂脂质体表面的任何其它交联剂。这还包含一种方法，其中两亲性分子，如脂肪酸、脂质或功能稳定剂能够被动地吸附并粘附到融合剂脂质体表面，由此引入官能性端基以系栓到配体。
货物
在一些实施例中，本文所描述的融合剂脂质体包含货物，所述货物为或包括膜蛋白有效负载剂。在一些实施例中，膜蛋白质有效负载剂可以为或可以编码治疗蛋白。融合剂脂质体可以另外包含其它货物，例如，在一些实施例中，本文所描述的融合剂脂质体包含为或包括治疗剂的货物。在一些实施例中，本文所描述的融合剂脂质体包含多种膜有效负载剂。在一些实施例中，本文所描述的融合剂脂质体包含货物，所述货物为或包括多种治疗剂。在一些实施例中，融合剂脂质体包括货物，所述货物包括一种或多种膜蛋白有效负载剂和一种或多种治疗剂。在一些实施例中，货物可以是相对于源细胞为外源性或内源性的治疗剂。
在一些实施例中，融合剂脂质体包括与融合剂脂质体脂质双层缔合的货物。在一些实施例中，融合剂脂质体包括安置于融合剂脂质体内腔内的货物。在一些实施例中，融合剂脂质体包括与融合剂脂质体脂质双层缔合的货物和安置于融合剂脂质体内腔内的货物。
在一些实施例中，货物并不在衍生融合剂脂质体的细胞中天然表达。在一些实施例中，货物在衍生融合剂脂质体的细胞中天然表达。在一些实施例中，货物为在衍生融合剂脂质体的细胞中天然表达的野生型核酸或蛋白质的突变体，或为在衍生融合剂脂质体的细胞中天然表达的突变体的野生型。
在一些实施例中，货物通过在衍生融合剂脂质体的细胞中的表达(例如从通过转染、转导或电穿孔引入的DNA或mRNA的表达)而装载到融合剂脂质体中。在一些实施例中，货物由整合于衍生融合剂脂质体的细胞或游离地维持衍生融合剂脂质体的细胞的基因组中的DNA表达。在一些实施例中，货物的表达在衍生融合剂脂质体的细胞为组成性的。在一些实施例中，诱导货物在衍生融合剂脂质体的细胞中的表达。在一些实施例中，诱导货物在衍生融合剂脂质体的细胞中的表达，随即产生所述融合剂脂质体。在一些实施例中，诱导货物在衍生融合剂脂质体的细胞中的表达，同时诱导融合剂在衍生融合剂脂质体的细胞中的表达。
在一些实施例中，通过电穿孔将货物装载到融合剂脂质体中，装载到融合剂脂质体自身中或装载到衍生融合剂脂质体的细胞中。在一些实施例中，通过转染将货物装载到融合剂脂质体中，装载到融合剂脂质体自身中或装载到衍生融合剂脂质体的细胞中。
在一些方面中，本公开提供一种融合剂脂质体组合物(例如药物组合物)，其包括：(i)以下中的一种或多种：软骨体(例如，如国际申请，PCT/US16/64251中所描述)、线粒体、细胞器(例如线粒体、溶酶体、核、细胞膜、细胞质、内质网、核糖体、液泡、内体、剪接体、聚合酶、衣壳、顶体、自噬体、中心粒、糖酵解酶体、乙醛酸循环体、氢化酶体、黑素体、纺锤剩体、肌原纤维、刺丝囊、过氧化物酶体、蛋白酶体、囊泡、应激颗粒和细胞器网状物)或去核细胞，例如包括前述中的任一种的去核细胞；以及(ii)融合剂，例如成肌蛋白。
在实施例中，融合剂存在于线粒体或软骨体外部的脂质双层中。在实施例中，软骨体具有如例如国际申请PCT/US16/64251中所描述的一种或多种特性，所述申请以全文引用的方式并入本文中，包含实例和发明内容。
在一些实施例中，货物可以包含一种或多种核酸序列、一种或多种多肽、核酸序列和/或多肽的组合、一种或多种细胞器和其任何组合。在一些实施例中，货物可以包含一种或多种细胞组分。在一些实施例中，货物包含一种或多种胞质和/或核组分。
在一些实施例中，货物包含核酸，例如DNA、核DNA(nDNA)、mtDNA(线粒体DNA)、蛋白质编码DNA、基因、操纵子、染色体、基因组、转座子、逆转录转座子、病毒基因组、内含子、外显子、经修饰的DNA、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、经修饰的RNA、微RNA、小干扰RNA(siRNA)、转移信使RNA(tmRNA)、核糖体RNA(rRNA)、mtRNA(线粒体RNA)、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、SmY RNA(mRNA反式剪接RNA)、向导RNA(gRNA)、TERC(端粒酶RNA组分)、反义RNA(aRNA)、顺式天然反义转录物(顺式NAT)、CRISPR RNA(crRNA)、lncRNA(长非编码RNA)、piRNA(piwi相互作用RNA)、短发夹RNA(shRNA)、tasiRNA(反式作用siRNA)、增强子RNA(eRNA)、卫星RNA、蛋白质编码RNA(pcRNA)、双链RNA(dsRNA)、RNAi(干扰RNA)、circRNA(环状RNA)、重编程RNA、适体和其任何组合。在一些实施例中，核酸为野生型核酸。在一些实施例中，蛋白质为突变核酸。在一些实施例中，核酸为多个核酸序列的融合物或嵌合体。
在一些实施例中，使用基因编辑技术，例如向导RNA和CRISPR-Cas9/Cpf1，或使用不同的靶向核酸内切酶(例如锌指核酸酶、转录活化子样核酸酶(TALEN))编辑融合剂脂质体中的DNA或衍生融合剂脂质体的细胞中的DNA，以校正遗传突变。在一些实施例中，遗传突变与受试者的疾病相关。DNA编辑的实例包含小插入/缺失、大缺失、模板DNA的基因校正或DNA的大插入。在一些实施例中，用非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)来实现基因编辑。在一些实施例中，编辑为基因敲除。在一些实施例中，编辑为基因敲入。在一些实施例中，DNA的两个等位基因都被编辑。在一些实施例中，单个等位基因被编辑。在一些实施例中，进行多次编辑。在一些实施例中，融合剂脂质体或细胞衍生自受试者，或与受试者基因匹配，或与受试者免疫学相容(例如具有类似的MHC)。
在一些实施例中，货物可以包含核酸。举例来说，货物可以包括RNA以增强内源性蛋白质(例如，在一些实施例中，相对于源细胞为内源性的，并且在一些实施例中，相对于靶细胞为内源性的)的表达，或抑制内源性蛋白质的蛋白质表达的siRNA或miRNA。举例来说，内源性蛋白质可以调控靶细胞中的结构或功能。在一些实施例中，货物可以包含编码经工程改造的蛋白质的核酸，所述经工程改造的蛋白质调控靶细胞中的结构或功能。在一些实施例中，货物是靶向调控靶细胞中的结构或功能的转录活化子的核酸。
在一些实施例中，货物包括自复制RNA，例如如本文所描述。在一些实施例中，自复制RNA为单链RNA和/或线性RNA。在一些实施例中，自复制RNA编码一种或多种蛋白质，例如本文所描述的蛋白质，例如膜蛋白、分泌性蛋白、核蛋白或细胞器蛋白。在一些实施例中，自复制RNA包括来自动脉炎病毒或α病毒或其变体的部分或完整基因组。
在一些实施例中，货物可以包括可以递送到靶细胞中的RNA，并且RNA在靶细胞内部复制。自复制RNA的复制可以涉及对宿主细胞为外源性的RNA复制机制和/或对宿主细胞为内源性的RNA复制机制。
在一些实施例中，自复制RNA包括病毒基因组或其自复制部分或类似物。在一些实施例中，自复制RNA来自正义单链RNA病毒。在一些实施例中，自复制RNA包括部分或完整的动脉炎病毒基因组或其变体。在一些实施例中，动脉炎病毒包括马动脉炎病毒(EAV)、猪呼吸道和生殖综合征病毒(PRRSV)、乳酸脱氢酶升高病毒(LDV)和猴出血性发热病毒(SHFV)。在一些实施例中，自复制RNA包括部分或完整的α病毒基因组或其变体。在一些实施例中，α病毒属于VEEV/EEEV群组(例如，委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitisvirus))、SF群组或SIN群组。
在一些实施例中，包括自复制RNA的融合剂脂质体还包括：(i)一种或多种促进RNA复制的蛋白质，或(ii)编码一种或多种促进RNA复制的蛋白质的核酸，例如作为自复制RNA的一部分或在单独的核酸分子中。
在一些实施例中，自复制RNA缺乏至少一种编码一种或多种相对于对应野生型基因组的病毒结构蛋白的功能基因。例如，在一些实施例中，自复制RNA完全不具有病毒结构蛋白的一种或多种基因或包括病毒结构蛋白的非功能性突变基因。在一些实施例中，自复制RNA不包括病毒结构蛋白的任何基因。
在一些实施例中，自复制RNA包括病毒衣壳增强子，例如如国际申请WO2018/106615中所描述，所述申请以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，病毒衣壳增强子为增加编码序列的顺式翻译的RNA结构，例如通过允许编码序列的eIF2α非依赖性翻译。在一些实施例中，宿主细胞具有减弱的翻译，例如归因于eIF2α的PKR介导的磷酸化。在实施例中，病毒衣壳增强子包括来自病毒衣壳蛋白或DLP的变体的下游环(DLP)。在一些实施例中，病毒衣壳增强子来自属于披膜病毒家族的病毒，例如披膜病毒家族的α病毒属。在一些实施例中，病毒衣壳增强子具有WO2018/106615的SEQ ID NO:1的序列(所述序列以全文引用的方式并入本文中)，或与其具有至少70％、80％、85％、90％、95％或99％一致性的序列。在一些实施例中，序列具有WO2018/106615图1中所示的相同的二级结构。
在一些实施例中，自复制RNA包括一种或多种动脉炎病毒序列，例如如国际申请WO2017/180770中所描述，所述申请以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，自复制RNA包括ORF7(或其功能片段或变体)和/或自复制RNA缺乏动脉炎病毒的功能性ORF2a(例如，完全缺乏ORF2a，或包括ORF2a的非功能性突变体)。在一些实施例中，自复制RNA缺乏功能性ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5a、ORF5、或ORF6或其任何组合(例如，完全缺乏一个或多个序列或包括一个或多个序列的非功能性突变体)。在一些实施例中，自复制RNA缺乏以下中的一种或多种的一部分：ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5a、ORF5或ORF6。在一些实施例中，自复制RNA包括一种或多种亚基因组(sg)启动子，例如位于非天然部位处。在一些实施例中，启动子包括sg启动子1、sg启动子2、sg启动子3、sg启动子4、sg启动子5、sg启动子6、sg启动子7或其功能片段或变体。在一些实施例中，自复制RNA包括一个或多个转录终止信号，例如T7转录终止信号，例如突变体T7转录终止信号，例如包括T9001G、T3185A或G3188A中的一种或多种(例如，任两种或全部)的突变体T7转录终止信号
在一些实施例中，自复制RNA包括5'UTR，例如突变体α病毒5'UTR，例如如国际申请WO2018/075235中所描述，所述申请以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，突变体α病毒5'UTR包括位置1、2、4或其组合处的一个或多个核苷酸取代。在一些实施例中，突变体α病毒5'UTR包括位置2处的U->G取代。
在一些实施例中，货物包含多肽，例如酶、结构多肽、信号传导多肽、调节多肽、转运多肽、感觉多肽、运动多肽、防御多肽、贮存多肽、转录因子、抗体、细胞因子、激素、分解代谢多肽、合成代谢多肽、蛋白水解多肽、代谢多肽、激酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、连接酶、酶调控子多肽、蛋白质结合多肽、脂质结合多肽、膜融合多肽、细胞分化多肽、表观遗传多肽、细胞死亡多肽、核转运多肽、核酸结合多肽、重编程多肽、DNA编辑多肽、DNA修复多肽、DNA重组多肽、DNA整合多肽、靶向核酸内切酶(例如锌指核酸酶、转录活化子样核酸酶(TALEN)、cas9和其同源物)、重组酶和其任何组合。在一些实施例中，蛋白质靶向细胞中的蛋白质以进行降解。在一些实施例中，蛋白质通过将蛋白质定位于蛋白酶体而靶向细胞中的蛋白质以进行降解。在一些实施例中，蛋白质为野生型蛋白质。在一些实施例中，蛋白质为突变蛋白质。在一些实施例中，蛋白质是融合或嵌合蛋白。
在一些实施例中，货物包含小分子，例如离子(例如Ca2+、Cl-、Fe2+)、碳水化合物、脂质、活性氧类、活性氮类、类异戊二烯、信号传导分子、血红素、多肽辅因子、接受电子化合物、给电子化合物、代谢物、配体和其任何组合。在一些实施例中，小分子为与细胞中的靶标相互作用的药物。在一些实施例中，小分子靶向细胞中的蛋白质以进行降解。在一些实施例中，小分子通过将蛋白质定位于蛋白酶体而靶向细胞中的蛋白质以进行降解。在一些实施例中，小分子为蛋白水解靶向嵌合体分子(PROTAC)。
在一些实施例中，货物包含蛋白质、核酸或代谢物，例如多个多肽、多个核酸、多个小分子的混合物；核酸、多肽和小分子的组合；核糖核蛋白复合物(例如Cas9-gRNA复合物)；多个转录因子、多个表观遗传因子、重编程因子(例如Oct4、Sox2、cMyc和Klf4)；多个调节RNA；和其任何组合。
在一些实施例中，货物包含一种或多种细胞器，例如软骨体、线粒体、溶酶体、细胞核、细胞膜、细胞质、内质网、核糖体、液泡、内体、剪接体、聚合酶、衣壳、顶体、自噬体、中心粒、糖酵解酶体、乙醛酸循环体、氢化酶体、黑素体、纺锤剩体、肌原纤维、刺丝囊、过氧化物酶体、蛋白酶体、囊泡、应激颗粒、细胞器网状物和其任何组合。
在一些实施例中，货物富集于融合剂脂质体或细胞膜处。在一些实施例中，通过经由肽信号序列靶向膜来富集货物。在一些实施例中，货物通过与膜缔合的蛋白质、脂质或小分子结合而富集。在一些实施例中，货物通过与膜缔合的蛋白质、脂质或小分子二聚而富集。在一些实施例中，货物为嵌合的(例如嵌合蛋白或核酸)并且包括介导与膜缔合的蛋白质、脂质或小分子的结合或二聚的域。所关注的膜缔合的蛋白质包含(但不限于)具有与细胞膜稳定结合(例如结合、整合等)的域(即，膜缔合域)的任何蛋白质，其中这类域可以包含肉豆蔻酰基化域、法呢基化域、跨膜域等。所关注的特定膜缔合的蛋白质包含(但不限于)：肉豆蔻酰基化蛋白质，例如p 60v-src等；法呢基化蛋白质，例如Ras、Rheb和CENP-E,F(通过结合到磷脂酰丝氨酸，一种细胞膜双层的脂质组分而结合特定脂质双层组分(例如膜联蛋白V)的蛋白质)等；膜锚蛋白；跨膜蛋白，例如转铁蛋白受体和其部分；以及膜融合蛋白。在一些实施例中，膜缔合的蛋白质含有第一二聚化域。第一二聚化域可以是例如直接结合到货物的第二二聚化域或通过二聚化介体结合到第二二聚化域的域。在一些实施例中，货物含有第二二聚化域。第二二聚化域可以是例如直接或通过二聚化介体与膜缔合的蛋白质的第一二聚化域二聚(例如稳定缔合，如通过非共价结合相互作用，直接或通过介体)的域。关于二聚化域，这些域是直接或通过二聚化介体参与结合事件的域，其中结合事件使得产生膜缔合的蛋白质与靶蛋白的所需多聚(例如二聚)复合物。第一和第二二聚化域可以是同二聚体，使得它们由氨基酸的相同序列构成，或异二聚体，使得它们由氨基酸的不同序列构成。二聚化域可以变化，其中所关注的域包含(但不限于)：靶生物分子的配体，如特异性结合到所关注的特定蛋白质的配体(例如蛋白质:蛋白质相互作用域)，如SH2域、Paz域、RING域、转录活化子域、DNA结合域、酶催化域、酶调节域、酶次单位、定位到定义的细胞位置的域、定位域的识别域、如下URL所列的域：pawsonlab.mshri.on.ca/index.php？option＝com_content&task＝view&id＝30&Itemid＝63/等。在一些实施例中，第一二聚化域结合核酸(例如mRNA、miRNA、siRNA、DNA)并且第二二聚化域为货物上存在的核酸序列(例如第一二聚化域为MS2并且第二二聚化域为MS2 RNA的高亲和力结合环)。可以使用充当二聚化介体的任何适宜的化合物。多种化合物，包含天然存在的和合成的物质可以用作二聚化介体。选择二聚化介体的适用并且易于观察或测量的标准包含：(A)配体为生理学上可接受的(即对使用所述配体的细胞或动物没有异常毒性)；(B)其具有合理的治疗剂量范围；(C)其可根据需要穿过细胞膜和其它膜(其中在一些情况下，其可能能够介导细胞外部的二聚化)，以及(D)以对于所需应用合理的亲和力结合到其所设计的嵌合蛋白的靶域。第一个必要标准是化合物在生理上相对惰性，但其具有二聚化介体活性。在一些情况下，配体将为非肽和非核酸。额外的二聚化域描述于例如US20170087087和US20170130197中，其中的每一个以全文引用的方式并入本文中。
有效负载剂
本文所描述的方法和组合物可以用于靶向有效负载(例如有效负载剂)。举例来说，有效负载剂可以例如通过使用共翻译内质网(ER)信号靶向细胞膜。细胞膜可以为例如ER膜、质膜、分泌性和/或分泌囊泡的膜，或溶酶体膜。在一些实施例中，有效负载剂为分泌的目标。在一些实施例中，本文所描述的方法和组合物可以用于在ER中翻译之后将有效负载靶向细胞器(例如高尔基体、分泌囊泡或溶酶体)的内腔。在一些实施例中，可以例如通过使用核定位信号将有效负载剂靶向细胞核。在另一个实例中，有效负载剂可以例如分别通过使用线粒体或过氧化物酶体定位信号来靶向线粒体或过氧化物酶体。
蛋白质有效负载剂(例如，膜蛋白有效负载剂或分泌性蛋白有效负载剂可以为或包括例如蛋白质或编码蛋白质的核酸，所述蛋白质选自：核周膜蛋白、核内膜蛋白、核质蛋白、核仁蛋白、核仁外周蛋白、卡哈尔体蛋白、碎晶体蛋白、宝石核体蛋白、组蛋白体蛋白、核小点蛋白、核应力体蛋白、旁斑蛋白、PML体蛋白、多梳体蛋白、跨膜蛋白、细胞表面蛋白、与膜胞质侧缔合的蛋白质、内质网蛋白、溶酶体蛋白、高尔基体蛋白、分泌性蛋白、分泌囊泡蛋白、线粒体膜蛋白、线粒体外膜蛋白、线粒体内膜蛋白、线粒体内边界膜蛋白、线粒体嵴膜蛋白、线粒体DNA蛋白、线粒体膜间间隙蛋白、线粒体基质蛋白、线粒体基质颗粒蛋白质、线粒体嵴蛋白、线粒体核糖体蛋白、线粒体嵴内蛋白、线粒体周围间隙蛋白、过氧化物酶体膜蛋白、过氧化物酶体晶体核心蛋白、过氧化物酶体基质蛋白、过氧化体或核内体蛋白或其组合。
在一些实施例中，膜蛋白有效负载剂为天然存在于或靶向靶膜的蛋白质的外源性型式。在一些实施例中，膜蛋白有效负载剂并不天然存在于或靶向靶膜。在一些实施例中，蛋白质有效负载剂(例如膜蛋白有效负载剂或分泌性蛋白有效负载剂)可以为或包括例如蛋白质或编码蛋白质的核酸，所述蛋白质选自：细胞表面受体蛋白、转运蛋白、离子通道、膜缔合酶、细胞粘附蛋白、免疫球蛋白、T细胞受体、内质网蛋白、溶酶体蛋白、高尔基体蛋白、分泌性蛋白、分泌囊泡蛋白、核内体蛋白。膜蛋白有效负载剂可以为例如天然存在的膜蛋白的重组型式或合成蛋白，例如具有未在自然界中发现的序列或未在自然界中发现的域的蛋白质，例如嵌合膜蛋白，例如具有衍生自第一天然存在的蛋白质的细胞外域的跨膜蛋白和衍生自第二天然存在的蛋白质，例如嵌合抗原受体的跨膜域和/或胞内域。
在一些实施例中，核蛋白有效负载剂为天然存在于或靶向细胞核的蛋白质的外源性型式。在一些实施例中，核蛋白有效负载剂并不天然存在于或靶向细胞核。在一些实施例中，蛋白质有效负载剂(例如核蛋白有效负载剂)可以为或包括例如蛋白质或编码蛋白质的核酸，所述蛋白质选自：转录因子、核酸酶、重组酶、表观遗传因子、转录后RNA修饰因子(例如mRNA剪接因子)、非编码RNA(例如snRNA或snoRNA)或核糖核酸蛋白(例如snRNP或snoRNP)、结构蛋白(例如核纤层蛋白或细胞骨架蛋白)。核蛋白有效负载剂可以为例如天然存在的核蛋白的重组型式或合成蛋白，例如具有未在自然界中发现的序列或未在自然界中发现的域的蛋白质，例如嵌合核蛋白，例如由衍生自锌指、TAL或RNA指导蛋白质的DNA结合域或所属领域中已知的其它DNA结合域之间的翻译融合或缔合构成的核蛋白，以及来自第二蛋白质的核酸修饰域，例如核酸酶、重组酶、碱基编辑剂(例如脱氨酶)、切口酶、转录因子(例如活化子或阻遏子)、改变DNA调节的病毒基序(例如VP16或VP64)、表观遗传修饰因子(例如脱甲基酶)或所属领域中已知的核酸修饰域。
细胞器蛋白有效负载剂可以为例如天然存在的核蛋白的重组型式或合成蛋白，例如具有未在自然界中发现的序列或未在自然界中发现的域的蛋白质，例如嵌合线粒体或过氧化物酶体蛋白，例如由衍生自锌指、TAL或RNA指导蛋白质的mtDNA结合域或所属领域中已知的其它mtDNA结合域之间的翻译融合或缔合构成的线粒体或过氧化物酶体蛋白，以及来自第二蛋白质的核酸修饰域，例如核酸酶、重组酶、碱基编辑剂(例如脱氨酶)、切口酶、转录因子(例如活化子或阻遏子)或所属领域中已知的核酸修饰域。
在一些实施例中，线粒体或过氧化物酶体蛋白有效负载剂为天然存在于或靶向线粒体或过氧化物酶体的蛋白质的外源性型式。在一些实施例中，线粒体或过氧化物酶体蛋白有效负载剂并不天然存在于或靶向线粒体或过氧化物酶体。在一些实施例中，蛋白质有效负载剂(例如线粒体或过氧化物酶体蛋白有效负载剂可以为或包括例如蛋白质或编码蛋白质的核酸，所述蛋白质选自：线粒体膜蛋白、线粒体外膜蛋白、线粒体内膜蛋白、线粒体内边界膜蛋白、线粒体嵴膜蛋白、线粒体DNA蛋白、线粒体膜间间隙蛋白、线粒体基质蛋白、线粒体基质颗粒蛋白、线粒体嵴蛋白线粒体核糖体蛋白、线粒体嵴内蛋白、线粒体周围间隙蛋白、过氧化物酶体膜蛋白、过氧化物酶体晶体核心蛋白、过氧化物酶体基质蛋白、过氧化体、转录因子、核酸酶、重组酶、表观遗传因子、非编码RNA或核糖核酸蛋白、结构蛋白、酶、转运蛋白、呼吸复合物、融合或分裂蛋白、细胞色素、信号传导蛋白、凋亡蛋白或因子、线粒体输入蛋白、线粒体输出蛋白或电子传递蛋白。
在一些实施例中，有效负载剂(例如膜蛋白有效负载剂、核蛋白有效负载剂、线粒体蛋白有效负载剂或过氧化物酶体蛋白有效负载剂)包括蛋白质(例如合成蛋白)，所述蛋白质包括与定位域(例如TAL、ZF、Cas9或大范围核酸酶)连接的效应子域。示例性效应子域包含(但不限于)：核酸酶、重组酶、整合酶、碱基编辑剂(例如脱氨酶)、转录因子和表观遗传修饰剂。
在一些实施例中，融合剂脂质体包括蛋白质有效负载剂(例如膜蛋白有效负载剂、核蛋白有效负载剂、细胞器蛋白有效负载剂、线粒体蛋白有效负载剂或过氧化物酶体蛋白有效负载剂，例如如本文所描述，或分泌性蛋白有效负载剂)。在一些实施例中，蛋白质有效负载剂为编码其的蛋白质和/或核酸。在一些实施例中，蛋白质在细胞系中表达，并且然后并入融合剂脂质体中。普通技术人员将了解，在任何这类蛋白质由细胞系表达的程度上，细胞系能够进行制备蛋白质所需的任何翻译后加工。在一些实施例中，翻译后加工包括蛋白质剪接、蛋白质裂解、蛋白质折叠、蛋白质糖基化、二聚化等中的一种或多种。
在一些实施例中，蛋白质(例如膜蛋白、核蛋白、细胞器蛋白有效负载剂、线粒体蛋白有效负载剂或过氧化物酶体蛋白有效负载剂，例如如本文所描述，或分泌性蛋白)由衍生融合剂脂质体的源细胞表达。普通技术人员将了解，在任何这类蛋白质由源细胞表达的程度上，源细胞能够进行制备蛋白质所需的任何翻译后加工。在一些实施例中，翻译后加工包括蛋白质剪接、蛋白质裂解、蛋白质折叠、蛋白质糖基化、二聚化等中的一种或多种。在一些实施例中，蛋白质有效负载剂为核酸。在一些实施例中，核酸编码细胞表面或核蛋白。在一些实施例中，核酸编码核外膜蛋白、核周膜蛋白、核内膜蛋白、核质蛋白、核仁蛋白、内质网蛋白、溶酶体蛋白、高尔基体蛋白、分泌性蛋、分泌囊泡蛋白、细胞器蛋白、线粒体蛋白或过氧化物酶体蛋白或核内体蛋白。在一些实施例中，蛋白质有效负载剂，例如膜蛋白有效负载剂、核蛋白有效负载剂或细胞器蛋白有效负载剂，例如如本文所描述，为蛋白质或编码选自本文所描述的细胞表面抗原的蛋白质的核酸。在一些实施例中，核酸编码经工程改造的细胞表面蛋白。在一些实施例中，经工程改造的细胞表面蛋白为嵌合抗原受体。在一些实施例中，核酸编码线粒体膜蛋白、线粒体外膜蛋白、线粒体内膜蛋白、线粒体内边界膜蛋白、线粒体嵴膜蛋白、线粒体DNA蛋白、线粒体膜间间隙蛋白、线粒体基质蛋白、线粒体基质颗粒蛋白、线粒体嵴蛋白、线粒体核糖体蛋白、线粒体嵴内蛋白、线粒体周围间隙蛋白、过氧化物酶体膜蛋白、过氧化物酶体晶体核心蛋白、过氧化物酶体基质蛋白或过氧化体。在一些实施例中，蛋白质有效负载剂，例如线粒体或过氧化物酶体蛋白有效负载剂为蛋白质或编码选自本文所描述的线粒体或过氧化物酶体蛋白的蛋白质的核酸。
在一些实施例中，蛋白质有效负载剂(例如膜蛋白有效负载剂、核蛋白有效负载剂、细胞器蛋白有效负载剂、线粒体蛋白有效负载剂或过氧化物酶体蛋白有效负载剂，或分泌性蛋白有效负载剂，例如如本文所描述)包括由融合靶细胞表达的核酸。普通技术人员将了解，在由核酸蛋白有效负载剂(例如膜蛋白有效负载剂、核蛋白有效负载剂、细胞器蛋白有效负载剂、线粒体蛋白有效负载剂或过氧化物酶体蛋白有效负载剂，例如如本文所描述)表达产生的任何蛋白质需要翻译后加工的程度上，这类翻译后加工将在融合靶细胞中进行。在一些实施例中，翻译后可以包括以下中的一种或多种：蛋白质剪接、蛋白质裂解、蛋白质折叠、蛋白质糖基化、二聚化等。在一些实施例中，翻译后修饰为脂质的共价附接，如脂肪酸、类异戊二烯、固醇、磷脂、糖基磷脂酰肌醇(GPI)、胆固醇、法呢基、香叶酰香叶酰、肉豆蔻酰基、软脂酰基，在一些实施例中，其将蛋白质靶向质膜。在一些实施例中，翻译后修饰为核定位序列的直接磷酸化。
在一些实施例中，蛋白质有效负载剂(例如膜蛋白有效负载剂、核蛋白有效负载剂、细胞器蛋白有效负载剂、线粒体蛋白有效负载剂或过氧化物酶体蛋白有效负载剂，或分泌性蛋白有效负载剂，例如如本文所描述)包括核酸，例如RNA或DNA。在一些实施例中，核酸为以下、包括以下或由以下组成：一个或多个天然核酸残基。在一些实施例中，核酸为以下、包括以下或由以下组成：一个或多个核酸类似物。在一些实施例中，核酸具有编码功能性基因产物(如RNA或蛋白质)的核苷酸序列。在一些实施例中，核酸包含一个或多个内含子。在一些实施例中，通过以下中的一种或多种来制备核酸：从天然来源分离、基于互补模板的聚合进行酶促合成(在体内或体外)、在重组细胞或系统中繁殖和化学合成。在一些实施例中，核酸的长度为至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、1 10、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000个或更多个残基。在一些实施例中，核酸部分或完全单链；在一些实施例中，核酸为部分或完全双链。在一些实施例中，核酸具有核苷酸序列，所述核苷酸序列包括至少一个编码多肽或为编码多肽的序列的互补序列的元件。核酸可以引发变体，例如与参考核酸具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％的总体序列一致性。在一些实施例中，变体核酸并不与参考核酸共用至少一个特征性序列元件。在一些实施例中，变体核酸共用参考核酸的生物活性中的一种或多种。在一些实施例中，核酸变体具有与参考核酸一致但在特定位置处进行少量序列变化的核酸序列。在一些实施例中，相比于参考核酸，变体中的少于约20％、约15％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％或约2％的残基被取代、插入或缺失。在一些实施例中，相比于参考核酸，变体核酸包括约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、约2或约1个经取代的残基。在一些实施例中，相对于参考核酸，变体核酸包括极小数目(例如少于约5、约4、约3、约2或约1个)数目的参与特定生物活性的经取代、插入或缺失的功能性残基。在一些实施例中，相比于参考核酸，变体核酸包括不超过约15、约12、约9、约3或约1个添加或缺失，并且在一些实施例中，不包括添加或缺失。在一些实施例中，相比于参考核酸，变体核酸包括少于约27、约24、约21、约18、约15、约12、约9、约6、约3个或少于约9、约6、约3或约2个添加或缺失。
在一些实施例中，蛋白质有效负载剂(例如膜蛋白有效负载剂、核蛋白有效负载剂、细胞器蛋白有效负载剂、线粒体蛋白有效负载剂或过氧化物酶体蛋白有效负载剂，或分泌性蛋白有效负载剂，例如如本文所描述)包括蛋白质。蛋白质可以包含除氨基酸以外的部分(例如可以是糖蛋白、蛋白多糖等)和/或可以其它方式加工或修饰。蛋白质有时可以包含超过一个多肽链，例如通过一个或多个二硫键连接或通过其它方式缔合。蛋白质可以含有L-氨基酸、D-氨基酸或这两种，并且可以含有多种氨基酸修饰或类似物中的任一种。在一些实施例中，蛋白质可以包括天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸和其组合。在一些实施例中，蛋白质为抗体、抗体片段、其生物活性部分和/或其特征部分。多肽可以包含其变体，例如与参考多肽具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％的总体序列一致性。在一些实施例中，变体多肽并不与参考多肽共用至少一个特征性序列元件。在一些实施例中，变体多肽共用参考多肽的生物活性中的一种或多种。在一些实施例中，多肽变体具有与参考多肽一致但在特定位置处进行少量序列变化的氨基酸序列。在一些实施例中，相比于参考多肽，变体中的少于约20％、约15％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％或约2％的残基被取代、插入或缺失。在一些实施例中，相比于参考多肽，变体多肽包括约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、约2或约1个经取代的残基。在一些实施例中，相对于参考多肽，变体多肽包括极小数目(例如少于约5、约4、约3、约2或约1个)数目的参与特定生物活性的经取代、插入或缺失的功能性残基。在一些实施例中，相比于参考多肽，变体多肽包括不超过约5、约4、约3、约2或约1个添加或缺失，并且在一些实施例中，不包括添加或缺失。在一些实施例中，相比于参考多肽，变体多肽包括少于约25、约20、约19、约18、约17、约16、约15、约14、约13、约10、约9、约8、约7、约6个并且通常少于约5、约4、约3或约2个添加或缺失。
信号序列
在一些实施例中，蛋白质有效负载剂(例如膜蛋白有效负载剂、核蛋白有效负载剂、细胞器蛋白有效负载剂、线粒体蛋白有效负载剂或过氧化物酶体蛋白有效负载剂，或分泌性蛋白有效负载剂，例如如本文所描述)为蛋白质(或编码其的核酸)，所述蛋白质(或编码其的核酸)包含将蛋白质引导到特定位点或位置(例如引导到细胞表面、细胞核、细胞器线粒体或过氧化物酶体)的信号序列。所属领域的技术人员将了解，在某些情况下，细胞使用“分选信号”，所述信号为至少为蛋白质的临时部分的氨基酸基序(例如，当最初产生时)，以将蛋白质靶向特定亚细胞位置(例如，靶向靶细胞的特定细胞器或表面膜)。在一些实施例中，分选信号为信号序列、信号肽或前导序列，其将蛋白质引导到被称作内质网(ER)、线粒体或过氧化物酶体的细胞器；在一些这类实施例中，接着将蛋白质递送到质膜。参见US20160289674A1。在一些这类实施例中，然后分泌蛋白质。在一些这类实施例中，然后将蛋白质运输到溶酶体。在一些这类实施例中，然后将蛋白质运输到高尔基体。在一些这类实施例中，然后将蛋白质运输到分泌囊泡，并且接着可以从细胞分泌蛋白质。在一些这类实施例中，然后将蛋白质运输到内体。在一些实施例中，分选信号为信号序列、信号肽或前导序列，其将蛋白质引导到细胞核(例如核定位序列)；在一些这类实施例中，接着将蛋白质递送到细胞核。
在一些实施例中，靶向ER的蛋白质为共翻译的。在一些实施例中，将蛋白质易位和膜插入偶联到蛋白质合成。在一些实施例中，信号序列可以是疏水性的。在一些实施例中，信号序列可以是部分疏水性的。在一些实施例中，信号序列由信号识别粒子(SRP)识别。在一些实施例中，当信号序列从核糖体出现时，SRP识别信号序列。在一些实施例中，通过结合到SRP受体，将新生肽链-核糖体复合物靶向ER。在一些实施例中，信号序列与易位子的Sec61α亚基相互作用并且引发所述膜蛋白或所述膜蛋白的部分链的易位。
在一些实施例中，靶向线粒体的蛋白质是通过使得能够易位到线粒体中的线粒体定位序列(也称为线粒体信号序列或前序列)。典型线粒体输入路径通常需要存在构成外膜移位酶(TOM)复合物的通道的Tom40蛋白。除通道自身以外，TOM复合物含有多种受体蛋白，如Tom20、Tom22和Tom70，其参与识别传入的前体蛋白。通过TOM复合物的输入取决于前驱蛋白与由TOM复合物的亚基暴露的受体域之间的相互作用。某些类别的前体蛋白与TOM复合物有差异地相互作用。被称作前序列的通过可裂解线粒体靶向信号靶向线粒体的前体蛋白在其与Tom22相互作用之前首先由Tom20识别。含有完整靶向信号的载剂蛋白的疏水性前体需要存在Tom70受体。在其通过Tom40的通道的方式上，两种类型的蛋白质前体与孔隙相互作用，但Tom40的相互作用残基的模式对于前序列和载剂前体为不同的。在一些实施例中，线粒体蛋白在翻译后或共翻译中转运。线粒体靶向元件可以作为沿前体的长度方向分散的个别或多个单元存在，并且在序列、结构和位置方面显著变化，反映其在替代的线粒体分选途径中的作用。“经典”线粒体靶向信号为被称为前序列的可裂解N端带正电序列，其将蛋白质引导到线粒体基质、内膜和在少数情况下线粒体膜间间隙。在一些实施例中，线粒体前序列包括N端延伸部分，其为具有净正电荷的长度在15个与55个氨基酸之间的α-螺旋区段。然而，驻留于外膜、膜间间隙和内膜中的线粒体蛋白质的较大部分缺乏经典前序列，但实际上含有成熟蛋白质内的内部隐蔽的靶向序列。在一些实施例中，线粒体定位序列由TOM复合物识别。在一些实施例中，线粒体蛋白借助于TIM伴随蛋白或线粒体外膜插入酶进一步移植到线粒体外膜中。在一些实施例中，线粒体蛋白通过线粒体膜间间隙输入和组装机制进一步转运到线粒体膜间间隙中。在一些实施例中，线粒体蛋白进一步转运到TIM23复合物中，到线粒体基质或内膜中。在一些实施例中，线粒体蛋白进一步转运到TIM22复合物中，到线粒体基质或内膜中。
在一些实施例中，靶向过氧化物酶体的蛋白质是通过使得能够易位到过氧化物酶体的过氧化物酶体定位序列(也成为过氧化物酶体靶向信号)。存在两种主要类别的过氧化物酶体定位序列。过氧化物酶体靶向信号1的特征在于具有共有序列(S/A/C)-(K/R/H)-(L/A)的c端三肽。常见的是丝氨酸-赖氨酸-亮氨酸(SKL)。过氧化物酶体靶向序列2的特征在于接近共有序列(R/K)-(L/V/I)-XXXXX-(H/Q)-(L/A/F)的N端定位的九肽，其中X为任何氨基酸。一些蛋白质既不含有这些信号，并且其转运是基于与确实含有过氧化物酶体靶向信号的蛋白质的缔合。在一些实施例中，过氧化物酶体定位序列与PEX基因相互作用。在一些实施例中，过氧化物酶体定位序列与由PEX5基因编码的PTS1受体相互作用。在一些实施例中，过氧化物酶体定位序列与由PEX7基因编码的PTS2受体相互作用。在一些实施例中，过氧化物酶体定位序列为“mPTS”基序，其更不充分定义并且可以由不连续子域组成。这些中的一个通常为将面对基质的蛋白质(即在膜跨越之间)环内的碱性氨基酸(精氨酸和赖氨酸)的集群。
在一些实施例中，膜蛋白有效负载剂包括所关注的蛋白质与跨膜蛋白的编码序列的框内融合物，或所关注的蛋白质与蛋白质的跨膜域或膜锚定域的框内融合物(与转铁蛋白受体膜锚定域融合)。参见例如Winndard,P,等人研发新颖嵌合跨膜蛋白以用于癌细胞的多模态成像(Development of novel chimeric transmembrane proteins formultimodality imaging of cancer cells),《癌症生物学与疗法(Cancer Biology&Therapy)》.12:1889-1899(2007)。
在一些实施例中，将分选信号或信号肽附加到蛋白质(例如膜蛋白或分泌性蛋白)的N或C端。See Goder,V.和Spiess,M.,膜蛋白的部位发生：决定因素和动力学(Topogenesis of membrane proteins:determinants and dynamics.)《FEBS快报》.504(3):87-93(2001)。在一些实施例中，蛋白质是天然蛋白质。在一些实施例中，膜蛋白为合成蛋白。
在一些实施例中，线粒体或过氧化物酶体蛋白有效负载剂包括所关注的蛋白质与线粒体或过氧化物酶体蛋白的编码序列的框内融合物，或所关注的蛋白质与线粒体或蛋白质的过氧化物酶体定位序列的框内融合物。
在一些实施例中，将线粒体或过氧化物酶体定位序列附加到蛋白质(例如，线粒体或过氧化物酶体蛋白)的N或C端。在一些实施例中，蛋白质是天然蛋白质。在一些实施例中，线粒体或过氧化物酶体蛋白为合成蛋白。
在一些实施例中，仅在转录物的翻译已达到终止密码子之后才从核糖体出现信号。在一些实施例中，膜蛋白的插入是在翻译后。
在一些实施例中，信号序列是选自表6。在一些实施例中，信号序列包括选自表6的序列。在一些实施例中，表6的信号序列可以附加到蛋白质(例如，膜蛋白或分泌性蛋白)的N端。在一些实施例中，表6的信号序列可以附加到蛋白质(例如，膜蛋白或分泌性蛋白质)的C端。普通技术人员将了解，下文的信号序列不限于与其相应天然缔合蛋白质一起使用。
表6：例示性信号序列.
在一些实施例中，靶向细胞核的蛋白质是通过核定位序列(也称为核定位信号)，所述核定位序列使得能够经由核孔复合物易位通过核包膜。核孔复合物由核孔蛋白构成。核孔蛋白与称为核转运蛋白的转运分子相互作用。核转运蛋白与含有核定位序列的蛋白质结合并且将蛋白质转运跨越核孔复合物。在一些实施例中，核定位序列由碱性氨基酸的一个或多个短(例如<50个氨基酸残基)序列组成。在一些实施例中，核定位序列由赖氨酸或精氨酸的一个或多个短(例如<50个氨基酸残基)序列组成。在一些实施例中，核定位序列为单部分或两部分的。在一些实施例中，核定位序列在蛋白质有效负载剂的N或C端处。在一些实施例中，核定位序列在蛋白质有效负载剂的氨基酸序列中间并且暴露于蛋白质表面上。在一些实施例中，核定位序列由核转运蛋白识别。在一些实施例中，核定位序列与一种或多种核转运蛋白相互作用。在一些实施例中，当核定位序列从核糖体出现时，核转运蛋白识别核定位序列。在一些实施例中，核转运蛋白识别完全翻译的蛋白质上的核定位序列。
在一些实施例中，核蛋白有效负载剂包括所关注的蛋白质与核蛋白的编码序列的框内融合物，或所关注的蛋白质与蛋白质的核定位序列的框内融合物。
在一些实施例中，将核定位序列附加到蛋白质(例如，核蛋白)的N或C端。在一些实施例中，蛋白质是天然蛋白质。在一些实施例中，核蛋白为合成蛋白。
在一些实施例中，核定位序列是选自表6-1。在一些实施例中，核定位序列包括选自表6-1的序列。在一些实施例中，表6-1的核定位序列可以附加到蛋白质(例如核蛋白)的N端。在一些实施例中，表6-1的信号序列可以附加到蛋白质(例如核蛋白)的C端。普通技术人员将了解，下文的信号序列不限于与其相应天然缔合蛋白质一起使用。在一些实施例中，核定位序列被定义为来自US 2015-0246139的表6中所列的蛋白质的核定位序列，其以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，核定位信号具有SEQ ID NO:128-507和605-626中的任一个中所示的氨基酸序列。
表6-1：示例性核定位序列
在一些实施例中，核蛋白有效负载剂将靶蛋白质或靶核酸定位到细胞核。在一些实施例中，核蛋白有效负载剂由含有核定位序列和靶结合域的蛋白质组成。在一些实施例中，靶结合域为抗体、纳米抗体、scFv或任何其它蛋白质结合域。在一些实施例中，靶结合域为核酸结合域。在一些实施例中，核蛋白有效负载剂在不具有核蛋白有效负载剂的细胞中增加靶蛋白或靶核酸在细胞核中的定位。
在一些实施例中，线粒体或过氧化物酶体定位序列是选自表6-2。在一些实施例中，核定位序列包括选自表6-2的序列。在一些实施例中，表6-2的线粒体或过氧化物酶体定位序列可以附加到蛋白质(例如线粒体或过氧化物酶体蛋白)的N端。在一些实施例中，表6-2的信号序列可以附加到蛋白质(例如线粒体或过氧化物酶体蛋白)的C端。普通技术人员将了解，下文的信号序列不限于与其相应天然缔合蛋白质一起使用。
表6-2：示例性线粒体或过氧化物酶体定位序列
膜蛋白有效负载剂
在一些实施例中，膜蛋白有效负载剂为天然存在于细胞的膜表面上(例如，在质膜的表面上)的蛋白质(或编码其的核酸)。
示例性膜蛋白(和/或编码其的核酸)可以发现于例如美国专利公开案第2016/0289674号，所述公开案的内容在此以引用的方式并入。在一些实施例中，膜蛋白有效负载剂(和/或编码其的核酸)具有如美国专利公开案第2016/0289674号的SEQ ID NO:8144-16131中的任一个中或其功能片段中所示的序列。在一些实施例中，膜蛋白有效负载剂为如美国专利公开案第2016/0289674号的SEQ ID NO:8144-16131中的任一个中所示的质膜蛋白质(编码其的核酸)或质膜蛋白质的其(或编码其的核酸)片段、变体或同源物。
在一些实施例中，本公开相关的膜蛋白为治疗性膜蛋白。在一些实施例中，本公开相关的膜蛋白为或包括细胞表面受体、膜转运蛋白(例如主动或被动转运蛋白，例如离子通道蛋白、成孔蛋白[例如毒素蛋白]等)、膜酶和/或细胞粘附蛋白)。
在一些实施例中，膜蛋白为单一跨膜蛋白。在一些实施例中，单一跨膜蛋白可以采用具有细胞质N端和外质C端(Ncyt/Cexo)或具有相反取向(Nexo/Ccyt)的最终拓扑。
在一些实施例中，膜蛋白为包括N端可裂解信号序列和终止转移序列(Nexo/Ccyt)的I型膜蛋白。在一些实施例中，信号在C端。在一些实施例中，N端可裂解信号序列将新生肽靶向ER。在一些实施例中，N端可裂解信号序列包括通常7-15个主要为非极性残基的疏水段。在一些实施例中，I型膜蛋白包括终止转移序列，其中断多肽的另一个易位并且充当跨膜锚定物。在一些实施例中，终止转移序列包括约20个疏水性残基的氨基酸序列。在一些实施例中，I型膜蛋白的N端为细胞外的并且C端为细胞质的。在一些实施例中，I型膜蛋白可以为血型糖蛋白或LDL受体。
在一些实施例中，膜蛋白为包括信号锚定序列(Ncyt/Cexo)的II型膜蛋白。在一些实施例中，信号在C端。在一些实施例中，信号锚定序列负责II型膜蛋白的插入和锚定。在一些实施例中，信号锚定序列包括约18-25个主要的非极性残基。在一些实施例中，信号锚定序列缺乏信号肽酶裂解位点。在一些实施例中，信号锚定序列可以位于多肽链内部。在一些实施例中，信号锚定序列诱导蛋白质的C端跨越细胞膜的易位。在一些实施例中，II型膜蛋白的C端为细胞外的并且N端为细胞质的。在一些实施例中，II型膜蛋白可以是转铁蛋白受体或半乳糖基转移酶受体。
在一些实施例中，膜蛋白为包括反向信号锚定序列(Nexo/Ccyt)的III型膜蛋白。在一些实施例中，信号在N端。在一些实施例中，反向信号锚定序列负责III型膜蛋白的插入和锚定。在一些实施例中，反向信号锚定序列包括约18-25个主要的非极性残基。在一些实施例中，信号锚定序列缺乏信号肽酶裂解位点。在一些实施例中，信号锚定序列可以位于多肽链内部。在一些实施例中，信号锚定序列诱导蛋白质的N端跨越细胞膜的易位。在一些实施例中，III型膜蛋白的N端为细胞外的并且C端为细胞质的。在一些实施例中，I型膜蛋白可以为突触、神经调节蛋白或细胞色素P-450。
在一些实施例中，I型、II型或III型膜蛋白通过包括SRP、SRP受体和Sec61易位子的细胞路径插入细胞膜中。
在一些实施例中，膜蛋白主要暴露于胞质溶胶并且通过C端信号序列锚定于膜，但其不与SRP相互作用。在一些实施例中，蛋白质为细胞色素b5或SNARE蛋白(例如突触泡蛋白)。
在一些实施例中，膜蛋白有效负载剂包括将有效负载膜蛋白定位到细胞膜的信号序列。在一些实施例中，膜蛋白有效负载剂为核酸，其中核酸编码将由核酸编码的有效负载膜蛋白定位到细胞膜的信号序列。
(i)整合素膜蛋白有效负载
在一些实施例中，膜蛋白有效负载剂为或损害整合素或其功能片段、变体或同源物，或编码其的核酸。在一些实施例中，膜蛋白有效负载剂为或损害选自表7的整合素，或其功能片段、变体或同源物，或编码其的核酸。在实施例中，膜蛋白有效负载剂包括与表7的蛋白质的多肽序列具有至少最少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％一致的序列的蛋白质，或编码其的核酸。在实施例中，膜蛋白有效负载剂包括与表7的基因的核酸序列具有至少最少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％一致的序列的核酸。
表7：示例性整合素蛋白
(ii)离子通道蛋白
在一些实施例中，膜蛋白有效负载剂为或损害离子通道蛋白或其功能片段、变体或同源物，或编码其的核酸。在一些实施例中，膜蛋白有效负载剂为或损害选自表8的离子通道蛋白或其功能片段、变体或同源物，或编码其的核酸。在实施例中，膜蛋白有效负载剂包括与表8的蛋白质的多肽序列具有至少最少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％一致的序列的蛋白质，或编码其的核酸。在实施例中，膜蛋白有效负载剂包括与表8的基因的核酸序列具有至少最少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％一致的序列的核酸。
表8：示例性离子通道蛋白
(iii)成孔蛋白
在一些实施例中，膜蛋白有效负载剂为或损害成孔蛋白或其功能片段、变体或同源物，或编码其的核酸。在一些实施例中，成孔蛋白可以为溶血素或其功能片段、变体或同源物，或编码其的核酸。在一些实施例中，膜蛋白有效负载剂为或损害选自表9的溶血素，或其功能片段、变体或同源物，或编码其的核酸。在一些实施例中，成孔蛋白可以为大肠杆菌素或其功能片段、变体或同源物，或编码其的核酸。在一些实施例中，膜蛋白有效负载剂为或损害选自表10的大肠杆菌素，或其功能片段、变体或同源物，或编码其的核酸。
在实施例中，膜蛋白有效负载剂包括与表9的蛋白质的多肽序列具有至少最少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％一致的序列的蛋白质，或编码其的核酸。在实施例中，膜蛋白有效负载剂包括与表9的基因的核酸序列具有至少最少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％一致的序列的核酸。
在实施例中，膜蛋白有效负载剂包括与表10的蛋白质的多肽序列具有至少最少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％一致的序列的蛋白质，或编码其的核酸。在实施例中，膜蛋白有效负载剂包括与表10的基因的核酸序列具有至少最少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％一致的序列的核酸。
表9：示例性溶血素蛋白
Uniprot ID
条目名称
基因名称
P19247
VVHA_VIBVU
vvhA VV2_0404
P09545
HLYA_VIBCH
hlyA VC_A0219
Q08677
HLY4_AERSA
ash4
P55870
HLY1_AERHH
ahh1 AHA_1512
Q4UK99
HLYC_RICFE
tlyC RF_1185
Q68W10
HLYC_RICTY
tlyC RT0725
O05961
HLYC_RICPR
tlyC RP740
A8GTI4
HLYC_RICRS
tlyC A1G_06280
Q92GI2
HLYC_RICCN
tlyC RC1141
A8F2M1
HLYC_RICM5
tlyC RMA_1168
Q93RR6
HLYE_SALPA
hlyE clyA sheA SPA1306
Q9REB3
HLYE_ECO57
hlyE clyA sheA Z1944 ECs1677
Q8Z727
HLYE_SALTI
hlyE clyA sheA STY1498 t1477
P77335
HLYE_ECOLI
hlyE clyA hpr sheA ycgD b1182 JW5181
P14711
HLYT_GRIHO
A8GUH1
HLYC_RICB8
tlyC A1I_00305
A8EZU0
HLYC_RICCK
tlyC A1E_04760
A8GPR9
HLYC_RICAH
tlyC A1C_05795
Q1RGX2
HLYC_RICBR
tlyC RBE_1311
Q9RCT3
HLYEL_SHIFL
SF1171 S1259
Q8FI27
HLYEL_ECOL6
c1630
P28030
HLY_VIBMI
tdh
P28031
HLY1_GRIHO
tdh
P19249
HLY1_VIBPA
tdh1 tdh VPA1378
P19250
HLY2_VIBPA
tdh2 tdh trh VPA1314
P28029
HLY3_VIBPH
tdh3 tdh/I tdhX
表10：示例性大肠菌素蛋白
Uniprot ID
条目名称
基因名称
Q47500
CE05_ECOLX
cfa
Q47125
CE10_ECOLX
cta
P04480
CEACITFR
caa
Q47108
CEA_ECOLX
caa
P02978
CEA1_ECOLX
cea
P21178
CEA1_SHISO
cea
P04419
CEA2ECOLX
col ceaB
P00646
CEA3_ECOLX
ceaC
P18000
CEA5_ECOLX
col
P17999
CEA6_ECOLX
Q47112
CEA7_ECOLX
colE7 cea
P09882
CEA8_ECOLX
col
P09883
CEA9_ECOLX
col cei
P05819
CEAB_ECOLX
cba
P00645
CEAC_ECOLX
ccl
P17998
CEAD_ECOLX
cda
Q47502
CEAK_ECOLX
cka
P08083
CEAN_ECOLX
cna
P06716
CEIA_ECOLX
cia
P04479
CEIB_ECOLX
cib
P22520
CVAB_ECOLX
cvaB
Q06583
PYS1_PSEAI
pys1
Q06584
PYS2_PSEAE
pys2 PA1150
(iv)Toll样受体
在一些实施例中，膜蛋白有效负载剂为或损害toll样受体(TLR)或其功能片段、变体或同源物，或编码其的核酸。在一些实施例中，膜蛋白有效负载剂为或损害选自表11的toll样受体，或其功能片段、变体或同源物，或编码其的核酸。在实施例中，膜蛋白有效负载剂包括与表11的蛋白质的多肽序列具有至少最少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％一致的序列的蛋白质，或编码其的核酸。在实施例中，膜蛋白有效负载剂包括与表11的基因的核酸序列具有至少最少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％一致的序列的核酸。
表11：示例性toll样受体
UniProt ID
条目名称
基因名称(主要)
Q86XR7
TCAM2_HUMAN
TICAM2
Q9BXR5
TLR10_HUMAN
TLR10
Q15399
TLR1_HUMAN
TLR1
O60603
TLR2_HUMAN
TLR2
O15455
TLR3_HUMAN
TLR3
O00206
TLR4_HUMAN
TLR4
O60602
TLR5_HUMAN
TLR5
Q9Y2C9
TLR6_HUMAN
TLR6
Q9NYK1
TLR7_HUMAN
TLR7
Q9NR97
TLR8_HUMAN
TLR8
Q9NR96
TLR9_HUMAN
TLR9
在一些实施例中，膜蛋白有效负载剂为或损害白细胞介素受体或其功能片段、变体或同源物，或编码其的核酸。在一些实施例中，膜蛋白有效负载剂为或损害选自表12的白细胞介素受体，或其功能片段、变体或同源物，或编码其的核酸。在实施例中，膜蛋白有效负载剂包括与表12的蛋白质的多肽序列具有至少最少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％一致的序列的蛋白质，或编码其的核酸。在实施例中，膜蛋白有效负载剂包括与表12的基因的核酸序列具有至少最少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％一致的序列的核酸。
(v)白细胞介素受体有效负载
表12：示例性白细胞介素受体
(vi)细胞粘附蛋白有效负载
在一些实施例中，膜蛋白有效负载剂为或损害细胞粘附蛋白或其功能片段、变体或同源物，或编码其的核酸。在一些实施例中，膜蛋白有效负载剂为或损害选自表13的细胞粘附蛋白，或其功能片段、变体或同源物，或编码其的核酸。在一些实施例中，细胞粘附蛋白可以为钙粘蛋白或其功能片段、变体或同源物，或编码其的核酸。在一些实施例中，膜蛋白有效负载剂为或损害选自表14的钙粘蛋白，或其功能片段、变体或同源物，或编码其的核酸。在一些实施例中，细胞粘附蛋白可以为选择素或其功能片段、变体或同源物，或编码其的核酸。在一些实施例中，膜蛋白有效负载剂为或损害选自表15的选择素，或其功能片段、变体或同源物，或编码其的核酸。在一些实施例中，细胞粘附蛋白可以为粘蛋白或其功能片段、变体或同源物，或编码其的核酸。在一些实施例中，膜蛋白有效负载剂为或损害选自表16的粘蛋白，或其功能片段、变体或同源物，或编码其的核酸。
在实施例中，膜蛋白有效负载剂包括与表13的蛋白质的多肽序列具有至少最少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％一致的序列的蛋白质，或编码其的核酸。在实施例中，膜蛋白有效负载剂包括与表13的基因的核酸序列具有至少最少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％一致的序列的核酸。
在实施例中，膜蛋白有效负载剂包括与表14的蛋白质的多肽序列具有至少最少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％一致的序列的蛋白质，或编码其的核酸。在实施例中，膜蛋白有效负载剂包括与表14的基因的核酸序列具有至少最少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％一致的序列的核酸。
在实施例中，膜蛋白有效负载剂包括与表15的蛋白质的多肽序列具有至少最少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％一致的序列的蛋白质，或编码其的核酸。在实施例中，膜蛋白有效负载剂包括与表15的基因的核酸序列具有至少最少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％一致的序列的核酸。
在实施例中，膜蛋白有效负载剂包括与表16的蛋白质的多肽序列具有至少最少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％一致的序列的蛋白质，或编码其的核酸。在实施例中，膜蛋白有效负载剂包括与表16的基因的核酸序列具有至少最少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％一致的序列的核酸。
表13：示例性细胞间粘附分子蛋白
UniProt ID
条目名称
基因名称(主要)
P05362
ICAM1HUMAN
ICAM1
P13598
ICAM2_HUMAN
ICAM2
P32942
ICAM3_HUMAN
ICAM3
Q14773
ICAM4HUMAN
ICAM4
Q9UMF0
ICAM5_HUMAN
ICAM5
表14：示例性钙粘蛋白
表15：示例性选择素蛋白
UniProt ID
条目名称
基因名称(主要)
P16109
LYAM3_HUMAN
SELP
P16581
LYAM2_HUMAN
SELE
Q14242
SELPL_HUMAN
SELPLG
P14151
LYAM1_HUMAN
SELL
表16：示例性粘蛋白
(vii)转运蛋白有效负载
在一些实施例中，膜蛋白有效负载剂为或损害转运蛋白或其功能片段、变体或同源物，或编码其的核酸。在一些实施例中，膜蛋白有效负载剂为或损害选自表17的转运蛋白，或其功能片段、变体或同源物，或编码其的核酸。在实施例中，膜蛋白有效负载剂包括与表17的蛋白质的多肽序列具有至少最少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％一致的序列的蛋白质，或编码其的核酸。在实施例中，膜蛋白有效负载剂包括与表17的基因的核酸序列具有至少最少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％一致的序列的核酸。
表17：示例性转运蛋白
(viii)嵌合抗原受体有效负载
在一些实施例中，膜蛋白有效负载剂为或包括CAR，例如，第一代CAR或编码第一代CAR的核酸。在一些实施例中，第一代CAR包括抗原结合域、跨膜域和信号传导域。在一些实施例中，信号传导域在T细胞活化期间介导下游信号传导。
在一些实施例中，膜蛋白有效负载剂为或包括第二代CAR或编码第二代CAR的核酸。在一些实施例中，第二代CAR包括抗原结合域、跨膜域和两个信号传导域。在一些实施例中，信号传导域在T细胞活化期间介导下游信号传导。在一些实施例中，信号传导域为共刺激域。在一些实施例中，共刺激域在T细胞活化期间增强细胞因子产生、CAR T细胞增殖和或CAR T细胞持久性。
在一些实施例中，膜蛋白有效负载剂为或包括第三代CAR或编码第三代CAR的核酸。在一些实施例中，第三代CAR包括抗原结合域、跨膜域和至少三个信号传导域。在一些实施例中，信号传导域在T细胞活化期间介导下游信号传导。在一些实施例中，信号传导域为共刺激域。在一些实施例中，共刺激域在T细胞活化期间增强细胞因子产生、CAR T细胞增殖和或CAR T细胞持久性。在一些实施例中，第三代CAR包括至少两个共刺激域。在一些实施例中，至少两个共刺激域是不同的。
在一些实施例中，膜蛋白有效负载剂为或包括第四代CAR或编码第四代CAR的核酸。在一些实施例中，第四代CAR包括抗原结合域、跨膜域和至少两个、三个或四个信号传导域。在一些实施例中，信号传导域在T细胞活化期间介导下游信号传导。在一些实施例中，信号传导域为共刺激域。在一些实施例中，共刺激域在T细胞活化期间增强细胞因子产生、CART细胞增殖和或CAR T细胞持久性。
在一些实施例中，第一、第二、第三或第四代CAR还包括在CAR成功信号传导之后诱导细胞因子基因表达的域。在一些实施例中，细胞因子基因对包括CAR的靶细胞为内源性或外源性的，所述CAR包括在CAR成功信号传导之后诱导细胞因子基因表达的域。在一些实施例中，细胞因子基因编码促炎性细胞因子。在一些实施例中，细胞因子基因编码IL-1、IL-2、IL-9、IL-12、IL-18、TNF或IFN-γ或其功能片段。在一些实施例中，在CAR成功信号传导之后诱导细胞因子基因表达的域为或包括转录因子或其功能性域或片段。在一些实施例中，在CAR成功信号传导之后诱导细胞因子基因表达的域为或包括转录因子或其功能性域或片段。在一些实施例中，转录因子或其功能性域或片段为或包括活化T细胞的核因子(NFAT)、NF-κB或其功能性域或片段。参见例如Zhang.C.等人，工程改造CAR-T细胞(EngineeringCAR-T cells.)《生物标记研究(Biomarker Research.)》5:22(2017)；WO 2016126608；Sha,H.等人用于肿瘤免疫疗法的嵌合抗原受体T细胞疗法(Chimaeric antigen receptor T-cell therapy for tumour immunotherapy).《生命科学报告Bioscience Reports)》2017年1月27日,37(1)。
(a)CAR抗原结合域
在一些实施例中，CAR抗原结合域为或包括抗体或其抗原结合部分。在一些实施例中，CAR抗原结合域为或包括scFv或Fab。在一些实施例中，CAR抗原结合域包括以下的scFv或Fab片段：T细胞α链抗体；T细胞β链抗体；T细胞γ链抗体；T细胞δ链抗体；CCR7抗体；CD3抗体；CD4抗体；CD5抗体；CD7抗体；CD8抗体；CD11b抗体；CD11c抗体；CD16抗体；CD19抗体；CD20抗体；CD21抗体；CD22抗体；CD25抗体；CD28抗体；CD34抗体；CD35抗体；CD40抗体；CD45RA抗体；CD45RO抗体；CD52抗体；CD56抗体；CD62L抗体；CD68抗体；CD80抗体；CD95抗体；CD117抗体；CD127抗体；CD133抗体；CD137(4-1BB)抗体；CD163抗体；F4/80抗体；IL-4Ra抗体；Sca-1抗体；CTLA-4抗体；GITR抗体GARP抗体；LAP抗体；颗粒酶B抗体；LFA-1抗体；或转铁蛋白受体抗体。
在一些实施例中，抗原结合域结合到细胞的细胞表面抗原。在一些实施例中，细胞表面抗原为一种类型的细胞的特征。在一些实施例中，细胞表面抗原为超过一种类型的细胞的特征。
在一些实施例中，CAR抗原结合域结合T细胞的细胞表面抗原特征。在一些实施例中，T细胞的抗原特征可以是细胞表面受体、膜转运蛋白(例如主动或被动转运蛋白，例如离子通道蛋白、成孔蛋白等)、跨膜受体、膜酶和/或T细胞的细胞粘附蛋白特征。在一些实施例中，T细胞的抗原特征可以是G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酰基环化酶或组氨酸激酶相关受体。
在一些实施例中，T细胞的抗原特征可以是T细胞受体。在一些实施例中，T细胞受体可以是AKT1；AKT2；AKT3；ATF2；BCL10；CALM1；CD3D(CD3δ)；CD3E(CD3ε)；CD3G(CD3γ)；CD4；CD8；CD28；CD45；CD80(B7-1)；CD86(B7-2)；CD247(CD3ζ)；CTLA4(CD152)；ELK1；ERK1(MAPK3)；ERK2；FOS；FYN；GRAP2(GADS)；GRB2；HLA-DRA；HLA-DRB1；HLA-DRB3；HLA-DRB4；HLA-DRB5；HRAS；IKBKA(CHUK)；IKBKB；IKBKE；IKBKG(NEMO)；IL2；ITPR1；ITK；JUN；KRAS2；LAT；LCK；MAP2K1(MEK1)；MAP2K2(MEK2)；MAP2K3(MKK3)；MAP2K4(MKK4)；MAP2K6(MKK6)；MAP2K7(MKK7)；MAP3K1(MEKK1)；MAP3K3；MAP3K4；MAP3K5；MAP3K8；MAP3K14(NIK)；MAPK8(JNK1)；MAPK9(JNK2)；MAPK10(JNK3)；MAPK11(p38β)；MAPK12(p38γ)；MAPK13(p38δ)；MAPK14(p38α)；NCK；NFAT1；NFAT2；NFKB1；NFKB2；NFKBIA；NRAS；PAK1；PAK2；PAK3；PAK4；PIK3C2B；PIK3C3(VPS34)；PIK3CA；PIK3CB；PIK3CD；PIK3R1；PKCA；PKCB；PKCM；PKCQ；PLCY1；PRF1(穿孔素)；PTEN；RAC1；RAF1；RELA；SDF1；SHP2；SLP76；SOS；SRC；TBK1；TCRA；TEC；TRAF6；VAV1；VAV2；或ZAP70。
在一些实施例中，CAR抗原结合域结合癌症的抗原特征。在一些实施例中，癌症的抗原特征是选自细胞表面受体、离子通道联接受体、酶联受体、G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酯酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酰基环化酶、组氨酸激酶相关受体、表皮生长因子受体(EGFR)(包含ErbB1/EGFR、ErbB2/HER2、ErbB3/HER3和ErbB4/HER4)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)(包含FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF18和FGF21)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)(包含VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和PIGF)、RET受体和Eph受体家族(包含EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA9、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4和EphB6)、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR8、CFTR、CIC-1、CIC-2、CIC-4、CIC-5、CIC-7、CIC-Ka、CIC-Kb、斑萎蛋白、TMEM16A、GABA受体、甘氨酸受体、ABC转运蛋白、NAV1.1、NAV1.2、NAV1.3、NAV1.4、NAV1.5、NAV1.6、NAV1.7、NAV1.8、NAV1.9、神经鞘氨醇-1-磷酸酯受体(S1P1R)、NMDA通道、跨膜蛋白、多跨跨膜蛋白、T细胞受体基序；T细胞α链；T细胞β链；T细胞γ链；T细胞δ链；CCR7；CD3；CD4；CD5；CD7；CD8；CD11b；CD11c；CD16；CD19；CD20；CD21；CD22；CD25；CD28；CD34；CD35；CD40；CD45RA；CD45RO；CD52；CD56；CD62L；CD68；CD80；CD95；CD117；CD127；CD133；CD137(4-1BB)；CD163；F4/80；IL-4Ra；Sca-1；CTLA-4；GITR；GARP；LAP；颗粒酶B；LFA-1；运铁蛋白受体；NKp46、穿孔素、CD4+；Th1；Th2；Th17；Th40；Th22；Th9；Tfh、典型Treg.FoxP3+；Tr1；Th3；Treg17；TREG；CDCP1、NT5E、EpCAM、CEA、gpA33、粘蛋白、TAG-72、碳酸酐酶IX、PSMA、叶酸结合蛋白、神经节苷脂(例如CD2、CD3、GM2)、Lewis-γ2、VEGF、VEGFR1/2/3、αVβ3、α5β1、ErbB1/EGFR、ErbB1/HER2、ErB3、c-MET、IGF1R、EphA3、TRAIL-R1、TRAIL-R2、RANKL、FAP、肌腱蛋白、PDL-1、BAFF、HDAC、ABL、FLT3、KIT、MET、RET、IL-1β、ALK、RANKL、mTOR、CTLA-4、IL-6、IL-6R、JAK3、BRAF、PTCH、平滑受体、PIGF、ANPEP、TIMP1、PLAUR、PTPRJ、LTBR或ANTXR1、叶酸受体α(FRa)、ERBB2(Her2/neu)、EphA2、IL-13Ra2、表皮生长因子受体(EGFR)、间皮素、TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、MUC16(CA125)、L1CAM、LeY、MSLN、IL13Rα1、L1-CAM、Tn Ag、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、白细胞介素-11受体a(IL-11Ra)、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、血小板衍生生长因子受体-β(PDGFR-β)、SSEA-4、CD20、MUC1、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-1受体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪氨酸酶、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、多唾液酸、PLACl、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、豆荚蛋白、HPV E6、E7、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺蛋白、存活素、端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断裂点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYPIB I、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人类端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、新抗原、CD133、CD15、CD184、CD24、CD56、CD26、CD29、CD44、HLA-A、HLA-B、HLA-C、(HLA-A、B、C)CD49f、CD151 CD340、CD200、tkrA、trkB或trkC，或其抗原片段或抗原部分。
在一些实施例中，CAR抗原结合域结合感染性疾病的抗原特征(例如病毒感染或细菌感染)。在一些实施例中，抗原为选自以下的感染性疾病的特征：HIV、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类疱疹病毒、人类疱疹病毒8(HHV-8，卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV))、人类嗜T-淋巴细胞病毒-1(HTLV-1)、梅克尔细胞多瘤病毒(MCV)、猴病毒40(SV40)、埃-巴二氏病毒、CMV、人类乳头瘤病毒。在一些实施例中，感染性疾病的抗原特征是选自细胞表面受体、离子通道联接受体、酶联受体、G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酰基环化酶或组氨酸激酶相关受体。在一些实施例中，CAR抗原结合域结合感染性疾病的抗原特征，其中抗原是选自HIVEnv、gpl20或HIV-1Env上CD4诱导的表位。参见例如WO2015/077789，其内容以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，CAR抗原结合域包括CD4或其HIV结合片段。
在一些实施例中，CAR抗原结合域结合自身免疫或发炎性病症的抗原特征。在一些实施例中，抗原是选自以下的自身免疫或发炎性病症的特征：慢性移植物抗宿主病(GVHD)、狼疮、关节炎、免疫复合物肾小球肾炎、古德帕斯丘综合征、葡萄膜炎、肝炎、全身性硬化症或硬皮病、I型糖尿病、多发性硬化症、冷凝集素病、寻常天疱疮、格雷弗氏病、自身免疫性溶血性贫血、血友病A、原发性舍格伦综合征、血栓性血小板减少性紫癜、视神经脊髓炎、埃文氏综合征、IgM介导的神经病、冷球蛋白血症、皮肌炎、特发性血小板减少症、强直性脊柱炎、大疱性类天疱疮、获得性血管性水肿、慢性荨麻疹、抗磷脂脱髓鞘性多发性神经病和自身免疫血小板减少症或嗜中性粒细胞减少症或纯红细胞再生障碍，然而同种异体免疫性疾病的示例性非限制性实例包含同种致敏作用(参见例如Blazar等人,2015,《美国移植杂志》,15(4):931-41)或由造血或实体器官移植、输血、胎儿同种致敏作用的妊娠、新生儿同种异体免疫性血小板减少症、新生儿溶血性疾病、对外来抗原的致敏作用引起的异种致敏作用，所述外来抗原如可以在用酶或蛋白质替代疗法、血液产品和基因疗法治疗的遗传性或获得性缺陷症的替代时出现。在一些实施例中，自身免疫或发炎性病症的抗原特征是选自细胞表面受体、离子通道联接受体、酶联受体、G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酰基环化酶或组氨酸激酶相关受体。在一些实施例中，CAR抗原结合域结合到在B细胞、浆细胞或成浆细胞上表达的配体。在一些实施例中，CAR抗原结合域结合自身免疫或发炎性病症的抗原特征，其中抗原是选自CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD27、CD38、CD45R、CD138、CD319、BCMA、CD28、TNF、干扰素受体、GM-CSF、ZAP-70、LFA-1、CD3γ、CD5或CD2。参见US2003/0077249；WO 2017/058753；WO2017/058850，其内容以引用的方式并入本文中。
(b)CAR跨膜域
在一些实施例中，CAR包括跨膜域。在一些实施例中，CAR包括以下的α、β或ζ链的至少跨膜区：T细胞受体、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154，或其功能变异体。在一些实施例中，CAR包括CD8α、CD8β、4-1BB/CD137、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40/CD134、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、TCRβ、TCRζ、CD32、CD64、CD64、CD45、CD5、CD9、CD22、CD37、CD80、CD86、CD40、CD40L/CD154、VEGFR2、FAS和FGFR2B的至少跨膜区，或其功能变体。
(c)CAR信号传导域
在一些实施例中，CAR包括以下中的一个或多个的信号传导域：B7-1/CD80；B7-2/CD86；B7-H1/PD-L1；B7-H2；B7-H3；B7-H4；B7-H6；B7-H7；BTLA/CD272；CD28；CTLA-4；Gi24/VISTA/B7-H5；ICOS/CD278；PD-1；PD-L2/B7-DC；PDCD6)；4-1BB/TNFSF9/CD137；4-1BB配体/TNFSF9；BAFF/BLyS/TNFSF13B；BAFF R/TNFRSF13C；CD27/TNFRSF7；CD27配体/TNFSF7；CD30/TNFRSF8；CD30配体/TNFSF8；CD40/TNFRSF5；CD40/TNFSF5；CD40配体/TNFSF5；DR3/TNFRSF25；GITR/TNFRSF18；GITR配体/TNFSF18；HVEM/TNFRSF14；LIGHT/TNFSF14；淋巴毒素-α/TNF-β；OX40/TNFRSF4；OX40配体/TNFSF4；RELT/TNFRSF19L；TACI/TNFRSF13B；TL1A/TNFSF15；TNF-α；TNF RII/TNFRSF1B)；2B4/CD244/SLAMF4；BLAME/SLAMF8；CD2；CD2F-10/SLAMF9；CD48/SLAMF2；CD58/LFA-3；CD84/SLAMF5；CD229/SLAMF3；CRACC/SLAMF7；NTB-A/SLAMF6；SLAM/CD150)；CD2；CD7；CD53；CD82/Kai-1；CD90/Thy1；CD96；CD160；CD200；CD300a/LMIR1；I类HLA；HLA-DR；Ikaros；整合素α4/CD49d；整合素α4β1；整合素α4β7/LPAM-1；LAG-3；TCL1A；TCL1B；CRTAM；DAP12；凝集素-1/CLEC7A；DPPIV/CD26；EphB6；TIM-1/KIM-1/HAVCR；TIM-4；TSLP；TSLP R；淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)；NKG2C、CD3ζ域、基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能变体。
在一些实施例中，CAR包括作为共刺激域的信号传导域。在一些实施例中，CAR包括第二共刺激域。在一些实施例中，CAR包括至少两个共刺激域。在一些实施例中，CAR包括至少三个共刺激域。在一些实施例中，CAR包括选自以下中的一个或多个的共刺激域：CD27、CD28、4-1BB、CD134/OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体。
在一些实施例中，CAR包括CD3ζ域或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)或其功能变体。在一些实施例中，CAR包括(i)CD3ζ域，或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能变体；以及(ii)CD28域，或4-1BB域，或其功能变体。在一些实施例中，CAR包括(i)CD3ζ域，或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能变体；(ii)CD28域或其功能变体；以及(iii)4-1BB域，或CD134域，或其功能变体。在一些实施例中，CAR包括(i)CD3ζ域，或基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，或其功能变体；(ii)CD28域或其功能变体；(iii)4-1BB域，或CD134域，或其功能变体；以及(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。
(d)CAR间隔子
在一些实施例中，CAR包括一个或多个间隔子。在一些实施例中，CAR包括抗原结合域与跨膜域之间的间隔子。在一些实施例中，CAR包括跨膜域与细胞内信号传导域之间的间隔子。
(e)CAR膜蛋白有效负载剂
除本文所描述的CAR之外，所属领域中已知各种嵌合抗原受体和编码其的核苷酸序列，并且其将适用于如本文所描述的活体内和活体外的融合剂脂质体递送和靶细胞的再编程。参见例如WO2013040557；WO2012079000；WO2016030414；Smith T,等人,《自然·纳米技术(Nature Nanotechnology)》.2017.DOI：10.1038/NNANO.2017.57，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，将包括膜蛋白有效负载剂的融合剂脂质体递送到靶细胞，所述膜蛋白有效负载剂为或包括CAR或编码CAR的核酸(例如，DNA、gDNA、cDNA、RNA、前mRNA、mRNA、miRNA、siRNA等)。在一些实施例中，靶细胞为效应子细胞，例如表达一个或多个Fc受体并且介导一个或多个效应子功能的免疫系统的细胞。在一些实施例中，靶细胞可以包含(但可能不限于)以下中的一种或多种：单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、大粒状淋巴细胞、朗格汉斯细胞(Langerhans'cell)、自然杀伤(NK)细胞、T淋巴细胞(例如T细胞)、γδT细胞、B淋巴细胞(例如B细胞)，并且可以来自包含(但不限于)以下的任何生物体：人类、小鼠、大鼠、兔和猴。
核蛋白有效负载剂
在一些实施例中，有效负载剂为或损害核蛋白有效负载剂或其功能片段、变体或同源物，或编码其的核酸。在一些实施例中，核蛋白有效负载剂为或损害选自表17-1的蛋白质，或其功能片段、变体或同源物，或编码其的核酸。在实施例中，核蛋白有效负载剂包括与表17-1的蛋白质的多肽序列具有至少最少85％、86％、87％、88％、89％、90％91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％一致的序列的蛋白质，或编码其的核酸。在实施例中，核蛋白有效负载剂包括与表17-1的基因的核酸序列具有至少最少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％一致的序列的核酸。在一些实施例中，有效负载剂为或包括定位到核仁或核体的蛋白质，或编码其的核酸。在一些实施例中，有效负载剂为或包括结构蛋白、转录活化子、转录阻遏子、表观遗传修饰剂、组蛋白乙酰基转移酶、组蛋白脱乙酰基酶、组蛋白甲基转移酶、组蛋白脱甲基酶、DNA修饰酶、RNA剪接因子或基因组稳态蛋白，或编码其的核酸。
表17-1：示例性核蛋白
细胞器蛋白有效负载剂
在一些实施例中，有效负载剂为或损害细胞器蛋白有效负载剂或其功能片段、变体或同源物，或编码其的核酸。在一些实施例中，细胞器蛋白有效负载剂为或损害选自表17-2的蛋白质，或其功能片段、变体或同源物，或编码其的核酸。在实施例中，细胞器蛋白有效负载剂包括与表17-2的蛋白质的多肽序列具有至少最少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％一致的序列的蛋白质，或编码其的核酸。在实施例中，细胞器蛋白有效负载剂包括与表17-2的基因的核酸序列具有至少最少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％一致的序列的核酸。在实施例中，细胞器蛋白有效负载剂定位到细胞内隔室，例如如本文所描述(例如，如表17-2中所列出)。在实施例中，细胞器蛋白有效负载剂定位到内质网、线粒体、过氧化物酶体、高尔基体、脂滴、质膜、应激颗粒或细胞骨架。在实施例中，细胞器蛋白有效负载剂包括细胞内隔室的定位信号，例如如本文所描述(例如，如表17-2中所列出)。在实施例中，细胞器蛋白有效负载剂包括以下中的一种或多种(例如，1、2、3或4种)的定位信号：内质网、线粒体、过氧化物酶体、高尔基体、脂滴、质膜、应激颗粒或细胞骨架。
表17-2：示例性细胞器蛋白
分泌性有效负载剂，例如分泌性蛋白有效负载剂
有效负载剂，例如蛋白质有效负载剂也可以靶向分泌。在一些实施例中，本文所描述的方法和组合物可以用于在ER中翻译之后将有效负载靶向细胞器(例如高尔基体、分泌囊泡)的内腔。在一些实施例中，分泌性蛋白有效负载剂包括分泌性蛋白或编码其的核酸。
软骨体
在一些实施例中，融合剂脂质体或融合剂脂质体组合物还包括软骨体或软骨体制剂。在一些实施例中，融合剂脂质体或融合剂脂质体组合物包括来源于线粒体的细胞源的经修饰的软骨体制剂。在一些实施例中，融合剂脂质体或融合剂脂质体组合物包括表达外源性蛋白的软骨体制剂。在一些实施例中，外源性蛋白对所述线粒体为外源性的。在一些实施例中，外源性蛋白对线粒体的所述细胞源为外源性的。包含软骨体、软骨体制剂、方法和用途的额外特征和实施例涵盖在本发明中，例如如国际申请PCT/US16/64251中所描述。
免疫原性
在本文所描述的方面中的任一个的一些实施例中，融合剂脂质体组合物为基本上非免疫原性的。免疫原性可以被定量，例如如本文所描述。
在一些实施例中，融合剂脂质体组合物具有细胞的膜对称性，所述细胞为或已知为基本上非免疫原性的，例如干细胞、间质干细胞、诱导多能干细胞、胚胎干细胞、塞特利氏细胞(sertoli cell)或视网膜色素上皮细胞。在一些实施例中，融合剂脂质体的免疫原性比干细胞、间质干细胞、诱导多能干细胞、胚胎干细胞、塞特利氏细胞或视网膜色素上皮细胞的免疫原性高不超过5％、10％、20％、30％、40％或50％，如通过本文所描述的分析所测量。
在一些实施例中，相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，或杰卡特细胞，融合剂脂质体组合物包括升高水平的免疫抑制剂。在一些实施例中，水平升高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍。在一些实施例中，融合剂脂质体组合物包括参考细胞中不存在的免疫抑制剂。在一些实施例中，相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，或杰卡特细胞，融合剂脂质体组合物包括降低水平的免疫活化剂。在一些实施例中，相比于参考细胞，水平降低至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％。在一些实施例中，免疫活化剂基本上不存在于融合剂脂质体中。
在一些实施例中，融合剂脂质体组合物包括膜，所述膜具有与源细胞，例如基本上非免疫原性的源细胞基本上类似(例如如通过蛋白质组学所测量)的组成。在一些实施例中，融合剂脂质体组合物包括膜，所述膜包括源细胞的膜蛋白的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。在一些实施例中，融合剂脂质体组合物包括膜，所述膜包括以源细胞膜上的膜蛋白的表达水平的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％表达的膜蛋白。
在一些实施例中，融合剂脂质体组合物，或衍生融合剂脂质体组合物的源细胞具有以下特征中的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二个或更多个：
a.相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，或HeLa细胞，MHC I类或MHC II类的表达为小于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
b.相比于参考细胞，例如以其它方式类似于与源细胞的未经修饰的细胞，或本文所描述的参考细胞，包含(但不限于)以下的一种或多种共刺激蛋白的表达为小于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小：LAG3、ICOS-L、ICOS、Ox40L、OX40、CD28、B7、CD30、CD30L 4-1BB、4-1BBL、SLAM、CD27、CD70、HVEM、LIGHT、B7-H3或B7-H4；
c.抑制巨噬细胞吞噬的表面蛋白(例如CD47)的表达，例如通过本文所描述的方法可检测的表达，例如相比于参考细胞，例如以其它方式类似于与源细胞的未经修饰的细胞，或杰卡特细胞，抑制巨噬细胞吞噬的表面蛋白(例如CD47)的表达为大于1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更大；
d.可溶性免疫抑制细胞因子(例如IL-10)的表达，例如通过本文所描述的方法可检测的表达，例如相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，或杰卡特细胞，可溶性免疫抑制细胞因子(例如IL-10)的表达为大于1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更大；
e.可溶性免疫抑制蛋白(例如PD-L1)的表达，例如通过本文所描述的方法可检测的表达，例如相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，或杰卡特细胞，可溶性免疫抑制蛋白(例如PD-L1)的表达为大于1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更大；
f.相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，或U-266细胞，可溶性免疫刺激细胞因子，例如IFN-γ或TNF-a的表达为小于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
g.相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，或A549细胞或SK-Br-3细胞，内源性免疫-刺激抗原，例如Zg16或Hormad1的表达为小于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
h.相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，或杰卡特细胞，HLA-E或HLA-G的表达，例如通过本文所描述的方法可检测的表达；
i.表面糖基化分布，例如含有唾液酸，其用以例如抑制NK细胞活化；
j.相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，或杰卡特细胞，TCRα/β的表达为小于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
k.相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，或HeLa细胞，ABO血型的表达为小于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
l.相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，或杰卡特细胞，次要组织相容性抗原(MHA)的表达为小于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；或
m.相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，或杰卡特细胞，具有小于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小的线粒体MHA，或具有不可检测的线粒体MHA。
在实施例中，共刺激蛋白为4-1BB、B7、SLAM、LAG3、HVEM或LIGHT，并且ref细胞为HDLM-2。在一些实施例中，共刺激蛋白是BY-H3，而参考细胞是HeLa。在一些实施例中，共刺激蛋白是ICOSL或B7-H4，而参考细胞是SK-BR-3。在一些实施例中，共刺激蛋白是ICOS或OX40，而参考细胞是MOLT-4。在一些实施例中，共刺激蛋白是CD28，而参考细胞是U-266。在一些实施例中，共刺激蛋白是CD30L或CD27，而参考细胞是Daudi。
在一些实施例中，融合剂脂质体组合物基本上不引发免疫系统，例如先天免疫系统的免疫原性应答。在实施例中，可以定量免疫原性应答，例如如本文所描述。在一些实施例中，先天免疫系统的免疫原性应答包括先天免疫细胞的应答，所述先天免疫细胞包含(但不限于)：NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞、肥大细胞或γ/δT细胞。在一些实施例中，先天免疫系统的免疫原性应答包括互补系统的应答，所述互补系统包含可溶性血液组分和膜结合组分。
在一些实施例中，融合剂脂质体组合物基本上不引发免疫系统，例如适应性免疫系统的免疫原性应答。在实施例中，可以定量免疫原性应答，例如如本文所描述。在一些实施例中，适应性免疫系统的免疫原性应答包括适应性免疫细胞的免疫原性应答，包含(但不限于)T淋巴细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞和或γ-δT细胞)或B淋巴细胞的数目或活性的变化，例如增加。在一些实施例中，适应性免疫系统的免疫原性应答包含增加水平的可溶性血液组分，包含(但不限于)细胞因子或抗体(例如IgG、IgM、IgE、IgA或IgD)的数目或活性的变化，例如增加。
在一些实施例中，融合剂脂质体组合物被修饰以具有降低的免疫原性。免疫原性可以被定量，例如如本文所描述。在一些实施例中，融合剂脂质体组合物的免疫原性比参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，或杰卡特细胞的免疫原性低小于5％、10％、20％、30％、40％或50％。
在本文所描述的方面中的任一个的一些实施例中，融合剂脂质体组合物衍生自源细胞，例如具有经修饰的基因组(例如使用本文所描述的方法修饰)的哺乳动物细胞，以降低(例如减少)免疫原性。免疫原性可以被定量，例如如本文所描述。
在一些实施例中，融合剂脂质体组合物衍生自哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞耗尽以下中的一、二、三、四、五、六、七个或更多个(例如将其基因敲除)：
a.MHC I类、MHC II类或MHA；
b.一种或多种共刺激蛋白，包含(但不限于)：LAG3、ICOS-L、ICOS、Ox40L、OX40、CD28、B7、CD30、CD30L 4-1BB、4-1BBL、SLAM、CD27、CD70、HVEM、LIGHT、B7-H3或B7-H4；
c.可溶性免疫刺激细胞因子，例如IFN-γ或TNF-a；
d.内源性免疫刺激抗原，例如Zg16或Hormad1；
e.T细胞受体(TCR)；
f.编码ABO血型的基因，例如ABO基因；
g.驱动免疫活化的转录因子，例如NFkB；
h.控制MHC表达的转录因子，例如II类反式-活化子(CIITA)、Xbox 5的调节因子(RFX5)、RFX相关蛋白(RFXAP)或RFX锚蛋白重复序列(RFXANK；也称为RFXB)；或
i.TAP蛋白，例如TAP2、TAP1或TAPBP，其减少MHC I类表达。
在一些实施例中，融合剂脂质体衍生自具有遗传修饰的源细胞，所述遗传修饰使得免疫抑制剂，例如以下中的一种、两种、三种或更多种的表达增加(例如其中在遗传修饰之前，细胞不表达因子)：
a.抑制巨噬细胞吞噬的表面蛋白，例如CD47；例如相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，或杰卡特细胞增加的CD47表达；
b.可溶性免疫抑制细胞因子，例如IL-10，例如相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，或杰卡特细胞增加的IL-10表达；
c.可溶性免疫抑制蛋白，例如PD-1、PD-L1、CTLA4或BTLA；例如相比于参考细胞，例如以其它方式类似于细胞源的未经修饰的细胞，或杰卡特细胞增加的免疫抑制蛋白表达；或
d.耐受蛋白，例如ILT-2或ILT-4促效剂，例如HLA-E或HLA-G或任何其它内源性ILT-2或ILT-4促效剂，例如相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，或杰卡特细胞增加的HLA-E、HLA-G、ILT-2或ILT-4的表达。
在一些实施例中，增加的表达水平为相比于参考细胞高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍。
在一些实施例中，融合剂脂质体衍生自源细胞，所述源细胞被修饰以具有降低的免疫活化剂的表达，例如以下中的一、二、三、四、五、六、七、八个或更多个：
a.相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，或HeLa细胞，MHC I类或MHC II类的表达为小于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
b.相比于参考细胞，例如以其它方式类似于与源细胞的未经修饰的细胞，或本文所描述的参考细胞，包含(但不限于)以下的一种或多种共刺激蛋白的表达为小于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小：LAG3、ICOS-L、ICOS、Ox40L、OX40、CD28、B7、CD30、CD30L 4-1BB、4-1BBL、SLAM、CD27、CD70、HVEM、LIGHT、B7-H3或B7-H4；
c.相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，或U-266细胞，可溶性免疫刺激细胞因子，例如IFN-γ或TNF-a的表达为小于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
d.相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，或A549细胞或SK-Br-3细胞，内源性免疫-刺激抗原，例如Zg16或Hormad1的表达为小于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
e.相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，或杰卡特细胞，T细胞受体(TCR)的表达为小于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
f.相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，或HeLa细胞，ABO血型的表达为小于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
g.相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，或杰卡特细胞，驱动免疫活化的转录因子，例如NFkB的表达为小于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小
h.相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，或杰卡特细胞，控制MHC表达的转录因子，例如II类反式-活化子(CIITA)、Xbox 5的调节因子(RFX5)、RFX相关蛋白(RFXAP)或RFX锚蛋白重复序列(RFXANK；也称为RFXB)的表达为小于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；或
i.相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，或HeLa细胞，降低MHC I类表达的TAP蛋白，例如TAP2、TAP1或TAPBP的表达为小于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小。
在一些实施例中，相比于未修饰的细胞，例如未修饰的间质干细胞，衍生自哺乳动物细胞(例如间质干细胞)，使用表达shRNA的慢病毒修饰以降低MHC I类表达的融合剂脂质体组合物具有较低的MHC I类的表达。在一些实施例中，相比于未修饰的细胞，例如未修饰的间质干细胞，衍生自哺乳动物细胞(例如间质干细胞)，使用表达HLA-G的慢病毒修饰以增加HLA-G表达的融合剂脂质体组合物具有增加的HLA-G表达。
在一些实施例中，融合剂脂质体组合物衍生自基本上没有免疫原性的源细胞，例如哺乳动物细胞，其中源细胞以0pg/mL到>0pg/mL的水平刺激(例如诱导)T细胞IFN-γ分泌，例如通过IFN-γELISPOT分析在体外所分析。
在一些实施例中，融合剂脂质体组合物衍生自源细胞，例如哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞来自用免疫抑制剂，例如糖皮质激素(例如地塞米松)、细胞生长抑制剂(例如甲氨喋呤)、抗体(例如莫罗单抗(Muromonab)-CD3)或免疫亲和素调控子(例如环孢菌素或雷帕霉素)处理的细胞培养物。
在一些实施例中，融合剂脂质体组合物衍生自源细胞，例如哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞包括外源药剂，例如治疗剂。
在一些实施例中，融合剂脂质体组合物衍生自源细胞，例如哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞为重组细胞。
在一些实施例中，融合剂脂质体衍生自哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞经遗传修饰以表达病毒逃避蛋白，例如hCMV US2或US11。
在一些实施例中，用聚合物，例如降低免疫原性和免疫介导的清除的生物相容性聚合物(例如PEG)来共价或非共价修饰融合剂脂质体的表面，或衍生融合剂脂质体的哺乳动物细胞的表面。
在一些实施例中，用唾液酸，例如含有NK抑制性聚糖表位的包括糖聚合物的唾液酸来共价或非共价修饰融合剂脂质体的表面，或衍生融合剂脂质体的哺乳动物细胞的表面。
在一些实施例中，用酶处理，例如用糖苷酶，例如α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶处理融合剂脂质体的表面，或衍生融合剂脂质体的哺乳动物细胞的表面以去除ABO血型
在一些实施例中，用酶处理融合剂脂质体的表面，或衍生融合剂脂质体的哺乳动物细胞的表面以产生，例如诱导与接受者体的血型匹配的ABO血型的表达。
评估免疫原性的参数
在一些实施例中，融合剂脂质体组合物衍生自源细胞，例如哺乳动物细胞，其基本上没有免疫原性，或被修饰(例如使用本文所描述的方法修饰)以降低免疫原性。源细胞和融合剂脂质体组合物的免疫原性可以通过本文所描述的任何分析来确定。
在一些实施例中，相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，融合剂脂质体组合物的体内移植物存活率增加，例如增加1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。在一些实施例中，在适当的动物模型，例如本文所描述的动物模型中通过如本文所描述的测量体内移植物存活率的分析来确定移植物存活率。
在一些实施例中，相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，融合剂脂质体组合物的畸胎瘤形成增加，例如增加1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。在一些实施例中，在适当的动物模型，例如本文所描述的动物模型中通过如本文所描述的测量畸胎瘤形成的分析来确定畸胎瘤形成。
在一些实施例中，相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，融合剂脂质体组合物的畸胎瘤存活率增加，例如增加1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。在一些实施例中，融合剂脂质体组合物在畸胎瘤存活率分析中存活一天或更多天。在一些实施例中，在适当的动物模型，例如本文所描述的动物模型中通过如本文所描述的测量畸胎瘤存活率的分析来确定畸胎瘤存活率。在一个实施例中，如实例中所描述，通过固定组织(例如冷冻或福尔马林固定)的成像分析，例如IHC染色、荧光染色或H&E来测量畸胎瘤形成。在一些实施例中，固定组织可以用以下抗体中的任何一种或全部来染色：抗人类CD3、抗人类CD4或抗人类CD8。
在一些实施例中，相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，融合剂脂质体组合物的向移植物或畸胎瘤中的CD8+T细胞浸润降低，例如降低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。在一些实施例中，在适当的动物模型，例如本文所描述的动物模型中通过如本文所描述的测量CD8+T细胞浸润的分析，例如组织学分析来确定CD8 T细胞浸润。在一些实施例中，衍生自融合剂脂质体组合物的畸胎瘤在0％、0.1％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的组织学组织切片的50×像场中具有CD8+T细胞浸润。
在一些实施例中，相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，融合剂脂质体组合物的向移植物或畸胎瘤中的CD4+T细胞浸润降低，例如降低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。在一些实施例中，在适当的动物模型，例如本文所描述的动物模型中通过如本文所描述的测量CD4+T细胞浸润的分析，例如组织学分析来确定CD4 T细胞浸润。在一些实施例中，衍生自融合剂脂质体组合物的畸胎瘤在0％、0.1％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的组织学组织切片的50×像场中具有CD4+T细胞浸润。
在一些实施例中，相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，融合剂脂质体组合物的向移植物或畸胎瘤中的CD3+NK细胞浸润降低，例如降低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。在一些实施例中，在适当的动物模型，例如本文所描述的动物模型中通过如本文所描述的测量CD3+NK细胞浸润的分析，例如组织学分析来确定CD3+NK细胞浸润。在一些实施例中，衍生自融合剂脂质体组合物的畸胎瘤在0％、0.1％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的组织学组织切片的50×像场中具有CD3+NK T细胞浸润。
在一些实施例中，相比于在将参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞一次或多次植入适当的动物模型，例如本文所描述的动物模型中之后的体液应答，融合剂脂质体组合物的免疫原性降低，如根据在将衍生的融合剂脂质体一次或多次植入适当的动物模型，例如本文所描述的动物模型中之后的体液应答的降低所测量。在一些实施例中，通过抗细胞抗体滴度，例如抗融合剂脂质体抗体滴度，例如通过ELISA来测量血清样品中的体液应答的降低。在一些实施例中，相比于来自施用未经修饰的细胞的动物的血清样品，来自施用融合剂脂质体组合物的动物的血清样品的抗细胞抗体滴度降低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。在一些实施例中，来自施用融合剂脂质体组合物的动物的血清样品具有增加的抗细胞抗体滴度，例如与基线相比增加了1％、2％、5％、10％、20％、30％或40％，例如其中基线是指在施用融合剂脂质体组合物之前来自相同动物的血清样品。
在一些实施例中，相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，融合剂脂质体组合物的巨噬细胞吞噬作用降低，例如巨噬细胞吞噬作用降低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，其中巨噬细胞吞噬作用的降低是通过体外分析吞噬作用指数来确定，例如如实例82中所描述。在一些实施例中，当在巨噬细胞吞噬作用的体外分析中与巨噬细胞一起培育时，融合剂脂质体组合物具有0、1、10、100或更大的吞噬作用指数，例如如通过实例82的分析所测量。
在一些实施例中，相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞或间质干细胞，源细胞的细胞毒性介导的通过PBMC的细胞溶解降低，例如细胞溶解降低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，例如使用实例83的分析。在实施例中，源细胞表达外源性HLA-G。
在一些实施例中，相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，融合剂脂质体组合物的NK介导的细胞溶解降低，例如NK介导的细胞溶解降低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，其中通过铬释放分析或铕释放分析在体外分析NK介导的细胞溶解。
在一些实施例中，相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，融合剂脂质体组合物的CD8+T细胞介导的细胞溶解降低，例如CD8 T细胞介导的细胞溶解降低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，其中通过铬释放分析或铕释放分析在体外分析CD8 T细胞介导的细胞溶解。在实施例中，如实例85中所描述地测量活化和/或增殖。
在一些实施例中，相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，融合剂脂质体组合物的CD4+T细胞增殖和/或活化降低，例如降低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，其中在体外分析CD4 T细胞增殖(例如经修饰或未经修饰的哺乳动物源细胞，和CD4+T细胞与CD3/CD28戴诺珠粒的共培养分析)，例如如实例86中所描述。
在一些实施例中，相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，融合剂脂质体组合物的T细胞IFN-γ分泌降低，例如降低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，其中在体外分析T细胞IFN-γ分泌，例如通过IFN-γELISPOT。
在一些实施例中，相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，融合剂脂质体组合物的免疫原性细胞因子分泌降低，例如免疫原性细胞因子分泌降低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，其中使用ELISA或ELISPOT在体外分析免疫原性细胞因子的分泌。
在一些实施例中，相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，融合剂脂质体组合物使得免疫抑制细胞因子的分泌增加，例如免疫抑制细胞因子的分泌增加1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，其中使用ELISA或ELISPOT在体外分析免疫抑制细胞因子的分泌。
在一些实施例中，相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，融合剂脂质体组合物的HLA-G或HLA-E的表达增加，例如HLA-G或HLA-E的表达增加1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，其中使用流式细胞测量术，例如FACS在体外分析HLA-G或HLA-E的表达。在一些实施例中，融合剂脂质体组合物衍生自源细胞，所述源细胞经修饰以具有增加的HLA-G或HLA-E的表达，例如相比于未经修饰的细胞，例如HLA-G或HLA-E的表达增加1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，其中使用流式细胞测量术，例如FACS在体外分析HLA-G或HLA-E的表达。在一些实施例中，衍生自具有增加的HLA-G表达的经修饰的细胞的融合剂脂质体组合物在畸胎瘤形成分析，例如如本文所描述的畸胎瘤形成分析中展现降低的免疫原性，例如根据降低的免疫细胞浸润所测量。
在一些实施例中，相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，融合剂脂质体组合物的T细胞抑制剂配体(例如CTLA4、PD1、PD-L1)的表达增加，例如T细胞抑制剂配体的表达增加1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，其中使用流式细胞测量术，例如FACS在体外分析T细胞抑制剂配体的表达。
在一些实施例中，相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞，融合剂脂质体组合物的共刺激配体的表达降低，例如共刺激配体的表达降低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，其中使用流式细胞测量术，例如FACS在体外分析共刺激配体的表达。
在一些实施例中，相比于参考细胞，例如以其它方式类似于源细胞的未经修饰的细胞或HeLa细胞，融合剂脂质体组合物的MHC I类或MHC II类的表达降低，例如MHC I类或MHC II类的表达降低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，其中使用流式细胞测量术，例如FACS在体外分析MHC I类或II类的表达。
在一些实施例中，融合剂脂质体组合物衍生自基本上非免疫原性的细胞源，例如哺乳动物细胞源。在一些实施例中，免疫原性可以被定量，例如如本文所描述。在一些实施例中，哺乳动物细胞源包括以下特征中的任何一个、全部或组合：
a.其中源细胞是从自体细胞源获得的；例如从将接受，例如施用融合剂脂质体组合物的接受者获得的细胞；
b.其中源细胞是从与接受者，例如将接受(例如施用)融合剂脂质体组合物的本文所描述的接受者具有匹配(例如类似)性别的同种异体细胞源获得的；
c.其中源细胞是从HLA与接受者的HLA匹配(例如在一个或多个等位基因处)的同种异体细胞源获得；
d.其中源细胞是从作为HLA同型接合子的同种异体细胞源获得；
e.其中源细胞是从缺乏MHC I类和II类(或MHC I类和II类水平相较于参考细胞降低)的同种异体细胞源获得；或
f.其中源细胞是从已知基本上非免疫原性的细胞源，包含(但不限于)：干细胞、间质干细胞、诱导多能干细胞、胚胎干细胞、塞特利氏细胞或视网膜色素上皮细胞获得的。
在一些实施例中，待施用融合剂脂质体组合物的个体具有或已知具有与融合剂脂质体反应的预先存在的抗体(例如IgG或IgM)，或关于所述抗体进行测试。在一些实施例中，待施用融合剂脂质体组合物的个体不具有可检测水平的与融合剂脂质体反应的预先存在的抗体。抗体的测试描述于例如实例78中。
在一些实施例中，已接受融合剂脂质体组合物的受试者具有或已知具有与融合剂脂质体反应的抗体(例如IgG或IgM)，或关于所述抗体进行测试。在一些实施例中，已接受融合剂脂质体组合物(例如至少一次、两次、三次、四次、五次或更多次)的受试者不具有可检测水平的与融合剂脂质体反应的抗体。在实施例中，抗体水平在两个时间点之间不升高超过1％、2％、5％、10％、20％或50％，第一时间点在第一次施用融合剂脂质体之前，并且第二时间点在一次或多次施用融合剂脂质体之后。抗体的测试描述于例如实例79中。
其它治疗剂
在一些实施例中，将融合剂脂质体组合物与其它药剂(例如治疗剂)共施用于受试者，例如接受者，例如本文所描述的接受者。在一些实施例中，共施用的治疗剂是免疫抑制剂，例如糖皮质激素(例如地塞米松)、细胞生长抑制剂(例如甲氨蝶呤)、抗体(例如莫罗单抗-CD3)或免疫亲和素调节剂(例如环孢菌素或雷帕霉素)。在实施例中，免疫抑制剂减少了免疫介导的融合剂脂质体清除。在一些实施例中，融合剂脂质体组合物与免疫刺激剂，例如佐剂、白细胞介素、细胞因子或趋化因子共施用。
在一些实施例中，在相同时间施用，例如同时施用融合剂脂质体组合物和免疫抑制剂。在一些实施例中，在施用免疫抑制剂之前施用融合剂脂质体组合物。在一些实施例中，在施用免疫抑制剂之后施用融合剂脂质体组合物。
在一些实施例中，免疫抑制剂是小分子，如布洛芬(ibuprofen)、乙酰胺苯酚(acetaminophen)、环孢灵(cyclosporine)、他克莫司(tacrolimus)、雷帕霉素、霉酚酸酯(mycophenolate)、环磷酰胺、糖皮质激素、西罗莫司(sirolimus)、硫唑嘌呤(azathriopine)或甲氨蝶呤。
在一些实施例中，免疫抑制剂为抗体分子，包含(但不限于)：莫罗诺单抗(muronomab)(抗CD3)、达利珠单抗(Daclizumab)(抗IL12)、巴利昔单抗(Basiliximab)、英利昔单抗(Infliximab)(抗TNFa)或利妥昔单抗(rituximab)(抗CD20)。
在一些实施例中，相比于融合剂脂质体组合物的单独施用，融合剂脂质体组合物与免疫抑制剂的共施用使得融合剂脂质体组合物在受试者中的持久性增强。在一些实施例中，相比于单独施用时融合剂脂质体组合物的持久性，共施用的融合剂脂质体组合物的持久性增强至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更长。在一些实施例中，相比于单独施用融合剂脂质体组合物时的生存期，共施用的融合剂脂质体组合物的持久性增强至少1、2、3、4、5、6、7、10、15、20、25或30天或更久。
递送
在一些实施例中，在递送融合剂脂质体之前、同时或之后向靶细胞或组织递送融合剂(例如蛋白质、脂质或化学融合剂)或融合剂结合搭配物。
在一些实施例中，在递送融合剂脂质体之前、同时或之后向非靶细胞或组织递送融合剂(例如蛋白质、脂质或化学融合剂)或融合剂结合搭配物。
在一些实施例中，在递送融合剂脂质体之前、同时或之后向靶细胞或组织递送编码融合剂(例如蛋白质或脂质融合剂)或融合剂结合搭配物的核酸。
在一些实施例中，在递送融合剂脂质体之前、同时或之后向靶细胞或组织递送上调或下调融合剂(例如蛋白质、脂质或化学融合剂)或融合剂结合搭配物的表达的多肽、核酸、核糖核蛋白或小分子。
在一些实施例中，在递送融合剂脂质体之前、同时或之后向非靶细胞或组织递送上调或下调融合剂(例如蛋白质、脂质或化学融合剂)或融合剂结合搭配物的表达的多肽、核酸、核糖核蛋白或小分子。
在一些实施例中，在递送融合剂脂质体之前、同时或之后通过(例如诱导应激或细胞分裂)来修饰靶细胞或组织以增加融合速率。一些非限制性实例包含诱导缺血、化学疗法治疗、抗生素、照射、毒素、发炎、炎性分子、抗炎分子、酸性损伤、碱性损伤、烧伤、聚乙二醇、神经递质、骨髓毒性药物、生长因子或激素、组织切除、饥饿和/或运动。
在一些实施例中，用血管舒张剂(例如氧化氮(NO)、一氧化碳、前列环素(PGI2)、硝酸甘油、酚妥拉明)或血管收缩剂(例如血管紧张素(AGT)、内皮素(EDN)、去甲肾上腺素)处理靶细胞或组织以增加融合剂脂质体转运到靶组织的速率。
在一些实施例中，用化学剂，例如化学治疗剂来处理靶细胞或组织。在这类实施例中，化学治疗剂诱导增强靶细胞或组织的融合活性的对靶细胞或组织的损伤。
在一些实施例中，用物理应力，例如电融合来处理靶细胞或组织。在此类实施例中，物理应力使靶细胞或组织的膜不稳定，以增强靶细胞或组织的融合活性。
在一些实施例中，靶细胞或组织可以用药剂处理以增强与融合剂脂质体的融合。例如，可以用抗抑郁药刺激特定神经元受体以增强融合特性。
包括本文所描述的融合剂脂质体的组合物可以施用或靶向到循环系统、肝系统、肾系统、心肺系统、中枢神经系统、周围神经系统、肌肉骨胳系统、淋巴系统、免疫系统、感觉神经系统(视觉、听觉、嗅觉、触觉、味觉)、消化系统、内分泌系统(包含脂肪组织代谢调节)和生殖系统。
在实施例中，将本文所描述的融合剂脂质体组合物离体递送到细胞或组织，例如人类细胞或组织。在一些实施例中，将组合物递送到处于受伤状态(例如由于创伤、疾病、缺氧、缺血或其它损伤)的离体组织。
在一些实施例中，将融合剂脂质体组合物递送到离体移植物(例如组织外植体或用于移植的组织，例如人类静脉，肌肉骨胳移植物(如骨骼或肌腱)、角膜、皮肤、心脏瓣膜、神经；或分离或培养的器官，例如待向人类移植的器官，例如人类心脏、肝脏、肺、肾脏、胰脏、肠、胸腺、眼睛)。组合物改良移植物的活力、呼吸或其它功能。组合物可以在移植之前、期间和/或之后递送到组织或器官。
在一些实施例中，将本文所描述的融合剂脂质体组合物离体递送到来源于受试者的细胞或组织。在一些实施例中，向受试者重新施用细胞或组织(即，细胞或组织为自体的)。
融合剂脂质体可以与来自任何哺乳动物(例如人类)组织，例如来自上皮、结缔组织、肌肉或神经组织或细胞，以及其组合的细胞融合。融合剂脂质体可以递送到任何真核(例如哺乳动物)器官系统，例如心血管系统(心脏、脉管系统)；消化系统(食道、胃、肝脏、胆囊、胰脏、肠、结肠、直肠和肛门)；内分泌系统(下丘脑、脑下垂体、松果体或松果体腺体、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺)；排泄系统(肾脏、输尿管、膀胱)；淋巴系统(淋巴、淋巴结、淋巴管、扁桃体、腺样体、胸腺、脾脏)；皮肤系统(皮肤、头发、指甲)；肌肉系统(例如骨骼肌)；神经系统(脑、脊髓、神经)；生殖系统(卵巢、子宫、乳腺、睾丸、输精管、精囊、前列腺)；呼吸系统(咽、喉、气管、支气管、肺、隔膜)；骨骼系统(骨骼、软骨)和其组合。
在实施例中，融合剂脂质体在向受试者施用时靶向组织，例如肝脏、肺、心脏、脾脏、胰脏、胃肠道、肾脏、睾丸、卵巢、脑、生殖器官、中枢神经系统、周围神经系统、骨骼肌、内皮、内耳、脂肪组织(例如棕色脂肪组织或白色脂肪组织)或眼睛，例如其中在24、48或72小时之后，在施用融合剂脂质体的群体中，至少0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的融合剂脂质体存在于靶组织中，例如根据实例87或100的分析。
在实施例中，融合剂脂质体可以与来自干细胞或祖细胞源的细胞融合，例如骨髓基质细胞、骨髓源性成年祖细胞(MAPC)、内皮祖细胞(EPC)、胚细胞、在室管膜下区中形成的中间祖细胞、神经干细胞、肌肉干细胞、卫星细胞、肝脏干细胞、造血干细胞、骨髓基质细胞、表皮干细胞、胚胎干细胞、间质干细胞、脐带干细胞、前体细胞、肌肉前体细胞、成肌细胞、心肌细胞、神经前体细胞、神经胶质前体细胞、神经元前体细胞、成肝细胞。
融合剂结合搭配物，例如用于降落垫实施例
在某些方面，本公开提供一种将融合剂脂质体递送到受试者的靶细胞的方法。在一些实施例中，方法包括向受试者施用包括编码融合剂(例如成肌蛋白)的核酸的融合剂脂质体，其中核酸在允许融合剂表达于受试者的融合剂脂质体表面上的条件下不存在或不表达(例如存在但不转录或不翻译)于细胞内。在一些实施例中，方法还包括在允许融合剂脂质体上的融合剂和融合剂结合搭配物融合的条件下向受试者施用组合物，所述组合物包括药剂，例如治疗剂，和融合剂结合搭配物，任选地包括载体，例如膜。在一些实施例中，载剂包括膜，例如脂质双层，例如将药剂安置于脂质双层内。在一些实施例中，脂质双层与靶细胞融合，从而将药剂递送到受试者的靶细胞。
在一些实施例中，融合剂结合搭配物为安置于靶细胞，例如本文公开的靶细胞的膜(例如脂质双层)中的部分，例如蛋白质分子。在一些实施例中，膜可以为细胞表面膜，或细胞器(例如线粒体、溶酶体或高尔基体)的亚细胞膜。在一些实施例中，融合剂结合搭配物可以内源性表达、过度表达或外源性表达(例如通过本文所描述的方法)。在一些实施例中，融合剂结合搭配物可以与其它融合剂结合搭配物聚集于膜处。
在一些实施例中，融合剂结合搭配物或多种融合剂结合搭配物在靶细胞膜中的存在产生了界面，所述界面可以促进靶细胞(例如本文所描述的细胞)上的融合剂结合搭配物与融合剂脂质体(例如本文所描述的融合剂脂质体)上的融合剂之间的相互作用，例如结合。在一些实施例中，融合剂脂质体上的融合剂与靶细胞，例如靶细胞膜(例如脂质双层)上的融合剂结合搭配物相互作用(例如结合)，以诱导融合剂脂质体与靶膜的融合。在一些实施例中，融合剂与包含线粒体的亚细胞细胞器上的降落垫上的融合剂结合搭配物相互作用(例如结合)，以诱导融合剂脂质体与亚细胞细胞器的融合。
融合剂结合搭配物可以通过下文所讨论的方法中的任一个引入靶细胞，例如本文所公开的靶细胞中。
在一些实施例中，将融合剂结合搭配物引入靶细胞的方法包括从受试者(例如本文所描述的受试者)去除(例如提取)靶细胞(例如通过血球分离术或活检)，和在允许融合剂结合搭配物表达于靶细胞膜上的条件下施用(例如暴露于)融合剂结合搭配物。在一些实施例中，方法包括使表达融合剂结合搭配物的靶细胞离体与包括融合剂的融合剂脂质体接触以诱导融合剂脂质体与靶细胞膜的融合。在一些实施例中，融合到融合剂脂质体的靶细胞被重新引入受试者中，例如通过静脉内。
在一些实施例中，表达融合剂结合搭配物的靶细胞被重新引入受试者中，例如通过静脉内。在一些实施例中，方法包括向受试者施用包括融合剂的融合剂脂质体以允许融合剂脂质体上的融合剂与靶细胞上的融合剂结合搭配物相互作用(例如结合)，和融合剂脂质体与靶细胞膜的融合。
在一些实施例中，靶细胞用表观遗传修饰剂，例如小分子表观遗传修饰剂处理以增加或降低内源性细胞表面分子(例如，在一些实施例中，相对于靶细胞为内源性的)，例如融合剂结合搭配物，例如器官、组织或细胞靶向分子的表达，其中细胞表面分子为蛋白质、聚糖、脂质或低分子量分子。在一些实施例中，靶细胞被遗传修饰以增加内源性细胞表面分子，例如融合剂结合搭配物，例如器官、组织或细胞靶向分子的表达，其中细胞表面分子为蛋白质、聚糖、脂质或低分子量分子。在一些实施例中，遗传修饰可以降低例如融合剂结合搭配物的内源性细胞表面分子的转录活化子的表达。
在一些实施例中，靶细胞被遗传修饰以表达(例如过度表达)外源性细胞表面分子，例如融合剂结合搭配物，其中细胞表面分子为蛋白质、聚糖、脂质或低分子量分子。
在一些实施例中，靶细胞被遗传修饰以增加外源融合剂在细胞中的表达，例如转基因的递送。在一些实施例中，将核酸，例如DNA、mRNA或siRNA转移到靶细胞，例如以增加或减少细胞表面分子(蛋白质、聚糖、脂质或低分子量分子)的表达。在一些实施例中，核酸靶向融合剂结合搭配物的阻遏子，例如shRNA或siRNA构建体。在一些实施例中，核酸编码融合剂结合搭配物阻遏子的抑制剂。
使用方法
本文所描述的药物组合物的施用可以通过口服、吸入、经皮或肠胃外(包含静脉内、瘤内、腹膜内、肌肉内、腔内和皮下)施用。融合剂脂质体可以单独施用或被配制成药物组合物。
融合剂脂质体可以单位剂量组合物，如单位剂量经口、肠胃外、经皮或吸入组合物的形式施用。这类组合物是通过掺合制备的，并且适合于经口、吸入、经皮或肠胃外施用，并且因此可以呈片剂、胶囊、口服液体制剂、粉末、颗粒、口含剂、可重构散剂、可注射和可输注溶液或悬浮液或栓剂或气雾剂的形式。
在一些实施例中，通过本文所描述的融合剂脂质体组合物的膜蛋白有效负载剂的递送可以诱导或阻断细胞分化、去分化或转分化。靶哺乳动物细胞可以是前体细胞。替代地，靶哺乳动物细胞可以是分化细胞，并且细胞命运改变包含驱动去分化为多能前体细胞，或阻断这类去分化。在需要细胞命运改变的情况下，在使得诱导细胞命运改变的条件下将有效量的编码细胞命运诱导分子或信号的本文所描述的融合剂脂质体引入靶细胞中。在一些实施例中，本文所描述的融合剂脂质体适用于将细胞亚群从第一表型重编程为第二表型。这类重编程可以为临时或永久的。任选地，重编程诱导靶细胞采取中间表型。
还提供减少靶细胞群体中的细胞分化的方法。举例来说，在使得组合物减少前体细胞分化的条件下，使含有一种或多种前体细胞类型的靶细胞群体与本文所描述的融合剂脂质体组合物接触。在某些实施例中，靶细胞群体含有哺乳动物受试者中的受损组织或受外科手术影响的组织。前体细胞为例如基质前体细胞、神经前体细胞或间质前体细胞。
包括膜蛋白有效负载剂的本文所描述的融合剂脂质体组合物可以用于将这类药剂递送到细胞组织或受试者。通过施用本文所描述的融合剂脂质体组合物来递送膜蛋白有效负载剂可以修饰细胞蛋白表达水平。在某些实施例中，施用的组合物引导一种或多种膜蛋白有效负载剂(例如多肽或核酸)的上调(通过细胞中的表达、细胞中的递送或细胞内的诱导)，其提供在递送膜蛋白有效负载剂的细胞中基本上不存在或降低的功能活性。举例来说，缺失的功能活性可以在本质上为酶的、结构的、信号传导的或调节的。在相关实施例中，施用的组合物引导一种或多种膜蛋白有效负载剂的上调，其增加(例如协同地)在上调膜蛋白有效负载剂的细胞中存在但基本上缺乏的功能活性。在相关实施例中，施用的组合物引导一种或多种多肽的下调，其降低(例如协同地)在下调多肽的细胞中存在或上调的功能活性。在某些实施例中，施用的组合物引导某些功能活性的上调和其它功能活性的下调。
在实施例中，融合剂脂质体组合物介导对靶细胞的作用，并且所述作用持续至少1、2、3、4、5、6或7天；2、3或4周；或1、2、3、6或12个月。在一些实施例中(例如其中融合剂脂质体组合物包括外源蛋白)，所述作用持续小于1、2、3、4、5、6或7天；2、3或4周；或1、2、3、6或12个月。
离体应用
在实施例中，将本文所描述的融合剂脂质体组合物离体递送到细胞或组织，例如人类细胞或组织。在实施例中，组合物改良离体细胞或组织的功能，例如改良细胞活力、信号传导、呼吸或其它功能(例如本文所描述的另一个功能)。
在一些实施例中，将组合物递送到处于受伤状态(例如由于创伤、疾病、缺氧、缺血或其它损伤)的离体组织。
在一些实施例中，将组合物递送到离体移植物(例如组织外植体或用于移植的组织，例如人类静脉，肌肉骨胳移植物(如骨骼或肌腱)、角膜、皮肤、心脏瓣膜、神经；或分离或培养的器官，例如待向人类移植的器官，例如人类心脏、肝脏、肺、肾脏、胰脏、肠、胸腺、眼睛)。组合物可以在移植之前、期间和/或之后递送到组织或器官。
在一些实施例中，组合物被递送、施用或与细胞(例如细胞制剂)接触。细胞制剂可以为细胞疗法制剂(意图向人类受试者施用的细胞制剂)。在实施例中，细胞制剂包括表达嵌合抗原受体(CAR)，例如表达重组CAR的细胞。表达CAR的细胞可以是例如T细胞、自然杀手(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节T细胞。在实施例中，细胞制剂为神经干细胞制剂。在实施例中，细胞制剂为间质干细胞(MSC)制剂。在实施例中，细胞制剂为造血干细胞(HSC)制剂。在实施例中，细胞制剂为胰岛细胞制剂。
体内使用
可以向受试者，例如哺乳动物，例如人类施用本文所描述的融合剂脂质体组合物。在这类实施例中，受试者可能处于特定疾病或病状(例如本文所描述的疾病或病状)的风险中，可能具有所述疾病或病状的症状，或可能被诊断患有或鉴别患有所述疾病或病状。在一个实施例中，受试者患有癌症。在一个实施例中，受试者患有感染性疾病。
在一些实施例中，融合剂脂质体的来源来自施用了融合剂脂质体组合物的相同受试者。在其它实施例中，其为不同的。举例来说，融合剂脂质体和接受者组织的来源可以为自体的(来自相同的受试者)或异源的(来自不同的受试者)。在任一情况下，本文所描述的融合剂脂质体组合物的供体组织可以是与接受者组织不同的组织类型。举例来说，供体组织可以是肌肉组织，而接受者组织可以是结缔组织(例如脂肪组织)。在其它实施例中，供体组织和接受者组织可以是相同或不同的类型，但是来自不同的器官系统。
本文所描述的融合剂脂质体组合物可以向患有癌症、自身免疫疾病、感染性疾病、代谢疾病、神经退化性疾病或遗传病(例如酶缺乏)的受试者施用。在一些实施例中，受试者的组织需要再生。
在一些实施例中，向受试者施用治疗有效量的本文所描述的融合剂脂质体组合物。在一些实施例中，物质的治疗有效量是当向患有或易患疾病、病症和/或病状的受试者施用时足以治疗疾病、病症和/或病状和/或延迟其发作的量。举例来说，在实施例中，治疗疾病、病状或病症的配制物中融合剂脂质体的有效量为缓解、改善、减轻、抑制、延迟发作、降低疾病、病症和/或病状的严重程度和/或降低疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征的发生率的量。
在一些实施例中，用融合剂脂质体组合物治疗受试者。在一些实施例中，治疗部分或完全缓解、改善、减轻、抑制、延迟发作、降低特定疾病、病症和/或病状的严重程度和/或降低特定疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征的发生率。在一些实施例中，治疗可以为对已诊断为罹患相关疾病、病症和/或病状的受试者的治疗。在一些实施例中，治疗可以是针对已知具有与产生相关疾病、病症和/或病状的风险的增加在统计学上相关的一种或多种易感因素的受试者。在一些实施例中，治疗部分或完全改善相关疾病、病症和/或病状的根本原因。
在一些实施例中，融合剂脂质体组合物可以有效治疗疾病，例如癌症。在一些实施例中，相比于施用前受试者中癌细胞的数目，融合剂脂质体组合物有效减少受试者中癌细胞的数目。在一些实施例中，相比于未治疗的疾病的预期病程，融合剂脂质体组合物有效减少受试者中癌细胞的数目。在一些实施例中，受试者在施用融合剂脂质体组合物之后经历完全反应或部分反应。
在一些实施例中，融合剂脂质体与抑制膜融合的蛋白质的抑制剂共施用。举例来说，抑制素为抑制细胞-细胞融合的人类蛋白质(Sugimoto等人,“抑制细胞-细胞融合的新颖人类内源性逆转录病毒蛋白(A novel human endogenous retroviral proteininhibits cell-cell fusion)”《科学报告(Scientific Reports)》3:1462DOI:10.1038/srep01462)。因此，在一些实施例中，融合剂脂质体与抑制素的抑制剂，例如siRNA或抑制抗体共施用。
非人类应用
本文所描述的组合物还可以用于类似地调节包含(但不限于)以下的多种其它生物体的细胞或组织功能或生理技能：农场或役用动物(马、牛、猪、鸡等)、宠物或动物园动物(猫、狗、蜥蜴、鸟类、狮子、老虎和熊等)、水产养殖动物(鱼、蟹、虾、牡蛎等)、植物物种(树木、农作物、观赏花卉等)、发酵物种(酵母等)。本文所描述的融合剂脂质体组合物可以由这类非人类来源制成并且向非人类靶细胞或组织或受试者施用。
融合剂脂质体组合物对靶标来说可以是自体的、同种异体的或异种的。
本文引用的所有参考文献和出版物都以引用的方式并入本文中。
提供以下实例以进一步说明本发明的一些实施例，但并不打算限制本发明的范围；通过其示例性性质应理解，可替代地使用所属领域的技术人员已知的其它程序、方法或技术。
实例
实例1.通过化学处理(PEG)产生去核的融合细胞
用0.25％胰蛋白酶使表达Mito-DsRed(线粒体特异性靶向染料)的供体HeLa细胞胰蛋白酶化，收集，以500xg旋转5分钟，在PBS中洗涤一次并且计数。随后将10×106个细胞再悬浮于补充有10μg/mL细胞松弛素-B的3ml含12.5％ficoll的完全MEM-α(+10％FBS，+1％青霉素/链霉素，+谷氨酰胺)中15分钟。为了使细胞去核，将其转移到由以下ficoll洗脱份(从上到下)组成的不连续ficoll梯度：2mL 12.5％ficoll、0.5mL 15％ficoll、0.5mL 16％ficoll、2mL 17％ficoll梯度、2mL 25％ficoll。所有ficoll梯度洗脱份在补充有10μg/mL细胞松弛素-B的完全DMEM中制成。将梯度在37℃下在Beckman SW-40超速离心机，Ti-70转子上以107971xg旋转1小时。在离心后，从12.5％、15％、16％和1/2的17％ficoll洗脱份收集去核的HeLa细胞并且将其再悬浮于完全DMEM(+10％FBS、+1％青霉素/链霉素、+谷氨酰胺)中，并以500xg旋转5分钟以制成球粒。将去核的Mito-DsRed供体细胞在DMEM中洗涤2次。同时，使表达Mito-GFP(线粒体特异性靶向染料)的接受者HeLa细胞胰蛋白酶化，计数并准备融合。
为了融合，将去核的Mito-DsRed供体HeLa细胞与Mito-GFP接受者HeLa细胞在37℃下以1:1比(各自200,000个)在50％聚乙二醇溶液(50％w/v PEG，制备于DMEM完全w/10％DMSO中)中组合1分钟。随后将细胞在10mL完全DMEM中洗涤3次并以50k个细胞/象限的密度接种于35mm玻璃底象限成像培养皿上，其中每个象限的面积为1.9cm2。
实例2.通过化学处理(PEG)产生成核的融合细胞
用0.25％胰蛋白酶使表达Mito-DsRed(线粒体特异性靶向染料)的供体HeLa细胞胰蛋白酶化，收集，以500xg旋转5分钟、在PBS中洗涤一次并且计数。随后将2×106个细胞再悬浮于完全DMEM(+10％FBS、+1％青霉素/链霉素、+谷氨酰胺)中，计数并准备融合。
将Mito-DsRed供体细胞在DMEM中洗涤3次。同时，使表达Mito-GFP(线粒体特异性靶向染料)的接受者HeLa细胞胰蛋白酶化，计数并准备融合。
为了融合，将Mito-DsRed供体HeLa细胞与Mito-GFP接受者HeLa细胞在37℃下以1:1比(各自200,000个)在50％聚乙二醇溶液(50％w/v PEG，制备于DMEM完全w/10％DMSO中)中组合1分钟。随后将细胞在10ml完全DMEM中洗涤3次并以50k个细胞/象限的密度接种于35mm玻璃底象限成像培养皿上，其中每个象限的面积为1.9cm2。
实例3.产生表达外源性融合剂的HeLa细胞
这一实例描述产生表达外源性融合剂的组织培养细胞。以下实例同样适用于任何基于蛋白质的融合剂并且同样适用于产生原代细胞(呈悬浮或粘附形式)和组织。在某些情况下，可以使用融合剂对来诱导融合(描述为融合剂和融合剂结合搭配物)。
将融合剂基因融合失败1(EFF-1)克隆到pIRES2-AcGFP1载体(克隆科技公司(Clontech))中，并且然后使用Lipofectamine 2000转染试剂(英杰公司(Invitrogen))将这一构建体转染到HeLa细胞(CCL-2TM，ATCC)中。将融合剂结合搭配物基因，即锚细胞融合失败1(AFF-1)克隆到pIRES2 DsRed-Express 2载体(克隆科技公司)中，并且然后使用Lipofectamine 2000转染试剂(英杰公司)将这一构建体转染到HeLa细胞(CCL-2TM，ATCC)中。将转染的HeLa细胞在37℃、5％CO2下保持于补充有GlutaMAX(吉毕科公司(GIBCO))、10％胎牛血清(吉毕科公司)和500mg/mL博莱霉素的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium；DMEM)中。通过分选荧光活化细胞分选(FACS)分离表达EFF-1的细胞，以获得表达EFF-1融合剂的GFP+HeLa细胞的纯群体。通过分选荧光活化细胞分选(FACS)分离表达AFF-1的细胞，以获得表达AFF-1融合剂结合搭配物的DSRED+HeLa细胞的纯群体。
实例4.通过化学增强的融合去核细胞递送细胞器
将如实例1中所描述产生和融合的融合细胞(Mito-DsRed供体去核细胞和Mito-GFP接受者HeLa细胞)在沉积于成像培养皿中之后24小时在Zeiss LSM 780倒置共聚焦显微镜上以63X放大率成像。对仅单独表达Mito-DsRed和单独表达Mito-GFP的细胞分别成像以配置采集设置，以此方式确保在同时存在和采集Mito-DsRed和Mito-GFP的条件下，两个通道之间没有信号重叠。以完全无偏的方式选择十个所关注区域，唯一的标准是每个ROI内含有最少10个细胞，使得最少100个细胞可用于下游分析。如果这些图像中的给定像素的任一通道(mito-DsRed和mito-GFP)的强度大于所有三个ROI中每个各别通道的最大强度值的10％，那么就将其确定为对于线粒体呈阳性。
基于以下标准鉴别细胞器递送的融合事件：基于上文指示的阈值，细胞中>50％的线粒体(通过为mito-GFP+或mito-Ds-Red+的所有像素鉴别)对于mitoDs-Red和mito-GFP均呈阳性，表明含有这些蛋白质的细胞器(在这种情况下为线粒体)已被递送、融合并且其内容物被掺混。在24小时的时间点，多个细胞通过融合展现阳性细胞器递送，如图7中所指示。这是通过供体与接受者HeLa细胞之间的融合的阳性细胞器递送的图像。以白色指示的细胞内区域指示供体与接受者线粒体之间的重叠。灰色的细胞内区域指示供体与接受者细胞器不重叠的区域。
实例5.通过化学增强的融合有核细胞递送细胞器
将如实例2中所描述产生和组合的融合细胞(Mito-DsRed供体细胞和Mito-GFP接受者HeLa细胞)在沉积于成像培养皿中之后24小时在Zeiss LSM 780倒置共聚焦显微镜上以63X放大率成像。对仅单独表达Mito-DsRed和单独表达Mito-GFP的细胞分别成像以配置采集设置，以此方式确保在同时存在和采集Mito-DsRed和Mito-GFP的条件下，两个通道之间没有信号重叠。以完全无偏的方式选择十个所关注区域，唯一的标准是每个ROI内含有最少10个细胞，使得最少100个细胞可用于下游分析。如果这些图像中的给定像素的任一通道(mito-DsRed和mito-GFP)的强度大于所有三个ROI中每个各别通道的最大强度值的20％，那么就将其确定为对于线粒体呈阳性。
基于以下标准鉴别细胞器递送的融合事件：基于上文指示的阈值，细胞中>50％的线粒体(通过为mito-GFP+或mito-Ds-Red+的所有像素鉴别)对于mitoDs-Red和mito-GFP均呈阳性，表明含有这些蛋白质的细胞器(在这种情况下为线粒体)已被递送、融合并且其内容物被掺混。在24小时的时间点，多个细胞通过融合展现阳性细胞器递送，如图8中所指示。这是通过供体与接受者HeLa细胞之间的融合的阳性细胞器递送的图像。以白色指示的细胞内区域指示供体与接受者线粒体之间的重叠。灰色的细胞内区域指示供体与接受者细胞器不重叠的区域。
实例6.通过蛋白质增强的融合去核细胞递送线粒体
将如实例3中所描述产生和组合的融合细胞在沉积于成像培养皿中之后24小时在Zeiss LSM 780倒置共聚焦显微镜上以63×放大率成像。对仅单独表达Mito-DsRed和单独表达Mito-GFP的细胞分别成像以配置采集设置，以此方式确保在同时存在和采集Mito-DsRed和Mito-GFP的条件下，两个通道之间没有信号重叠。以完全无偏的方式选择十个所关注区域，唯一的标准是每个ROI内含有最少10个细胞，使得最小数目个细胞可用于下游分析。如果这些图像中的给定像素的任一通道(mito-DsRed和mito-GFP)的强度大于所有三个ROI中每个各别通道的最大强度值的10％，那么就将其确定为对于线粒体呈阳性。
将基于以下标准鉴别细胞器递送的融合事件：基于上文指示的阈值，细胞中>50％的线粒体(通过为mito-GFP+或mito-Ds-Red+的所有像素鉴别)对于mitoDs-Red和mito-GFP均呈阳性，其将表明含有这些蛋白质的细胞器(在这种情况下为线粒体)被递送、融合并且其内容物被掺混。在24小时的时间点，预期多个细胞展现通过融合的阳性细胞器递送。
实例7：通过核酸电穿孔产生融合剂脂质体
这一实例描述通过用编码融合剂的核酸(例如mRNA或DNA)对细胞或囊泡进行电穿孔来产生融合剂脂质体。
将包含嘌呤霉素抗性基因的开放阅读框连同克隆片段的开放阅读框的转座酶载体(系统生物科学公司(System Biosciences,Inc.))(例如来自水泡性口炎病毒的糖蛋白[VSV-G]，Oxford Genetics编号OG592)使用电穿孔器(Amaxa)和293T细胞系特异性核转染试剂盒(龙沙(Lonza))电穿孔到293Ts中。
在含有20％胎牛血清和1×青霉素/链霉素的DMEM中用1μg/μL嘌呤霉素选择3-5天后，细胞然后用1×PBS，冰冷的溶解缓冲液(150mM NaCl、0.1％Triton X-100、0.5％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、50mM Tris-HCl，pH 8.0和蛋白酶抑制剂混合液(艾碧康(Abcam)，ab201117))洗涤，超声处理3次，每次10-15秒，并且以16,000x g离心20分钟。用针对VSV-G具有特异性的探针对回收的上清液洗脱份进行蛋白质印迹，以确定来自由稳定转染的细胞或对照细胞制备的融合剂脂质体的VSV-G的非膜特异性浓度并且相比于VSV-G蛋白的标准。
在实施例中，来自稳定转染的细胞的融合剂脂质体将比由未被稳定转染的细胞产生的融合剂脂质体具有更多的VSV-G。
实例8：通过蛋白质电穿孔产生融合剂脂质体
这一实例描述融合剂电穿孔以产生融合剂脂质体。
使用电穿孔转染系统(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))将大致5×106个细胞或囊泡用于电穿孔。为了形成预混液，将24μg纯化的蛋白质融合剂添加到再悬浮缓冲液(提供于试剂盒中)中。将混合物在室温下培育10分钟。同时，将细胞或囊泡转移到无菌试管中并且在500×g下离心5分钟。吸出上清液并将球粒再悬浮于1mL不含Ca2+和Mg2+的PBS中。具有融合剂的缓冲液然后用于再悬浮细胞或囊泡的球粒。细胞或囊泡悬浮液还用于优化条件，其在脉冲电压、脉冲宽度和脉冲数方面不同。在电穿孔之后，将具有融合剂的电穿孔细胞或囊泡用PBS洗涤，再悬浮于PBS中，并且保持于冰上。
参见例如Liang等人,通过Cas9蛋白转染进行快速高效的哺乳动物细胞工程改造(Rapid and highly efficiency mammalian cell engineering via Cas9 proteintransfection),《生物技术杂志(Journal of Biotechnology)》208:44-53,2015。
实例9：通过囊泡形成和离心产生和分离融合剂脂质体
这一实例描述通过囊泡化和离心来产生和分离融合剂脂质体。这是可以分离融合剂脂质体的方法之一。
如下制备融合剂脂质体。将大致4×106个HEK-293T细胞在10cm培养皿中接种于完全培养基(DMEM+10％FBS+Pen/Strep)中。在接种之后一天，将15μg融合剂表达质粒或病毒递送到细胞。在融合剂表达的足够时段之后，将培养基用补充有100μM ATP的新制培养基小心地替换。在融合剂表达之后48-72小时收获上清液，通过过滤通过0.45μm过滤器澄清，并且在150,000×g下超速离心1小时。将球粒化材料再悬浮于冰冷的PBS中过夜。将融合剂脂质体再悬浮于所需的缓冲液中以进行实验。
参见例如Mangeot等人,《分子疗法(Molecular Therapy)》,第19卷第9期,1656-1666,2011年9月
实例10：产生和分离巨质膜融合剂脂质体
这一实例描述通过囊泡化和离心来产生和分离融合剂脂质体。这是可以分离融合剂脂质体的方法之一。如下制备融合剂脂质体。
简单来说，将表达融合剂的HeLa细胞在缓冲液(10mM HEPES、150mM NaCl、2mMCaCl2，pH 7.4)中洗涤两次，再悬浮于溶液(1mM DTT、12.5mM三聚甲醛和1mM N-乙基顺丁烯二酰亚胺于GPMV缓冲液中)中，并且在37℃下培育1小时。通过首先在100×g下离心10分钟来去除细胞，并且然后在4℃下在20,000×g下收获融合剂脂质体1小时而从细胞澄清融合剂脂质体。将融合剂脂质体再悬浮于所需的缓冲液中以进行实验。
参见例如Sezgin E等人使用巨膜血浆囊泡阐明膜结构和蛋白质特性(Elucidating membrane structure and protein behavior using giant membraneplasma vesicles.)《自然实验手册(Nat.Protocols.)》7(6):1042-51 2012。
实例11：产生和分离融合剂脂质体影
这一实例描述通过低渗处理和离心来产生和分离融合剂脂质体。这是可以产生融合剂脂质体的方法之一。
首先，主要通过使用低渗处理将融合剂脂质体从表达融合剂的间质干细胞(109个细胞)分离，使得细胞破裂并且形成融合剂脂质体。将细胞再悬浮于低渗溶液，Tris-镁缓冲液(TM，例如pH 7.4或pH 8.6，在40℃下，用HCl调节pH)中。通过相差显微镜来监测细胞溶胀。一旦细胞溶胀并且形成融合剂脂质体，将悬浮液置放于均质机中。通常，约95％细胞破裂为足够的，如通过细胞计数和标准AOPI染色所测量。然后将膜/融合剂脂质体置放于蔗糖(0.25M或更高)中进行保存。替代地，融合剂脂质体融合剂脂质体由所属领域中已知的溶解细胞的其它方法形成，如轻度超声处理(《Arkhiv anatomii,gistologii i embriologii》；1979年8月,77(8)5-13；PMID:496657)、冻融(《自然(Nature.)》1999年12月2日；402(6761):551-5；PMID:10591218)、弗氏压碎(French-press)(《酶学方法(Methods inEnzymology)》,第541卷,2014,第169-176页；PMID:24423265)、针传代(www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/nuclear-protein-extraction.html)或在含清洁剂的溶液中增溶(3}www.thermofisher.com/order/catalog/product/89900)。
为了避免粘附，将融合剂脂质体置放于塑料管中并且离心。产生层压的球粒，其中最顶部的浅灰色薄层包含大部分融合剂脂质体。但是，整个球粒被加工以增加产率。可以重复离心(例如在4℃下以3,000rpm持续15分钟)和洗涤(例如20体积的Tris镁/TM-蔗糖pH7.4)。
在下一步骤中，通过以不连续的蔗糖密度梯度浮选来分离融合剂脂质体洗脱份。洗涤的球粒残留少量过剩的上清液，所述球粒现在包含融合剂脂质体、细胞核和不完全破裂的全细胞。向悬浮液添加额外含60％w/w蔗糖的TM，pH 8.6，以在折射计上得到45％蔗糖的读数。在这一步骤之后，所有溶液都为TM pH 8.6。将15mL悬浮液置放于SW-25.2硝酸纤维素管中并且通过分别添加40％和35％w/w蔗糖的15mL层，并且然后添加5mL TM-蔗糖(0.25M)而在悬浮液上形成不连续梯度。然后将样品在4℃下以20,000rpm离心10分钟。细胞核沉淀物形成球粒，在40％-45％界面处收集不完全破裂的全细胞，并且在35％-40％界面处收集融合剂脂质体。收集并且合并来自多个管的融合剂脂质体。参见例如国际专利公开案WO2011024172A2。
实例12：通过挤压产生融合剂脂质体
这一实例描述通过挤压通过膜来制造融合剂脂质体。
简单来说，表达融合剂的造血干细胞在37℃悬浮液中，在含有蛋白酶抑制剂混合液(Set V，Calbiochem 539137-1ML)的无血清培养基中的密度为1×106个细胞/毫升。用鲁尔锁(luer lock)注射器吸出细胞并且通过一次性5mm针筒过滤器一次传递到清洁的管中。如果膜结垢并且变得堵塞，那么将其放在一边并且附接新的过滤器。在整个细胞悬浮液穿过过滤器之后，使5mL无血清培养基穿过用于所述过程的所有过滤器，以洗涤通过一个或多个过滤器的任何残留物质。溶液然后与挤出的融合剂脂质体在滤液中组合。
融合剂脂质体可以通过遵循相同方法以介于5mm到0.2mm范围内的越来越小的过滤器孔隙大小继续挤压而进一步减小直径。当完成最终挤压时，悬浮液通过离心(所需的时间和速度因大小而异)球粒化并且再悬浮于培养基中。
另外，这一过程可以使用肌动蛋白细胞骨架抑制剂来补充，以减少现有细胞骨架结构对挤压的影响。简单来说，将1×106个细胞/毫升悬浮液在具有500nM Latrunculin B(ab144291，马萨诸塞州剑桥的艾碧康(Abcam,Cambridge,MA))的无血清培养基中培育并且在37℃下在5％CO2存在下培育30分钟。在培育之后，添加蛋白酶抑制剂混合液并且将细胞抽吸到鲁尔锁注射器中，如先前所描述地进行挤压。
将融合剂脂质体球粒化并且在PBS中洗涤一次以去除细胞骨架抑制剂，随后再悬浮于培养基中。
实例13：通过蛋白质化学处理产生融合剂脂质体
这一实例描述化学介导的融合剂递送以产生融合剂脂质体。大致5×106个细胞或囊泡用于化学介导的融合剂递送。将细胞或囊泡悬浮于50μL的Opti-MEM培养基中。为了形成预混液，将24μg纯化的蛋白质融合剂与25μL的Opti-MEM培养基混合，接着添加25μL含有2μL脂质转染试剂3000的Opti-MEM。通过轻轻地旋转培养板并且在37℃下培育6小时来混合细胞或囊泡和融合剂溶液，使得融合剂将被并入细胞或囊泡膜中。然后将融合剂脂质体用PBS洗涤，再悬浮于PBS中并且保持于冰上。
也参见Liang等人,通过Cas9蛋白转染进行快速高效的哺乳动物细胞工程改造,《生物技术杂志》208:44-53,2015。
实例14：通过用含融合剂的脂质体处理来产生融合剂脂质体
这一实例描述脂质体介导的融合剂递送到源细胞以产生融合剂脂质体。大致5×106个细胞或囊泡用于脂质体介导的融合剂递送。将细胞或囊泡悬浮于50μL的Opti-MEM培养基中。融合剂蛋白在正辛基b-D-吡喃葡萄糖苷存在下从细胞纯化。正辛基b-D-吡喃葡萄糖苷为用于溶解整合膜蛋白的温和的清洁剂。然后通过混合正辛基b-D-吡喃葡萄糖苷悬浮的蛋白质与用正辛基b-D-吡喃葡萄糖苷预饱和的大(400nm直径)单层囊泡(LUV)，接着去除正辛基b-D-吡喃葡萄糖苷而将融合剂蛋白复原成LUV，如Top等人,《欧洲分子生物学学会(EMBO)》24:2980-2988,2005中所描述。为了形成预混液，将含有24μg总融合剂蛋白的大量脂质体与50μL的Opti-MEM培养基混合。然后将脂质体和源细胞或囊泡的溶液合并，并且通过轻轻地旋转培养板并在允许含融合剂的脂质体和源细胞或囊泡融合的条件下在37℃下培育6小时来混合整个溶液，使得融合剂蛋白将被并入源细胞或囊泡膜中。然后将融合剂脂质体用PBS洗涤，再悬浮于PBS中并且保持于冰上。也参见Liang等人,通过Cas9蛋白转染进行快速高效的哺乳动物细胞工程改造,《生物技术杂志》208:44-53,2015。
实例15：分离从细胞自由释放的融合微囊泡
这一实例描述通过离心分离融合剂脂质体。这是可以分离融合剂脂质体的方法之一。
通过差速离心从表达融合剂的细胞分离融合剂脂质体。首先通过在>100,000×g下超速离心1小时来使培养基(DMEM+10％胎牛血清)澄清不含小粒子。澄清的培养基然后用于生长表达融合剂的小鼠胚胎成纤维细胞。通过以200×g离心10分钟而使细胞与培养基分离。收集上清液并且依序以500×g离心10分钟两次、以2,000×g离心15分钟一次、以10,000×g离心30分钟一次以及以70,000×g离心60分钟一次。在最终离心步骤期间将自由释放的融合剂脂质体球粒化、再悬浮于PBS中并且以70,000×g再球粒化。将最终球粒再悬浮于PBS中。
另外参见Wubbolts R等人人类B细胞源性外泌体的蛋白质组学和生化分析：对其功能和多囊体形成的潜在影响(Proteomic and Biochemical Analyses of Human BCell-derived Exosomes:Potential Implications for their Function andMultivesicular Body Formation.)《生物化学杂志》278:10963-10972 2003。
实例16：融合剂脂质体的物理去核
这一实例描述通过细胞骨架灭活和离心来对融合剂脂质体进行去核。这是可以修饰融合剂脂质体的方法之一。
从表达融合剂的哺乳动物初级或永生化细胞系分离融合剂脂质体。通过用肌动蛋白骨架抑制剂处理和超速离心来使细胞去核。简单来说，收集C2C12细胞、球粒化并且再悬浮于含有12.5％Ficoll 400(F2637，密苏里州圣路易斯的西格玛(Sigma,St.Louis MO))和500nM Latrunculin B(ab144291，马萨诸塞州剑桥的艾碧康)的DMEM中并在37°℃+5％CO2下培育30分钟。将悬浮液小心地层铺到含有增加浓度的DMEM于Ficoll 400中的溶液(15％、16％、17％、18％、19％、20％，每层3mL)的超速离心管中，所述溶液已在5％CO2存在下在37°℃下平衡过夜。将Ficoll梯度液在37℃下在Ti-70转子(加利福尼亚州布瑞亚市的贝克曼-库尔特(Beckman-Coulter,Brea,CA))中以32,300RPM旋转60分钟。在超速离心之后，将发现于16％-18％之间的Ficoll的融合剂脂质体去除，用DMEM洗涤并且再悬浮于DMEM中。
如实例35中所描述地关于核含量用Hoechst 33342染色，接着使用流式细胞测量术和/或将进行成像以确认细胞核的射出。
实例17：通过照射修饰融合剂脂质体
以下实例描述用γ照射修饰融合剂脂质体。不受理论束缚，γ照射可以引起DNA中的双链断裂并且驱动细胞经历凋亡。
首先，在汇合密度以下在组织培养瓶或培养板上的单层中培养表达融合剂的细胞(例如通过培养或接种细胞)。然后从汇合瓶中去除培养基，用不含Ca2+和Mg2+的HBSS冲洗细胞，并且使其胰蛋白酶化以从培养基质中去除细胞。然后将细胞球粒再悬浮于10ml不含青霉素/链霉素的组织培养基中并且转移到100mm皮氏培养皿(Petri dish)中。球粒中的细胞数应等于将自150cm2烧瓶上的10-15次汇合MEF培养物获得的细胞数。细胞然后暴露于来自γ辐射源的4000rads以产生融合剂脂质体。然后洗涤融合剂脂质体并且再悬浮于待使用的最终缓冲液或培养基中。
实例18：通过化学处理来修饰融合剂脂质体
以下实例描述用丝裂霉素C处理来修饰融合剂脂质体。不受任何具体理论束缚，丝裂霉素C处理通过灭活细胞周期来修饰融合剂脂质体。
首先，在汇合密度下从组织培养瓶或培养板中的单层培养表达融合剂的细胞(例如通过培养或接种细胞)。将1mg/mL丝裂霉素C储备溶液添加到培养基以达到10μg/mL的最终浓度。然后使培养板返回到培育箱中2到3小时。然后从汇合瓶中去除培养基，用不含Ca2+和Mg2+的HBSS冲洗细胞，并且使其胰蛋白酶化以从培养基质中去除细胞。然后洗涤细胞并且再悬浮于待使用的最终缓冲液或培养基中。
参见例如小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)喂养细胞制备(Mouse Embryo Fibroblast(MEF)Feeder Cell Preparation),《现代分子生物学实验技术(Current Protocols inMolecular Biology)》。David A.Conner 2001。
实例19：融合剂脂质体中缺乏转录活性
这一实例定量相比于用于融合剂脂质体产生的亲本细胞(例如源细胞)，融合剂脂质体中的转录活性。在一些实施例中，相比于亲本细胞(例如源细胞)，融合剂脂质体中的转录活性将较低或不存在的。
融合剂脂质体为递送治疗剂的基础。可以高效率递送到细胞或局部组织环境的治疗剂(如miRNA、mRNA、蛋白质和/或细胞器)可以用于调控在接受者组织中通常不活跃或在病理性低或高水平下不活跃的路径。在一些实施例中，融合剂脂质体不能转录，或融合剂脂质体的转录活性小于其亲本细胞的观察结果将证实已充分发生了核物质的去除。
通过前述实例中所描述的方法中的任一种来制备融合剂脂质体。然后在37℃和5％CO2下持续1小时将足够数目的融合剂脂质体和用于产生融合剂脂质体的亲本细胞在6孔低附着多孔培养板中接种到含有20％胎牛血清、1×青霉素/链霉素和可荧光标记的炔烃-核苷EU的DMEM中。对于阴性对照，也将足够数目的融合剂脂质体和亲本细胞在多孔培养板中接种于含有20％胎牛血清、1×青霉素/链霉素但不具有炔烃-核苷EU的DMEM中。
在1小时培育之后，按照制造商的成像试剂盒(赛默飞世尔科技)说明书对样品进行处理。将包含阴性对照的细胞和融合剂脂质体样品用1×PBS缓冲液洗涤三次并且再悬浮于1×PBS缓冲液中并通过流式细胞测量术(美国加利福尼亚州圣何塞的百克顿-迪金森公司(Becton Dickinson,San Jose,CA,USA))，使用488nm氩气激光激发，以及530+/-30nm发射进行分析。BD FACSDiva软件用于采集和分析。将光散射通道设定为线性增益，并将荧光通道设定为对数标度，其中在每种条件下分析最少10,000个细胞。
在一些实施例中，由于省略了炔烃-核苷EU，阴性对照中如根据530+/-30nm发射所测量的转录活性将为零。在一些实施例中，相比于亲本细胞，融合剂脂质体的转录活性将为小于约70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％或更小。
也参见《美国国家科学院院刊》,2008年10月14日；105(41):15779-84.doi:10.1073/pnas.0808480105.电子版2008年10月7日。
实例20：缺乏DNA复制或复制活性
这一实例定量融合剂脂质体中的DNA复制。在一些实施例中，相比于细胞，融合剂脂质体将以低速率复制DNA。
通过前述实例中所描述的方法中的任一种来制备融合剂脂质体。通过并入可荧光标记的核苷酸(赛默飞世尔科技编号C10632)来评估融合剂脂质体和亲本细胞DNA复制活性。在用二甲亚砜制备EdU储备溶液之后，将融合剂脂质体和相等数目的细胞与EdU以10μM的最终浓度一起培育2小时。样品然后使用3.7％PFA固定15分钟，用1×PBS缓冲液，pH 7.4洗涤并且在0.5％清洁剂于1×PBS缓冲液，pH 7.4中的溶液中渗透15分钟。
在渗透之后，将悬浮于含有0.5％洗涤剂的PBS缓冲液中的融合剂脂质体和细胞用1×PBS缓冲液，pH 7.4洗涤并且在21℃下在反应混合液、1×PBS缓冲液、CuSO4(组分F)、叠氮化物-荧光剂488、1×反应缓冲液添加剂中培育30分钟。
用与上文相同地处理但在1×反应混合液中没有叠氮化物-荧光剂488的样品制得融合剂脂质体和细胞DNA复制活性的阴性对照。
然后将细胞和融合剂脂质体样品洗涤并且再悬浮于1×PBS缓冲液中并通过流式细胞测量术分析。用FACS细胞仪(美国加利福尼亚州圣何塞的百克顿-迪金森公司)以488nm氩气激光激发进行流式细胞测量术，并且收集530+/-30nm发射光谱。FACS分析软件用于采集和分析。将光散射通道设定为线性增益，并将荧光通道设定为对数标度，其中在每种条件下分析最少10,000个细胞。基于每个样品中叠氮化物-荧光剂488的中值强度来计算相对DNA复制活性。在正向和侧向散射通道中捕获所有事件(替代地，可以应用门来仅选择融合剂脂质体群体)。通过从融合剂脂质体的中值荧光强度值减去对应阴性对照样品的中值荧光强度值来确定融合剂脂质体的标准化荧光强度值。然后将融合剂脂质体样品的标准化相对DNA复制活性相对于对应有有核细胞样品进行标准化，以便产生DNA复制活性的定量测量结果。
在一些实施例中，融合剂脂质体的DNA复制活性低于亲本细胞。
也参见Salic,2415-2420,doi:10.1073/pnas.0712168105。
实例21：用核酸货物电穿孔以修饰融合剂脂质体
这一实例描述用核酸货物对融合剂脂质体进行电穿孔。
通过前述实例中所描述的方法中的任一种来制备融合剂脂质体。将大致109个融合剂脂质体和1μg核酸(例如RNA)在电穿孔缓冲液(1.15mM磷酸钾pH 7.2、25mM氯化钾、60％碘克沙醇w/v于水中)中混合。使用单一4mm比色管，使用电穿孔系统(伯乐(BioRad),165-2081)对融合剂脂质体进行电穿孔。将融合剂脂质体和核酸在400V、125μF和∞欧姆下电穿孔，并且将比色管立即转移到冰上。在电穿孔之后，将融合剂脂质体用PBS洗涤，再悬浮于PBS中，并且保持于冰上。
参见例如Kamerkar等人,外泌体有助于胰腺癌中致癌性KRAS的治疗靶向(Exosomes facilitate therapeutic targeting of oncogenic KRAS in pancreaticcancer),《自然》,2017
实例22：用蛋白质货物电穿孔以修饰融合剂脂质体
这一实例描述用蛋白质货物对融合剂脂质体进行电穿孔。
通过前述实例中所描述的方法中的任一种来制备融合剂脂质体。使用电穿孔转染系统(赛默飞世尔科技)将大致5×106个融合剂脂质体用于电穿孔。为了形成预混液，将24μg纯化的蛋白质货物添加到再悬浮缓冲液(提供于试剂盒中)中。将混合物在室温下培育10分钟。同时，将融合剂脂质体转移到无菌试管中并且在500×g下离心5分钟。吸出上清液并且将球粒再悬浮于1mL不含Ca2+和Mg2+的PBS中。然后将具有蛋白质货物的缓冲液用于再悬浮的融合剂脂质体的球粒。融合剂脂质体悬浮液然后用于优化条件，其在脉冲电压、脉冲宽度和脉冲数方面不同。在电穿孔之后，将融合剂脂质体用PBS洗涤，再悬浮于PBS中，并且保持于冰上。
参见例如Liang等人,通过Cas9蛋白转染进行快速高效的哺乳动物细胞工程改造,《生物技术杂志》208:44-53,2015。
实例23：化学处理融合剂脂质体以用核酸货物修饰
这一实例描述通过化学处理将核酸货物装载到融合剂脂质体中。
通过前述实例中所描述的方法中的任一种来制备融合剂脂质体。通过在4℃下以10,000g离心5分钟使大致106个融合剂脂质体球粒化。然后将球粒化的融合剂脂质体再悬浮于具有20μg DNA的TE缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.1mM EDTA)中。将融合剂脂质体:DNA溶液用温和的清洁剂处理以提高DNA在整个融合剂脂质体膜中的渗透率(试剂B，科斯莫生物有限公司(Cosmo Bio Co.,LTD)，目录号ISK-GN-001-EX)。将溶液再次离心并且将球粒再悬浮于具有带正电的肽，如硫酸鱼精蛋白的缓冲液中，以增加载有DNA的融合剂脂质体与靶接受者细胞之间的亲和力(试剂C，科斯莫生物有限公司，目录号ISK-GN-001-EX)。在DNA装载之后，将装载的融合剂脂质体在使用之前保持于冰上。
也参见Kaneda,Y.等人,药物递送的新载体创新：融合型非病毒粒子的开发(Newvector innovation for drug delivery:development of fusigenic non-viralparticles.)《当代药物靶标(Curr.Drug Targets)》，2003
实例24：化学处理融合剂脂质体以用蛋白质货物修饰
这一实例描述通过化学处理将蛋白质货物装载到融合剂脂质体中。
通过前述实例中所描述的方法中的任一种来制备融合剂脂质体。通过在4℃下以10,000g离心5分钟使大致106个融合剂脂质体球粒化。然后将球粒化的融合剂脂质体再悬浮于具有带正电的肽，如硫酸鱼精蛋白的缓冲液中，以增加融合剂脂质体与货物蛋白质之间的亲和力(试剂A，科斯莫生物有限公司，目录号ISK-GN-001-EX)。随后，将10μg货物蛋白质添加到融合剂脂质体溶液中，接着添加温和的清洁剂以增加蛋白质在整个融合剂脂质体膜中的渗透率(试剂B，科斯莫生物有限公司，目录号ISK-GN-001-EX)。将溶液再次离心并且将球粒再悬浮于具有带正电的肽，如硫酸鱼精蛋白的缓冲液中，以增加装载有蛋白质的融合剂脂质体与靶接受者细胞之间的亲和力(试剂C，科斯莫生物有限公司，目录号ISK-GN-001-EX)。在蛋白质装载之后，将装载的融合剂脂质体在使用之前保持于冰上。
也参见Yasouka,E.等人,无针鼻内施用含过敏原的HVJ-E减轻了实验性过敏性鼻炎(Needleless intranasal administration of HVJ-E containing allergenattenuates experimental allergic rhinitis.)《分子医学杂志(J.Mol.Med.)》,2007
实例25：转染融合剂脂质体以用核酸货物修饰
这一实例描述将核酸货物转染到融合剂脂质体中。通过前述实例中所描述的方法中的任一种来制备融合剂脂质体。
将5×106个融合剂脂质体维持于Opti-Mem中。将0.5μg核酸与25μL的Opti-MEM培养基混合，接着添加25μL含有2μL脂质转染试剂2000的Opti-MEM。将核酸、Opti-MEM和脂质转染试剂的混合物维持在室温下15分钟，然后添加到融合剂脂质体中。整个溶液通过轻轻地旋转培养板并且在37℃下培育6小时而混合。然后将融合剂脂质体用PBS洗涤，再悬浮于PBS中并且保持于冰上。
也参见Liang等人,通过Cas9蛋白转染进行快速高效的哺乳动物细胞工程改造,《生物技术杂志》208:44-53,2015。
实例26：转染融合剂脂质体以用蛋白质货物修饰
这一实例描述将蛋白质货物转染到融合剂脂质体中。
通过前述实例中所描述的方法中的任一种来制备融合剂脂质体。将5×106个融合剂脂质体维持于Opti-Mem中。将0.5μg纯化蛋白与25μL的Opti-MEM培养基混合，接着添加25μL含有2μL脂质转染试剂3000的Opti-MEM。将蛋白质、Opti-MEM和脂质转染试剂的混合物维持在室温下15分钟，然后添加到融合剂脂质体中。整个溶液通过轻轻地旋转培养板并且在37℃下培育6小时而混合。然后将融合剂脂质体用PBS洗涤，再悬浮于PBS中并且保持于冰上。
也参见Liang等人,通过Cas9蛋白转染进行快速高效的哺乳动物细胞工程改造,《生物技术杂志》208:44-53,2015。
实例27：具有脂质双层结构的融合剂脂质体
这一实例描述融合剂脂质体的组合物。在一些实施例中，融合剂脂质体组合物将包括在中心具有内腔的脂质双层结构。
不希望受理论束缚，融合剂脂质体的脂质双层结构促进与靶细胞的融合，并且允许融合剂脂质体装载不同的治疗剂。
使用前述实例中所描述的方法来新制融合剂脂质体。阳性对照为天然细胞系(HEK293)，并且阴性对照为冷的DPBS和膜破裂的HEK293细胞制剂，其已穿过36号针50次。
将样品在埃彭道夫管(Eppendorf tube)中短暂离心，并且小心地去除上清液。然后将预温热的固定液(2.5％戊二醛于0.05M二甲胂酸盐与0.1M NaCl的缓冲液，pH 7.5中；使用前保持于37℃下30分钟)添加到样品球粒中并且保持在室温下20分钟。在固定之后，将样品用PBS洗涤两次。将四氧化锇溶液添加到样品球粒中并且培育30分钟。在用PBS冲洗一次之后，添加30％、50％、70％和90％己二醇并涡旋洗涤，每次15分钟。然后涡旋添加100％己二醇3次，每次10分钟。
将树脂与己二醇以1:2的比组合，并且然后添加到样品中并在室温下培育2小时。在培育之后，将溶液用100％树脂替换并且培育4-6小时。用新制100％树脂再重复这一步骤一次。然后将其用100％新制树脂替换，将水平调节为约1-2mm深度，并且烘烤8-12小时。切开埃彭道夫管并且将与样品一起浇铸的环氧树脂片再烘烤16-24小时。然后将环氧树脂铸件切割成小块，记下具有细胞的一侧。使用市售的5分钟环氧胶将小片粘合到块上以进行切片。透射电子显微镜(美国约耳(JOEL,USA))用于在80kV的电压下对样品成像。
在一些实施例中，融合剂脂质体将展示与阳性对照(HEK293细胞)类似的脂质双层结构，并且在DPBS对照中未观察到明显的结构。在一些实施例中，在破坏的细胞制剂中将不会观察到内腔结构。
实例28：检测融合剂表达
这一实例定量融合剂脂质体中的融合剂表达。
将包含嘌呤霉素抗性基因的开放阅读框连同克隆片段的开放阅读框的转座酶载体(系统生物科学公司)(例如来自水泡性口炎病毒的糖蛋白[VSV-G]，Oxford Genetics编号OG592)使用电穿孔器(Amaxa)和293T细胞系特异性核转染试剂盒(龙沙)电穿孔到293Ts中。
在含有20％胎牛血清和1×青霉素/链霉素的DMEM中用1μg/μL嘌呤霉素选择3-5天后，通过前述实例中所描述的方法中的任一种由稳定表达的细胞系或由对照细胞制备融合剂脂质体。
然后将融合剂脂质体用1×PBS，冰冷的溶解缓冲液(150mM NaCl、0.1％Triton X-100、0.5％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、50mM Tris-HCl，pH 8.0和蛋白酶抑制剂混合液III(艾碧康，ab201117))洗涤，超声处理3次，每次10-15秒，并且以16,000x g离心20分钟。用针对VSV-G具有特异性的探针对回收的上清液洗脱份进行蛋白质印迹，以确定来自由稳定转染的细胞或对照细胞制备的融合剂脂质体的VSV-G的非膜特异性浓度并且相比于VSV-G蛋白的标准。
在一些实施例中，来自稳定转染的细胞的融合剂脂质体将比由未被稳定转染的细胞产生的融合剂脂质体具有更多的VSV-G。
实例29：融合剂的定量
这一实例描述每个融合剂脂质体中融合剂的绝对数的定量。
通过前述实例中所描述的方法中的任一种产生融合剂脂质体组合物，除了如前述实例中所描述地对融合剂脂质体进行工程改造以表达用GFP标记的融合剂(VSV-G)。另外，在不存在融合剂(VSV-G)或GFP的情况下对阴性对照融合剂脂质体进行工程改造。
随后如下分析具有GFP标记的融合剂的融合剂脂质体和一个或多个阴性对照的融合剂的绝对数。连续稀释商业上获得的重组GFP以产生蛋白质浓度的校准曲线。然后使用GFP光立方体(469/35激发滤光片和525/39发射滤光片)在荧光计中测量校准曲线和已知数量的融合剂脂质体的样品的GFP荧光，以计算融合剂脂质体制剂中GFP分子的平均摩尔浓度。然后将摩尔浓度转换为GFP分子的数目并且除以每个样品的融合剂脂质体数目，以获得每个融合剂脂质体的GFP标记的融合剂分子的平均数目，并且因此提供每个融合剂脂质体的融合剂数目的相对估算。
在一些实施例中，相比于其中不存在融合剂或GFP的阴性对照，具有GFP标签的融合剂脂质体中的GFP荧光将更高。在一些实施例中，GFP荧光是相对于存在的融合剂分子的数目。
替代地，根据制造商的说明书使用单一细胞制备系统(富鲁达(Fluidigm))分离个别融合剂脂质体，并且使用可商购的探针组(塔克曼(Taqman))和被设计成基于Ct值定量融合剂或GFP cDNA水平的预混液进行qRT-PCR。通过合成(Amsbio)产生与融合剂基因或GFP基因的克隆片段具有相同序列的RNA标准品，并且然后以连续稀释添加到单一细胞制备系统qRT-PCR实验反应，以建立Ct相对于融合剂或GFP RNA浓度的标准曲线。
将来自融合剂脂质体的Ct值与标准曲线进行比较以确定每个融合剂脂质体的融合剂或GFP RNA的量。
在一些实施例中，相比于其中不存在融合剂或GFP的阴性对照，被工程改造以表达融合剂的融合剂脂质体中的融合剂和GFP RNA将更高。
通过如先前所描述地分析脂质双层结构和如本文其它实例中所描述地通过LC-MS定量脂质双层中的融合剂，可以进一步定量脂质双层中的融合剂。
实例30：测量融合剂脂质体的平均直径
这一实例描述融合剂脂质体平均直径的测量。
通过前述实例中所描述的方法中的任一种来制备融合剂脂质体。使用市售的系统(iZON Science)测量融合剂脂质体以确定平均直径。将系统与软件(根据制造商的说明)和纳米孔一起使用，被设计成分析40nm到10μm直径范围内的粒子。将融合剂脂质体和亲本细胞再悬浮于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中以达到0.01-0.1μg蛋白质/mL的最终浓度范围。如下表中所指示地调节其它仪器设置：
表18：融合剂脂质体测量参数和设置
测量参数
设置
压力
6
纳米孔类型
NP300
校准样品
CPC400_6P
黄金标准分析
无
捕获助手
无
在分离后的2小时内分析所有融合剂脂质体。在一些实施例中，相比于亲本源细胞，融合剂脂质体的直径将在约1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大内。
实例31：测量融合剂脂质体的平均直径分布
这一实例描述融合剂脂质体直径分布的测量。
通过前述实例中所描述的方法中的任一种产生融合剂脂质体，并且使用如先前实例中所描述的市售系统进行测试以确定粒子的平均直径。在一些实施例中，将以围绕中值为中心的10％、50％和90％的融合剂脂质体的直径阈值与亲本细胞进行比较以评估融合剂脂质体直径分布。
在一些实施例中，融合剂脂质体将在10％、50％或90％的样品内具有亲本细胞的直径分布变化率的小于约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或更小。
实例32：融合剂脂质体的平均体积
这一实例描述融合剂脂质体平均体积的测量。不希望受理论所束缚，改变融合剂脂质体的大小(例如直径、体积、表面积等)可以使其对于不同的货物装载、治疗设计或应用为通用的。
如前述实例中所描述地制备融合剂脂质体。阳性对照为HEK293细胞或具有已知大小的聚苯乙烯珠粒。阴性对照为穿过36号针大致50次的HEK293细胞。
如前述实例中所描述的用透射式电子显微镜分析用于确定融合剂脂质体的大小。测量融合剂脂质体的直径并且然后计算体积。
在一些实施例中，融合剂脂质体将具有大致50nm或更大直径的平均大小。
实例33：融合剂脂质体的平均密度
通过如Théry等人,《细胞生物学实验指南(Curr Protoc Cell Biol.)》2006年4月；第3章：第3.22节中所描述的连续蔗糖梯度离心分析来测量融合剂脂质体密度。如前述实例中所描述地获得融合剂脂质体。
首先，制备蔗糖梯度。分别通过混合4mL HEPES/蔗糖储备溶液和1mL HEPES储备溶液或0.5mL HEPES/蔗糖储备溶液和4.5mL HEPES储备溶液来产生2M和0.25蔗糖溶液。将这两个洗脱份装入关闭所有挡板的梯度仪中，2M蔗糖溶液在具有磁力搅拌棒的近端隔室中，并且0.25M蔗糖溶液在远端隔室中。将梯度仪置于磁性搅拌板上，打开近端与远端隔室之间的挡板并且打开磁性搅拌板。如下制得HEPES储备溶液：2.4g N-2-羟基乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES；最终20mM)，300H2O，用10N NaOH将pH调节到7.4并且最后用H2O将体积调节到500mL。如下制得HEPES/蔗糖储备溶液：2.4g羟基乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES；最终20mM)，428g无蛋白酶的蔗糖(ICN；最终2.5M)，150mL H2O，用10N NaOH将pH调节到7.4并且最后用H2O将体积调节到500mL。
将融合剂脂质体再悬浮于2mL HEPES/蔗糖储备溶液中并且倒入SW 41离心管的底部。将外管置放于SW 41管中，恰好在2mL融合剂脂质体的上方。打开外挡板，并且将连续的2M(底部)到0.25M(顶部)蔗糖梯度缓慢倒入融合剂脂质体的顶部上。SW 41管在倒入梯度时降低，以使得管始终略高于液体顶部。
所有具有梯度的管彼此平衡，或与具有相同重量的蔗糖溶液的其它管平衡。将梯度在4℃下在制动器设置于低位的SW 41旋转铲斗转子中以210,000×g离心过夜(≥14小时)。
使用微量移液器从上到下收集十一份1mL洗脱份并且置放于用于TLA-100.3转子的3mL管中。将样品放在一旁，并且在96孔培养板的单独孔中将50μl的每份洗脱份用于测量折射率。培养板用粘性箔覆盖以防止蒸发并且在室温下存储不超过1小时。折射计用于测量10μl到20μl的来自96孔培养板中存储的材料的每份洗脱份的折射率(因此测量蔗糖浓度和密度)。
在可从Beckman网站下载的超速离心目录中可获得将折射率转换为g/mL的表格。
然后制备每份洗脱份以进行蛋白质含量分析。将两毫升20mM HEPES，pH 7.4添加到每个1mL梯度洗脱份中，并且通过上下移液二到三次而混合。每个管的一侧标记有永久性标记，并且将管置放于TLA-100.3转子中，标记侧朝上。
将具有经稀释的洗脱份的3mL管在4℃下以110,000×g离心1小时。TLA-100.3转子容纳六个管，因此每个梯度进行两次离心，将其它管保持于4℃下知道其可以离心。
从每个3mL管吸出上清液，在球粒顶部留一滴。球粒很可能不可见，但可以从管上的标记推断出其位置。将不可见的球粒再悬浮并且转移到微量离心管。将每个再悬浮的洗脱份的一半用于通过二喹啉甲酸分析进行蛋白质含量分析，描述于另一实例中。这提供跨融合剂脂质体制剂的各个梯度洗脱份的分布。这个分布用于确定融合剂脂质体的平均密度。将另外一半体积的洗脱份存储于-80℃下并且一旦蛋白质分析揭露跨洗脱份的融合剂脂质体分布便用于其它目的(例如功能分析，或通过免疫分离进一步纯化)。
在一些实施例中，使用这一分析或等效物，包括多个融合剂脂质体的制剂的平均密度将为1.25g/mL+/-0.05标准差。在一些实施例中，制剂的平均密度将在1-1.1、1.05-1.15、1.1-1.2、1.15-1.25、1.2-1.3或1.25-1.35g/mL范围内。在一些实施例中，制剂的平均密度将小于1或大于1.35。
实例34：测量融合剂脂质体中的细胞器含量
这一实例描述检测融合剂脂质体中的细胞器。
如本文所描述地制备融合剂脂质体。为了检测内质网(ER)和线粒体，将融合剂脂质体或C2C12细胞用1μM ER染色剂(E34251，马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔)和1μM线粒体染色剂(M22426，马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔)染色。为了检测溶酶体，将融合剂脂质体或细胞用50nM溶酶体染色剂(L7526，马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔)染色。
将染色的融合剂脂质体在流式细胞仪(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔)上运行并且根据下表测量每种染料的荧光强度。通过比较染色的融合剂脂质体与未染色的融合剂脂质体(阴性对照)和染色的细胞(阳性对照)的荧光强度来验证细胞器的存在。
在去核后5小时，内质网(图1)、线粒体(图2)和溶酶体(图3)的融合剂脂质体染色呈阳性。
表19：融合剂脂质体染色
染色
Attune激光/滤光片
激光波长
发射滤光片(nm)
Hoechst 33342
VL1
405
450/40
ER-Tracker绿色
BL1
488
530/30
MitoTracker深红色FM
RL1
638
670/14
LysoTracker绿色
BL1
488
530/30
实例35：测量融合剂脂质体中的核含量
这一实例描述测量融合剂脂质体中的核含量。为了验证融合剂脂质体不含核，将融合剂脂质体用1μg·mL-1Hoechst 33342和1μM CalceinAM(C3100MP，马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔)染色并且将染色的融合剂脂质体在Attune NXT流式细胞仪(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔)上运行以根据下表确定每种染料的荧光强度。在一些实施例中，将通过比较染色的融合剂脂质体与未染色的融合剂脂质体和染色的细胞的平均荧光强度来验证存在胞质溶胶(CalceinAM)和不存在核(Hoechst 33342)。
表20：流式细胞仪设置
染色
Attune激光/滤光片
激光波长
发射滤光片(nm)
Hoechst 33342
VL1
405
450/40
Calcein AM
BL1
488
530/30
实例36：测量核包膜含量
这一实例描述测量去核的融合剂脂质体中的核包膜含量。核包膜从细胞的细胞质分离DNA。
在一些实施例中，经纯化的融合剂脂质体组合物包括已如本文所描述去核的哺乳动物细胞，如HEK-293T(293[HEK-293](CRL-1573TM)。这一实例描述不同核膜蛋白的定量，作为测量在融合剂脂质体产生之后剩余的完整核膜的量的代替。
在这个实例中，将10×106个HEK-293T和等量的由10×106个HEK-293T制备的融合剂脂质体用3.7％PFA固定15分钟，用1×PBS缓冲液，pH 7.4洗涤并且同时渗透，并且然后使用含有1％牛血清白蛋白和0.5％X-100的1×PBS缓冲液，pH 7.4阻断15分钟。在渗透之后，将融合剂脂质体和细胞与不同的一级抗体，例如(抗RanGAP1抗体[EPR3295](艾碧康-ab92360)、抗NUP98抗体[EPR6678]-核孔标记(艾碧康-ab124980)、抗核孔复合物蛋白抗体[Mab414]-(艾碧康-ab24609)、抗输入蛋白7抗体(艾碧康-ab213670)一起在4°℃下培育12小时，所述一级抗体以制造商建议的浓度在含有1％牛血清白蛋白和0.5％X-100的1×PBS缓冲液，pH 7.4中稀释。然后将融合剂脂质体和细胞用1×PBS缓冲液，pH 7.4洗涤，并且与适当的荧光二级抗体一起在21°℃下培育2小时，所述二级抗体检测先前指定的一级抗体，以制造商建议的浓度在含有1％牛血清白蛋白和0.5％清洗涤剂的1×PBS缓冲液，pH 7.4中稀释。然后将融合剂脂质体和细胞用1×PBS缓冲液洗涤，再悬浮于300μL含有1μg/mL Hoechst 33342的1×PBS缓冲液，pH 7.4中，通过20μm FACS管过滤并且通过流式细胞测量术分析。
阴性对照使用相同的染色程序产生，但不添加一级抗体。在FACS细胞仪(美国加利福尼亚州圣何塞的百克顿-迪金森公司)上以488nm氩气激光激发进行流式细胞测量术，并且收集530+/-30nm发射光谱。FACS采集软件用于采集和分析。将光散射通道设定为线性增益，并将荧光通道设定为对数标度，其中在每种条件下分析最少10,000个细胞。相对完整的核膜含量是基于每个样品中荧光的中值强度来计算。在正向和侧向散射通道中捕获所有事件。
通过从融合剂脂质体的中值荧光强度值减去对应阴性对照样品的中值荧光强度值来确定融合剂脂质体的标准化荧光强度值。然后将融合剂脂质体样品的标准化荧光相对于对应有核细胞样品进行标准化，以产生完整核膜含量的定量测量结果。
在一些实施例中，相比于有核亲本细胞，去核的融合剂脂质体将包括小于1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％荧光强度或核包膜含量。
实例37：测量染色质水平
这一实例描述测量去核的融合剂脂质体中的染色质。
DNA可以浓缩成染色质以使其在细胞核内适合。在一些实施例中，通过本文所描述的方法中的任一种产生的纯化融合剂脂质体组合物将包括低水平的染色质。
使用具有针对组蛋白H3或组蛋白H4具有特异性的抗体的ELISA分析通过先前所描述的方法中的任一种制备的去核的融合剂脂质体和阳性对照细胞(例如亲本细胞)的染色质含量。组蛋白为染色质的主要蛋白质组分，并且H3和H4为主要的组蛋白。
使用商业试剂盒(例如艾碧康组蛋白提取试剂盒(ab113476))或所属领域中已知的其它方法从融合剂脂质体制剂和细胞制剂提取组蛋白。将这些等分试样存储在-80℃下直到使用。通过在分析缓冲液的溶液中将纯化的组蛋白(H3或H4)稀释为1ng/μL到50ng/μL来制备标准连续稀释液。分析缓冲液可以来源于由制造商供应的试剂盒(例如艾碧康组蛋白H4总定量试剂盒(ab156909)或艾碧康组蛋白H3总定量试剂盒(ab115091))。将分析缓冲液添加到涂布有抗组蛋白H3或抗H4抗体的48孔培养板或96孔培养板的每个孔，并且将样品或标准对照物添加到孔以使每个孔的总体积达到50μL。然后将培养板覆盖并且在37℃下培育90分钟到120分钟。
在培育之后，制备结合到与培养板连接的抗组蛋白抗体的任何组蛋白以进行检测。吸出上清液并且将培养板用150μL洗涤缓冲液洗涤。然后将包含抗组蛋白H3或抗H4捕获抗体的捕获缓冲液以50μL的体积和1μg/mL的浓度添加到培养板。然后将培养板在室温下在定轨振荡器上培育60分钟。
然后，将培养板吸出并且使用洗涤缓冲液洗涤6次。然后将可被捕获抗体活化的信号报告分子添加到每个孔。将培养板覆盖并且在室温下培育30分钟。然后将培养板吸出并且使用洗涤缓冲液洗涤4次。通过添加终止溶液来终止反应。读取培养板中的每个孔在450nm处的吸光度，并且根据450nm处的吸光度相对于标准样品中组蛋白的浓度的标准曲线计算每个样品中组蛋白的浓度。
在一些实施例中，融合剂脂质体样品将包括有核亲本细胞的组蛋白浓度的小于1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
实例38：测量融合剂脂质体中的DNA含量
这一实例描述相对于有核对应物的融合剂脂质体中的DNA量的定量。在一些实施例中，融合剂脂质体将具有比有核对应物少的DNA。通过测量总DNA或特定管家基因的水平来确定核酸水平。在一些实施例中，具有减少的DNA含量或基本上缺少DNA的融合剂脂质体将不能复制、分化或转录基因，确保当向受试者施用时其剂量和功能不改变。
通过前述实例中所描述的方法中的任一种来制备融合剂脂质体。如根据融合剂脂质体和源细胞的蛋白质所测量的相同质量的制剂用于分离总DNA(例如使用试剂盒，如Qiagen DNeasy目录号69504)，接着使用标准光谱法测定DNA浓度，以评估DNA的吸光度(例如使用Thermo Scientific NanoDrop)。
在一些实施例中，去核的融合剂脂质体中的DNA的浓度将为亲本细胞中的小于约50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％或更小。
替代地，可以使用半定量实时PCR(RT-PCR)在有核细胞与融合剂脂质体之间比较特定管家基因(如GAPDH)的浓度。从亲本细胞和融合剂脂质体分离总DNA并且如本文所描述地测量DNA浓度。使用以下反应模板用PCR试剂盒(应用生物系统公司(AppliedBiosystems)，目录号4309155)进行RT-PCR：
正向和反向引物是获自Integrated DNA Technologies。下表详述引物对和其相关序列：
表21：引物序列
实时PCR系统(应用生物系统公司)用于通过以下方案进行扩增和检测：
变性，94℃ 2分钟
以下顺序的40个循环：
变性，94℃ 15秒
结合，延伸，60℃ 1分钟
用GAPDH DNA的连续稀释液制备Ct相对于DNA浓度的标准曲线并且用于将来自融合剂脂质体PCR结果的Ct核值标准化为DNA的特定量(ng)。
在一些实施例中，去核的融合剂脂质体中的GAPDH DNA的浓度将为亲本细胞中的小于约50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％或更小。
实例39：测量融合剂脂质体中的miRNA含量
这一实例描述融合剂脂质体中的微RNA(miRNA)的定量。在一些实施例中，融合剂脂质体包括miRNA。
miRNA为控制信使RNA(mRNA)翻译成蛋白质的速率(以及其它活动)的调节元件。在一些实施例中，携带miRNA的融合剂脂质体可以用于将miRNA递送到靶位点。
通过前述实例中所描述的方法中的任一种来制备融合剂脂质体。如先前所描述地制备来自融合剂脂质体或亲本细胞的RNA。至少一个miRNA基因是选自www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/index.shtml处的Sanger Center miRNA Registry。如Chen等人,《核酸研究》,33(20),2005中所描述地制备miRNA。通过赛默飞世尔r(A25576，马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham,MA))可获得所有TaqMan miRNA分析。
根据制造商的说明书对miRNA cDNA进行qPCR，并且使用实时PCR系统如本文所描述地产生和分析CT值。
在一些实施例中，融合剂脂质体的miRNA含量将为其亲本细胞的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。
实例40：定量融合剂脂质体中的内源性RNA或合成RNA的表达
这一实例描述定量具有改变的表达的内源性RNA或在融合剂脂质体中表达的合成RNA的水平。
融合剂脂质体或亲本细胞被工程改造以改变介导融合剂脂质体的细胞功能的内源性或合成RNA的表达。
转座酶载体(系统生物科学公司)包含嘌呤霉素抗性基因的开放阅读框连同蛋白质药剂的克隆片段的开放阅读框。使用电穿孔器(Amaxa)和293T细胞系特异性核转染试剂盒(龙沙)将载体电穿孔到293T中。
在含有20％胎牛血清和1×青霉素/链霉素的DMEM中用嘌呤霉素选择3-5天后，通过前述实例中所描述的方法中的任一种由稳定表达的细胞系制备融合剂脂质体。
如先前实例中所描述地分离个别融合剂脂质体并且定量每个融合剂脂质体的蛋白质药剂或RNA。
在一些实施例中，融合剂脂质体将具有每个融合剂脂质体至少1、2、3、4、5、10、20、50、100、500、103、5.0×103、104、5.0×104、105、5.0×105、106、5.0×106个或更多个RNA。
实例41：测量融合剂脂质体中的脂质组成
这一实例描述定量融合剂脂质体的脂质组成。在一些实施例中，融合剂脂质体的脂质组成与衍生其的细胞类似。脂质组成影响融合剂脂质体和细胞的重要生物物理学参数，如大小、静电相互作用和胶体特性。
脂质测量是基于质谱分析。通过前述实例中所描述的方法中的任一种来制备融合剂脂质体。
如(Sampaio等人,《美国国家科学院院刊》,2011年2月1日；108(5):1903-7)所描述，在脂质分析服务机构(德国德累斯顿(Dresden,Germany))进行基于质谱分析的脂质分析。使用两步氯仿/甲醇程序提取脂质(Ejsing等人,《美国国家科学院院刊》,2009年3月17日；106(7):2136-41)。用以下的内部脂质标准混合物加标样品：心磷脂16:1/15:0/15:0/15:0(CL)、神经酰胺18:1；2/17:0(Cer)、二酰甘油17:0/17:0(DAG)、己糖基神经酰胺18:1；2/12:0(HexCer)、溶血磷脂酸酯17:0(LPA)、溶血磷脂酰胆碱12:0(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺17:1(LPE)、溶血磷脂酰甘油17:1(LPG)、溶血磷脂酰肌醇17:1(LPI)、溶血磷脂酰丝氨酸17:1(LPS)、磷脂酸酯17:0/17:0(PA)、磷脂酰胆碱17:0/17:0(PC)、磷脂酰乙醇胺17:0/17:0(PE)、磷脂酰甘油17:0/17:0(PG)、磷脂酰肌醇16:0/16:0(PI)、磷脂酰丝氨酸17:0/17:0(PS)、胆固醇酯20:0(CE)、鞘磷脂18:1；2/12:0；0(SM)和三酰甘油17:0/17:0/17:0(TAG)。
在提取之后，将有机相转移到输注培养板并且在速度真空浓缩器中干燥。将第一步干提取物再悬浮于含7.5mM乙酸铵的氯仿/甲醇/丙醇(1:2:4，V:V:V)中并且将第二步干提取物再悬浮于甲胺于氯仿/甲醇中的33％乙醇溶液(0.003:5:1；V:V:V)中。所有液体处理步骤均使用用于有机溶剂的机器人平台进行，所述平台具有用于移液的防液滴控制特征(汉密尔顿机器人公司(Hamilton Robotics))。
在配备有离子源(Advion Biosciences)的质谱仪(赛默科技)上通过直接输注来分析样品。在单次采集中，以正离子和负离子模式分析样品，其中MS的分辨率为Rm/z＝200＝280000并且串联MS/MS实验的分辨率为Rm/z＝200＝17500。MS/MS由包含列表触发，所述列表涵盖以1Da增量扫描的对应MS质量范围(Surma等人,《欧洲脂质科学与技术杂志(Eur Jlipid Sci Technol)》,2015年10月；117(10):1540-9)。将MS和MS/MS数据组合，以监测作为铵加合物的CE、DAG和TAG离子；作为乙酸盐加合物的PC、PC O-；和作为去质子化阴离子的CL、PA、PE、PE O-、PG、PI和PS。仅MS用于监测作为去质子化阴离子的LPA、LPE、LPE O-、LPI和LPS；作为乙酸盐的Cer、HexCer、SM、LPC和LPC O-。
用内部开发的脂质鉴别软件分析数据，如以下参考文献中所描述(Herzog等人,《基因组生物学(Genome Biol)》,2011年1月19日；12(1):R8；Herzog等人,《公共科学图书馆·综合(PLoS One)》,2012年1月；7(1):e29851)。仅将信噪比>5，并且信号强度比对应空白样品中高5倍的脂质鉴别考虑用于进一步的数据分析。
将融合剂脂质体脂质组成与亲本细胞的脂质组成进行比较。在一些实施例中，如果亲本细胞中>50％的鉴别的脂质存在于融合剂脂质体中，那么融合剂脂质体和亲本细胞将具有类似的脂质组成，并且在那些鉴别的脂质中，融合剂脂质体中的水平将为亲本细胞中的对应脂质水平的>25％。
实例42：测量融合剂脂质体中的蛋白质组学组成
这一实例描述定量融合剂脂质体的蛋白质组成。在一些实施例中，融合剂脂质体的蛋白质组成将与衍生其的细胞类似。
通过前述实例中所描述的方法中的任一种来制备融合剂脂质体。将融合剂脂质体再悬浮于溶解缓冲液(7M脲、2M硫脲、于50mM Tris中的4％(w/v)Chaps，pH 8.0)中并且在室温下在偶尔涡旋的情况下培育15分钟。然后通过在冰浴中超声处理5分钟将混合物溶解并且以13,000RPM短暂离心5分钟。通过比色分析(皮尔斯(Pierce))确定蛋白质含量并且将每个样品的蛋白质转移到新试管中并用50mM Tris pH 8平衡体积。
将蛋白质在65℃下用10mM DTT还原15分钟并且在室温下在黑暗中用15mM碘乙酰胺烷基化30分钟。通过逐渐添加6体积的冷(-20℃)丙酮使蛋白质沉淀，并且在-80℃下培育过夜。用冷(-20℃)甲醇洗涤蛋白质球粒3次。将蛋白质再悬浮于50mM Tris pH 8.3中。
随后，在消化的前4小时内在37℃下在搅拌下将胰蛋白酶/lysC添加到蛋白质。将样品用50mM Tris pH 8稀释，并且将0.1％脱氧胆酸钠与更多胰蛋白酶/lysC一起添加以在37℃下在搅拌下消化过夜。停止消化并且通过添加2％v/v甲酸来去除脱氧胆酸钠。将样品涡旋并且通过以13,000RPM离心1分钟来清除。通过逆相固相萃取(SPE)来纯化肽并干燥。将样品在20μl的3％DMSO、0.2％甲酸的水溶液中复原并且通过LC-MS分析。
为了进行定量测量，还在仪器上运行蛋白质标准物。将标准肽(皮尔斯，等摩尔，LC-MS级，#88342)稀释到4、8、20、40和100fmol/μL并且通过LC-MS/MS进行分析。对于每种浓度，计算每种蛋白质的5个最佳肽(3个MS/MS过渡/肽)的平均AUC(曲线下面积)以产生标准曲线。
用高分辨率质谱仪(ABSciex，美国加利福尼亚州福斯特市(Foster City,CA,USA))进行采集，所述质谱仪配备有具有25μm iD毛细管的电喷雾接口并且与微超高效液相色谱仪(μUHPLC)(Eksigent,美国加利福尼亚州雷德伍德城(Redwood City,CA,USA))耦接。分析软件用于控制仪器以及进行数据处理和采集。将源电压设置为5.2kV并且维持于225℃下，将气帘气设置为27psi，将气体一设置为12psi并将气体二设置为10psi。对于蛋白质数据库，以信息相关采集(Information Dependent Acquisition；IDA)模式进行采集，并且对于样品，以SWATH采集模式进行采集。在维持于60℃下的0.3μm内径，2.7μm粒子，150mm长的逆相色谱柱(特拉华州威明顿的先进材料技术(Advance Materials Technology,Wilmington,DE))上进行分离。样品通过环路过满注入5μL环路中。对于120分钟(样品)LC梯度，移动相包含以下：流动速率为3μL/min的溶剂A(于水中的0.2％v/v甲酸和3％DMSO v/v)和溶剂B(于EtOH中的0.2％v/v甲酸和3％DMSO)。
对于蛋白质的绝对定量，使用每种蛋白质的5个最佳肽(3MS/MS离子/肽)的AUC的总和产生标准曲线(5点，R2>0.99)。为了产生用于样品分析的数据库，对12个样品中的每一个运行DIAUmpire算法并且与输出MGF文件合并到一个数据库中。这个数据库与软件(ABSciex)一起使用，以使用5个过渡/肽和5个肽/蛋白质最大值定量每个样品中的蛋白质。如果计算的评分高于1.5或FDR<1％，那么将肽视为被充分测量。将每个充分测量的肽的AUC的总和绘制于标准曲线上，并且报告为fmol。
随后如下分析所得蛋白质定量数据，以确定已知类别的蛋白质的蛋白质水平和比例：酶被鉴别为用酶委员会(EC)编号注释的蛋白质；ER相关蛋白被鉴别为具有ER而非线粒体的基因本体(GO；http://www.geneontology.org)细胞隔室分类的蛋白质；外泌体相关蛋白被鉴别为具有外泌体而非线粒体的基因本体细胞隔室分类的蛋白质；并且线粒体蛋白被鉴别为在MitoCarta数据库中被鉴别为线粒体的蛋白质(Calvo等人,NAR 2015l doi:10.1093/nar/gkv1003)。将这些类别中的每一个的摩尔比确定为每类中的所有蛋白质的摩尔量的总和除以每个样品中所有鉴别的蛋白质的摩尔量的总和。
将融合剂脂质体蛋白质组学组成与亲本细胞蛋白质组学组成进行比较。在一些实施例中，当>50％的鉴别的蛋白质存在于融合剂脂质体中时，将观察到融合剂脂质体与亲本细胞之间类似的蛋白质组学组成，并且在那些鉴别的蛋白质中，水平为亲本细胞中的对应蛋白质水平的>25％。
实例43：定量每个融合剂脂质体的内源性或合成蛋白水平
这一实例描述定量融合剂脂质体中的内源性或合成蛋白货物。在一些实施例中，融合剂脂质体包括内源性或合成蛋白货物。
融合剂脂质体或亲本细胞经工程改造，以改变内源性蛋白的表达或表达介导治疗性或新颖细胞功能的合成货物。
转座酶载体(系统生物科学公司)包含嘌呤霉素抗性基因的开放阅读框连同蛋白质药剂的克隆片段的开放阅读框，任选地翻译融合到绿色荧光蛋白(GFP)的开放阅读框。使用电穿孔器(Amaxa)和293T细胞系特异性核转染试剂盒(龙沙)将载体电穿孔到293T中。
在含有20％胎牛血清和1×青霉素/链霉素的DMEM中用嘌呤霉素选择3-5天后，通过前述实例中所描述的方法中的任一种由稳定表达的细胞系制备融合剂脂质体。
如上文所描述地根据质谱定量内源性蛋白的改变的表达水平或未融合到GFP的合成蛋白的表达水平。在一些实施例中，融合剂脂质体将具有每个融合剂脂质体至少1、2、3、4、5、10、20、50、100、500、103、5.0×103、104、5.0×104、105、5.0×105、106、5.0×106个或更多个蛋白质药剂分子。
替代地，将纯化的GFP在含有20％胎牛血清和1×青霉素/链霉素的DMEM中连续稀释以产生蛋白质浓度的标准曲线。使用GFP光立方(469/35激发滤光片和525/39发射滤光片)在荧光计(BioTek)中测量标准曲线和融合剂脂质体样品的GFP荧光，以计算融合剂脂质体中的GFP分子的平均摩尔浓度。然后将摩尔浓度转换成GFP分子的数目除以每个样品的融合剂脂质体的数目以获得每个融合剂脂质体的蛋白质药剂分子的平均数目。
在一些实施例中，融合剂脂质体将具有每个融合剂脂质体至少1、2、3、4、5、10、20、50、100、500、103、5.0×103、104、5.0×104、105、5.0×105、106、5.0×106个或更多个蛋白质药剂分子。
实例44：测量融合剂脂质体中的外泌体蛋白的标记
这一分析描述样品制剂的蛋白质组学组成的定量，并且定量了已知是外泌体的特异性标记的蛋白质的比例。
根据标准生物样品处理程序，将融合剂脂质体球粒化并且冷冻运送到蛋白质组学分析中心。
将融合剂脂质体解冻以用于蛋白质提取和分析。首先，将其再悬浮于溶解缓冲液(7M脲、2M硫脲、4％(w/v)chaps于50mM Tris中，pH 8.0)中并且在室温下在偶尔涡旋的情况下培育15分钟。然后通过在冰浴中超声处理5分钟将混合物溶解并且以13,000RPM短暂离心5分钟。通过比色分析(皮尔斯)测定总蛋白含量并且将来自每个样品的100μg蛋白质转移到新试管中并用50mM Tris pH 8调节体积。
将蛋白质在65℃下用10mM DTT还原15分钟并且在室温下在黑暗中用15mM碘乙酰胺烷基化30分钟。然后通过逐渐添加6体积的冷(-20℃)丙酮使蛋白质沉淀，并且在-80℃下培育过夜。
将蛋白质球粒化，用冷(-20℃)甲醇洗涤3次，并且再悬浮于50mM Tris pH 8中。在消化的前4小时内在37℃下在搅拌下将3.33μg胰蛋白酶/lysC添加到蛋白质。将样品用50mMTris pH 8稀释，并且将0.1％脱氧胆酸钠与另外3.3μg胰蛋白酶/lysC一起添加以在37℃下在搅拌下消化过夜。停止消化并且通过添加2％v/v甲酸来去除脱氧胆酸钠。将样品涡旋并且通过以13,000RPM离心1分钟来清除。
通过逆相固相萃取(SPE)来纯化蛋白质并干燥。如先前所描述，将样品在3％DMSO、0.2％甲酸的水溶液中复原并且通过LC-MS进行分析。
分析所得的蛋白质定量数据，以确定已知外泌体标记蛋白质的蛋白质水平和比例。确切地说：四跨膜蛋白家族蛋白(例如CD63、CD9或CD81)、ESCRT相关蛋白(例如TSG101、CHMP4A-B或VPS4B)、Alix、TSG101、MHCI、MHCII、GP96、辅肌动蛋白-4、线粒体内膜蛋白、同线蛋白-1、TSG101、ADAM10、EHD4、同线蛋白-1、TSG101、EHD1、脂阀结构蛋白-1、热休克70kDa蛋白(HSC70/HSP73、HSP70/HSP72)。将这些外泌体标记蛋白质相对于所有测量的蛋白质的摩尔比确定为以上列出的每种特定外泌体标记蛋白质的摩尔量除以每个样品中所有鉴别的蛋白质的摩尔量的总和并表示为百分比。
类似地，将所有外泌体标记蛋白质相对于所有测量的蛋白质的摩尔比确定为以上列出的所有特定外泌体标记蛋白质的摩尔量的总和除以每个样品中所有鉴别的蛋白质的摩尔量的总和并表示为总数的百分比。
在一些实施例中，样品将包括小于5％的任何单独的外泌体标记蛋白质和小于15％的总外泌体标记蛋白质。
在一些实施例中，任何单独的外泌体标记蛋白质将以小于0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％或10％存在。
在一些实施例中，所有外泌体标记蛋白质的总和将为小于0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％或25％。
实例45：测量融合剂脂质体中的GAPDH
这一分析描述定量融合剂脂质体中的甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的水平，和与亲本细胞相比，融合剂脂质体中的GAPDH的相对水平。
根据制造商的说明，使用用于GAPDH的标准可商购的ELISA(ab176642，艾碧康)在亲本细胞和融合剂脂质体中测量GAPDH。
以用于测量GAPDH的样品的相同体积，如先前所描述地通过二喹啉甲酸分析来类似地测量总蛋白质水平。在实施例中，使用这个分析，融合剂脂质体中的GAPDH/总蛋白质的水平将为<100ng GAPDH/μg总蛋白质。类似地，在实施例中，从亲本细胞到融合剂脂质体的GAPDH水平相对于总蛋白的降低将为大于10％降低。
在一些实施例中，以ng GAPDH/μg总蛋白质为单位的制剂中的GAPDH含量将为小于500、小于250、小于100、小于50、小于20、小于10、小于5或小于1。
在一些实施例中，从亲本细胞到制剂的以ng/μg为单位的GAPDH/总蛋白的降低将为大于1％、大于2.5％、大于5％、大于10％、大于15％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％、大于70％、大于80％或大于90％。
实例46：测量融合剂脂质体中的钙连蛋白
这一分析描述定量融合剂脂质体中的钙连蛋白(CNX)水平，和与亲本细胞相比，融合剂脂质体中的CNX的相对水平。
根据制造商的说明，使用用于钙连蛋白的标准可商购的ELISA(MBS721668，MyBioSource)在起始细胞和制剂中测量钙连蛋白。
以用于测量钙连蛋白的样品的相同体积，如先前所描述地通过二喹啉甲酸分析来类似地测量总蛋白质水平。在实施例中，使用这个分析，融合剂脂质体中的钙连蛋白/总蛋白质的水平将为<100ng钙连蛋白/μg总蛋白质。类似地，在实施例中，从亲本细胞到融合剂脂质体的钙连蛋白水平相对于总蛋白质的增加将为大于10％增加。
在一个实施例中，以ng钙连蛋白/μg总蛋白质为单位的制剂中的钙连蛋白含量将为小于500、250、100、50、20、10、5或1。
在一些实施例中，从亲本细胞到制剂的以ng/μg为单位的钙连蛋白/总蛋白质的减少将为大于1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
实例47：比较可溶性与不溶性蛋白质质量
这一实例描述定量融合剂脂质体中的可溶性:不溶性蛋白质质量比。在一些实施例中，融合剂脂质体中的可溶性:不溶性蛋白质质量比将与有核细胞类似。
通过前述实例中所描述的方法中的任一种来制备融合剂脂质体。使用标准二喹啉甲酸分析(BCA)(例如使用可商购的PierceTMBCA蛋白质分析试剂盒，赛默飞世尔产品编号23225)测试融合剂脂质体制剂以确定可溶性:不溶性蛋白质的比。通过将制备的融合剂脂质体或亲本细胞以1×107个细胞或融合剂脂质体/mL的浓度悬浮于PBS中，并且以1600g离心以将融合剂脂质体或细胞球粒化来制备可溶性蛋白质样品。以可溶性蛋白质洗脱份形式收集上清液。
通过剧烈移液并且在具有2％Triton-X-100的PBS中涡旋来溶解球粒中的融合剂脂质体或细胞。溶解的洗脱份表示不溶性蛋白质洗脱份。
使用供应的BSA，每孔0到20μg(一式三份)来产生标准曲线。融合剂脂质体或细胞制剂被稀释，使得测量的量在标准范围内。一式三份地分析融合剂脂质体制剂并且使用平均值。将可溶性蛋白质浓度除以不溶性蛋白质浓度以得到可溶性:不溶性蛋白质的比。
在一些实施例中，相比于亲本细胞，融合剂脂质体可溶性:不溶性蛋白质比将在1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大内。
实例48：测量融合剂脂质体中的LPS
这一实例描述定量与亲本细胞相比，融合剂脂质体中的脂多糖(LPS)的水平。在一些实施例中，融合剂脂质体将具有相比于亲本细胞较低水平的LPS。
LPS是细菌膜的组分和先天免疫应答的强力诱导剂。
如前述实例中所描述，LPS测量是基于质谱分析。
在一些实施例中，融合剂脂质体的脂质含量的小于5％、1％、0.5％、0.01％、0.005％、0.0001％、0.00001％或更小将为LPS。
实例49：融合剂脂质体中的脂质与蛋白质的比
这一实例描述定量融合剂脂质体中的脂质质量与蛋白质质量的比。在一些实施例中，融合剂脂质体将具有与有核细胞类似的脂质质量与蛋白质质量的比。
总脂质含量计算为在先前实例中概述的脂质组学数据集中鉴别的所有脂质的摩尔含量的总和。通过如本文所描述的二喹啉甲酸分析来测量融合剂脂质体的总蛋白含量。
替代地，脂质与蛋白质的比可以被描述为特定脂质物种与特定蛋白质的比。特定脂质物种是选自先前实例中产生的脂质组学数据。特定蛋白质是选自先前实例中所产生的蛋白质组学数据。所选脂质物种和蛋白质的不同组合用于定义特定的脂质:蛋白质比。
实例50：融合剂脂质体中的蛋白质与DNA的比
这一实例描述定量融合剂脂质体中的蛋白质质量与DNA质量的比。在一些实施例中，融合剂脂质体将具有比细胞大得多的蛋白质质量与DNA质量的比。
如先前实例中所描述地测量融合剂脂质体和细胞的总蛋白质含量。如先前实例中所描述地测量融合剂脂质体和细胞的DNA质量。然后通过将总蛋白质含量除以总DNA含量来确定蛋白质与总核酸的比，以得到典型融合剂脂质体制剂的在给定范围内的比。
替代地，通过使用半定量实时PCR(RT-PCR)将核酸水平定义为特定管家基因，如GAPDH的水平来确定蛋白质与核酸的比。
然后通过将总蛋白含量除以总GAPDH DNA含量来确定蛋白质与GAPDH核酸的比，以定义典型融合剂脂质体制剂的蛋白质:核酸比的特定范围。
实施例51：融合剂脂质体中脂质与DNA的比
这一实例描述定量与亲本细胞相比，融合剂脂质体中的脂质与DNA的比。在一些实施例中，与亲本细胞相比，融合剂脂质体将具有更大的脂质与DNA的比。
这一比被定义为总脂质含量(在以上实例中概述)或特定脂质物种。在特定脂质物种的情况下，范围取决于所选的特定脂质物种。特定脂质物种是选自前述实例中产生的脂质组学数据。如先前实例中所描述地确定核酸含量。
使用标准化为核酸含量的所选脂质物种的不同组合来定义特定融合剂脂质体制剂的特征性的特定脂质:核酸比。
实例52：分析融合剂脂质体上的表面标记
这一分析描述鉴别融合剂脂质体上的表面标记。
根据标准生物样品处理程序，将融合剂脂质体球粒化并且冷冻运送到蛋白质组学分析中心。
为了鉴别融合剂脂质体上存在或不存在表面标记，将其用针对磷脂酰丝氨酸和CD40配体的标记染色并且使用FACS系统(百克顿-迪金森公司)通过流式细胞测量术分析。为了检测表面磷脂酰丝氨酸，用膜联蛋白V分析(556547，BD生物科学(BD Biosciences))如制造商所描述地分析产物。
简单来说，将融合剂脂质体用冷PBS洗涤两次，并且然后以1×106个融合剂脂质体/mL的浓度再悬浮于1×结合缓冲液中。将10％的再悬浮液转移到5mL培养管中并且添加5μl FITC膜联蛋白V。将细胞轻轻地涡旋并且在室温(25℃)下在黑暗中培育15分钟。
并行地，将单独的10％的再悬浮液转移到不同的管中作为未染色的对照。将1×结合缓冲液添加到每个管中。在1小时内通过流式细胞测量术分析样品。
在一些实施例中，使用这一分析，染色的融合剂脂质体群体的平均值将被确定为高于未染色的细胞的平均值，表明融合剂脂质体包括磷脂酰丝氨酸。
类似地，对于CD40配体，根据制造商的说明将以下单克隆抗体添加到另外10％的洗涤的融合剂脂质体：PE-CF594小鼠抗人类CD154克隆TRAP1(563589，BD Pharmigen)。简单来说，使用饱和量的抗体。并行地，将单独的10％的融合剂脂质体转移到不同的管中作为未染色的对照。将管在室温下以400×g离心5分钟。倒出上清液并且将球粒用流式细胞测量术洗涤溶液洗涤两次。将0.5mL的1％多聚甲醛固定剂添加到每个管。将每个管短暂涡旋并且存储在4℃下，直到在流式细胞仪上进行分析。
在一些实施例中，使用这一分析或等效物，染色的融合剂脂质体群体的平均值将被确定为高于未染色的细胞的平均值，表明融合剂脂质体包括CD40配体。
实例53：分析融合剂脂质体中的病毒衣壳蛋白
这一分析描述样品制剂的组成分析，并且评估衍生自病毒衣壳来源的蛋白质的比例。
根据标准生物样品处理程序，将融合剂脂质体球粒化并且冷冻运送到蛋白质组学分析中心。
将融合剂脂质体解冻以用于蛋白质提取和分析。首先，将其再悬浮于溶解缓冲液(7M脲、2M硫脲、4％(w/v)chaps于50mM Tris中，pH 8.0)中并且在室温下在偶尔涡旋的情况下培育15分钟。然后通过在冰浴中超声处理5分钟将混合物溶解并且以13,000RPM短暂离心5分钟。通过比色分析(皮尔斯)测定总蛋白含量并且将来自每个样品的100μg蛋白质转移到新试管中并用50mM Tris pH 8调节体积。
将蛋白质在65℃下用10mM DTT还原15分钟并且在室温下在黑暗中用15mM碘乙酰胺烷基化30分钟。然后通过逐渐添加6体积的冷(-20℃)丙酮使蛋白质沉淀，并且在-80℃下培育过夜。
将蛋白质球粒化，用冷(-20℃)甲醇洗涤3次，并且再悬浮于50mM Tris pH 8中。在消化的前4小时内在37℃下在搅拌下将3.33μg胰蛋白酶/lysC添加到蛋白质。将样品用50mMTris pH 8稀释，并且将0.1％脱氧胆酸钠与另外3.3μg胰蛋白酶/lysC一起添加以在37℃下在搅拌下消化过夜。停止消化并且通过添加2％v/v甲酸来去除脱氧胆酸钠。将样品涡旋并且通过以13,000RPM离心1分钟来清除。
通过逆相固相萃取(SPE)来纯化蛋白质并干燥。如先前所描述，将样品在3％DMSO、0.2％甲酸的水溶液中复原并且通过LC-MS进行分析。
将病毒衣壳蛋白相对于所有测量的蛋白质的摩尔比确定为所有病毒衣壳蛋白的摩尔量除以每个样品中所有鉴别的蛋白质的摩尔量的总和并表示为百分比。
在一个实施例中，使用这一方法或等效物，样品将包括少于10％的病毒衣壳蛋白。在一些实施例中，样品将包括少于0.5％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％或90％的病毒衣壳蛋白。
实例54：测量与靶细胞的融合
这一实例描述定量相比于非靶细胞，融合剂脂质体与靶细胞的融合。
在一些实施例中，融合剂脂质体与靶细胞的融合允许将融合剂脂质体的内腔中携带的货物细胞特异性地递送到接受者细胞的胞质溶胶。如下分析通过本文所描述的方法产生的融合剂脂质体与靶细胞的融合速率。
在这个实例中，融合剂脂质体包括在其质膜上表达成肌蛋白的HEK293T细胞。另外，融合剂脂质体表达mTagBFP2荧光蛋白和Cre重组酶。靶细胞为成肌细胞，其表达成肌蛋白和肌混合蛋白两者，并且非靶细胞为成纤维细胞，其既不表达成肌蛋白也不表达肌混合蛋白。预测表达成肌蛋白的融合剂脂质体与表达成肌蛋白和肌混合蛋白两者的靶细胞融合但不与非靶细胞融合(Quinn等人,2017,《自然通信(Nature Communications)》,8,15665.doi.org/10.1038/ncomms15665)(Millay等人,2013,《自然》,499(7458),301-305.doi.org/10.1038/nature12343)。靶细胞和非靶细胞类型均从小鼠分离并且在CMV启动子下稳定表达“LoxP-stop-Loxp-tdTomato”盒，所述启动子在通过Cre重组后开启tdTomato表达，指示融合。
将靶接受者细胞或非靶接受者细胞接种于黑色的透明底部96孔培养中。靶细胞和非靶细胞均对于不同的融合基团进行接种。随后，在接种接受者细胞之后24小时，将表达Cre重组酶蛋白和成肌蛋白的融合剂脂质体施加到DMEM培养基中的靶接受者细胞或非靶接受者细胞。融合剂脂质体的剂量与接种于孔中的接受者细胞的数目相关。在施加融合剂脂质体之后，将细胞培养板以400g离心5分钟，以帮助引发融合剂脂质体与接受者细胞之间的接触。
从融合剂脂质体应用后四小时开始，对细胞孔成像以阳性地鉴别区域或孔中的RFP阳性细胞相对于GFP阳性细胞。
在这个实例中，使用自动显微镜(www.biotek.com/products/imaging-microscopy-automated-cell-imagers/lionheart-fx-automated-live-cell-imager/)对细胞培养板进行成像。通过首先在DMEM培养基中用Hoechst 33342染色细胞10分钟来确定给定孔中的总细胞群体。Hoechst 33342通过插入到DNA中染色细胞核并且因此用于鉴别个别细胞。在染色之后，将Hoechst培养基用常规DMEM培养基替换。
使用405nm LED和DAPI滤光立方体对Hoechst成像。GFP使用465nm LED和GFP滤光立方体成像，而RFP使用523nm LED和RFP滤光立方体成像。通过首先在阳性对照孔；即，用编码Cre重组酶的腺病毒而非融合剂脂质体处理的接受者细胞上确立LED强度和积分时间来采集靶细胞孔和非靶细胞孔的图像。
设定采集设置，以使得RFP和GFP强度处于最大像素强度值但不饱和。然后使用确立的设置对所关注的孔成像。每4小时对孔成像以采集融合活性速率的时程数据。
用配备有荧光显微镜的软件或其它软件(Rasband,W.S.,ImageJ,美国国家卫生研究院(U.S.National Institutes of Health),美国马里兰州贝塞斯达(Bethesda,Maryland,USA),rsb.info.nih.gov/ij/,1997-2007)进行GFP和RFP阳性孔的分析。
使用60μm宽的滚球背景减除算法对图像进行预处理。在Hoechst阳性细胞上设置总细胞掩码。Hoechst强度显著高于背景强度的细胞为阈值处理的并且排除太小或太大而无法成为Hoechst阳性细胞的区域。
在总细胞掩码内，通过对显著高于背景的细胞再次取阈值并且将Hoechst(细胞核)掩码扩展到整个细胞区域以包含整个GFP和RFP细胞荧光来鉴别GFP和RFP阳性细胞。在含有靶接受者细胞或非靶接受者细胞的对照孔中鉴别的RFP阳性细胞的数目用于从含有融合剂脂质体的孔中减去RFP阳性细胞的数目(以减去非特异性Loxp重组)。然后在每个时间点将RFP阳性细胞(融合的接受者细胞)的数目除以GFP阳性细胞(未融合的接受者细胞)与RFP阳性细胞的总和，以定量接受者细胞群体内的融合剂脂质体融合速率。将速率标准化为施加到接受者细胞的融合剂脂质体的给定剂量。对于靶向融合(融合剂脂质体与所靶向的细胞融合)的速率，从与靶细胞的融合速率减去与非靶细胞的融合速率，以定量靶向融合的速率。
在一些实施例中，融合剂脂质体与靶细胞的平均融合速率将在0.01-4.0RFP/GFP细胞/小时范围内(对于靶细胞融合)，或为非靶接受者细胞与融合剂脂质体的平均融合速率的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。在一些实施例中，未施加融合剂脂质体的组将展示<0.01RFP/GFP细胞/小时的背景速率。
实例55：递送膜蛋白的体外融合
这一实例描述融合剂脂质体与细胞的体外融合。在一些实施例中，融合剂脂质体与细胞的体外融合使得将活性膜蛋白递送到接受者细胞。
在这个实例中，融合剂脂质体是从表达仙台病毒HVJ-E蛋白的HEK293T细胞产生(Tanaka等人,2015,《基因疗法》,22(2014年10月),1-8.doi.org/10.1038/gt.2014.12)。在一些实施例中，产生融合剂脂质体以表达膜蛋白GLUT4，其主要发现于肌肉和脂肪组织中并且负责胰岛素调节的葡萄糖向细胞内的转运。如前述实例中所描述的方法中的任一种所描述，由HEK293T细胞制备具有或不具有GLUT4的融合剂脂质体。
然后用表达GLUT4的融合剂脂质体、不表达GLUT4的融合剂脂质体、PBS(阴性对照)或胰岛素(阳性对照)处理肌肉细胞，如C2C12细胞。通过荧光2-脱氧葡萄糖类似物，2-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基]-2-脱氧葡萄糖(2-NBDG)的摄取来测量GLUT4对C2C12细胞的活性。使用先前实例中所描述的方法，通过显微镜评估C2C12细胞的荧光。
在一些实施例中，预期相比于用PBS或不表达GLUT4的融合剂脂质体处理的C2C12细胞，用表达GLUT4和胰岛素的融合剂脂质体处理的C2C12细胞展示增加的荧光。也参见Yang等人,《先进材料(Advanced Materials)》29,1605604,2017。
实例56：膜蛋白的体内递送
这一实例描述融合剂脂质体与细胞的体内融合。在一些实施例中，融合剂脂质体与细胞的体内融合使得将活性膜蛋白递送到接受者细胞。
在这个实例中，如同先前实例中，从表达仙台病毒HVJ-E蛋白的HEK293T细胞产生融合剂脂质体。在一些实施例中，产生融合剂脂质体以表达膜蛋白GLUT4。如前述实例中所描述的方法中的任一种所描述，由HEK293T细胞制备具有或不具有GLUT4的融合剂脂质体。
向BALB/c-nu小鼠施用表达GLUT4的融合剂脂质体、不表达GLUT4的融合剂脂质体或PBS(阴性对照)。向小鼠的胫骨前肌中肌肉内注射融合剂脂质体或PBS。紧邻在融合剂脂质体施用之前，使小鼠禁食12小时并且注射[18F]2-氟-2脱氧-d-葡萄糖(18F-FDG)，其为使得能够进行正电子发射断层扫描(PET成像)的葡萄糖类似物。在麻醉(2％异氟醚)下通过尾静脉向小鼠注射18F-FDG。使用纳米级成像系统(1T,Mediso,匈牙利(Hungary))进行PET成像。在施用融合剂脂质体之后4小时进行成像。成像后，立即处死小鼠并称重胫骨前肌。使用3D成像系统在全检测器模式下，并启用所有矫正、高正则化和八次迭代来重构PET图像。使用成像软件包(Mediso,匈牙利)并且应用标准摄取值(SUV)分析来进行重构的图像的三维感兴趣体积(VOI)分析。为胫骨前肌部位绘制固定具有2mm直径的球体的VOI。使用下式计算每个VOI位点的SUV：SUV＝(感兴趣体积中的放射性，测量为Bq/cc×体重)/注入的放射性。
在一些实施例中，预期相比于施用PBS或不表达GLUT4的融合剂脂质体的小鼠，施用表达GLUT4的融合剂脂质体的小鼠展示VOI中增加的放射性信号。也参见Yang等人,《先进材料(Advanced Materials)》29,1605604,2017。
实例57：测量从血管的外渗
这一实例描述用体外微流体系统测试的跨内皮单层的融合剂脂质体外渗的定量(J.S Joen等人2013,journals.plos.org/plosone/article？id＝10.1371/journal.pone.0056910)。
细胞从血管系统外渗到周围组织中。不希望受理论束缚，外渗为融合剂脂质体到达血管外组织的一种方式。
系统包含三个可独立寻址的介质通道，所述通道由可以将ECM模拟凝胶注入其中的腔室分隔。简单来说，微流体系统具有模制的PDMS(聚二甲基硅氧烷；Silgard 184；密歇根州的陶氏化学(Dow Chemical,MI))，通过其钻取进入口并且结合到盖玻璃以形成微流体通道。通道截面尺寸为1mm(宽度)×120μm(高度)。为了增强基质粘着，PDMS通道涂布有PDL(聚D-赖氨酸氢溴酸盐；1mg/ml；密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO))溶液。
随后，将I型胶原蛋白(BD生物科学，美国加利福尼亚州圣何塞)溶液(2.0mg/mL)伴以磷酸盐缓冲盐水(PBS；Gibco)和NaOH通过四个单独的填充口注入装置的凝胶区域中，并且培育30分钟以形成水凝胶。当凝胶聚合时，立即将内皮细胞培养基(从如龙沙或西格玛的供应商获得)吸移到通道中以防止凝胶脱水。吸出培养基后，将稀水凝胶(BD科学)溶液(3.0mg/mL)引入细胞通道中并且使用冷培养基将过量的水凝胶溶液洗掉。
将内皮细胞引入中间通道中并且使其沉降以形成内皮。在内皮细胞接种后两天，将融合剂脂质体或巨噬细胞(阳性对照)引入相同通道中，其中内皮细胞已在所述通道中形成完整的单层。引入融合剂脂质体以使其附着并且跨单层转移到凝胶区域中。将培养物保持于37℃和5％CO2下的含湿气培育箱中。融合剂脂质体的GFP表达型式用于使得能够通过荧光显微镜进行活细胞成像。第二天，将细胞固定并在腔室中使用DAPI染色对细胞核染色，并且使用共聚焦显微镜对多个所关注区域成像以确定多少融合剂脂质体穿过了内皮单层。
在一些实施例中，DAPI染色将指示在接种后，融合剂脂质体和阳性对照细胞能够穿过内皮屏障。
实例58：测量趋化性细胞迁移率
这一实例描述融合剂脂质体趋化性的定量。细胞可以通过趋化性而朝向或远离化学梯度移动。在一些实施例中，趋化性将使融合剂脂质体归巢到损伤部位或追踪病原体。如下分析通过先前实例中所描述的方法中的任一种产生的纯化融合剂脂质体组合物的趋化能力。
根据制造商提供的方案在DMEM培养基(ibidi.com/img/cms/products/labware/channel_slides/S_8032X_Chemotaxis/IN_8032X_Chemotaxis.pdf)中，将足够数目的融合剂脂质体或巨噬细胞(阳性对照)装载到显微镜玻片孔中。将融合剂脂质体在37℃和5％CO2下放置1小时以使其附着。在细胞附着后，将DMEM(阴性对照)或含DMEM的MCP1化学引诱剂装载到中心通道的相邻储集器中，并且使用Zeiss倒置宽视场显微镜对融合剂脂质体连续成像2小时。使用ImageJ软件(Rasband,W.S.,ImageJ,美国马里兰州贝塞斯达的美国国家卫生研究院,http://rsb.info.nih.gov/ij/,1997-2007)分析图像。用手动追踪插件(FabriceCordelières,Institut Curie,法国(奥赛Orsay,France))获取每个观察到的融合剂脂质体或细胞的迁移协调数据。趋化图和迁移速度是由趋化性和迁移工具(ibidi)确定。
在一些实施例中，融合剂脂质体的平均累积距离和迁移速度将在阳性对照细胞对趋化因子的应答的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大内。细胞对趋化因子的应答描述于例如Howard E.Gendelman等人,《神经免疫药理学杂志(Journal of Neuroimmune Pharmacology)》,4(1):47-59,2009中。
实例59：测量归巢潜力
这一实例描述将融合剂脂质体归巢到损伤部位。细胞可以从远端部位迁移和/或积聚于特定部位，例如归巢到部位。通常，部位为损伤部位。在一些实施例中，融合剂脂质体将归巢到，例如迁移到或积聚于损伤部位。
通过使用30G针以2μg/mL的浓度将肌肉内(IM)注射到右胫骨前肌(TA)中而向八周龄C57BL/6J小鼠(杰克逊实验室(Jackson Laboratories))给药含黑牙蛇毒素(NTX)(精密化学科技公司(Accurate Chemical&Scientific Corp))，一种含肌肉毒素的无菌盐水。通过使用化学脱毛剂对区域脱毛45秒，接着用水冲洗3次而制备胫骨前肌(TA)上的皮肤。选择这个浓度以确保肌纤维的最大变性，以及对其卫星细胞、运动神经元轴突和血管的最小损伤。
在NTX注射后的第1天，小鼠接受表达萤火虫荧光素酶的融合剂脂质体或细胞的静脉内注射。通过前述实例所描述的方法中的任一种从稳定表达萤火虫荧光素酶的细胞产生融合剂脂质体。生物发光成像系统(珀金埃尔默(Perkin Elmer))用于在注射后0、1、3、7、21和28处获得生物发光的全动物图像。
在成像前五分钟，小鼠接受以150mg/kg剂量腹膜内注射的生物发光底物(珀金埃尔默)以使荧光素酶可视化。成像系统被校准以补偿所有装置设置。使用辐射光子(Radiance Photons)测量生物发光信号，并且将总通量用作测量值。通过围绕ROI的信号产生感兴趣区域(ROI)，以得到以光子数/秒计的值。对用NTX处理的TA肌肉和对侧TA肌肉都评估了ROI，并且计算NTX处理的TA肌肉与未用NTX处理的TA肌肉之间的光子数/秒的比，作为归巢到NTX处理的肌肉的量度。
在一些实施例中，融合剂脂质体和细胞中的NTX处理的TA肌肉与未用NTX处理的TA肌肉之间的光子数/秒的比将大于1，指示表达荧光素酶的融合剂脂质体在损伤处的位点特异性积聚。
参见例如Plant等人,《肌肉神经(Muscle Nerve)》34(5)L 577-85,2006。
实例60：测量吞噬活性
这一实例表明融合剂脂质体的吞噬活性。在一些实施例中，融合剂脂质体具有吞噬活性，例如能够进行吞噬作用。细胞参与吞噬，吞噬粒子，从而能够封存和破坏外来侵入物，如细菌或死细胞。
通过前述实例中所描述的方法中的任一种产生的包括来自具有部分或完全核灭活的哺乳动物巨噬细胞的融合剂脂质体的纯化融合剂脂质体组合物能够进行吞噬作用(通过病原体生物粒子所分析)。根据以下方案，通过使用荧光吞噬分析来进行这个评估。
将巨噬细胞(阳性对照)和融合剂脂质体在收获后立即接种于单独的共聚焦玻璃底培养皿中。将巨噬细胞和融合剂脂质体在DMEM+10％FBS+1％P/S中培育1小时以附着。如制造商的方案中所指示地将荧光素标记的大肠杆菌K12和非荧光素标记的大肠杆菌K-12(阴性对照)添加到巨噬细胞/融合剂脂质体，并且培育2小时，tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp06694.pdf。在2小时之后，通过添加锥虫蓝将游离的荧光粒子淬灭。通过共聚焦显微镜在488激发下对由吞噬粒子发出的细胞内荧光成像。使用image J软件对吞噬阳性融合剂脂质体的数目进行定量。
在引入生物粒子后2小时，吞噬融合剂脂质体的平均数目为至少30％，并且在阳性对照巨噬细胞中为大于30％。
实例61：测量穿过细胞膜或血脑屏障的能力
这一实例描述穿过血脑屏障的融合剂脂质体的定量。在一些实施例中，融合剂脂质体将穿过(例如进入和离开)血脑屏障，例如以递送到中枢神经系统。
对八第龄C57BL/6J小鼠(杰克逊实验室)静脉内注射表达萤火虫荧光素酶的融合剂脂质体或白细胞(阳性对照)。通过前述实例中所描述的方法中的任一种，从稳定表达萤火虫荧光素酶的细胞或不表达荧光素酶的细胞(阴性对照)产生融合剂脂质体。生物发光成像系统(珀金埃尔默)用于在融合剂脂质体或细胞注射后一、二、三、四、五、六、八、十二和二十四小时获得生物发光的全动物图像。
在成像前五分钟，小鼠接受以150mg/kg剂量腹膜内注射的生物发光底物(珀金埃尔默)以使荧光素酶可视化。成像系统被校准以补偿所有装置设置。测量生物发光信号，并将总通量用作测量值。通过围绕ROI的信号产生感兴趣区域(ROI)，以得到以光子数/秒计的值。所选的ROI为包含脑的区域周围的小鼠的头部。
在一些实施例中，相比于不表达荧光素酶的阴性对照融合剂脂质体，注射表达荧光素酶的细胞或融合剂脂质体的动物中的ROI中的光子数/秒将更大，指示表达荧光素酶的融合剂脂质体积聚于脑内或周围。
实例62：测量蛋白质分泌的潜力
这一实例描述由融合剂脂质体的分泌的定量。在一些实施例中，融合剂脂质体将能够分泌，例如分泌蛋白质。细胞可以通过分泌来处置或排出物质。在一些实施例中，融合剂脂质体将通过分泌在其环境中化学相互作用和通信。
使用来自赛默飞世尔科技的Gaussia荧光素酶快速分析(目录号16158)确定融合剂脂质体以给定速率分泌蛋白质的能力。将通过前述实例中所描述的方法中的任一种产生的小鼠胚胎成纤维细胞(阳性对照)或融合剂脂质体在生长培养基中培育，并通过首先以1600g球粒化融合剂脂质体5分钟并且随后收集上清液来每15分钟收集培养基样品。将收集的样品吸移到透明底96孔培养板中。然后根据制造商的说明书制备分析缓冲液的工作溶液。
简单来说，将考伦特嗪(colenterazine)，一种荧光素或发光分子与快速分析缓冲液混合并将混合物吸移到含有样品的96孔培养板的每个孔中。缺乏细胞或融合剂脂质体的阴性对照孔包含生长培养基或分析缓冲液以确定背景Gaussia荧光素酶信号。另外，制备纯化的Gaussia荧光素酶(雅典娜酶系统(Athena Enzyme Systems)，目录号0308)的标准曲线以便将每小时发光信号转化为Gaussia荧光素酶分泌的分子。
使用500毫秒积分来分析培养板的发光。从所有样品减去背景Gaussia荧光素酶信号并且然后计算Gaussia荧光素酶标准曲线的线性最佳拟合曲线。如果样品读数在标准曲线内不拟合，那么将其适当稀释并再分析。使用这个分析，确定融合剂脂质体以给定范围内的速率(分子数/小时)分泌Gaussia荧光素酶的能力。
在一些实施例中，融合剂脂质体将能够以阳性对照细胞的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大的速率分泌蛋白质。
实例63：测量信号转导潜力
这一实例描述融合剂脂质体中的信号转导的定量。在一些实施例中，融合剂脂质体能够进行信号转导。细胞可以通过信号级联(如磷酸化)在称为信号转导的过程中从细胞外环境发送和接收分子信号。通过前述实例中所描述的方法中的任一种产生的包括来自具有部分或完全核灭活的哺乳动物细胞的融合剂脂质体的纯化融合剂脂质体组合物能够进行胰岛素诱导的信号转导。通过测量AKT磷酸化水平，胰岛素受体信号级联中的关键路径和回应于胰岛素的葡萄糖摄取来评估胰岛素诱导的信号转导。
为了测量AKT磷酸化，将细胞，例如小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)(阳性对照)和融合剂脂质体接种于48孔培养板中并且在37℃和5％CO2下的含湿气培育箱中放置2小时。在细胞粘着后，将胰岛素(例如10nM)或不含胰岛素的阴性对照溶液添加到含有细胞或融合剂脂质体的孔中持续30分钟。在30分钟后，由融合剂脂质体或细胞制得蛋白质溶解物，并且通过蛋白质印迹法测量胰岛素刺激和对照物未刺激的样品中的磷酸化AKT水平。
如在葡萄糖摄取部分中所阐述，通过使用经标记的葡萄糖(2-NBDG)来测量回应于胰岛素或阴性对照溶液的葡萄糖摄取。(S.Galic等人,《分子细胞生物学》25(2):819-829,2005)。
在一些实施例中，相比于阴性对照，融合剂脂质体将增强AKT磷酸化和回应于胰岛素的葡萄糖摄取至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大。
实例64：测量跨细胞膜转运葡萄糖的能力
这一实例描述2-NBDG(2-(N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基)-2-脱氧葡萄糖)的水平的定量，2-NBDG为一种可以用于监测活细胞中的葡萄糖摄取，并且因此测量跨脂质双层的主动转运的荧光葡萄糖类似物。在一些实施例中，这个分析或等效物可以用于测量葡萄糖摄取的水平和跨融合剂脂质体的脂质双层的主动转运。
通过前述实例中所描述的方法中的任一种来产生融合剂脂质体组合物。然后将足够数目的融合剂脂质体在不含葡萄糖、20％胎牛血清和1×青霉素/链霉素的DMEM中在37℃和5％CO2下培育2小时。在2小时葡萄糖饥饿时段之后，更换培养基以使其包含不含葡萄糖、20％胎牛血清、1×青霉素/链霉的DMEM和20μM 2-NBDG(赛默飞世尔)并且再在37℃和5％CO2下培育2小时。
相同地处理阴性对照融合剂脂质体，除了添加等量的DMSO来代替2-NBDG。
然后将融合剂脂质体用1×PBS洗涤三次并且再悬浮于适当的缓冲液中，并转移到96孔成像培养板中。然后使用GFP光立方体(469/35激发滤光片和525/39发射滤光片)在荧光计中测量2-NBDG荧光，以定量在1小时装载时段内已跨融合剂脂质体膜转运并累积于融合剂脂质体中的2-NBDG的量。
在一些实施例中，相比于阴性(DMSO)对照，经2-NBDG处理的融合剂脂质体中的2-NBDG荧光将更高。用525/39发射滤光片的荧光测量将与存在的2-NBDG分子的数目相关。
实例65：融合剂脂质体的内腔与水溶液可混溶
这一实例评估融合剂脂质体内腔与水溶液，如水的混溶性。
如前述实例中所描述地制备融合剂脂质体。对照为具有低渗溶液、高渗溶液或正常渗透溶液的透析膜。
将融合剂脂质体、阳性对照(正常渗透溶液)和阴性对照(低渗溶液)与低渗溶液(150mOsmol)一起培育。在将每个样品暴露于水溶液之后，在显微镜下测量细胞大小。在一些实施例中，相比于阴性对照，融合剂脂质体和阳性对照大小在低渗溶液中增加。
将融合剂脂质体、阳性对照(正常渗透溶液)和阴性对照(高渗溶液)与高渗溶液(400mOsmol)一起培育。在将每个样品暴露于水溶液之后，在显微镜下测量细胞大小。在一些实施例中，相比于阴性对照，融合剂脂质体和阳性对照大小在高渗溶液中将减小。
将融合剂脂质体、阳性对照(低渗或高渗溶液)和阴性对照(正常渗透)与正常渗透溶液(290mOsmol)一起培育。在将每个样品暴露于水溶液之后，在显微镜下测量细胞大小。在一些实施例中，相比于阴性对照，正常渗透溶液中的融合剂脂质体和阳性对照大小将保持基本上相同。
实例66：测量胞质溶胶中的酯酶活性
这一实例描述融合剂脂质体中的酯酶活性的定量，作为代谢活性的替代。通过钙黄绿素-AM染色的定量评估来确定融合剂脂质体中的胞质酯酶活性(Bratosin等人,《细胞测量术(Cytometry)》66(1):78-84,2005)。
膜渗透性染料钙黄绿素-AM(分子探针公司(Molecular Probes)，尤金或美国)制备为10mM的二甲亚砜储备溶液和100mM的PBS缓冲液，pH 7.4的工作溶液。将通过前述实例中所描述的方法中的任一种产生的融合剂脂质体或阳性对照亲本小鼠胚胎成纤维细胞悬浮于PBS缓冲液中，并且与钙黄绿素-AM工作溶液(钙黄绿素-AM中的最终浓度：5mM)一起在37℃下在黑暗中培育30分钟，并且然后在PBS缓冲液中稀释以立即进行钙黄绿素荧光保留的流式细胞测量分析。
如(Jacob等人,《细胞测量术(Cytometry)》12(6):550-558,1991)中所描述，用皂苷将融合剂脂质体和对照亲本小鼠胚胎成纤维细胞实验性透化为零酯酶活性的阴性对照。将融合剂脂质体和细胞在含有0.05％叠氮化钠的1％皂苷于PBS缓冲液，pH 7.4中的溶液中培育15分钟。由于质膜透化的可逆性质，在用于另外染色和洗涤步骤的所有缓冲液中均包含皂苷。在皂苷透化后，将融合剂脂质体和细胞悬浮于含有0.1％皂苷和0.05％叠氮化钠PBS缓冲液中并且与钙黄绿素-AM一起培育(37℃在黑暗中持续45分钟)到5mM的最终浓度，用含有0.1％皂苷和0.05％叠氮化钠的相同的PBS缓冲液洗涤三次，并且通过流式细胞测量术进行分析。在FACS细胞仪(美国加利福尼亚州圣何塞的百克顿-迪金森公司)上进行流式细胞测量术分析，在530+/-30nm处收集488nm氩气激光激发和发射。FACS软件用于采集和分析。将光散射通道设定为线性增益，并将荧光通道设定为对数标度，其中在每种条件下分析最少10,000个细胞。基于每个样品中的钙黄绿素-AM的强度计算相对酯酶活性。在正向和侧向散射通道中捕获所有事件(替代地，可以应用门来仅选择融合剂脂质体群体)。通过减去对应的阴性对照皂苷处理的样品的荧光强度(FI)值来确定融合剂脂质体的FI值。将融合剂脂质体样品的标准化酯酶活性相对于对应的阳性对照细胞样品进行标准化，以产生胞质酯酶活性的定量测量结果。
在一些实施例中，融合剂脂质体制剂相比于阳性对照细胞将具有1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大内的酯酶活性。
也参见Bratosin D,Mitrofan L,Palii C,Estaquier J,Montreuil J.使用钙黄绿素-AM的新型荧光分析，用于测定人类红细胞活力和衰老(Novel fluorescence assayusing calcein-AM for the determination of human erythrocyte viability andaging.)《细胞测量术A》2005年7月；66(1):78-84；以及Jacob BC,Favre M,Bensa JC.用皂苷的膜细胞透化和通过流式细胞测量术的多参数分析(Membrane cell permeabilisationwith saponin and multiparametric analysis by flow cytometry.)《细胞测量术》1991；12:550-558。
实例67：测量融合剂脂质体中的乙酰胆碱酯酶活性
遵循先前描述的程序(Ellman等人,《生化药理学(Biochem.Pharmacol.)》7,88,1961)并遵循制造商的建议使用试剂盒(MAK119，西格玛)测量乙酰胆碱酯酶活性。
简单来说，将融合剂脂质体悬浮于含1.25mM乙酰硫代胆碱的PBS，pH 8中，与含0.1mM 5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)的PBS，pH 7混合。在室温下进行培育，但在开始光学密度读取之前，将融合剂脂质体和底物溶液在37℃下预温热10分钟。
用培养板读取器分光光度计(ELX808，BIO-TEK instruments,美国佛蒙特州威努斯基(Winooski,VT,USA))在450nm处监测吸收变化10分钟。单独地，样品用于通过二喹啉甲酸分析来确定融合剂脂质体的蛋白质含量以进行标准化。使用这个分析，融合剂脂质体被确定为具有<100AChE活性单位/μg蛋白质。
在一些实施例中，AChE活性单位/μg蛋白质值将小于0.001、0.01、0.1、1、10、100或1000。
实例68：测量代谢活性水平
这一实例描述融合剂脂质体中的柠檬酸合酶活性的测量的定量。
柠檬酸合酶为三羧酸(TCA)循环内的一种酶，其催化草酰乙酸(OAA)与乙酰基-CoA之间的反应以产生柠檬酸盐。在乙酰基-CoA水解后，会释放具有硫醇基的CoA(CoA-SH)。硫醇基与化学试剂5,5-二硫基双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)反应，以形成5-硫基-2-硝基苯甲酸(TNB)，其为可以分光光度法在412nm处测量的黄色产物(Green 2008)。可商购的试剂盒，如艾碧康人类柠檬酸合酶活性分析试剂盒(产品编号ab119692)提供了执行这个测量所需的所有试剂。
根据制造商的建议进行分析。如下制备融合剂脂质体样品溶解物：收集通过先前实例中所描述的方法中的任一种产生的融合剂脂质体并将其在提取缓冲液(Abcam)中在冰上溶解20分钟。在离心之后收集上清液，并通过二喹啉甲酸分析(BCA，赛默飞世尔科技)评估蛋白质含量，并且将制剂保持于冰上直到引发以下定量方案。
简单来说，将融合剂脂质体溶解物样品在提供的微盘孔中的1×培育缓冲液(艾碧康)中稀释，其中一组孔仅接受1×培育缓冲液。将盘密封并且在室温下在300rpm振荡下培育4小时。然后从孔中吸出缓冲液并添加1×洗涤缓冲液。再次重复这个洗涤步骤。随后，将1×活性溶液添加到每个孔，并且通过每20秒测量412nm处的吸光度持续30分钟，并在读取之间振荡而在微盘读取器上分析培养板。
从所有孔减去背景值(仅具有1×培育缓冲液的孔)，并且将柠檬酸合酶活性表示为每微克装载的融合剂脂质体溶解物样品每分钟吸光度的变化(Δ[email protected]/min/μg蛋白质)。仅使用动力学测量的100-400秒的线性部分来计算活性。
在一些实施例中，融合剂脂质体制剂相比于对照细胞将具有在1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大内的合酶活性。
参见例如Green HJ等人，在运动和恢复的连续三天内，人体肌肉中的代谢、酶和转运体反应(Metabolic,enzymatic,and transporter response in human muscle duringthree consecutive days of exercise and recovery.)《美国生理调节、综合和比较生理学杂志(Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol)》295:R1238-R1250,2008。
实例69：测量呼吸水平
这一实例描述融合剂脂质体中的呼吸水平的测量的定量。细胞中的呼吸水平可以为耗氧量的量度，其促进代谢。通过Seahorse细胞外通量分析仪(安捷伦(Agilent))测量融合剂脂质体呼吸的耗氧量(Zhang 2012)。
将通过前述实例中所描述的方法中的任一种产生的融合剂脂质体或细胞接种于96孔Seahorse微盘(安捷伦)中。将微盘短暂离心以将孔底部的融合剂脂质体和细胞制成球粒。如下起始耗氧量分析：通过去除生长培养基，用含有25mM葡萄糖和2mM谷氨酰胺(安捷伦)的低缓冲DMEM基本培养基代替并且在37℃下培育微盘60分钟以使温度和pH平衡。
然后在细胞外通量分析仪(安捷伦)中分析微盘，所述分析仪测量紧贴在附着的融合剂脂质体和细胞周围的培养基中的细胞外氧和pH的变化。在获得稳态耗氧量(基础呼吸速率)和细胞外酸化速率后，将抑制ATP合酶的寡霉素(5μM)和将线粒体解偶联的质子离子载体FCCP(羰基氰化物4-(三氟甲氧基)苯腙；2μM)添加到微盘的每个孔，以获得最大耗氧速率的值。
最后，添加5μM抗霉素A(线粒体复合物III的抑制剂)以确认呼吸变化主要是由于线粒体呼吸。从所有耗氧量测量结果中减去添加抗霉素A后的最低耗氧率，以去除非线粒体呼吸组分。分析中不包含对寡霉素(耗氧速率相比于基础至少降低25％)或FCCP(耗氧速率相比于基础至少增加50％)的应答不恰当的细胞样品。然后将融合剂脂质体呼吸水平测量为pmol O2/min/1e4融合剂脂质体。
然后将这个呼吸水平标准化为对应的细胞呼吸水平。在一些实施例中，融合剂脂质体相比于各别细胞样品将具有在至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大内的呼吸水平。
参见例如Zhang J,Nuebel E,Wisidagama DRR等人测量经培养的细胞，包含人类多能干细胞和分化细胞中的能量代谢(Measuring energy metabolism in culturedcells,including human pluripotent stem cells and differentiated cells.)《自然实验手册(Nature protocols.)》2012；7(6):10.1038/nprot.2012.048.doi:10.1038/nprot.2012.048。
实例70：测量融合剂脂质体的磷脂酰丝氨酸水平
这一实例描述膜联蛋白-V结合到融合剂脂质体表面的水平的定量。
染色细胞可以在细胞表面上显示磷脂酰丝氨酸，其为程序性细胞死亡路径中细胞凋亡的标记。膜联蛋白-V结合到磷脂酰丝氨酸，并且因此，膜联蛋白-V结合为细胞活力的代替。
如本文所描述地产生融合剂脂质体。为了检测凋亡信号，用5％膜联蛋白V荧光剂594(A13203，马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔)对融合剂脂质体或阳性对照细胞进行染色。每组(详述于下表中)包含用凋亡诱导剂甲萘醌处理的实验组。将甲萘醌以100μM甲萘醌添加4小时。所有样品在流式细胞仪(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔)上运行，并且用YL1激光在561nm的波长和585/16nm的发射滤光片测量荧光强度。通过比较所有组中的膜联蛋白V的荧光强度来定量细胞外磷脂酰丝氨酸的存在。
阴性对照未染色的融合剂脂质体对膜联蛋白V染色不呈阳性。
在一些实施例中，融合剂脂质体能够回应于甲萘醌上调细胞表面上的磷脂酰丝氨酸显示，指示非甲萘醌刺激的融合剂脂质体未经历凋亡。在一些实施例中，用甲萘醌刺激的阳性对照细胞展现比未用甲萘醌刺激的融合剂脂质体更高水平的膜联蛋白V染色。
表22：膜联蛋白V染色参数
实验组
膜联蛋白V信号的平均荧光强度(和标准差)
未染色的融合剂脂质体(阴性对照)
941(937)
染色的融合剂脂质体
11257(15826)
染色的融合剂脂质体+甲萘醌
18733(17146)
染色的巨噬细胞+甲萘醌(阳性对照)
14301(18142)
实例71：测量近分泌信号传导水平
这一实例描述融合剂脂质体中的近分泌信号传导的定量。
细胞可以通过近分泌信号传导形成细胞接触依赖性信号传导。在一些实施例中，融合剂脂质体中近分泌信号传导的存在将证明融合剂脂质体可以刺激、抑制与其紧邻的细胞并且通常与所述细胞通信。
通过前述实例中所描述的方法中的任一种从具有部分或完全核灭活的哺乳动物骨髓基质细胞(BMSC)产生的融合剂脂质体通过巨噬细胞中的近分泌信号传导触发IL-6分泌。将初级巨噬细胞与BMSC共培养。首先将骨髓源性巨噬细胞接种到6孔培养板中，并且培育24小时，然后将初级小鼠BMS源性融合剂脂质体或BMSC细胞(阳性对照亲本细胞)置放于具有10％FBS的DMEM培养基中的巨噬细胞上。在不同时间点(2、4、6、24小时)收集上清液并通过ELISA分析来分析IL-6分泌。(Chang J.等人,2015)。
在一些实施例中，通过增加培养基中的巨噬细胞分泌的IL-6水平来测量由BMSC融合剂脂质体诱导的近分泌信号传导的水平。在一些实施例中，近分泌信号传导的水平将为由阳性对照骨髓基质细胞(BMSC)诱导的水平的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大。
实例72：测量旁分泌信号传导水平
这一实例描述融合剂脂质体中的旁分泌信号传导的定量。
细胞可以通过旁分泌信号传导与局部微环境中的其它细胞通信。在一些实施例中，融合剂脂质体将能够进行旁分泌信号传导，例如以与其局部环境中的细胞通信。在一些实施例中，融合剂脂质体通过以下方案通过旁分泌衍生的分泌在内皮细胞中触发Ca2+信号传导的能力将通过钙指示剂fluo-4AM来测量Ca2+信号传导。
为了制备实验培养板，将鼠类肺微血管内皮细胞(MPMVEC)接种于0.2％明胶涂布的25mm玻璃底共聚焦培养皿上(80％汇合)。将MPMVEC在室温下在含有2％BSA和0.003％普朗尼克酸(pluronic acid)的ECM中培育30分钟，最终浓度为5μM fluo-4AM(英杰公司)，以允许装载fluo-4AM。在装载之后，将MPMVEC用含有苯磺唑酮的成像溶液(含有0.25％BSA的ECM)洗涤，以使染料损失降到最低。在装载fluo-4之后，将500μl预温热的实验成像溶液添加到培养板，并且通过Zeiss共聚焦成像系统对培养板进行成像。
在单独的试管中，将新鲜分离的鼠类巨噬细胞在培养基(DMEM+10％FBS)中用1μg/mL LPS处理或不用LPS处理(阴性对照)。在刺激后，通过前述实例中所描述的方法中的任一种从巨噬细胞产生融合剂脂质体。
然后在含有2％BSA和0.003％普朗尼克酸的ECM中用cell tracker red CMTPX(英杰公司)标记融合剂脂质体或亲本巨噬细胞(阳性对照)。然后将融合剂脂质体和巨噬细胞洗涤并且再悬浮于实验成像溶液中。将标记的融合剂脂质体和巨噬细胞添加到共聚焦培养板中的装有fluo-4AM的MPMVEC上。
使用具有氩离子激光源的Zeiss共聚焦成像系统每3秒记录一次绿色和红色荧光信号，持续10-20分钟，其中分别针对fluo-4AM和cell tracker red荧光在488nm和561nm处激发。使用成像软件分析Fluo-4荧光强度变化(Mallilankaraman,K.等人,《可视化实验杂志(J Vis Exp.)》(58):3511,2011)。从LPS刺激的融合剂脂质体和细胞组中减去阴性对照融合剂脂质体和细胞组中测量的Fluo-4强度水平。
在一些实施例中，相比于阳性对照细胞组，融合剂脂质体，例如活化的融合剂脂质体将诱导至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大的Fluo-4荧光强度增加。
实例73：针对迁移率测量使肌动蛋白聚合的能力
这一实例描述融合剂脂质体中的细胞骨架组分(如肌动蛋白)的定量。在一些实施例中，融合剂脂质体包括如肌动蛋白的细胞骨架组分，并且能够进行肌动蛋白聚合。
细胞将肌动蛋白(其为细胞骨架组分)用于迁移和其它细胞质过程。细胞骨架对于产生迁移驱动力和协调运动过程至关重要。
如本文所描述地使C2C12细胞去核。将从12.5％和15％Ficoll层获得的融合剂脂质体合并标记为‘轻’，而将来自16-17％层的融合剂脂质体合并并标记为‘中等’。将融合剂脂质体或细胞(亲本C2C12细胞，阳性对照)再悬浮于DMEM+Glutamax+10％胎牛血清(FBS)中，接种于24孔超低附着培养板(#3473，纽约州康宁的康宁公司(Corning Inc,Corning,NY))中并且在37°℃+5％CO2下培育。定期(5.25小时、8.75小时、26.5小时)获取样品并且用165μM若丹明鬼笔环肽染色(阴性对照不染色)，并且在流式细胞仪(#A24858，马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔)上用FC激光YL1(561nm，具有585/16滤光片)测量以测量F-肌动蛋白细胞骨架含量。测量融合剂脂质体以及未染色的融合剂脂质体和染色的亲本C2C12细胞中若丹明鬼笔环肽的荧光强度。
融合剂脂质体荧光强度在所有时间点均大于阴性对照(图4)，并且融合剂脂质体能够以与亲本C2C12细胞类似的速率聚合肌动蛋白。
通过可商购的ELISA系统(Cell Signaling Technology and MyBioSource)，根据制造商的说明书测量其它细胞骨架组分，如下表中所列的那些。
表23：细胞骨架组分
然后将100μL适当稀释的溶解物从微孔条带添加到适当的孔中。将微孔用胶带密封并且在37℃下培育2小时。在培育之后，去除密封胶带并且丢弃内含物。每个微孔用200μL的1×洗涤缓冲液洗涤四次。在每次单独洗涤之后，将培养板在吸水布上敲打，以便从每个孔中去除残留的洗涤溶液。但是，孔在实验期间的任何时候都不是完全干燥的。
随后，将100μL复原的检测抗体(绿色)添加到每个单独的孔中，阴性对照孔除外。然后将孔密封并且在37℃下培育1小时。在培育完成之后重复洗涤程序。将100μL复原的HRP连接的二级抗体(红色)添加到每个孔中。将孔用胶带密封并且在37℃下培育30分钟。然后去除密封胶带并且重复洗涤程序。然后将100μL TMB底物添加到每个孔中。将孔用胶带密封，然后在37℃下培育10分钟。一旦完成这个最终培育，将100μL终止溶液添加到每个孔中并且将培养板轻轻振荡几秒。
在添加终止溶液的30分钟内进行所述分析的分光光度法分析。用无绒组织擦拭孔的底面并且然后在450nm处读取吸光度。在一些实施例中，已用检测抗体染色的融合剂脂质体样品将在450nm处吸收比阴性对照融合剂脂质体样品更多的光，并且比已用检测抗体染色的细胞样品吸收更少的光。
实例74：测量平均膜电位
这一实例描述融合剂脂质体的线粒体膜电位的定量。在一些实施例中，包括线粒体膜的融合剂脂质体将维持线粒体膜电位。
线粒体代谢活性可以通过线粒体膜电位来测量。使用可商购的染料TMRE定量融合剂脂质体制剂的膜电位，以评估线粒体膜电位(TMRE：四甲基若丹明，乙酯，高氯酸盐，艾碧康，目录号T669)。
通过前述实例中所描述的方法中的任一种来产生融合剂脂质体。在生长培养基(具有10％胎牛血清的无酚红DMEM)中以6等份(未处理和FCCP处理的一式三份)稀释融合剂脂质体或亲本细胞。将样品的一个等分试样与FCCP一起培育，所述FCCP是消除线粒体膜电位并且防止TMRE染色的解偶联剂。对于经FCCP处理的样品，将2μM FCCP添加到样品并且在分析之前培育5分钟。然后用30nM TMRE对融合剂脂质体和亲本细胞进行染色。对于每个样品，还并行地制备未染色的(无TMRE)样品。将样品在37℃下培育30分钟。然后将样品在具有488nm氩激光的流式细胞仪上分析，并且在530+/-30nm处收集激发和发射。
基于TMRE的强度计算膜电位值(以毫伏，mV为单位)。在正向和侧向散射通道中捕获所有事件(替代地，可以应用门来排除小碎屑)。通过从未经处理和经FCCP处理的样品的几何平均值减去未染色的样品的荧光强度的几何平均值来将未经处理和经FCCP处理的样品的荧光强度(FI)值标准化。使用标准化荧光强度值用修正的能斯特方程式(Nernstequation)(参见下文)来计算每种制剂的膜电位状态，所述方程式可以用于基于TMRE荧光来确定融合剂脂质体或细胞的线粒体膜电位(因为TMRE以能斯特方式在线粒体中积聚)。
用下式计算融合剂脂质体或细胞膜电位：(mV)＝-61.5*log(FI未处理-标准化/FIFCCP处理-标准化)。在一些实施例中，对来自C2C12小鼠成肌细胞的融合剂脂质体制剂使用这个分析，融合剂脂质体制剂的膜电位状态将在亲本细胞的约1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大内。在一些实施例中，膜电位的范围为约-20mV到-150mV。
实例75：测量受试者中的持久性半衰期
这一实例描述融合剂脂质体半衰期的测量。
融合剂脂质体来源于表达gaussia荧光素酶的细胞，通过前述实例中所描述的方法中的任一种产生，并且在缓冲溶液中制备纯、1:2、1:5和1:10稀释液。将缺少融合剂脂质体的缓冲溶液用作阴性对照。
将每个剂量静脉内施用到三只八周龄雄性C57BL/6J小鼠(杰克逊实验室)。在静脉内施用融合剂脂质体后1、2、3、4、5、6、12、24、48和72小时从眼眶后静脉收集血液。在实验结束时通过CO2吸入将动物处死。
将血液在室温下离心20分钟。立即将血清样品冷冻于-80℃下直到生物分析。随后，在将样品与Gaussia荧光素酶底物(Nanolight，亚利桑那州派恩托普(Pinetop,AZ))混合后，将每个血液样品用于进行Gaussia荧光素酶活性分析。简单来说，将考伦特嗪，一种荧光素或发光分子与快速分析缓冲液混合并且将混合物吸移到含有血液样品的96孔培养板的孔中。缺少血液的阴性对照孔含有分析缓冲液以确定背景Gaussia荧光素酶信号。
另外，制备阳性对照纯化的Gaussia荧光素酶(Athena Enzyme Systems,目录号0308)的标准曲线以便将每小时发光信号转化为Gaussia荧光素酶分泌的分子。使用500毫秒积分来分析培养板的发光。从所有样品减去背景Gaussia荧光素酶信号并且然后计算Gaussia荧光素酶标准曲线的线性最佳拟合曲线。如果样品读数在标准曲线内不拟合，那么将其适当稀释并再分析。将来自1、2、3、4、5、6、12、24、48和72小时处获取的样品的荧光素酶信号内插到标准曲线。使用一室模型的以下方程式计算消除速率常数ke(h-1)：C(t)＝C0 xe-kext，其中C(t)(ng/mL)为时间t(h)处的融合剂脂质体浓度并且C0为在时间＝0时的融合剂脂质体浓度(ng/mL)。将消除半衰期t1/2,e(h)计算为ln(2)/ke。
在一些实施例中，相比于阴性对照细胞，融合剂脂质体将具有至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大的半衰期。
实例76：测量融合剂脂质体在循环中的保留
这一实例描述将融合剂脂质体递送到循环中和在器官中的保留的定量。在一些实施例中，将融合剂脂质体递送到循环中，并且不被捕获和保留在器官部位中。
在一些实施例中，递送到外周循环中的融合剂脂质体逃避了网状内皮系统(RES)的捕获和保留，以便高效地到达靶位点。RES包括细胞的系统，主要是巨噬细胞，其驻留在例如脾脏、淋巴结和肝脏的实体器官中。这些细胞通常负责去除“老”细胞，如红细胞。
融合剂脂质体衍生自表达CRE重组酶的细胞(药剂)，或不表达CRE的细胞(阴性对照)。如载实例62中，制备这些融合剂脂质体用于体内注射。
接受者小鼠携带有一个被CRE蛋白修饰的loxp-荧光素酶基因组DNA基因座，所述蛋白由通过融合剂脂质体递送的mRNA制成，以开启荧光素酶的表达(JAX#005125)。可以通过生物发光成像在活动物中检测到荧光素酶。用于这个实例的阳性对照是与小鼠品系配对的接受者小鼠的后代，所述品系仅在巨噬细胞和单核细胞中表达来自其自身基因组的相同蛋白质(Cx3cr1-CRE JAX#025524)。来自这个配对的后代携带有每个等位基因之一(loxp-荧光素酶，Cx3cr1-CRE)。
通过尾静脉注射(静脉内，实例#48)将融合剂脂质体注射到小鼠的外周循环中，所述小鼠携带基因座，其在受到CRE蛋白作用时引起荧光素酶的表达。RES的非特异性捕获机制在本质上为吞噬的，将一定比例的CRE蛋白从融合剂脂质体释放到巨噬细胞中，从而引起基因组重组。IVIS测量(如实例62中所描述)鉴别非融合剂对照在何处积聚和融合。脾脏、淋巴结和肝脏中的积聚指示非特异性RES介导的融合剂脂质体捕获。在融合剂脂质体注射后24、48和96小时处进行IVIS。
将小鼠安乐死并且收集脾脏、肝脏和肠道中的主要淋巴链。
将基因组DNA从这些器官分离并且进行针对重组的基因组DNA残余物的定量聚合酶链反应。还对替代基因组位点(不被CRE靶向)进行定量，以提供样品中的细胞数目的量度。
在实施例中，将在整个动物中并且特别是在肝脏和脾脏部位，对于药剂和阴性对照两者观察到低生物发光信号。在实施例中，阳性对照将展示肝脏中增加的信号(相比于阴性对照和药剂)和脾脏中的高信号以及与淋巴结一致的分布。
在一些实施例中，这些组织的基因组PCR定量将指示在所有检查的组织中，阳性对照中的替代基因座上的高重组信号比例，而对于药剂和阴性对照，重组水平在所有组织中都将可忽略不计。
在一些实施例中，这个实例的结果将指示非融合剂对照不被RES保留，并且将能够实现广泛分布并展现高生物可用性。
实例77：在免疫抑制下的融合剂脂质体寿命
这一实例描述当融合剂脂质体组合物与免疫抑制药物共施用时，融合剂脂质体组合物的免疫原性的定量。
刺激免疫应答的疗法有时可以降低治疗功效或对接受者产生毒性。在一些实施例中，融合剂脂质体基本上为非免疫原性的。
将通过前述实例中所描述的方法中的任一种产生的融合剂脂质体的纯化组合物与免疫抑制药物共施用，并且通过融合剂脂质体的体内寿命来分析免疫原性特性。将足够数目的荧光素酶标记的融合剂脂质体连同他克莫司(TAC，4mg/kg/天；西格玛阿尔德里奇)，或媒剂(阴性对照)或无任何其它药剂(阳性对照)局部注射到正常小鼠的腓肠肌中。然后在注射后1、2、3、4、5、6、12、24、48和72小时处对小鼠进行体内成像。
简单来说，将小鼠用异氟醚麻醉并且以每千克体重375mg的剂量腹膜内施用D-荧光素。在成像时，将动物置放于不透光的室内，并且取决于生物发光的发射强度，以5秒到5分钟的整合时间收集从移植到动物体内的表达荧光素酶的融合剂脂质体发射的光子。在上述的各个时间点重复扫描相同的小鼠。BLI信号以光子数/秒(总通量)为单位定量并且呈现为log[光子数/秒]。通过比较使用或不使用TAC的强度和融合剂脂质体注射来分析数据。
在实施例中，在最终时间点，分析将展示TAC共施用组中的融合剂脂质体寿命相对于单独的融合剂脂质体和媒剂组增加。除了融合剂脂质体寿命增加以外，在一些实施例中，将观察到在每个时间点，来自融合剂脂质体加TAC组的BLI信号相对于融合剂脂质体加媒剂或单独的融合剂脂质体增加。
实例78：测量针对融合剂脂质体具有反应性的预先存在的IgG和IgM抗体
这一实例描述使用流式细胞测量术测量的预先存在的抗融合剂脂质体抗体滴度的定量。
融合剂脂质体的免疫原性的一个量度是抗体应答。识别融合剂脂质体的抗体可以能够限制融合剂脂质体活性或寿命的方式结合。在一些实施例中，本文所描述的融合剂脂质体的一些接受者将具有结合并且识别融合剂脂质体的预先存在的抗体。
在这一实例中，使用融合剂脂质体测试抗融合剂脂质体抗体滴度，所述融合剂脂质体使用异种源细胞通过前述实例中所描述的方法中的任一种产生。在这个实例中，对未用融合剂脂质体治疗的小鼠评估抗融合剂脂质体抗体的存在。值得注意的是，通过对方案进行优化，本文所描述的方法同样可以适用于人类、大鼠、猴。
阴性对照为已耗尽IgM和IgG的小鼠血清，并且阳性对照为衍生自小鼠的血清，所述小鼠已接受产生自异种源细胞的融合剂脂质体的多次注射。
为了评估结合到融合剂脂质体的预先存在的抗体的存在，来自未用融合剂脂质体治疗的小鼠的血清首先通过加热到56℃后维持30分钟而去补体，并且随后在含有3％FCS和0.1％NaN3的PBS中稀释33％。将等量的血清和融合剂脂质体(1×102-1×108个融合剂脂质体/毫升)悬浮液在4℃下培育30分钟并经小牛血清缓冲用PBS洗涤。
通过将细胞与针对小鼠IgM(BD生物科学)的Fc部分具有特异性的PE缀合的山羊抗体一起在4℃下培育45分钟而对IgM异种反应抗体染色。值得注意的是，也可以使用抗小鼠IgG1或IgG2二级抗体。来自所有组的细胞用含有2％FCS的PBS洗涤两次，并且然后在FACS系统(BD生物科学)上进行分析。通过使用对数扩增来收集荧光数据并表示为平均荧光强度。在一些实施例中，阴性对照血清将展示与无血清或单独的二级对照类似的可忽略的荧光。在一个实施例中，阳性对照展示的荧光大于阴性对照，并且大于无血清对照或单独二级对照。在一个实施例中，在发生免疫原性的情况下，来自未用融合剂脂质体处理的小鼠的血清将展示比阴性对照更多的荧光。在一个实施例中，在不发生免疫原性的情况下，来自未用融合剂脂质体处理的小鼠的血清将展示与阴性对照相比类似的荧光。
实例79：在多次施用融合剂脂质体后测量IgG和IgM抗体应答
这一实例描述在多次施用经修饰的融合剂脂质体后，经修饰的融合剂脂质体的体液反应的定量。在一些实施例中，经修饰的融合剂脂质体(例如通过本文所描述的方法修饰)将在多次(例如超过一次，例如2次或更多次)施用经修饰的融合剂脂质体后具有降低的(例如相比于施用未修饰的融合剂脂质体降低的)体液应答。
融合剂脂质体的免疫原性的一个量度是抗体应答。在一些实施例中，重复注射融合剂脂质体可以使得产生抗融合剂脂质体抗体，例如识别融合剂脂质体的抗体。在一些实施例中，识别融合剂脂质体的抗体可以能够限制融合剂脂质体活性或寿命的方式结合。
在这个实例中，在一次或多次施用融合剂脂质体后检查抗融合剂脂质体抗体滴度。通过前述实例中的任一个产生融合剂脂质体。融合剂脂质体由以下产生：未修饰的间质干细胞(下文称为MSC)、经慢病毒介导的HLA-G表达修饰的间质干细胞(下文称为MSC-HLA-G)和经慢病毒介导的空载体表达修饰的间质干细胞(下文称为MSC-空载体)。血清取自不同的组：全身和/或局部注射1、2、3、5、10次媒剂(未用融合剂脂质体处理的组)、MSC融合剂脂质体、MSC-HLA-G融合剂脂质体或MSC-空载体融合剂脂质体注射液的小鼠。
为了评估抗融合剂脂质体抗体的存在和丰度，来自小鼠的血清首先通过加热到56℃后维持30分钟去补体并且随后在具有3％FCS和0.1％NaN3的PBS中稀释33％。将等量的血清和融合剂脂质体(1×102-1×108个融合剂脂质体/毫升)在4℃下培育30分钟并经小牛血清缓冲用PBS洗涤。
通过将细胞与针对小鼠IgM(BD生物科学)的Fc部分具有特异性的PE缀合的山羊抗体一起在4℃下培育45分钟而对融合剂脂质体反应性IgM抗体染色。值得注意的是，也可以使用抗小鼠IgG1或IgG2二级抗体。来自所有组的细胞用含有2％FCS的PBS洗涤两次，并且然后在FACS系统(BD生物科学)上进行分析。通过使用对数扩增来收集荧光数据并表示为平均荧光强度。
在一些实施例中，相比于MSC融合剂脂质体或MSC-空载体融合剂脂质体，MSC-HLA-G融合剂脂质体将在注射后具有降低的抗融合剂脂质体IgM(或IgG1/2)抗体滴度(如根据FACS上的荧光强度所测量)。
实例80：修饰融合剂脂质体源细胞以表达耐受蛋白以降低免疫原性
这一实例描述衍生自经修饰的细胞源的融合剂脂质体中的免疫原性的定量。在一些实施例中，与衍生自未修饰的细胞源的融合剂脂质体相比，衍生自经修饰的细胞源的融合剂脂质体具有降低的免疫原性。
刺激免疫应答的疗法有时可以降低治疗功效或对接受者产生毒性。在一些实施例中，向受试者施用基本上非免疫原性的融合剂脂质体。在一些实施例中，可以分析细胞源的免疫原性作为融合剂脂质体免疫原性的代替。
使用慢病毒介导的HLA-G表达或空载体(阴性对照)表达修饰的iPS细胞的免疫原性特性分析如下。将足够数目的iPS细胞作为潜在的融合剂脂质体细胞源在后侧腹皮下注射到C57/B6小鼠中，并且给予适当量的时间以允许畸胎瘤形成。
一旦形成畸胎瘤便收集组织。将准备用于荧光染色的组织在OCT中冷冻，并且将准备用于免疫组织化学和H&E染色的组织固定于10％缓冲福尔马林中并包埋于石蜡中。根据一般免疫组织化学方案，将组织切片用抗体多克隆兔抗人类CD3抗体(达科公司(DAKO))、小鼠抗人类CD4 mAb(RPA-T4，BD PharMingen)、小鼠抗人类CD8 mAb(RPA-T8，BD PharMingen)染色。通过使用适当的检测试剂，即抗小鼠次级HRP(赛默飞世尔)或抗兔次级HRP(赛默飞世尔)来检测这些抗体。
使用基于过氧化物酶的可视化系统(安捷伦)来实现检测。通过对使用光学显微镜以20×视场检查的25、50或100个组织切片中存在的浸润CD4+T细胞、CD8+T细胞CD3+NK细胞取平均值来分析数据。在实施例中，与表达HLA-G的iPSC相比，未修饰的iPSC或表达空载体的iPSC将在检查的视场中存在更高数目的浸润CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD3+NK细胞。
在一些实施例中，融合剂脂质体的免疫原性特性将基本上等同于源细胞。在一些实施例中，相对于其未修饰的对应物，衍生自用HLA-G修饰的iPS细胞的融合剂脂质体将具有降低的免疫细胞浸润。
实例81：修饰融合剂脂质体源细胞以敲落免疫原性蛋白以降低免疫原性
这一实例描述衍生自细胞源的融合剂脂质体组合物的产生的定量，所述融合剂脂质体组合物已被修饰以降低具有免疫原性的分子的表达。在一些实施例中，融合剂脂质体可以来源于经修饰以降低具有免疫原性的分子的表达的细胞源。
刺激免疫应答的疗法可以降低治疗功效或对接受者产生毒性。因此，免疫原性是安全并且有效的治疗性融合剂脂质体的重要特性。某些免疫活化剂的表达可以产生免疫应答。MHC I类代表免疫活化剂的一个实例。
在这个实例中，通过前述实例中所描述的方法中的任一种来产生融合剂脂质体。融合剂脂质体由以下产生：未修饰的间质干细胞(下文称为MSC，阳性对照)、经慢病毒介导的靶向shRNA的MHC I类的表达修饰的间质干细胞(下文称为MSC-shMHC I类)和经慢病毒介导的非靶向加扰shRNA的表达修饰的间质干细胞(下文称为MSC加扰，阴性对照)。
使用流式细胞测量术对融合剂脂质体分析MHC I类的表达。洗涤适当数目个融合剂脂质体并且再悬浮于PBS中，与针对MHC I类的荧光偶联单克隆抗体(Harlan Sera-Lab，英国贝尔顿(Belton,UK))的1:10-1:4000稀释液一起在冰上保存30分钟。将融合剂脂质体在PBS中洗涤三次并且再悬浮于PBS中。使用与等稀释的同型对照抗体一起培育并且适当荧光结合的融合剂脂质体制剂的相等的等分试样来确定非特异性荧光。在流式细胞仪(FACSort，百克顿-迪金森)中分析逆融合剂脂质体并且用流程分析软件(百克顿-迪金森)来分析数据。
比较衍生自MSC、MSC-shMHC I类、MSC-加扰的融合剂脂质体的平均荧光数据。在一些实施例中，相比于MSC和MSC-加扰，衍生自MSC-shMHC I类的融合剂脂质体将具有较低的MHC I类表达。
实例82：修饰融合剂脂质体源细胞以逃避巨噬细胞吞噬作用
这一实例描述通过经修饰的融合剂脂质体逃避吞噬作用的定量。在一些实施例中，经修饰的融合剂脂质体将通过巨噬细胞逃避吞噬作用。
细胞参与吞噬，吞噬粒子，从而能够封存和破坏外来侵入物，如细菌或死细胞。在一些实施例中，融合剂脂质体被巨噬细胞吞噬将降低其活性。
通过前述实例中所描述的方法中的任一种来产生融合剂脂质体。融合剂脂质体由以下产生：缺少CD47的CSFE标记的哺乳动物细胞(下文称为NMC，阳性对照)、使用慢病毒介导的CD47 cDNA的表达工程改造以表达CD47的CSFE标记的细胞(下文称为NMC-CD47)和使用慢病毒介导的空载体对照的表达工程改造的CSFE标记的细胞(下文称为NMC-空载体，阴性对照)。
根据以下方案通过吞噬作用分析来确定巨噬细胞介导的免疫清除的降低。将巨噬细胞在收获后立即接种于共聚焦玻璃底培养皿中。在DMEM+10％FBS+1％P/S中培育巨噬细胞1小时以附着。如方案中所指示地将适当数目的衍生自NMC、NMC-CD47、NMC-空载体的融合剂脂质体添加到巨噬细胞，并且培育2小时，tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp06694.pdf。
2小时之后，轻轻地洗涤培养皿并检查细胞内荧光。通过共聚焦显微镜在488激发下对由吞噬粒子发出的细胞内荧光成像。使用成像软件对吞噬阳性巨噬细胞的数目进行定量。数据被表示为吞噬指数＝(吞噬细胞的总数/计数的巨噬细胞的总数)×(含有吞噬细胞的巨噬细胞的数目/计数的巨噬细胞的总数)×100。
在一些实施例中，相对于衍生自NMC或NMC-空载体的融合剂脂质体，当巨噬细胞与衍生自NMC-CD47的融合剂脂质体一起培育时，吞噬指数将减小。
实例83：修饰融合剂脂质体源细胞以减少由PBMC细胞溶解介导的细胞毒性
这一实例描述衍生自细胞的融合剂脂质体的产生，所述细胞被修饰以具有降低的归因于PBMC细胞溶解的细胞毒性。
在一些实施例中，细胞毒性介导的PBMC对源细胞或融合剂脂质体的细胞溶解是融合剂脂质体的免疫原性的量度，因为溶解将降低(例如抑制或终止)融合剂脂质体的活性。
在这个实例中，通过前述实例中所描述的方法中的任一种来产生融合剂脂质体。融合剂脂质体由以下产生：未修饰的间质干细胞(下文称为MSC，阳性对照)、经慢病毒介导的HLA-G表达修饰的间质干细胞(下文称为MSC-HLA-G)和经慢病毒介导的空载体表达修饰的间质干细胞(下文称为MSC-空载体，阴性对照)。
PMBC介导的融合剂脂质体溶解是通过如Bouma等人《人类免疫学(Hum.Immunol.)》35(2):85-92；1992以及van Besouw等人，《移植(Transplantation)》70(1):136-143；2000。从适当供体中分离出PBMC(下文称为效应子细胞)，并且在37℃下在圆底96孔培养板中用γ照射的同种异体PMBC和200IU/mL IL-2(阿地介白素(proleukin)，Chiron BV，荷兰阿姆斯特丹(Amsterdam,The Netherlands))刺激7天。将融合剂脂质体用铕-二亚乙基三胺五乙酸盐(DTPA)(美国密苏里州圣路易斯的西格玛)标记。
在第7天，通过在接种之后，以1000:1-1:1与1:1.25-1:1000范围内的效应子细胞/靶细胞比将63Eu标记的融合剂脂质体与效应子细胞一起在96孔培养板中培育1、2、3、4、5、6、8、10、15、20、24、48小时来进行细胞毒性介导的溶解分析。在培育之后，将培养板离心并且将上清液样品转移到具有低背景荧光的96孔培养板(荧光免疫培养板，Nunc，丹麦罗斯基勒(Roskilde,Denmark))。
随后，将增强溶液(荷兰格罗宁根的珀金埃尔默(PerkinElmer,Groningen,TheNetherlands))添加到每个孔。用时间分辨荧光计(Victor 1420多标记计数器，芬兰LKB-Wallac)测量所释放的铕。荧光以每秒计数(CPS)表示。通过将适当数目(1×102-1×108)的融合剂脂质体与1％曲通(triton)(西格玛-奥德里奇)培育适当的时间来测定靶融合剂脂质体释放郁的最大百分比。通过在没有效应子细胞的情况下培育标记的靶融合剂脂质体来测量由靶融合剂脂质体自发释放的铕。然后按照：(自发释放/最大释放)×100％来计算渗漏百分比。最后，将细胞毒性介导的溶解的百分比计算为溶解％＝[(测量的溶解-自发溶解-自发释放)/(最大释放-自发释放)]×100％。通过观察溶解百分比与不同效应子靶标比的关系来分析数据。
在一些实施例中，相比于MSC或MSC-加扰产生的融合剂脂质体，由MSC-HLA-G细胞产生的融合剂脂质体将在特定时间点具有减小的靶细胞溶解百分比。
实例84：修饰融合剂脂质体源细胞以降低NK溶解活性
这一实例描述衍生自细胞源的融合剂脂质体组合物的产生，所述融合剂脂质体组合物已被修饰以降低细胞毒性介导的通过NK细胞的细胞溶解。在一些实施例中，细胞毒性介导的源细胞或融合剂脂质体通过NK细胞的细胞溶解是融合剂脂质体的免疫原性的量度。
在这个实例中，通过前述实例中所描述的方法中的任一种来产生融合剂脂质体。融合剂脂质体由以下产生：未修饰的间质干细胞(下文称为MSC，阳性对照)、经慢病毒介导的HLA-G表达修饰的间质干细胞(下文称为MSC-HLA-G)和经慢病毒介导的空载体表达修饰的间质干细胞(下文称为MSC-空载体，阴性对照)。
NK细胞介导的融合剂脂质体溶解是通过如以下文献中所描述的铕释放分析来测定：Bouma等人《人类免疫学》35(2):85-92；1992以及van Besouw等人，《移植》70(1):136-143；2000。根据Crop等人《细胞移植》(20):1547-1559；2011中的方法从适当供体分离出NK细胞(下文称为效应子细胞)，并且在37℃下在圆底96孔培养板中用γ照射的同种异体PMBC和200IU/mL IL-2(阿地介白素，Chiron BV，荷兰阿姆斯特丹)刺激7天。将融合剂脂质体用铕-二亚乙基三胺五乙酸盐(DTPA)(美国密苏里州圣路易斯的西格玛)标记。
在第7天，通过在接种之后，以1000:1-1:1与1:1.25-1:1000范围内的效应子细胞/靶细胞比将63Eu标记的融合剂脂质体与效应子细胞一起在96孔培养板中培育1、2、3、4、5、6、8、10、15、20、24、48小时来进行细胞毒性介导的溶解分析。在培育之后，将培养板离心并且将上清液样品转移到具有低背景荧光的96孔培养板(荧光免疫培养板，Nunc，丹麦罗斯基勒(Roskilde,Denmark))。
随后，将增强溶液(荷兰格罗宁根的珀金埃尔默)添加到每个孔。用时间分辨荧光计(Victor 1420多标记计数器，芬兰LKB-Wallac)测量所释放的铕。荧光以每秒计数(CPS)表示。通过将适当数目(1×102-1×108)的融合剂脂质体与1％曲通(triton)(西格玛-奥德里奇)培育适当的时间来测定靶融合剂脂质体释放郁的最大百分比。通过在没有效应子细胞的情况下培育标记的靶融合剂脂质体来测量由靶融合剂脂质体自发释放的铕。然后按照：(自发释放/最大释放)×100％来计算渗漏百分比。最后，将细胞毒性介导的溶解的百分比计算为溶解％＝[(测量的溶解-自发溶解-自发释放)/(最大释放-自发释放)]×100％。通过观察溶解百分比与不同效应子靶标比的关系来分析数据。
在一些实施例中，相比于MSC或MSC-加扰产生的融合剂脂质体，由MSC-HLA-G细胞产生的融合剂脂质体将在适当时间点具有减小的溶解百分比。
实例85：修饰融合剂脂质体源细胞以降低CD8杀手T细胞溶解
这一实例描述衍生自细胞源的融合剂脂质体组合物的产生，所述融合剂脂质体组合物已被修饰以降低细胞毒性介导的通过CD8+T细胞的细胞溶解。在一些实施例中，细胞毒性介导的源细胞或融合剂脂质体通过CD8+T细胞的细胞溶解是融合剂脂质体的免疫原性的量度。
在这个实例中，通过前述实例中所描述的方法中的任一种来产生融合剂脂质体。融合剂脂质体由以下产生：未修饰的间质干细胞(下文称为MSC，阳性对照)、经慢病毒介导的HLA-G表达修饰的间质干细胞(下文称为MSC-HLA-G)和经慢病毒介导的空载体表达修饰的间质干细胞(下文称为MSC-空载体，阴性对照)。
CD8+T细胞介导的融合剂脂质体溶解是通过如以下文献中所描述的铕释放分析来测定：Bouma等人《人类免疫学》35(2):85-92；1992以及van Besouw等人，《移植》70(1):136-143；2000。根据Crop等人《细胞移植》(20):1547-1559；2011中的方法从适当供体分离出CD8+T细胞(下文称为效应子细胞)，并且在37℃下在圆底96孔培养板中用γ照射的同种异体PMBC和200IU/mL IL-2(阿地介白素，Chiron BV，荷兰阿姆斯特丹)刺激7天。将融合剂脂质体用铕-二亚乙基三胺五乙酸盐(DTPA)(美国密苏里州圣路易斯的西格玛)标记。
在第7天，通过在接种之后，以1000:1-1:1与1:1.25-1:1000范围内的效应子细胞/靶细胞比将63Eu标记的融合剂脂质体与效应子细胞一起在96孔培养板中培育1、2、3、4、5、6、8、10、15、20、24、48小时来进行细胞毒性介导的溶解分析。在培育之后，将培养板离心并且将20μL的上清液转移到具有低背景荧光的96孔培养板(荧光免疫培养板，Nunc，丹麦罗斯基勒)。
随后，将增强溶液(荷兰格罗宁根的珀金埃尔默)添加到每个孔。用时间分辨荧光计(Victor 1420多标记计数器，芬兰LKB-Wallac)测量所释放的铕。荧光以每秒计数(CPS)表示。通过将适当数目(1×102-1×108)的融合剂脂质体与1％曲通(triton)(西格玛-奥德里奇)培育适当的时间来测定靶融合剂脂质体释放郁的最大百分比。通过在没有效应子细胞的情况下培育标记的靶融合剂脂质体来测量由靶融合剂脂质体自发释放的铕。然后按照：(自发释放/最大释放)×100％来计算渗漏百分比。最后，将细胞毒性介导的溶解的百分比计算为溶解％＝[(测量的溶解-自发溶解-自发释放)/(最大释放-自发释放)]×100％。通过观察溶解百分比与不同效应子靶标比的关系来分析数据。
在一些实施例中，相比于MSC或MSC-加扰产生的融合剂脂质体，由MSC-HLA-G细胞产生的融合剂脂质体将在适当时间点具有减小的溶解百分比。
实例86：修饰融合剂脂质体源细胞以降低T细胞活化
这一实例描述经修饰的融合剂脂质体的产生，所述融合剂脂质体将具有如通过混合淋巴细胞反应(MLR)评估的降低的T细胞活化和增殖。
T细胞增殖和活化是融合剂脂质体的免疫原性的量度。通过融合剂脂质体组合物在MLR反应中刺激T细胞增殖可以表明体内T细胞增殖的刺激。
在一些实施例中，如通过混合淋巴细胞反应(MLR)所评估，从经修饰的源细胞产生的融合剂脂质体具有降低的T细胞活化和增殖。在一些实施例中，从经修饰的源细胞产生的融合剂脂质体不在体内产生免疫应答，因此维持融合剂脂质体组合物的功效。
在这个实例中，通过前述实例中所描述的方法中的任一种来产生融合剂脂质体。融合剂脂质体由以下产生：未修饰的间质干细胞(下文称为MSC，阳性对照)、经慢病毒介导的IL-10表达修饰的间质干细胞(下文称为MSC-IL-10)和经慢病毒介导的空载体表达修饰的间质干细胞(下文称为MSC-空载体，阴性对照)。
BALB/c和C57BL/6脾细胞用作刺激剂或应答细胞。值得注意的是，这些细胞的来源可以与常用的人源性刺激剂/应答细胞交换。另外，任何哺乳动物纯化的同种异体CD4+T细胞群体、CD8+T细胞群体或CD4-/CD8-可以用作应答群体。
通过机械解离使用完全磨砂的载玻片分离小鼠脾细胞，接着用溶解缓冲液(密苏里州圣路易的西格玛-奥德里奇)溶解红细胞。在实验之前，用20Gy的γ射线照射刺激细胞以防止其与应答细胞反应。然后通过将等量的刺激剂和应答细胞(或替代浓度，同时维持1:1的比)添加到含完全DMEM-10培养基的圆底96孔培养板来制备共培养物。在不同的时间间隔(t＝0、6、12、24、36、48小时)将适当数目的融合剂脂质体(以1×101-1×108范围内的若干浓度)添加到共培养物。
通过添加1μCi的[3H]-胸苷(英国白金汉郡的安玛西亚(Amersham,Buckinghamshire,UK))以允许掺入来评估增殖。在t＝2、6、12、24、36、48、72小时处将[3H]-胸苷添加到MLR，并且在2、6、12、18、24、36和48小时的延长培养之后使用96孔细胞收集器(Inoteck,Bertold,日本)将细胞收集到玻璃纤维过滤器上。所有T细胞增殖实验都一式三份地进行。使用microbeta lLuminescence计数器(马萨诸塞州韦尔斯利的珀金埃尔默)测量[3H]-胸苷掺入。结果可以表示为每分钟计数(cpm)。
在一些实施例中，相比于MSC-空载体或MSC未修饰的融合剂脂质体对照，MSC-IL10融合剂脂质体将展示T细胞增殖的减少。
实例87：测量受试者中的靶向潜力
这个实例评估融合剂脂质体靶向特定身体部位的能力。在一些实施例中，融合剂脂质体可以靶向特定身体部位。靶向是将治疗剂的活性限制于一个或多个相关治疗部位的方式。
向八周龄C57BL/6J小鼠(杰克逊实验室)静脉内注射表达萤火虫荧光素酶的融合剂脂质体或细胞。通过前述实例中所描述的方法中的任一种，从稳定表达萤火虫荧光素酶的细胞或不表达荧光素酶的细胞(阴性对照)产生融合剂脂质体。在融合剂脂质体或细胞注射后一、二、三、四、五、六、八、十二和二十四小时对小鼠组进行安乐死。
在安乐死前五分钟，小鼠接受以150mg/kg剂量腹膜内注射的生物发光底物(珀金埃尔默)以使荧光素酶可视化。生物发光成像系统被校准以补偿所有装置设置。然后使小鼠安乐死并收集肝脏、肺、心脏、脾脏、胰脏、胃肠道和肾脏。成像系统(珀金埃尔默)用于获得这些离体器官的生物发光图像。使用辐射光子测量生物发光信号，并且将总通量用作测量值。通过围绕离体器官产生感兴趣区域(ROI)，以得到以光子数/秒计的值。计算靶器官(例如肝脏)与非靶器官(例如来自肺、心脏、脾脏、胰脏、胃肠道和肾脏的光子数/秒的总和)之间的光子数/秒的比，作为靶向肝脏的量度。
在一些实施例中，在融合剂脂质体和细胞中，肝脏与其它器官之间的光子数/秒的比均将大于1，这将表明融合剂脂质体靶向肝脏。在一些实施例中，阴性对照动物将在所有器官中显示低得多的光子数/秒。
实例88：测量受试者中的外源药剂递送
这一实例描述受试者中包括外源药剂的融合剂脂质体的递送的定量。通过前述实例中所描述的方法中的任一种，从表达Gaussia荧光素酶的细胞或从不表达荧光素酶的细胞(阴性对照)制备融合剂脂质体。
将阳性对照细胞或融合剂脂质体静脉内注射到小鼠中。使用26号胰岛素注射针在5-8秒内递送融合剂脂质体或细胞。使用体内成像系统(加利福尼亚州阿拉米达的精诺真公司(Xenogen Corporation,Alameda,CA))在注射后1、2或3天对小鼠进行体内生物发光成像。
在即将使用之前，在酸化甲醇中制备考伦特嗪，一种荧光素或发光分子(5mg/mL)并且立即注射道小鼠尾静脉中。使用XGI-8气体麻醉系统在加热台上对小鼠进行连续麻醉。
通过在紧接在静脉内尾静脉注射考伦特嗪(4μg/g体重)后的5分钟内获取光子计数来获得生物发光成像。使用软件(精诺真(Xenogen))分析获取的数据并将其覆叠于光视图图像上。使用自动信号强度轮廓工具产生感兴趣区域(ROI)并且通过相同动物的背景减除进行标准化。使用三个滤光片在580nm、600nm和620nm的波长与3-10分钟暴露时间下进行连续数据获取，以定位小鼠体内的生物发光光源。
此外，在每个时间点处，通过腹部触诊收集尿液样品。
从每只小鼠的尾静脉获得血液样品(50μL)，放入肝素化或EDTA管中。对于血浆分离，将血液样品在4℃下以1.3×g离心25分钟。
接着，在将样品与50μM Gaussia荧光素酶底物(Nanolight,亚利桑那州派恩托普(Pinetop,AZ))混合之后，使用5μL血液、血浆或尿液样品进行Gaussia荧光素酶活性分析。
在一些实施例中，阴性对照样品将对荧光素酶呈阴性，并且阳性对照样品将来自所施用的动物的细胞。在一些实施例中，来自施用表达Gaussia荧光素酶的融合剂脂质体的动物的样品将在每个样品中对荧光素酶呈阳性。
参见例如El-Amouri SS等人,《分子生物技术(Molecular biotechnology)》53(1):63-73,2013。
实例89：跨融合剂脂质体的脂质双层的主动转运
这一实例描述2-NBDG(2-(N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基)-2-脱氧葡萄糖)的水平的定量，2-NBDG为一种可以用于监测活细胞中的葡萄糖摄取并且因此监测跨脂质双层的主动转运的荧光葡萄糖类似物。在一些实施例中，这个分析或等效物可以用于测量葡萄糖摄取的水平和跨融合剂脂质体的脂质双层的主动转运。
通过前述实例中所描述的方法中的任一种来产生融合剂脂质体组合物。然后将足够数目的融合剂脂质体在不含葡萄糖、20％胎牛血清和1×青霉素/链霉素的DMEM中在37℃和5％CO2下培育2小时。在2小时葡萄糖饥饿时段之后，改变培养基以使其包含不含葡萄糖、20％胎牛血清、1×青霉素/链霉素和20μM 2-NBDG(赛默飞世尔)的DMEM并且在37℃和5％CO2下培育2小时。相同地处理阴性对照融合剂脂质体，除了添加等量的DMSO(用于2-NBDG的媒剂)来代替2-NBDG。
然后将融合剂脂质体用1×PBS洗涤三次并且再悬浮于适当的缓冲液中，并转移到96孔成像培养板中。然后使用GFP光立方体(469/35激发滤光片和525/39发射滤光片)在荧光计中测量2-NBDG荧光，以定量在1小时装载时段内已跨融合剂脂质体膜转运并累积于融合剂脂质体中的2-NBDG的量。
在一些实施例中，相比于阴性(DMSO)对照，经2-NBDG处理的融合剂脂质体中的2-NBDG荧光将更高。用525/39发射滤光片的荧光测量将与存在的2-NBDG分子的数目相关。
实例90：通过非内吞路径递送融合剂脂质体
这一实例描述通过非内吞路径将融合剂脂质体递送Cre到接受者细胞的定量。
在一些实施例中，融合剂脂质体将通过融合剂脂质体介导的非内吞路径递送药剂。不希望受理论束缚，在不需要任何内吞作用介导的融合剂脂质体摄取的情况下将融合剂脂质体的内腔中携带的药剂(例如Cre)直接递送到接受者细胞的胞质溶胶将通过融合剂脂质体介导的非内吞路径递送来发生。
在这个实例中，融合剂脂质体在其质膜上包括表达仙台病毒H和F蛋白的HEK293T细胞(Tanaka等人,2015,《基因疗法》,22(2014年10月),1-8.https://doi.org/10.1038/gt.2014.123)。另外，融合剂脂质体表达mTagBFP2荧光蛋白和Cre重组酶。靶细胞为RPMI8226细胞，其在CMV启动子下稳定表达“LoxP-GFP-stop-LoxP-RFP”盒，所述启动子在通过Cre重组后从GFP转换为RFP表达，指示融合和Cre作为递送标记。
如下对通过本文所描述的方法产生的融合剂脂质体分析Cre通过非内吞路径的递送。将接受者细胞接种到黑色的透明底96孔培养板中。随后，在接种接受者细胞之后24小时，将表达Cre重组酶蛋白并且具有特定融合剂蛋白的融合剂脂质体施加到DMEM培养基中的接受者细胞。为了确定通过非内吞路径的Cre递送水平，用内体酸化抑制剂氯奎(30μg/mL)处理接受融合剂脂质体的接受者细胞的平行组。融合剂脂质体的剂量与接种于孔中的接受者细胞的数目相关。在施加融合剂脂质体之后，将细胞培养板以400g离心5分钟，以帮助引发融合剂脂质体与接受者细胞之间的接触。然后将细胞培育16小时并且通过成像评估药剂递送Cre。
对细胞进行成像以在视场或孔中阳性鉴别RFP阳性细胞相对于GFP阳性细胞。在这个实例中，使用自动化荧光显微镜对细胞培养板进行成像。通过首先在DMEM培养基中用Hoechst 33342染色细胞10分钟来确定给定孔中的总细胞群体。Hoechst 33342通过插入到DNA中染色细胞核并且因此用于鉴别个别细胞。在染色之后，将Hoechst培养基用常规DMEM培养基替换。
使用405nm LED和DAPI滤光立方体对Hoechst成像。GFP使用465nm LED和GFP滤光立方体成像，而RFP使用523nm LED和RFP滤光立方体成像。通过首先在阳性对照孔；即，用编码Cre重组酶的腺病毒而非融合剂脂质体处理的接受者细胞上确立LED强度和积分时间来采集不同细胞组的图像。
设定采集设置，以使得RFP和GFP强度处于最大像素强度值但不饱和。然后使用确立的设置对所关注的孔成像。
用配备有荧光显微镜的软件或其它软件(Rasband,W.S.,ImageJ,美国国家卫生研究院，美国马里兰州贝塞斯达1997-2007)进行GFP和RFP阳性孔的分析。使用60μm宽的滚球背景减除算法对图像进行预处理。在Hoechst阳性细胞上设置总细胞掩码。Hoechst强度显著高于背景强度的细胞用于设置阈值，并且排除太小或太大而无法成为Hoechst阳性细胞的区域。
在总细胞掩码内，通过对显著高于背景的细胞再次设置阈值并且将Hoechst(细胞核)掩码扩展到整个细胞区域以包含整个GFP和RFP细胞荧光来鉴别GFP和RFP阳性细胞。
在含有接受者细胞的对照孔中鉴别的RFP阳性细胞的数目用于从含有融合剂脂质体的孔中的RFP阳性细胞的数目减去(以减去非特异性Loxp重组)。然后将RFP阳性细胞(接受Cre的接受者细胞)的数目除以GFP阳性细胞(未接受Cre的接受者细胞)与RFP阳性细胞的总和，以定量递送到接受者细胞群体的融合剂脂质体Cre的比例。将水平标准化为施加到接受者细胞的融合剂脂质体的给定剂量。为了计算通过非内吞路径递送的融合剂脂质体Cre的值，确定在存在氯奎的情况下的融合剂脂质体Cre递送的水平(FusL+CQ)以及在不存在氯奎的情况下的融合剂脂质体Cre递送的水平(FusL-CQ)。为了确定通过非内吞路径递送的融合剂脂质体Cre的标准化值，使用以下方程式：[(FusL-CQ)-(FusL+CQ)]/(FusL-CQ)。
在一些实施例中，对于给定融合剂脂质体，通过非内吞路径递送的融合剂脂质体Cre的平均水平将在经氯奎处理的接受者细胞的0.1-0.95范围内，或至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。
实例91：通过内吞路径递送融合剂脂质体
这一实例描述融合剂脂质体通过内吞路径递送Cre到接受者细胞。
在一些实施例中，融合剂脂质体将通过融合剂脂质体介导的内吞路径递送药剂。不希望受理论束缚，在摄取路径具有内吞作用依赖性的情况下将融合剂脂质体的内腔中携带的药剂(例如货物)递送到接受者细胞将通过融合剂脂质体介导的内吞路径递送来发生。
在这个实例中，融合剂脂质体包括微囊泡，所述微囊泡通过将在质膜上表达融合剂蛋白的HEK293T细胞挤出通过2μm过滤器而产生(Lin等人,2016,《生物医学微装置(Biomedical Microdevices)》18(3).doi.org/10.1007/s10544-016-0066-y)(Riedel,Kondor-Koch和Garoff,1984,《欧洲分子生物学学会杂志(The EMBO Journal)》,3(7),1477-83.从www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6086326检索)。另外，融合剂脂质体表达mTagBFP2荧光蛋白和Cre重组酶。靶细胞为PC3细胞，其在CMV启动子下稳定表达“LoxP-GFP-stop-LoxP-RFP”盒，所述启动子在通过Cre重组后从GFP转换为RFP表达，指示融合和Cre作为递送标记。
如下对通过本文所描述的方法产生的融合剂脂质体分析通过内吞路径的Cre递送。将接受者细胞接种于与待使用的成像系统相容的细胞培养多孔培养板中(在这个实例中，将细胞接种于黑色的透明底96孔培养板中)。随后，在接种接受者细胞之后24小时，将表达Cre重组酶蛋白并且具有特定融合剂蛋白的融合剂脂质体施加到DMEM培养基中的接受者细胞。为了确定通过内吞路径的Cre递送水平，用内体酸化抑制剂氯奎(30μg/mL)处理接受融合剂脂质体的接受者细胞的平行组。融合剂脂质体的剂量与接种于孔中的接受者细胞的数目相关。在施加融合剂脂质体之后，将细胞培养板以400g离心5分钟，以帮助引发融合剂脂质体与接受者细胞之间的接触。然后将细胞培育16小时并且通过成像评估药剂递送Cre。
对细胞进行成像以在视场或孔中阳性鉴别RFP阳性细胞相对于GFP阳性细胞。在这个实例中，使用自动化荧光显微镜对细胞培养板进行成像。通过首先在DMEM培养基中用Hoechst33342染色细胞10分钟来确定给定孔中的总细胞群体。Hoechst 33342通过插入到DNA中染色细胞核并且因此用于鉴别个别细胞。在染色之后，将Hoechst培养基用常规DMEM培养基替换。
使用405nm LED和DAPI滤光立方体对Hoechst成像。GFP使用465nm LED和GFP滤光立方体成像，而RFP使用523nm LED和RFP滤光立方体成像。通过首先在阳性对照孔；即，用编码Cre重组酶的腺病毒而非融合剂脂质体处理的接受者细胞上确立LED强度和积分时间来采集不同细胞组的图像。
设定采集设置，以使得RFP和GFP强度处于最大像素强度值但不饱和。然后使用确立的设置对所关注的孔成像。
用配备有荧光显微镜的软件或其它软件(Rasband,W.S.,ImageJ,美国国家卫生研究院，美国马里兰州贝塞斯达，1997-2007)进行GFP和RFP阳性孔的分析。使用60μm宽的滚球背景减除算法对图像进行预处理。在Hoechst阳性细胞上设置总细胞掩码。Hoechst强度显著高于背景强度的细胞为阈值处理的并且排除太小或太大而无法成为Hoechst阳性细胞的区域。
在总细胞掩码内，通过对显著高于背景的细胞再次取阈值并且将Hoechst(细胞核)掩码扩展到整个细胞区域以包含整个GFP和RFP细胞荧光来鉴别GFP和RFP阳性细胞。
在含有接受者细胞的对照孔中鉴别的RFP阳性细胞的数目用于从含有融合剂脂质体的孔中的RFP阳性细胞的数目减去(以减去非特异性Loxp重组)。然后将RFP阳性细胞(接受Cre的接受者细胞)的数目除以GFP阳性细胞(未接受Cre的接受者细胞)与RFP阳性细胞的总和，以定量递送到接受者细胞群体的融合剂脂质体Cre的比例。将水平标准化为施加到接受者细胞的融合剂脂质体的给定剂量。为了计算通过内吞路径递送的融合剂脂质体Cre的值，确定在存在氯奎的情况下的融合剂脂质体Cre递送的水平(FusL+CQ)以及在不存在氯奎的情况下的融合剂脂质体Cre递送的水平(FusL-CQ)。为了确定通过内吞路径递送的融合剂脂质体Cre的标准化值，使用以下方程式：(FusL+CQ)/(FusL-CQ)。
在一些实施例中，对于给定融合剂脂质体，通过内吞路径递送的融合剂脂质体Cre的平均水平将在经氯奎处理的接受者细胞的0.01-0.6范围内，或至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。
实例92：通过发动蛋白介导的路径、巨胞饮路径或肌动蛋白介导的路径递送融合剂脂质体
这一实例描述融合剂脂质体通过发动蛋白介导的路径递送Cre到接受者细胞。可以如先前实例中所描述地产生包括微囊泡的融合剂脂质体。根据先前实例对融合剂脂质体分析通过发动蛋白介导的路径递送Cre，除了一组接受融合剂脂质体的接受者细胞用发动蛋白抑制剂Dynasore(120μM)处理。为了计算通过发动蛋白介导的路径递送的融合剂脂质体Cre的值，确定在存在Dynasore的情况下的融合剂脂质体Cre递送的水平(FusL+DS)以及在不存在Dynasore的情况下的融合剂脂质体Cre递送的水平(FusL-DS)。可以如先前实例中所描述地计算所递送的融合剂脂质体Cre的标准化值。
这个实例还描述通过巨胞饮将Cre递送到接受者细胞。可以如先前实例中所描述地产生包括微囊泡的融合剂脂质体。根据先前实例对融合剂脂质体分析通过巨胞饮递送Cre，除了一组接受融合剂脂质体的接受者细胞用巨胞饮抑制剂5-(N-乙基-N-异丙基)阿米洛利(EIPA)(25μM)处理。为了计算通过巨胞饮递送的融合剂脂质体Cre的值，确定在存在EIPA的情况下的融合剂脂质体Cre递送的水平(FusL+EPIA)以及在不存在EPIA的情况下的融合剂脂质体Cre递送的水平(FusL-EIPA)。可以如先前实例中所描述地计算所递送的融合剂脂质体Cre的标准化值。
这个实例描述融合剂脂质体通过肌动蛋白介导的路径递送Cre到接受者细胞。可以如先前实例中所描述地产生包括微囊泡的融合剂脂质体。根据先前实例对融合剂脂质体分析通过巨胞饮递送Cre，除了一组接受融合剂脂质体的接受者细胞用肌动蛋白聚合抑制剂Latrunculin B(6μM)处理。为了计算通过肌动蛋白介导的路径递送的融合剂脂质体Cre的值，确定在存在Latrunculin B的情况下的融合剂脂质体Cre递送的水平(FusL+LatB)以及在不存在Latrunculin B的情况下的融合剂脂质体Cre递送的水平(FusL-LatB)。可以如先前实例中所描述地计算所递送的融合剂脂质体Cre的标准化值。
实施例93：细胞器的递送
这一实例描述融合剂脂质体与细胞的体外融合。在一些实施例中，融合剂脂质体与细胞的体外融合可以使得将融合剂脂质体线粒体货物递送到接受者细胞。
如下分析通过本文所描述的方法所描述的方法产生的融合剂脂质体将其线粒体递送到接受者细胞的能力。
在这个特定实例中，融合剂脂质体为HEK293T细胞，所述细胞在其膜上表达融合剂蛋白，以及标记线粒体的线粒体靶向的DsRED(mito-DsRED)蛋白。将接受者细胞接种于与待使用的成像系统相容的细胞培养多孔培养板中(在这个实例中，将细胞接种于玻璃底成像培养皿中)。接受者细胞稳定表达胞质GFP。
随后，在接种接受者细胞之后24小时，将表达mito-DsRED并且具有特定融合剂蛋白的融合剂脂质体施加到DMEM培养基中的接受者细胞。融合剂脂质体的剂量与接种于孔中的接受者细胞的数目相关。在施加融合剂脂质体之后，将细胞培养板以400g离心5分钟，以帮助引发融合剂脂质体与接受者细胞之间的接触。然后将细胞培育4小时，并且通过暴露于pH 6.0磷酸盐缓冲盐水一分钟(或将对照细胞暴露于pH 7.4磷酸盐缓冲盐水)诱导VSVG介导的融合。在诱导融合之后，将细胞再培育16小时并且通过成像评估线粒体递送。
在这个实例中，将细胞在维持于37℃和5％CO2下时，在具有63×油浸物镜的ZeissLSM 710共聚焦显微镜上成像。GFP经受488nm激光激发，并且通过带通495-530nm滤光片记录发射。DsRED经受543nm激光激发，并且通过带通560-610nm滤光片记录发射。扫描细胞以阳性鉴别对胞质GFP荧光和mito-DsRED荧光呈阳性的细胞。
在相同细胞中发现胞质GFP和mito-DsRED线粒体两者的存在，表明细胞经历了VSVG介导的融合，并且因此线粒体已从融合剂脂质体递送到接受者细胞。
实例94：体外递送DNA
这一实例描述使用融合剂脂质体将DNA体外递送到细胞。这一实例定量融合剂脂质体使用编码外源基因GFP(一种替代治疗货物)的质粒递送DNA的能力。
由通过前述实例中所描述的方法中的任一种产生的细胞源性囊泡或细胞源性细胞生物制剂产生的融合剂脂质体组合物(除了融合剂脂质体)被工程改造，以使得融合剂与Cre的开放阅读框同框。在产生融合剂脂质体之后，将其另外用具有编码GFP的序列的质粒(系统生物科学公司)核染。
参见例如Chen X等人,《基因与疾病(Genes Dis.)》2015年3月；2(1):96-105.DOI:10.1016/j.gendis.2014.12.001。
作为阴性对照，将融合剂脂质体用具有编码β-肌动蛋白的序列的质粒核染。
然后将足够数目的融合剂脂质体与具有loxP-STOP-loxP-tdTomato报告子的接受者NIH/3T3成纤维细胞细胞系在37℃和5％CO2下在含有20％胎牛血清和1×青霉素/链霉素的DMEM中一起培育48小时的时段。在48小时培育之后，然后通过FACS，使用FACS细胞仪(美国加利福尼亚州圣何塞的百克顿-迪金森公司)以561nm激光激发分离tdTomato阳性细胞并且在590+/-20nm处收集发射。然后使用DNA提取溶液(Epicentre)分离总DNA并且使用扩增600bp片段的针对GFP具有特异性的引物(参见表222)进行PCR。在凝胶电泳后存在于凝胶上的600bp片段将接着证实向接受者细胞的DNA递送的存在。
表24.扩增500bp片段的GFP引物序列
引物
序列(SEQ ID NO)
GFP-F
ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC(SEQ ID NO:600)
GFP-R
GTCCTTTTACCAGACAACCATTAC(SEQ ID NO:601)
在一些实施例中，相比于阴性对照，具有GFP质粒的融合剂脂质体中通过融合剂脂质体的体外核酸货物递送更高。在阴性对照中检测到可忽略的GFP荧光。
实例95：体内递送DNA
这一实例描述通过融合剂脂质体将DNA体内递送到细胞。将DNA体内递送到细胞使得在接受者细胞内表达蛋白质。
体内融合剂脂质体DNA递送将证明在生物体(小鼠)内的接受者细胞中的DNA和蛋白质表达的递送。
如本文所描述地制备表达肝定向融合剂的融合剂脂质体。在产生融合剂脂质体后，将其另外用具有编码Cre重组酶的序列的质粒核染。
制备融合剂脂质体以用于体内递送。对融合剂脂质体悬浮液进行离心。将融合剂脂质体的球粒再悬浮于无菌磷酸盐缓冲盐水中以进行注射。
使用核酸检测方法，例如PCR来证实融合剂脂质体含有DNA。
接受者小鼠携带有一个被CRE蛋白修饰的loxp-荧光素酶基因组DNA基因座，所述蛋白由通过融合剂脂质体递送的DNA制成，以开启荧光素酶的表达(JAX#005125)。用于这个实例的阳性对照是与小鼠品系配对的接受者小鼠的后代，所述品系仅在肝脏中表达来自其自身基因组的相同蛋白质(白蛋白-CRE JAX#003574)。来自这个配对的后代携带有每个等位基因之一(loxp-荧光素酶，白蛋白-CRE)。通过向接受者小鼠注射不表达融合剂的融合剂脂质体或具有融合剂但不含Cre DNA的融合剂脂质体来进行阴性对照。
通过静脉内(IV)尾静脉施用将融合剂脂质体递送到小鼠中。将小鼠置放于市售的小鼠限制器(哈佛装置(Harvard Apparatus))中。在限制之前，通过将动物的笼子置放于循环水浴上而使动物升温。一旦进入限制器，使动物适应环境。准备由30G针尖、3"长度的PE-10管和28G针组成的静脉内导管并且用肝素化盐水冲洗。用70％酒精棉片清洁尾巴。随后，将导管针用镊子固定并且缓慢引入到尾侧静脉中，直到血液在管中变得可见。将融合剂脂质体溶液(约500K-5M融合剂脂质体)抽吸到1cc结核菌素注射器中并且连接到输液泵。将融合剂脂质体溶液以20μL/min的速率递送30秒到5分钟(取决于剂量)。在输注完成后，移开导管，并且向注射部位施加压力直到停止任何出血。将小鼠放回其笼子中并使其恢复。
在融合之后，DNA将被转录和翻译成CRE蛋白，其将然后易位到细胞核以进行重组，从而引起荧光素酶的组成性表达。腹膜内施用D-荧光素(珀金埃尔默，150mg/kg)使得能够通过产生生物发光来检测荧光素酶表达。将动物置放于体内生物发光成像腔室(珀金埃尔默)中，所述腔室装有锥形麻醉器(异氟醚)以防止动物运动。在注射后8-20分钟之间进行光子收集，以观察由D-荧光素药物动力学清除所致的生物发光最大值。在软件中创建肝脏的特定区域并且设置收集暴露时间，以使得计数率高于600(在这个区域中)，以产生可解释的辐射率(光子数/秒/平方厘米/立体弧度)测量值。将生物发光辐射率的最大值记录为生物发光分布的图像。专门监测肝脏组织，以进行高于背景(未处理的动物)和阴性对照的辐射率测量。在注射后24小时进行测量以观察荧光素酶活性。然后对小鼠进行安乐死并且收集肝脏。
通过将新鲜收集的组织浸入4℃下的4％多聚甲醛/0.1M磷酸钠缓冲液pH 7.4中1-3小时来进行固定和包埋。然后将组织浸入4℃下的无菌15％蔗糖/1×PBS中(3小时到过夜)。然后将组织包埋于O.C.T.(Baxter编号M7148-4)中。将组织适当地定向在块中以进行切片(横截面)。然后使用以下方法在液氮中冷冻组织：将块的底部三分之一放入液氮中，使其冷冻直到除了O.C.T.中心以外的所有部分都被冷冻，并且使得在干冰上结束冷冻。通过低温恒温器将块切成5-7微米的切片，置放在载玻片上并且重新冷冻以染色。
使用洋地黄毒苷标记的核酸探针(用于CRE DNA和荧光素酶mRNA检测)在组织切片上进行原位杂交(使用标准方法)，用抗洋地黄毒苷荧光抗体标记并且通过共聚焦显微镜观察。
在一些实施例中，与未处理的动物(无CRE并且无融合剂脂质体)和阴性对照相比，阳性对照动物(在不注射融合剂脂质体的情况下通过繁殖重组)将在肝脏中展示生物发光强度，而与阴性对照(无融合剂的融合剂脂质体)和未处理的动物相比，注射药剂的动物将在肝脏中展示生物发光。
在实施例中，相比于阴性对照和未处理的动物，检测注射药剂的动物的组织切片中的核酸将展示在组织的细胞中检测到CRE重组酶和荧光素酶mRNA，而阳性对照将在整个组织中展示荧光素酶mRNA和CRE重组酶DNA的水平。
将通过基于原位杂交的DNA检测和其在动物的接受者组织中的共定位来检测由融合剂脂质体递送DNA的证据。将通过生物发光成像检测由DNA表达的蛋白质的活性。在实施例中，融合剂脂质体将递送会引起蛋白质产生和活性的DNA。
实例96：体外递送mRNA
这一实例描述融合剂脂质体与细胞的体外融合。在一些实施例中，融合剂脂质体与细胞的体外融合使得将指定mRNA递送到接受者细胞。
如下分析通过本文所描述的方法产生的融合剂脂质体将指定mRNA递送到接受者细胞的能力。在这个特定实例中，融合剂脂质体为细胞生物物质(缺少细胞核)，其由表达Cre和GFP的3T3小鼠成纤维细胞产生。然后用HVJ-E融合剂蛋白处理细胞生物物质以产生融合剂脂质体。
将接受者小鼠巨噬细胞接种到与待使用的成像系统相容的细胞培养多孔培养板中(在这个实例中，将细胞接种于玻璃底成像培养皿中)。接受者细胞在CMV启动子下稳定表达“LoxP-stop-LoxP-tdTomato”盒，所述启动子在通过Cre重组后诱导tdTomato表达，表明向接受者细胞递送Cre蛋白。
随后，在接种接受者细胞之后24小时，将表达Cre重组酶蛋白并且具有特定融合剂蛋白的融合剂脂质体施加到DMEM培养基中的接受者细胞。融合剂脂质体的剂量与接种于孔中的接受者细胞的数目相关。在施加融合剂脂质体之后，将细胞培养板以400g离心5分钟，以帮助引发融合剂脂质体与接受者细胞之间的接触。然后将细胞培育16小时并且通过成像评估mRNA递送。
成像前，将细胞在DMEM培养基中用1μg/mL Hoechst 33342染色10分钟。在这个实例中，将细胞在维持于37℃和5％CO2下时，在具有63×油浸物镜的Zeiss LSM 710共聚焦显微镜上成像。Hoechst经受405nm激光激发，并且通过带通430-460nm滤光片记录发射。GFP经受488nm激光激发，并且通过带通495-530nm滤光片记录发射。tdTomato经受543nm激光激发，并且通过带通560nm到610nm滤光片记录发射。
首先，扫描细胞以阳性地鉴别单个核tdTomato阳性细胞。tdTomato阳性细胞的存在表明细胞已经历融合，并且单个核表明融合是通过细胞生物学融合剂脂质体供体进行的。首先对这些鉴别的细胞成像，并且然后随后使用488nm激光进行光漂白，以部分淬灭GFP荧光。然后随时间推移对细胞成像以评估GFP荧光的恢复，这将展现新GFP蛋白的翻译并且因此展示通过供体融合剂脂质体递送的GFP mRNA的存在。
使用ImageJ软件(Rasband,W.S.,ImageJ,美国马里兰州贝塞斯达的美国国家卫生研究院,rsb.info.nih.gov/ij/,1997-2007)进行所关注细胞中的Hoechst、GFP和tdTomato荧光的分析。首先，使用60μm宽的滚球背景减除算法对图像进行预处理。在光漂白的细胞内，对GFP荧光取阈值以去除背景。然后在光漂白之前和之后的不同时间分析光漂白的细胞的GFP平均荧光强度。
在这个特定实例内，将表达Cre和GFP并且具有施加的融合剂HVJ-E(+融合剂)的3T3小鼠成纤维细胞细胞生物物质施加到表达“LoxP-stop-LoxP-tdTomato”盒的接受者小鼠巨噬细胞。代表性图像和数据在图5中示出。对于这个特定实例，GFP荧光强度在光漂白之后10小时恢复到原始强度的25％，表明在接受者细胞中递送主动翻译的mRNA。
实例97：体外递送siRNA
这一实例描述通过融合剂脂质体将短干扰RNA(siRNA)体外递送到细胞。将siRNA体外递送到细胞引起接受者细胞内的蛋白质表达的抑制。这可以用于抑制表达对细胞有害的蛋白质的活性，从而使细胞正常运行。
如下分析通过本文所描述的方法产生的融合剂脂质体将指定siRNA递送到接受者细胞的能力。如本文所描述地制备融合剂脂质体。在产生融合剂脂质体后，将其另外用具有特异性抑制GFP的序列的siRNA电穿孔。靶向GFP的双链siRNA的序列为5'GACGUAAACGGCCACAAGUUC 3'和其互补序列3'CGCUGCAUUUGCCGGUGUUCA 5'(应注意，在siRNA序列的3'端处存在2个碱基对长的突出端)。作为阴性对照，将融合剂脂质体用具有特异性抑制荧光素酶的序列的siRNA电穿孔。靶向荧光素酶的双链siRNA的序列为5'CUUACGCUGAGUACUUCGATT 3'和其互补序列3'TTGAAUGCGACUCAUGAAGCU 5'(应注意，在siRNA序列的3'端处存在2个碱基对长的突出端)。
然后将融合剂脂质体施加到组成性表达GFP的接受者细胞。将接受者细胞接种到黑色的透明底96孔培养板中。随后，在接种接受者细胞之后24小时，将表达的融合剂脂质体施加到DMEM培养基中的接受者细胞。融合剂脂质体的剂量与接种于孔中的接受者细胞的数目相关。在施加融合剂脂质体之后，将细胞培养板以400g离心5分钟，以帮助引发融合剂脂质体与接受者细胞之间的接触。随后将细胞培育16小时并且通过成像评估药剂递送siRNA。
对细胞成像以阳性鉴别视场或孔中的GFP阳性细胞。在这个实例中，使用自动荧光显微镜(www.biotek.com/products/imaging-microscopy-automated-cell-imagers/lionheart-fx-automated-live-cell-imager/)对细胞培养板进行成像。通过首先在DMEM培养基中用Hoechst33342染色细胞10分钟来确定给定孔中的总细胞群体。Hoechst 33342通过插入到DNA中染色细胞核并且因此用于鉴别个别细胞。在染色之后，将Hoechst培养基用常规DMEM培养基替换。
使用405nm LED和DAPI滤光立方体对Hoechst成像。使用465nm LED和GFP滤光立方体对GFP成像。通过首先在未处理的孔；即，未用任何融合剂脂质体处理的接受者细胞上确立LED强度和积分时间来采集不同细胞组的图像。
设定采集设置，以使得GFP强度处于最大像素强度值但不饱和。然后使用确立的设置对所关注的孔成像。
用配备有荧光显微镜的软件或其它软件(Rasband,W.S.,ImageJ,美国马里兰州贝塞斯达的美国国家卫生研究院,http://rsb.info.nih.gov/ij/,1997-2007)进行GFP阳性孔的分析。使用60μm宽的滚球背景减除算法对图像进行预处理。在Hoechst阳性细胞上设置总细胞掩码。Hoechst强度显著高于背景强度的细胞为阈值处理的并且排除太小或太大而无法成为Hoechst阳性细胞的区域。
在总细胞掩码内，通过对显著高于背景的细胞再次取阈值并且将Hoechst(细胞核)掩码扩展到整个细胞区域以包含整个GFP细胞荧光来鉴别GFP阳性细胞。计算总细胞中的GFP阳性细胞的百分比。
在实施例中，相比于用含有针对荧光素酶的siRNA的融合剂脂质体处理的孔中的GFP阳性细胞的百分比，用含有针对GFP的siRNA的融合剂脂质体处理的孔的GFP阳性细胞的百分比将小至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％。
实例98：体内递送mRNA
这一实例描述通过融合剂脂质体将信使RNA(mRNA)体内递送到细胞。在一些实施例中，将mRNA体内递送到细胞使得在接受者细胞内表达蛋白质。在一些实施例中，这一递送方法可以用于补充由于基因突变而不存在的蛋白质，允许细胞正常运行，或重定向细胞的活性以执行功能，例如治疗功能。
在一些实施例中，体内递送融合剂脂质体mRNA展现生物体(例如小鼠)内的接受者细胞中的信使RNA递送和蛋白质表达。
在一些实施例中，制备表达肝脏定向的融合剂，并且产生表达Cre的mRNA的融合剂脂质体用于体内递送。
如本文所描述地制备融合剂脂质体。对融合剂脂质体悬浮液进行离心。将融合剂脂质体的球粒再悬浮于无菌磷酸盐缓冲盐水中以进行注射。
使用核酸检测方法，例如PCR来证实融合剂脂质体表达mRNA。
接受者小鼠携带有一个被CRE蛋白修饰的loxp-荧光素酶基因组DNA基因座，所述蛋白由通过融合剂脂质体递送的mRNA制成，以开启荧光素酶的表达(JAX#005125)。用于这个实例的阳性对照是与小鼠品系配对的接受者小鼠的后代，所述品系仅在肝脏中表达来自其自身基因组的相同蛋白质(白蛋白-CRE JAX#003574)。来自这个配对的后代携带有每个等位基因之一(loxp-荧光素酶，白蛋白-CRE)。通过向接受者小鼠注射不表达融合剂的融合剂脂质体或具有融合剂但不表达Cre mRNA的融合剂脂质体来进行阴性对照。
通过静脉内(IV)尾静脉施用将融合剂脂质体递送到小鼠中。将小鼠置放于市售的小鼠限制器(哈佛装置(Harvard Apparatus))中。在限制之前，通过将动物的笼子置放于循环水浴上而使动物升温。一旦进入限制器，使动物适应环境。准备由30G针尖、3"长度的PE-10管和28G针组成的静脉内导管并且用肝素化盐水冲洗。用70％酒精棉片清洁尾巴。随后，将导管针用镊子固定并且缓慢引入到尾侧静脉中，直到血液在管中变得可见。将融合剂脂质体溶液(约500K-5M融合剂脂质体)抽吸到1cc结核菌素注射器中并且连接到输液泵。将融合剂脂质体溶液以20μL/min的速率递送30秒到5分钟(取决于剂量)。在输注完成后，移开导管，并且向注射部位施加压力直到停止任何出血。将小鼠放回其笼子中并使其恢复。
在融合之后，mRNA在接受者细胞质中翻译为CRE蛋白，其然后易位到细胞核以进行重组，引起荧光素酶的组成性表达。腹膜内施用D-荧光素(珀金埃尔默，150mg/kg)使得能够通过产生生物发光来检测荧光素酶表达。将动物置放于体内生物发光成像腔室(珀金埃尔默)中，所述腔室装有锥形麻醉器(异氟醚)以防止动物运动。在注射后8-20分钟之间进行光子收集，以观察由D-荧光素药物动力学清除所致的生物发光最大值。在软件中创建肝脏的特定区域并且设置收集暴露时间，以使得计数率高于600(在这个区域中)，以产生可解释的辐射率(光子数/秒/平方厘米/立体弧度)测量值。将生物发光辐射率的最大值记录为生物发光分布的图像。专门监测肝脏组织，以进行高于背景(未处理的动物)和阴性对照的辐射率测量。在注射后24小时进行测量以观察荧光素酶活性。然后对小鼠进行安乐死并且收集肝脏。
通过将新鲜收集的组织浸入4℃下的4％多聚甲醛/0.1M磷酸钠缓冲液pH 7.4中1-3小时来进行固定和包埋。然后将组织浸入4℃下的无菌15％蔗糖/1×PBS中(3小时到过夜)。然后将组织包埋于O.C.T.(Baxter编号M7148-4)中。将组织适当地定向在块中以进行切片(横截面)。然后使用以下方法在液氮中冷冻组织：将块的底部三分之一放入液氮中，使其冷冻直到除了O.C.T.中心以外的所有部分都被冷冻，并且使得在干冰上结束冷冻。通过低温恒温器将块切成5-7微米的切片，置放在载玻片上并且重新冷冻以染色。
使用洋地黄毒苷标记的RNA探针(用于CRE mRNA和荧光素酶mRNA检测)在组织切片上进行原位杂交(使用标准方法)，用抗洋地黄毒苷荧光抗体标记并且通过共聚焦显微镜观察。
在一些实施例中，相比于未处理的动物(例如无CRE或融合剂脂质体)和阴性对照，阳性对照动物(例如在不注射融合剂脂质体的情况下通过繁殖重组)将展示肝脏中的生物发光强度。在一些实施例中，相比于阴性对照(例如无融合剂的融合剂脂质体)和未处理的动物，注射融合剂脂质体的动物将展示肝脏中的生物发光。
在一些实施例中，相比于阴性对照和未处理的动物，检测施用融合剂脂质体的动物的组织切片中的mRNA将展示在组织的细胞中检测到CRE重组酶和荧光素酶mRNA。在一些实施例中，阳性对照将在整个组织中展示荧光素酶mRNA和CRE重组酶mRNA的水平。
在一些实施例中，将通过基于原位杂交的mRNA检测和其在动物的接受者组织中的共定位来检测由融合剂脂质体递送mRNA的证据。在一些实施例中，通过生物发光成像检测由通过融合剂脂质体递送的mRNA表达的蛋白质的活性。在一些实施例中，融合剂脂质体将递送会引起蛋白质产生和活性的mRNA。
实例99：体外递送蛋白质
这一实例展现融合剂脂质体与细胞的体外融合。在这个实例中，融合剂脂质体与细胞的体外融合使得将Cre蛋白递送到接受者细胞。
在这个实例中，融合剂脂质体由具有仙台病毒HVJ-E蛋白的3T3小鼠成纤维细胞产生(Tanaka等人,2015,《基因疗法》,22(2014年10月),1-8.doi.org/10.1038/gt.2014.12)。另外，融合剂脂质体表达Cre重组酶。靶细胞为初级HEK293T细胞，其在CMV启动子下稳定表达“LoxP-GFP-stop-LoxP-RFP”盒，所述启动子在通过Cre重组后从GFP转换为RFP表达，表明融合和Cre(作为标记)递送。
如下分析通过本文所描述的方法产生的融合剂脂质体将Cre蛋白递送到接受者细胞的能力。将接受者细胞接种于与待使用的成像系统相容的细胞培养多孔培养板中(在这个实例中，将细胞接种于黑色的透明底96孔培养板中)。随后，在接种接受者细胞之后24小时，将表达Cre重组酶蛋白并且具有特定融合剂蛋白的融合剂脂质体施加到DMEM培养基中的接受者细胞。融合剂脂质体的剂量与接种于孔中的接受者细胞的数目相关。在施加融合剂脂质体之后，将细胞培养板以400g离心5分钟，以帮助引发融合剂脂质体与接受者细胞之间的接触。然后将细胞培育16小时并且通过成像评估蛋白质递送。
对细胞进行成像以在视场或孔中阳性鉴别RFP阳性细胞相对于GFP阳性细胞。在这个实例中，使用自动化显微镜对细胞培养板进行成像。通过首先在DMEM培养基中用1μg/mLHoechst 33342染色细胞10分钟来确定给定孔中的总细胞群体。Hoechst 33342通过插入到DNA中染色细胞核并且因此用于鉴别个别细胞。在染色之后，将Hoechst培养基用常规DMEM培养基替换。使用405nm LED和DAPI滤光立方体对Hoechst成像。GFP使用465nm LED和GFP滤光立方体成像，而RFP使用523nm LED和RFP滤光立方体成像。通过首先在阳性对照孔；即，用编码Cre重组酶的腺病毒处理的细胞上确立LED强度和积分时间来获得不同细胞组的图像。设定采集设置，以使得RFP和GFP强度处于最大像素强度值但不饱和。然后使用确立的设置对所关注的孔成像。
在配备有LionHeart FX的Gen5软件中或通过ImageJ软件(Rasband,W.S.,ImageJ,美国马里兰州贝塞斯达的美国国家卫生研究院,http://rsb.info.nih.gov/ij/,1997-2007)进行Hoechst、GFP和RFP阳性孔的分析。首先，使用60μm宽的滚球背景减除算法对图像进行预处理。随后，在Hoechst阳性细胞上设置总细胞掩码。Hoechst强度显著高于背景强度的细胞为阈值处理的并且排除太小或太大而无法成为Hoechst阳性细胞的区域。在总细胞掩码内，通过对显著高于背景的细胞再次取阈值并且将Hoechst(细胞核)掩码扩展到整个细胞区域以包含整个GFP和RFP细胞荧光来鉴别GFP和RFP阳性细胞。
在仅含有接受者细胞的对照孔中鉴别的RFP阳性细胞的数目用于从含有融合剂脂质体的孔中的RFP阳性细胞的数目减去(以减去非特异性Loxp重组)。随后将RFP阳性细胞(接受药剂的接受者细胞)的数目除以GFP阳性细胞(未接受药剂的接受者细胞)与RFP阳性细胞的总和，以定量递送到接受者细胞群体内的融合剂脂质体药剂的比例。
在这个特定实例内，将表达Cre并且具有(+融合剂)或不具有(-融合剂)施加的融合剂HVJ-E的3T3小鼠成纤维细胞施加到表达“LoxP-GFP-stop-LoxP-RFP”盒的接受者293T细胞。通过在接受者细胞中诱导RFP表达来评估Cre蛋白的递送。图6中的图展示对Hoechst染色呈阳性的总细胞(每对中的最左边的条)中的RFP阳性细胞(每对中的最右边的条)的定量。对于这个特定实例，对于具有HVJ-E融合剂的3T3 Cre细胞，递送到接受者细胞的融合剂脂质体的比例为0.44。
实例100：体内递送蛋白质
这一实例描述通过融合剂脂质体将治疗剂递送到眼睛。
融合剂脂质体使用先前实例中所描述的方法中的任一种衍生自造血干细胞和祖细胞并且装载有缺乏小鼠基因敲除的蛋白质。
将融合剂脂质体视网膜下注射到缺乏蛋白质的小鼠右眼中，并且将媒剂对照注射到小鼠左眼中。当小鼠达到2个月大时，对小鼠的子组进行安乐死。
对收集的视网膜组织进行组织学和H&E染色，以计数小鼠的每个视网膜中拯救的细胞的数目(描述于Sanges等人,《临床调查杂志(The Journal of ClinicalInvestigation)》,126(8):3104-3116,2016中)。
通过用对PDE6B蛋白具有特异性的抗体进行蛋白质印迹，在从2个月大时安乐死的小鼠收集的视网膜中测量所注射的蛋白质的水平。
在一些实施例中，相比于用媒剂处理的小鼠右眼，施用融合剂脂质体的小鼠左眼将具有存在于视网膜的外核层中的增加数目的细胞核。增加的蛋白质暗示突变的PBE6B蛋白的互补。
实例101：递送以编辑接受者DNA
这一实例描述用于将基因组CRISPR-Cas9编辑机构体外递送到细胞的融合剂脂质体。在一些实施例中，通过融合剂脂质体将基因组CRISPR-Cas9编辑机构体外递送到细胞导致接受者细胞中的特定蛋白质的功能缺失。在这个实例中，提及的基因组编辑机构为与对GFP具有特异性的向导RNA(gRNA)复合的化脓性链球菌(S.pyogenes)Cas9蛋白。
在一些实施例中，融合剂脂质体为递送治疗剂的底物。在一些实施例中，可以高特异性和效率递送到细胞的治疗剂，如基因组编辑机构可以用于灭活基因，并且因此，后续基因产物(例如蛋白质)在以高水平或在错误细胞类型中表达时变为病理的。
通过前述实例中所描述的方法中的任一种产生的融合剂脂质体组合物(除了融合剂脂质体)被工程改造，以使得融合剂脂质体还包含与对A.Victoria EGFP具有特异性的序列的向导RNA(gRNA)序列复合的化脓性链球菌Cas9蛋白。这通过共核染具有新霉素抗性基因的开放阅读框的PiggyBac载体来实现，新霉素抗性基因与化脓性链球菌Cas9的开放阅读框的框内融合，由P2A裂解序列分离。另外的共核染的PiggyBac载体还包含由U6启动子驱动的gRNA序列(GAAGTTCGAGGGCGACACCC)。作为阴性对照，融合剂脂质体被工程化，使得融合剂脂质体包含与对小鼠基因组中的任何靶标不具有特异性的加扰gRNA(GCACTACCAGAGCTAACTCA)序列复合的化脓性链球菌Cas9蛋白。
将足够数目的融合剂脂质体与NIH/3T3 GFP+细胞在37℃和5％CO2下在含有20％胎牛血清和1×青霉素/链霉素的DMEM中一起培育48小时的时段。在48小时培育之后，制备基因组DNA并用作模板，所述模板对GFP基因中预测的gRNA裂解位点的500bp内的区域具有特异性的引物(参见表25)。
表25.用于TIDE分析的扩增500bp片段的GFP引物序列
引物
序列(SEQ ID NO)
GFP-F
ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC(SEQ ID NO:602)
GFP-R
GTCCTTTTACCAGACAACCATTAC(SEQ ID NO:603)
然后纯化PCR扩增子，通过毛细管测序进行测序，并且然后上传到TideCalculator，一种快速评估由向导RNA确定的通过靶基因座的CRISPR-Cas9的基因组编辑的网络工具。基于来自两个标准毛细管测序反应的定量序列跟踪数据，软件定量编辑效果。通过GFP基因座在预测的gRNA裂解位点处的插入缺失(插入或缺失)导致细胞中的GFP表达的损失，并且通过FACS，使用FACS分析(美国加利福尼亚州圣何塞的百克顿-迪金森公司)以488nm氩激光激发定量，并且在530+/-30nm处收集发射。FACS软件用于采集和分析。将光散射通道设定为线性增益，并将荧光通道设定为对数标度，其中在每种条件下分析最少10,000个细胞。基于每个样品中的GFP信号的强度计算GFP功能的插入缺失和后续损失。
在一些实施例中，相比于阴性对照，在具有GFP基因座的预测的gRNA裂解位点处的插入缺失(插入或缺失)和细胞中的GFP荧光损失将表明融合剂脂质体编辑DNA并且在体外导致蛋白质功能缺失的能力。在一些实施例中，具有加扰gRNA序列的融合剂脂质体将不展示插入缺失或后续蛋白质功能缺失。
实例102：评估施用融合剂脂质体后的畸胎瘤形成
这一实例描述不存在通过融合剂脂质体形成畸胎瘤。在一些实施例中，融合剂脂质体在向受试者施用时将不会导致畸胎瘤形成。
通过前述实例中所描述的方法中的任一种来产生融合剂脂质体。将融合剂脂质体、肿瘤细胞(阳性对照)或媒剂(阴性对照)在PBS中皮下注射到小鼠(12-20周龄)的左侧腹中。在融合剂脂质体、肿瘤细胞或媒剂注射后的八周，通过用测径规测量法测定肿瘤体积而每周分析畸胎瘤(例如肿瘤)生长2-3次。
在一些实施例中，通过测径规测量法，施用融合剂脂质体或媒剂的小鼠将不具有可测量的肿瘤形成，例如畸胎瘤。在一些实施例中，用肿瘤细胞处理的阳性对照动物将展现可观的肿瘤(例如畸胎瘤)大小，如通过卡尺在八周的观察中所测量。
实例103：融合剂脂质体将活性蛋白体内递送到受试者的接受者细胞
这一实例展现融合剂脂质体可以向受试者体内递送蛋白质。这通过核编辑蛋白Cre的递送来例示。一旦在细胞内部，Cre易位到细胞核，在其中重新组合并且切除两个LoxP位点之间的DNA。当两个LoxP位点之间的DNA为终止密码子并且在远端荧光蛋白(如红色荧光蛋白tdTomato)的上游时，可以用显微镜测量Cre介导的重组。
将购自Takara(Cre重组酶Gesicles，Takara产品631449)的含有CRE和融合剂VSV-G的融合剂脂质体注入B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J小鼠(杰克逊实验室品系007909)中。在如表26中所描述的解剖部位、注射体积和注射部位处向动物注射。不具有tdTomato并且注射融合剂脂质体的小鼠(FVB.129S6(B6)-GT(ROSA)26Sortm1(Luc)Kael/J，杰克逊实验室品系005125)和未注射融合剂脂质体的B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J小鼠用作阴性对照。
表26：注射参数
注射后两天处死动物并且收集样品。将样品固定于2％PFA中8小时，在30％蔗糖中固定过夜，并且运送以立即包埋于OCT中并切成切片。将切片用DAPI染色(针对细胞核)。用显微镜对DAPI和tdTomato荧光成像。
表26中所列的所有解剖部位均展现tdTomato荧光(图9)。另外，使用荧光显微镜检查tdTomato确认了向肌肉组织的递送(图11)。阴性对照小鼠没有任何具有tdTomato荧光的组织。这一结果展现融合剂脂质体能够在各种解剖部位打开小鼠细胞中的tdTomato荧光，并且如果未用融合剂脂质体处理小鼠或如果小鼠的基因组中不具有tdTomato，那么就不会发生这种情况。因此，融合剂脂质体将活性Cre重组酶体内递送到小鼠细胞核。
还展示不同施用途径可以体内递送融合剂脂质体到组织。将购自Takara的含有CRE和融合剂VSV-G的融合剂脂质体(Cre重组酶Gesicles，Takara产品631449)肌肉内(50μL到右胫骨肌前肌)、腹膜内(50μL到腹膜腔)和皮下(50μL在背部皮肤下)注射到FVB.129S6(B6)-GT(ROSA)26Sortm1(Luc)Kael/J(杰克逊实验室品系005125)。
通过使用化学脱毛剂将区域脱毛45秒，接着用水冲洗3次而分别准备用于肌肉内、腹膜内和皮下注射的腿部、腹侧和背部皮肤。
在注射后第3天，体内成像系统(珀金埃尔默)用于获得生物发光的全动物图像。在成像前五分钟，小鼠接受以150mg/kg剂量腹膜内注射的生物发光底物(珀金埃尔默)以使荧光素酶可视化。成像系统被校准以补偿所有装置设置。
通过所有三种途径施用均引起发光(图10)，表明将活性Cre重组酶成功地体内递送到小鼠细胞。
总之，融合剂脂质体能够将活性蛋白体内递送到受试者的细胞。
实例104：融合剂脂质体中超声处理介导的核酸装载
这一实例描述通过超声处理将核酸有效负载装载到融合剂脂质体中。超声处理方法公开于例如Lamichhane,TN等人,通过用超声处理将小RNA主动装载到细胞外囊泡中的癌基因敲落(Oncogene Knockdown via Active Loading of Small RNAs intoExtracellular Vesicles by Sonication.)《细胞和分子生物工程化(Cell MolBioeng)》,(2016)中，其全部内容以引用的方式并入本文中。
通过前述实例中所描述的方法中的任一种来制备融合剂脂质体。将大致106个融合剂脂质体与5-20μg核酸混合并且在室温下培育30分钟。然后使用以40kHz操作的水浴超声发生器(Brason型号#1510R-DTH)将融合剂脂质体/核酸混合物在室温下超声处理30秒。然后将混合物置放于冰上一分钟，接着以40kHz进行第二轮超声处理30秒。然后将混合物在4℃下以16,000g离心5分钟以将含核酸的融合剂脂质体制成球粒。去除含有未合并的核酸的上清液并且将球粒再悬浮于磷酸盐缓冲盐水中。在DNA装载之后，将融合剂脂质体在使用之前保持于冰上。
实例105：融合剂脂质体中超声处理介导的蛋白质装载
这一实例描述通过超声处理将蛋白质有效负载装载到融合剂脂质体中。超声处理方法公开于例如Lamichhane,TN等人,通过用超声处理将小RNA主动装载到细胞外囊泡中的癌基因敲落《细胞和分子生物工程化》,(2016)中，其全部内容以引用的方式并入本文中。
通过前述实例中所描述的方法中的任一种来制备融合剂脂质体。将大致106个融合剂脂质体与5-20μg蛋白质混合并且在室温下培育30分钟。然后使用以40kHz操作的水浴超声发生器(Brason型号#1510R-DTH)将融合剂脂质体/蛋白混合物在室温下超声处理30秒。然后将混合物置放于冰上一分钟，接着以40kHz进行第二轮超声处理30秒。然后将混合物在4℃下以16,000g离心5分钟以将含蛋白质的融合剂脂质体制成球粒。去除含有未合并的蛋白质的上清液并且将球粒再悬浮于磷酸盐缓冲盐水中。在蛋白质装载之后，将融合剂脂质体在使用之前保持于冰上。
实例106：融合剂脂质体中疏水性载剂介导的核酸装载
这一实例描述通过疏水性载剂将核酸有效负载装载到融合剂脂质体中。疏水性装载的示例性方法公开于例如Didiot等人,用于亨廷顿蛋白mRNA沉默的外泌体介导的疏水性修饰的siRNA的递送(Exosome-mediated Delivery of Hydrophobically Modified siRNAfor Huntingtin mRNA Silencing),《分子疗法》24(10):1836-1847,(2016)中，其全部内容以引用的方式并入本文中。
通过前述实例中所描述的方法中的任一种来制备融合剂脂质体。RNA分子的3'端缀合到生物活性疏水性缀合物(三乙二醇-胆固醇)。通过在以500rpm振荡的情况下在37°℃下培育90分钟，将大致106个融合剂脂质体(1mL)与10μmol/l的siRNA缀合物在PBS中混合。疏水性载剂介导RNA与融合剂脂质体膜的缔合。在一些实施例中，一些RNA分子被并入融合剂脂质体的内腔中，并且一些存在于融合剂脂质体的表面上。通过在4°℃下在台式超速离心机中使用TLA-110转子以100,000g超速离心1小时，将未装载的融合剂脂质体与装载有RNA的融合剂脂质体分离。未装载的融合剂脂质体保留在上清液中，并且装载有RNA的融合剂脂质体形成球粒。将装载有RNA的融合剂脂质体再悬浮于1mL PBS中，并且在使用之前保持于冰上。
实例107：加工融合剂脂质体
这一实例描述融合剂脂质体的加工。通过先前实例中所描述的方法中的任一种产生的融合剂脂质体可以被进一步加工。
在一些实施例中，融合剂脂质体首先被均质化，例如通过超声处理。举例来说，超声处理方案包含使用将微探针振幅设置于8的MSE超声发生器(纽约的仪表联合公司(Instrumentation Associates,N.Y.))进行5秒超声处理。在一些实施例中，这一短时段的超声处理足以使得融合剂脂质体的质膜破裂成均匀大小的融合剂脂质体。在这些条件下，细胞器膜不会被破坏并且将其通过离心(3,000rpm，15分钟4℃)去除。然后如实例16中所描述地通过差速离心纯化融合剂脂质体。
将融合剂脂质体挤压通过可商购的聚碳酸酯膜(例如购自华盛顿(Washington)的Sterlitech)或可商购自法国(France)的Pall Execia的不对称陶瓷膜(例如Membralox)是将融合剂脂质体大小减小为相对明确定义的大小分布的有效方法。通常，悬浮液循环通过膜一次或多次，知道获得所需融合剂脂质体大小分布。融合剂脂质体可以挤压通过依次更小的孔隙膜(例如400nm、100nm和/或50nm孔隙大小)以实现大小的逐渐减小和均匀分布。
在一些实施例中，在融合剂脂质体生产的任何步骤，但通常在均质化、超声处理和/或挤压步骤之前，可以将医药剂(如治疗剂)添加到反应混合物，使得所得融合剂脂质体囊封医药剂。
实例108：测量融合剂脂质体和源细胞中的总RNA
这一实例描述定量融合剂脂质体相对于源细胞中的RNA的量的方法。在一些实施例中，融合剂脂质体将具有与源细胞类似的RNA水平。在这个分析中，通过测量总RNA来确定RNA水平。
通过前述实例中所描述的方法中的任一种来制备融合剂脂质体。如根据融合剂脂质体和源细胞的蛋白质所测量的相同质量的制剂用于分离总RNA(例如使用试剂盒，如Qiagen RNeasy目录号74104)，接着使用标准光谱法测定RNA浓度，以评估RNA的吸光度(例如使用赛默科技NanoDrop)。
在一些实施例中，根据蛋白质的质量，融合剂脂质体中的RNA的浓度将为源细胞的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％。
实例109：融合剂脂质体体外融合到T细胞
a.DNA有效负载
这一实例描述使用融合剂脂质体将DNA体外递送到CD3+T细胞。这一实例使用编码外源基因的质粒来定量融合剂脂质体递送DNA的能力，所述外源基因为针对CD19的嵌合抗原受体，其为治疗性货物。
由如前述实例中所描述的方法中的任一种产生的细胞衍生的囊泡或细胞衍生的细胞生物制剂产生的融合剂脂质体组合物(除了融合剂脂质体)被工程改造，以使得融合剂与Cre的开放阅读框同框，但由P2A自裂解肽序列分隔。在产生融合剂脂质体之后，将其另外用具有编码CAR的序列的质粒核染。
参见例如Chen X等人,《基因与疾病》2015年3月；2(1):96-105.DOI:10.1016/j.gendis.2014.12.001。
作为阴性对照，融合剂脂质体用编码GFP的质粒核染。
然后将足够数目的融合剂脂质体与具有loxP-STOP-loxP-tdTomato报告分子的接受者CD3+T细胞一起在37℃和5％CO2下在包括X-VIVO 15培养基(瑞士CH巴塞尔的龙沙)的补充有5％胎牛血清(FBS)(美国加利福尼亚州洛杉矶的吉毕科公司)、100U mL-1青霉素、100μg mL-1链霉素、1.25μg mL-1两性霉素B、2mM L-谷氨酰胺(吉毕科公司)和100U mL-1hIL-2(美国康涅狄格州洛基山的PerproTech)的T细胞培养基中培育48小时的时段。融合剂脂质体与具有具有loxP-STOP-loxP-tdTomato报告分子的CD3+T细胞的融合导致由于Cre重组酶从阻断tdTomato表达的终止密码子切除了DNA。在48小时培育之后，然后通过FACS，使用FACS细胞仪(美国加利福尼亚州圣何塞的百克顿-迪金森公司)以561nm激光激发分离tdTomato阳性细胞并且在590+/-20nm处收集发射。然后使用DNA提取溶液(Epicentre)分离总DNA。定量实时PCR是使用具有快速高级主混合物(赛默飞世尔科学)、100ng DNA模板、对抗CD19 CAR的可变区具有特异性的引物和探针组(使用塔克曼在线引物和探针设计程序设计)的QuantStudio3实时PCR系统(赛默飞世尔科学)进行。通过制备编码CAR的质粒的连续稀释液，制得用于绝对定量的抗CD19 CAR转基因DNA拷贝的cA标准曲线。对β-内酰胺酶(AMPr基因)具有特异性的引物和探针组用于对DNA量标准化。Ct值用于比较用具有CAR质粒的融合剂脂质体或用阴性对照处理的CD3+T细胞中的CAR DNA的量。
在一些实施例中，相比于阴性对照，具有CAR质粒的融合剂脂质体中通过融合剂脂质体的体外DNA货物递送更高。
b.mRNA有效负载
这一实例描述使用融合剂脂质体将mRNA体外递送到CD3+T细胞。这一实例定量融合剂脂质体递送编码外源基因的mRNA的能力，所述外源基因为针对CD19的嵌合抗原受体，其为治疗性货物。
由如前述实例中所描述的方法中的任一种产生的细胞衍生的囊泡或细胞衍生的细胞生物制剂产生的融合剂脂质体组合物(除了融合剂脂质体)被工程改造，以使得融合剂与Cre的开放阅读框同框，但由P2A自裂解肽序列分隔。在产生融合剂脂质体之后，将其另外用具有编码CAR的序列的mRNA核染。参见例如Chen X等人,《基因与疾病》2015年3月；2(1):96-105.DOI:10.1016/j.gendis.2014.12.001。
作为阴性对照，融合剂脂质体用编码GFP的mRNA核染。
然后将足够数目的融合剂脂质体与具有loxP-STOP-loxP-tdTomato报告分子的接受者CD3+T细胞一起在37℃和5％CO2下在包括X-VIVO 15培养基(瑞士CH巴塞尔的龙沙)的补充有5％胎牛血清(FBS)(美国加利福尼亚州洛杉矶的吉毕科公司)、100U mL-1青霉素、100μg mL-1链霉素、1.25μg mL-1两性霉素B、2mM L-谷氨酰胺(吉毕科公司)和100U mL-1hIL-2(美国康涅狄格州洛基山的PerproTech)的T细胞培养基中培育48小时的时段。融合剂脂质体与具有loxP-STOP-loxP-tdTomato报告分子的CD3+T细胞的融合导致由于Cre重组酶从阻断tdTomato表达的终止密码子切除了DNA。在48小时培育之后，然后通过FACS，使用FACS细胞仪(美国加利福尼亚州圣何塞的百克顿-迪金森公司)以561nm激光激发分离tdTomato阳性细胞并且在590+/-20nm处收集发射。
分离总RNA(例如使用如Qiagen RNeasy目录号74104的试剂盒)，接着使用标准分光镜法确定RNA浓度以评估RNA的吸光度(例如用赛默科技NanoDrop)。使用用于RT-PCR(赛默飞世尔科技)的Superscript III第一链合成超混合物进行逆转录，并且将RNA(100ng)逆转录成cDNA。使用具有快速高级主混合物(赛默飞世尔科学)、100ng cDNA模板、对抗CD19 CAR的可变区具有特异性的引物和探针组(使用Taqman在线引物和探针设计程序设计)以及被设计成将β-肌动蛋白扩增为内源性内参考物的引物探针组的QuantStudio3实时PCR系统(赛默飞世尔科学)进行实时PCR定量。Ct值用于比较用含有CAR mRNA的融合剂脂质体处理与用含有阴性对照的融合剂脂质体处理的CD3+T细胞之间的qRT-PCR反应中的CARcDNA的量。使用ΔΔCt方法计算相对表达。CAR的较高相对表达水平归因于从分选的CD3+T细胞纯化的CAR mRNA的较高水平。
在一些实施例中，相比于阴性对照融合剂脂质体，含有CAR mRNA的融合剂脂质体中通过融合剂脂质体的体外mRNA货物递送更高。
c.蛋白质/mRNA有效负载，其中有效负载由供体细胞表达
这一实例描述融合剂脂质体与细胞的体外融合。在一些实施例中，融合剂脂质体与CD3+T细胞的体外融合导致将嵌合抗原受体蛋白递送到CD3+T细胞的膜。
由如前述实例中所描述的方法中的任一种产生的细胞衍生的囊泡或细胞衍生的细胞生物制剂产生的融合剂脂质体组合物(除了融合剂脂质体)被工程改造，以使得融合剂与Cre的开放阅读框和靶向CD19的CAR的开放阅读框同框，但分别由P2A和T2A自裂解肽序列分隔。阴性对照融合剂脂质体被工程改造以使得融合剂与Cre的开放阅读框和蓝色荧光蛋白mTagBFP2的开放阅读框同框，各自由P2A自裂解肽序列分隔。参见例如Chen X等人,《基因与疾病》2015年3月；2(1):96-105.DOI:10.1016/j.gendis.2014.12.001。
然后将足够数目的融合剂脂质体与具有loxP-STOP-loxP-tdTomato报告分子的接受者CD3+T细胞一起在37℃和5％CO2下在包括X-VIVO 15培养基(瑞士CH巴塞尔的龙沙)的补充有5％胎牛血清(FBS)(美国加利福尼亚州洛杉矶的吉毕科公司)、100U mL-1青霉素、100μg mL-1链霉素、1.25μg mL-1两性霉素B、2mM L-谷氨酰胺(吉毕科公司)和100U mL-1hIL-2(美国康涅狄格州洛基山的PerproTech)的T细胞培养基中培育48小时的时段。融合剂脂质体与具有loxP-STOP-loxP-tdTomato报告分子的CD3+T细胞的融合导致由于Cre重组酶从阻断tdTomato表达的终止密码子切除了DNA。在48小时培育之后，然后通过FACS，使用FACS细胞仪(美国加利福尼亚州圣何塞的百克顿-迪金森公司)以561nm激光激发分离tdTomato阳性细胞并且在590+/-20nm处收集发射。
分析mRNA递送到分选的T细胞。分离总RNA(例如使用如Qiagen RNeasy目录号74104的试剂盒)，接着使用标准分光镜法确定RNA浓度以评估RNA的吸光度(例如用赛默科技NanoDrop)。使用用于RT-PCR(赛默飞世尔科技)的Superscript III第一链合成超混合物进行逆转录，并且将RNA(100ng)逆转录成cDNA。使用具有快速高级主混合物(赛默飞世尔科学)、100ng cDNA模板、对抗CD19 CAR的可变区具有特异性的引物和探针组(使用Taqman在线引物和探针设计程序设计)以及被设计成将β-肌动蛋白扩增为内源性内参考物的引物探针组的QuantStudio3实时PCR系统(赛默飞世尔科学)进行实时PCR定量。Ct值用于比较用含有CAR mRNA的融合剂脂质体处理与用含有阴性对照的融合剂脂质体处理的CD3+T细胞之间的qRT-PCR反应中的CAR cDNA的量。使用ΔΔCt方法计算相对表达。CAR的较高相对表达水平归因于从分选的CD3+T细胞纯化的CAR mRNA的较高水平。
在一些实施例中，相比于衍生自表达CFP的细胞的阴性对照融合剂脂质体，衍生自表达CAR的细胞的融合剂脂质体中通过融合剂脂质体的体外CAR mRNA货物递送更高。
分析分选细胞的表面上的CAR表达。将分选的tdTomato+CD3+细胞与缀合到Alexa荧光剂488(CD19sIg1-4:AF488)的CD19sIg1-4一起培育，如De Oliveira等人,《转化医学杂志(J Transl Med)》11:23,2013中所描述。CD19sIg1-4:AF488标记表达CD19 CAR的细胞。在由来自AB血浆(西格玛-奥德里奇公司)的人类血清阻断10分钟之后，在4℃下在黑暗中将2×105个细胞与450ng CD19sIg1-4:AF488一起培育30分钟。在用PBS洗涤两次之后，在运行FACSDivaTM软件(加利福尼亚州圣何塞的BD生物科学)的LSR II(加利福尼亚州圣何塞的BD生物科学)机器上分析细胞。与阴性对照融合剂一起培育的tdTomato+CD3+细胞细胞用于设定用于CD19sIg1-4:AF488信号的阴性门。选择门使得CD19sIg1-4:AF488的阳性事件的％等于0.0％。在用衍生自表达CAR的细胞的融合剂脂质体处理的分选的细胞中测量对于CD19sIg1-4:AF488为阳性的事件的百分比。
在一些实施例中，相比于衍生自表达mTagBFP2的细胞的阴性对照融合剂脂质体，用衍生自表达CAR的细胞的融合剂脂质体处理的细胞中通过表面CAR表达的分选的细胞的百分比更高。
实例110：T细胞特异性融合剂脂质体体外融合到T细胞
这一实例描述对于体外CD3+T细胞优先的融合剂脂质体融合物。在一些实施例中，融合剂脂质体以比替代细胞类型更大的效率将其有效负载递送到CD3+T细胞。
由如前述实例中所描述的方法中的任一种产生的细胞衍生的囊泡或细胞衍生的细胞生物制剂产生的融合剂脂质体组合物(除了融合剂脂质体)被工程改造，以使得融合剂与Cre的开放阅读框同框，但由P2A自裂解肽序列分隔。
然后将足够数目的融合剂脂质体与具有loxP-STOP-loxP-tdTomato报告分子的接受者CD3+T细胞一起在37℃和5％CO2下在包括X-VIVO 15培养基(瑞士CH巴塞尔的龙沙)的补充有5％胎牛血清(FBS)(美国加利福尼亚州洛杉矶的吉毕科公司)、100U mL-1青霉素、100μg mL-1链霉素、1.25μg mL-1两性霉素B、2mM L-谷氨酰胺(吉毕科公司)和100U mL-1hIL-2(美国康涅狄格州洛基山的PerproTech)的T细胞培养基中培育48小时的时段。融合剂脂质体与具有loxP-STOP-loxP-tdTomato报告分子的CD3+T细胞的融合导致由于Cre重组酶从阻断tdTomato表达的终止密码子切除了DNA。
在单独实验中，将相同数目的融合剂脂质体与具有loxP-STOP-loxP-tdTomato报告分子的接受者NIH/3T3成纤维细胞细胞系在37℃和5％CO2下在含有20％胎牛血清和1×青霉素/链霉素的DMEM中一起培育48小时的时段。融合剂脂质体与具有loxP-STOP-loxP-tdTomato报告分子的NIH/3T3纤维母细胞的融合导致由于Cre重组酶从阻断tdTomato表达的终止密码子切除了DNA。
在48小时培育之后，细胞在561nm激光激发和在590+/-20nm处收集发射的FACS细胞仪(美国加利福尼亚州圣何塞的百克顿-迪金森公司)上运行。设置门以测量阳性tdTomato表达。选择门以使得尚未与融合剂脂质体接触的CD3+T细胞和NIH/3T3成纤维细胞都是阴性的。对于tdTomato表达为阳性的细胞百分比在已与融合剂脂质体接触的CD3+T细胞和NIH/3T3成纤维细胞中测量。
在一些实施例中，与NIH/3T3与融合剂脂质体接触的成纤维细胞相比，与融合剂脂质体接触的CD3+细胞中的tdTomato表达呈阳性的细胞百分比更高，其表明融合剂脂质体优先与靶CD3+细胞融合。
实例111：T细胞特异性融合剂脂质体体内融合到T细胞
这一实例描述对于体内CD3+T细胞优先的融合剂脂质体融合物。在一些实施例中，融合剂脂质体以比任何替代细胞类型更大的效率将其有效负载递送到CD3+T细胞。
由如前述实例中所描述的方法中的任一种产生的细胞衍生的囊泡或细胞衍生的细胞生物制剂产生的融合剂脂质体组合物(除了融合剂脂质体)被工程改造，以使得融合剂与Cre的开放阅读框同框，但由P2A自裂解肽序列分隔。
然后每天使用可编程BS-300输注泵通过啮齿动物尾静脉导管(两个都来自Braintree Scientific Inc.)将3×1011个融合剂脂质体或PBS历时20分钟缓慢施用到B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J小鼠(杰克逊实验室品系007909)持续5天。在最终处理后三天，从接受融合剂脂质体处理的小鼠和接受PBS处理的小鼠收集周边血液。将血液收集到含有5μM EDTA的1ml PBS中并立即混合以防止凝血。将试管保持于冰上并且使用缓冲氯化铵(ACK)溶液去除红细胞。在用牛血清白蛋白阻断10分钟之后，将细胞在4℃下在黑暗中用鼠类CD3-FITC抗体(赛默飞世尔目录号：11-0032-82)染色30分钟。在用PBS洗涤两次之后，在使用488nm激光激发并且在530+/-30nm收集发射、运行FACSDivaTM软件(加利福尼亚州圣何塞的BD生物科学)的LSR II(加利福尼亚州圣何塞的BD生物科学)上分析细胞。来自接受PBS处理的小鼠的未染色细胞用于绘制阴性FITC和阴性tdTomato荧光的门。
在一些实施例中，与用PBS处理的小鼠相比，用融合剂脂质体处理的小鼠中对tdTomato荧光呈阳性的细胞百分比更高。在一些实施例中，对FITC染色呈阳性的tdTomato阳性细胞的百分比大于对用融合剂脂质体处理的小鼠中的FITC染色呈阴性的那些细胞。这表明靶向CD3+细胞的融合剂脂质体在体内与CD3+细胞特异性融合。
实例112：体外经工程改造的T细胞体外溶解与靶抗原缔合的细胞
这一实例表明在与如前述实例中的方法中的任一种中所描述的融合剂脂质体接触之后，表达CAR的CD3+T细胞能够体外溶解与靶抗原缔合的细胞，例如CD19。
表达CAR靶向CD19的CD3+T细胞与CD19+Eμ-ALL01白血病细胞(靶标)或CD19-B16F10黑素瘤肿瘤细胞(对照)一起培育。在培育之前，CD3+T细胞使用CD3特异性和CD28特异性磁珠在三个珠粒/细胞(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司生命技术)下活化，并且Eμ-ALL01白血病细胞和B16F10黑素瘤肿瘤细胞用膜染料PKH-26(西格玛-奥德里奇公司)标记、用含有10％胎牛血清的RPMI洗涤并且再悬浮于浓度为1×105个肿瘤细胞/mL的相同的培养基中。然后将T细胞以T细胞:肿瘤细胞的各种比(范围为0个T细胞:1个肿瘤细胞到100个T细胞:1个肿瘤细胞)添加到96孔培养板(最终体积为200μL)中的悬浮液中，并且在37℃下培育3小时。随后，将细胞转移到V型底96孔培养板并且用膜联蛋白V-亮紫色421(Biolegend)染色。在PBS中洗涤之后，在运行FACSDivaTM软件(加利福尼亚州圣何塞的BD生物科学)的LSR II(加利福尼亚州圣何塞的BD生物科学)上，通过流式细胞测量术分析细胞。来自培育0个T细胞:1个肿瘤细胞的细胞和单独批次的T细胞首先在流式细胞仪上运行。首先绘制门以基于PKH-26荧光区分T细胞和肿瘤细胞。绘制门以使得T细胞为阴性的并且与PKH-26一起培育的肿瘤细胞为阳性的。接着，绘制门以测量膜联蛋白V-亮紫色421染色。绘制门以使得来自培育0个T细胞:1个肿瘤细胞的细胞对于膜联蛋白V-亮紫色421都是阴性的。使用这两个门，在流式细胞仪上运行来自T细胞:肿瘤细胞的各种比的培育中的每一种的细胞。
在一些实施例中，对于PKH-26和膜联蛋白V-亮紫色421为阳性的细胞百分比随着T细胞与对于Eμ-ALL01白血病细胞的肿瘤细胞的比增加而增加，并且对于PKH-26和膜联蛋白V-亮紫色421为阳性的细胞百分比不会随着T细胞与对于B16F10黑素瘤肿瘤的肿瘤细胞的比增加而增加。这表明表达CAR靶向CD19的T细胞在与融合剂脂质体接触之后能够特异性地溶解CD19-阳性的细胞。
参见例如Smith T等人,《自然·纳米技术(Nature Nanotechnology.)》2017.DOI:10.1038/NNANO.2017.57
实例113：体内经工程改造的T细胞体外溶解与靶抗原缔合的细胞
这一实例表明经工程改造以在与融合剂脂质体体内接触之后表达CAR的CD3+T细胞能够在体外溶解与靶抗原缔合的细胞。
由如前述实例中所描述的方法中的任一种产生的细胞衍生的囊泡或细胞衍生的细胞生物制剂产生的融合剂脂质体组合物(除了融合剂脂质体)被工程改造，以使得融合剂与Cre的开放阅读框同框，但由P2A自裂解肽序列分隔。另外，融合剂脂质体被工程改造以将靶向CD-19的CAR递送到如前述实例中所描述的靶细胞。
然后每天使用可编程BS-300输注泵通过啮齿动物尾静脉导管(两个都来自Braintree Scientific Inc.)将3×1011个融合剂脂质体或PBS历时20分钟缓慢施用到B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J小鼠(杰克逊实验室品系007909)持续5天。在最终处理后三天，从接受融合剂脂质体处理的小鼠和接受PBS处理的小鼠收集周边血液。将血液收集到含有5μM EDTA的1ml PBS中并立即混合以防止凝血。将试管保持于冰上并且使用缓冲氯化铵(ACK)溶液去除红细胞。在用牛血清白蛋白阻断10分钟之后，将细胞在4℃下在黑暗中用鼠类CD3-FITC抗体(赛默飞世尔目录号：11-0032-82)染色30分钟。在用PBS洗涤两次之后，在使用488nm激光激发并且在530+/-30nm收集发射、运行FACSDivaTM软件(加利福尼亚州圣何塞的BD生物科学)的LSR II(加利福尼亚州圣何塞的BD生物科学)上分析细胞。然后将来自融合剂脂质体或PBS处理的小鼠的分选的细胞与CD19+Eμ-ALL01白血病细胞一起培育。在培育之前，用膜染料PKH-26(西格玛-奥德里奇公司)标记Eμ-ALL01白血病细胞、用含有10％胎牛血清的RPMI洗涤，并且再悬浮于浓度为1×105个肿瘤细胞/mL的相同培养基中。然后将T细胞以T细胞:肿瘤细胞的各种比(范围为0个T细胞:1个肿瘤细胞到100个T细胞:1个肿瘤细胞)添加到96孔培养板(最终体积为200μL)中的悬浮液中，并且在37℃下培育3小时。随后，将细胞转移到V型底96孔培养板并且用膜联蛋白V-亮紫色421(Biolegend)染色。在PBS中洗涤之后，在运行FACSDivaTM软件(加利福尼亚州圣何塞的BD生物科学)的LSR II(加利福尼亚州圣何塞的BD生物科学)上，通过流式细胞测量术分析细胞。来自培育0个T细胞:1个肿瘤细胞的细胞和单独批次的分选T细胞首先在流式细胞仪上运行。首先绘制第一门以基于PKH-26荧光区分T细胞和肿瘤细胞。绘制门以使得T细胞为阴性的并且与PKH-26一起培育的肿瘤细胞为阳性的。接着，绘制门以测量膜联蛋白V-亮紫色421染色。绘制门以使得来自培育0个T细胞:1个肿瘤细胞的细胞对于膜联蛋白V-亮紫色421都是阴性的。使用这两个门，在流式细胞仪上运行来自T细胞:肿瘤细胞的各种比的培育中的每一种的细胞。
在一些实施例中，对于PKH-26和膜联蛋白V-亮紫色421为阳性的细胞百分比随着T细胞与来自经融合剂脂质体处理的小鼠的Eμ-ALL01白血病细胞的比增加而增加，并且对于PKH-26和膜联蛋白V-亮紫色421为阳性的细胞百分比不会随着T细胞与来自经PB处理的小鼠的Eμ-ALL01白血病细胞的比增加而增加。这表明经工程改造以表达在用融合剂脂质体处理之后靶向CD19的CAR的T细胞能够溶解与CD19缔合的细胞。参见例如Smith T等人,《自然·纳米技术》2017.DOI:10.1038/NNANO.2017.57
实例114：体内经工程改造的T细胞体内溶解与靶抗原缔合的肿瘤细胞
这一实例表明经工程改造以在与融合剂脂质体体内接触之后表达CAR的CD3+T细胞能够体内处理肿瘤。
由如前述实例中所描述的方法中的任一种产生的细胞衍生的囊泡或细胞衍生的细胞生物制剂产生的融合剂脂质体组合物(除了融合剂脂质体)被工程改造，以使得融合剂与Cre的开放阅读框同框，但由P2A自裂解肽序列分隔。另外，融合剂脂质体被工程改造以递送如前述实例中所描述的靶向CD-19的CAR。
通过将表达Eμ-ALL01白血病细胞的荧光素酶全身性注射到4-6周龄的雌性白化病B6(C57BL/6J-Tyr<c-2J>)小鼠(杰克逊实验室)中并且使其发育1周来建立白血病模型。然后将小鼠随机分配到实验组。然后每天使用可编程BS-300输注泵通过啮齿动物尾静脉导管(两个都来自Braintree Scientific Inc.)将3×1011个融合剂脂质体或PBS历时20分钟缓慢施用持续5天。
然后每日测量作为活的白血病细胞数目的代表的发光。PBS中(15mg mL-1)的荧光素(精诺真)用作由白血病细胞表达的F-luc的底物。用精诺真IVIS光谱成像系统(精诺真)收集生物发光图像。Living Image软件4.3.1版(精诺真)用于在将D-荧光素腹膜内注射待用150mg kg-1的2％异氟醚(Forane，Baxter医疗保健)麻醉的动物种之后，采集(并且稍后定量)历时10-35分钟范围所获得的数据。采集时间在10秒到5分钟范围内。为了校正背景生物发光，从所关注的测量区域(ROI)减去从无肿瘤小鼠(注射有荧光素)所采集的信号。
在实施例中，荧光素酶信号在用PBS处理的小鼠中在21天过程内增加，并且荧光素酶信号在用融合剂脂质体处理的小鼠中在21天过程内降低。
还追踪接受PBS或融合剂脂质体的小鼠的存活期。在实施例中，接受PBS的小鼠具有小于用融合剂脂质体处理的小鼠的中值存活期。
这表明融合剂脂质体能够工程改造T细胞以在体内靶向肿瘤细胞。参见例如SmithT等人,《自然·纳米技术》2017.DOI:10.1038/NNANO.2017.57
实例115：融合剂脂质体将跨膜蛋白递送到接受者细胞
这一实例描述融合剂脂质体与细胞的体外融合。在一些实施例中，融合剂脂质体融合物导致将跨膜蛋白递送到接受者细胞。
由如前述实例中所描述的方法中的任一种产生的细胞衍生的囊泡或细胞衍生的细胞生物制剂产生的融合剂脂质体组合物(除了融合剂脂质体)被工程改造，以使得融合剂与Cre的开放阅读框和人类胰岛素受体的开放阅读框同框，但分别由P2A和T2A自裂解肽序列分隔。阴性对照融合剂脂质体被工程改造以使得融合剂与Cre的开放阅读框和蓝色荧光蛋白mTagBFP2的开放阅读框同框，各自由P2A自裂解肽序列分隔。参见例如Chen X等人,《基因与疾病》2015年3月；2(1):96-105.DOI:10.1016/j.gendis.2014.12.001。
然后将足够数目的融合剂脂质体与具有loxP-STOP-loxP-tdTomato报告分子的接受者HEK293细胞在37℃和5％CO2下在完整培养基(DMEM+10％FBS+Pen/Strep)种一起培育48小时的时段。融合剂脂质体与具有loxP-STOP-loxP-tdTomato报告分子的HEK293细胞的融合导致由于Cre重组酶从阻断tdTomato表达的终止密码子切除了DNA。在48小时培育之后，然后通过FACS，使用FACS细胞仪(美国加利福尼亚州圣何塞的百克顿-迪金森公司)以561nm激光激发分离tdTomato阳性细胞并且在590+/-20nm处收集发射。
分析递送到分选的HEK293细胞的mRNA。分离总RNA(例如使用如Qiagen RNeasy目录号74104的试剂盒)，接着使用标准分光镜法确定RNA浓度以评估RNA的吸光度(例如用赛默科技NanoDrop)。使用用于RT-PCR(赛默飞世尔科技)的Superscript III第一链合成超混合物进行逆转录，并且将RNA(100ng)逆转录成cDNA。使用具有快速高级主混合物(赛默飞世尔科学)、100ng cDNA模板、对人类胰岛素受体的可变区具有特异性的引物和探针组(使用Taqman在线引物和探针设计程序设计)以及被设计成将β-肌动蛋白扩增为内源性内参考物的引物探针组的QuantStudio3实时PCR系统(赛默飞世尔科学)进行实时PCR定量。Ct值用于比较用含有胰岛素受体mRNA的融合剂脂质体处理与用含有阴性对照的融合剂脂质体处理的HEK293细胞之间的qRT-PCR反应中的胰岛素受体cDNA的量。使用ΔΔCt方法计算相对表达。胰岛素受体的较高相对表达水平归因于从分选的HEK293 T细胞纯化的胰岛素受体mRNA的较高水平。
在一些实施例中，相比于衍生自表达CFP的细胞的阴性对照融合剂脂质体，衍生自表达胰岛素受体的细胞的融合剂脂质体中通过融合剂脂质体的体外胰岛素受体mRNA货物递送更高。
分析分选细胞的表面上的胰岛素受体表达。将分选的tdTomato+HEK293细胞与缀合到Alexa荧光剂488(Bioss抗体，目录号bs-0260R-A488)的胰岛素受体α抗体一起培育。抗体标记表达与胰岛素受体表达的量成比例的胰岛素受体的细胞。在由来自AB血浆(西格玛-奥德里奇公司)的人类血清阻断10分钟之后，在4℃下在黑暗中将2×105个细胞与450ng的缀合到Alexa荧光剂488的胰岛素受体α抗体一起培育30分钟。在用PBS洗涤两次之后，在运行FACSDivaTM软件(加利福尼亚州圣何塞的BD生物科学)的LSR II(加利福尼亚州圣何塞的BD生物科学)机器上分析细胞。与阴性对照融合剂一起培育的tdTomato+HEK293细胞用于设定用于缀合到Alexa荧光剂488信号的胰岛素受体α抗体的阴性门。选择门以使得对于缀合到Alexa荧光剂488的胰岛素受体α抗体呈阳性事件的百分比等于0.0％。对于缀合到Alexa荧光剂488的胰岛素受体α抗体呈阳性的事件的百分比是在用衍生自表达胰岛素受体的细胞的融合剂脂质体处理的分选的细胞中测量。
在一些实施例中，相比于衍生自表达mTagBFP2的细胞的阴性对照融合剂脂质体，用衍生自表达胰岛素受体的细胞的融合剂脂质体处理的细胞中通过表面胰岛素受体表达的分选的细胞的百分比更高。
实例116：融合剂脂质体将异源的信号肽靶向的跨膜蛋白递送到接受者细胞
这一实例描述融合剂脂质体与细胞的体外融合。在一些实施例中，融合剂脂质体与接受者细胞的融合导致将异源膜蛋白有效负载递送到接受者细胞的质膜。
由如前述实例中所描述的方法中的任一种产生的细胞衍生的囊泡或细胞衍生的细胞生物制剂产生的融合剂脂质体组合物(除了融合剂脂质体)被工程改造，以使得融合剂与Cre的开放阅读框和膜靶向GFP的开放阅读框同框，但分别由P2A和T2A自裂解肽序列分隔。通过将GFP的编码序列的N端融合到LCK的第一第二十六个氨基酸、含有两个棕榈酰化域和单个豆蔻酰化域的Src家族酪氨酸激酶来产生膜靶向GFP。阴性对照融合剂脂质体被工程改造以使得融合剂与Cre的开放阅读框和胞质GFP(不具有任何额外靶向肽序列的GFP编码序列)的开放阅读框同框，各自由P2A自裂解肽序列分隔。参见例如Chen X等人,《基因与疾病》2015年3月；2(1):96 105.DOI:10.1016/j.gendis.2014.12.001，和Benediktsson A等人,,《神经科学方法杂志(Journal of Neuroscience Methods)》2005 141,41-53。
然后将足够数目的融合剂脂质体与具有loxP-STOP-loxP-tdTomato报告分子的接受者HEK293细胞在37℃和5％CO2下在完整培养基(DMEM+10％FBS+Pen/Strep)种一起培育48小时的时段。融合剂脂质体与具有loxP-STOP-loxP-tdTomato报告分子的HEK293细胞的融合导致由于Cre重组酶从阻断tdTomato表达的终止密码子切除了DNA。在48小时培育之后，然后通过FACS，使用FACS细胞仪(美国加利福尼亚州圣何塞的百克顿-迪金森公司)以561nm激光激发分离tdTomato阳性细胞并且在590+/-20nm处收集发射。
GFP在经分选的HEK293细胞的质膜中的膜定位是通过共聚焦显微镜分析。在共聚焦显微镜检查之前，用标记质膜的试剂(例如CellMask深红色质膜染色，英杰公司目录号C10046)染色经分选的HEK293细胞。使用Plan Apochromat 63×1.4数值孔径油物镜，用Zeiss LSM 710倒置显微镜进行成像实验。使用488nm氩激光来激发GFP/EGFP，并且使用632nm氩激光来激发质膜染色。写入MATLAB脚本以确定每个细胞的质膜和胞质溶胶的平均GFP强度。在脚本中，计算质膜(由如质膜染色所定义的质膜的两侧上的6个像素定义)和胞质溶胶(质膜区域内的区域)中的平均强度。然后每个细胞的质膜和胞质溶胶强度的值用于计算质膜定位％。使用以下等式计算质膜定位％：质膜强度/(质膜+胞质溶胶)强度×100％。参见例如Johnson A等人,《科学报告(Scientific Reports)》6:19125(2015)。
在一些实施例中，用含有质膜定位GFP的融合剂脂质体处理的经分选细胞与用含有胞质GFP的融合剂脂质体处理的经分选细胞相比具有较高GFP质膜定位百分比。
实例117：核靶向蛋白的融合剂脂质体递送
这一实例描述融合剂脂质体与细胞的体外融合。在一个实施例中，融合剂脂质体与细胞的体外融合使得将蛋白质递送到接受者细胞核。
由如前述实例中所描述的方法中的任一种产生的细胞衍生的囊泡或细胞衍生的细胞生物制剂产生的融合剂脂质体组合物含有编码LRH-1的mRNA(例如，如Mamrosh等人,eLife 3:e01694,2014中所描述)。作为阴性对照，融合剂脂质体组合物含有具有错义突变的mRNA，其阻止LRH-1的翻译。
然后将足够数目的融合剂脂质体与接受者HEK293细胞系在37℃和5％CO2下在含有20％胎牛血清和1×青霉素/链霉素的DMEM中一起培育12小时的时段。
在12小时培育之后，制备细胞以进行成像。细胞经固定、渗透、阻断并且用抗LRH-1抗体缀合FITC(例如，LSBio目录号LC-C423401-100)免疫染色。在免疫染色之后，细胞用DAPI复染以标记细胞核。
在这个实例中，将细胞在维持于37℃和5％CO2下时，在具有63×油浸物镜的ZeissLSM710共聚焦显微镜上成像。DAPI经受405nm激光激发并且FITC经受488nm激光激发。
写入MATLAB脚本以确定视场中的核的平均FITC强度。在脚本中，核中的平均强度(由如由DAPI染色所定义的核的两侧上的6个像素定义)。核外的任何FITC信号被定义为非核。每个视场中的核和非核强度的值任何用于计算核定位％。使用以下等式计算核定位％：核定位强度/总(核+非核)强度×100％。
在一些实施例中，用含有LRH-1mRNA的融合剂脂质体处理的细胞将具有比用含有错义LRH-1mRNA的融合剂脂质体处理的细胞更高的FITC信号的核定位％。这一分析可以用于展示将治疗蛋白递送到接受者细胞核的融合剂脂质体。
实例118：不天然进入细胞核但在添加核定位序列后靶向细胞核的GFP递送
这一实例描述融合剂脂质体与细胞的体外融合。在一个实施例中，融合剂脂质体与细胞的体外融合使得将蛋白质递送到接受者细胞核。
由前述实例种所描述的方法中的任一种产生的细胞衍生的囊泡或细胞衍生的细胞生物制剂产生的融合剂脂质体组合物含有编码EGFP与核定位序列(例如，表6-1中的核定位序列中的一个)之间的翻译融合物的mRNA。作为阴性对照，融合剂脂质体组合物含有编码EGFP而不编码核定位序列的mRNA。
然后将足够数目的融合剂脂质体与接受者HEK293细胞系在37℃和5％CO2下在含有20％胎牛血清和1×青霉素/链霉素的DMEM中一起培育12小时的时段。
在12小时培育之后，使细胞成像。在使细胞成像之前，用1μg/mL Hoechst 33342染色细胞以标记核，并且用标记质膜的染色剂(例如CellMask深红色质膜染色，英杰公司，目录号C10046)染色细胞。在这个实例中，将细胞在维持于37℃和5％CO2下时，在具有63×油浸物镜的Zeiss LSM 710共聚焦显微镜上成像。Hoechst经受405nm激光激发，EGFP经受488nm激光激发，并且质膜染色经受632nm氦-氖激光激发。
写入MATLAB脚本以确定每个细胞的核和胞质溶胶的平均EGFP强度。在脚本中，计算核(由如Hoechst 33342染色所定义的细胞核的两侧上的6个像素定义)和胞质溶胶(质膜区域内和细胞核外的区域)中的平均强度。然后每个细胞的核和胞质溶胶强度的值用于计算核定位％。使用以下等式计算核定位％：核定位强度/总(核+胞质溶胶)强度×100％。
在一些实施例中，用含有EGFP-NLS融合蛋白的融合剂脂质体处理的细胞将具有比用含有EGFP的融合剂脂质体处理的细胞更高的EGFP的核定位％。这一分析可以用于展示将蛋白质递送到接受者细胞核的融合剂脂质体。
实例119：将含有驱动内源性胞质蛋白定位到接受者细胞核的核定位序列的纳米抗体递送到接受者细胞核
这一实例描述融合剂脂质体与细胞的体外融合。在一个实施例中，融合剂脂质体与细胞体外融合导致含有核定位序列的纳米抗体的递送，所述核定位序列随后将内源性胞质蛋白驱动到接受者细胞核。
由前述实例种所描述的方法中的任一种产生的细胞衍生的囊泡或细胞衍生的细胞生物制剂产生的融合剂脂质体组合物含有编码识别GFP蛋白的纳米抗体的DNA质粒，并且所述纳米抗体还含有核定位序列(例如，表6-1中的核定位序列中的一个)。作为阴性对照，融合剂脂质体组合物含有相同的GFP-靶向纳米抗体但缺乏核定位序列。
然后将足够数目的融合剂脂质体与内源性表达GFP的接受者HEK293细胞系在37℃和5％CO2下在含有10％胎牛血清和1×青霉素/链霉素的DMEM中一起培育24小时的时段。
在24小时培育之后，使细胞成像。在使细胞成像之前，用1μg/mL Hoechst 33342染色细胞以标记核，并且用标记质膜的染色剂(例如CellMask深红色质膜染色，英杰公司，目录号C10046)染色细胞。在这个实例中，将细胞在维持于37℃和5％CO2下时，在具有63×油浸物镜的Zeiss LSM 710共聚焦显微镜上成像。Hoechst经受405nm激光激发，GFP经受488nm激光激发，并且质膜染色经受632nm氦-氖激光激发。
写入ImageJ宏以确定每个细胞的核和胞质溶胶的平均EGFP强度。在宏中，计算核(由如由在取阈值和适当减去背景之后的Hoechst 33342染色定义的核的两侧上的6个像素定义)和胞质溶胶(质膜区域内核核外的区域)中的平均强度。然后每个细胞的核和胞质溶胶整合像素强度的值用于计算核定位％。使用以下等式计算核定位％：核定位整合强度/总(核+胞质溶胶)强度×100％。
在一些实施例中，用具有核定位序列的含有GFP-靶向纳米抗体的融合剂脂质体处理的细胞与用不具有核定位序列的含有GFP-靶向纳米抗体的融合剂脂质体处理的细胞相比将具有较高GFP的核定位％。这个分析可以用于展示递送可以驱动内源性蛋白定位到接受者细胞核的靶向纳米抗体的融合剂脂质体。
实例120：在不存在核靶向蛋白的情况下递送DNA
这一实例描述融合剂脂质体与细胞的体外融合。在一个实施例中，融合剂脂质体与细胞的体外融合导致将DNA递送到细胞核。
由如前述实例中所描述的方法中的任一种产生的细胞衍生的囊泡或细胞的衍生细胞生物制剂产生的融合剂脂质体组合物含有含四环素阻遏子(TetR)结合位点核DNA-探针结合位点以及TetR-NLS的DNA质粒，所述DNA质粒为翻译地融合到核定位序列(例如表6-1中的核定位序列中的一个)的TetR蛋白。作为阴性对照，融合剂脂质体组合物在DNA质粒上含有四环素阻遏子(TetR)结合位点和DNA-探针结合位点。在一些实施例中，TetR-NLS将结合到质粒上的TetR结合位点，并且在蛋白质归因于其NLS跨越核包膜运输时将质粒以及其携带到核中。
然后将足够数目的融合剂脂质体与接受者HEK293细胞系在37℃和5％CO2下在含有20％胎牛血清和1×青霉素/链霉素的DMEM中一起培育12小时的时段。
在12小时培育之后，制备细胞用于荧光原位杂交(FISH)。使用FISH标签DNAOrange试剂盒，用Alex Fluor 555染料(赛默飞世尔目录号F32948)进行FISH。简单来说，结合到质粒上的DNA-探针结合位点的DNA探针是通过切口平移、染料标记和纯化的程序产生，如试剂盒手册中所描述。然后用DNA探针标记细胞，如试剂盒手册中所描述。在用DNA探针标记之后，用1μg/mL Hoechst 33342染色细胞以标记核。
随后，将细胞在维持于37℃和5％CO2下时，在具有63×油浸物镜的Zeiss LSM 710共聚焦显微镜上成像。Hoechst经受405nm激光激发，并且DNA探针经受555nm激光激发以刺激Alexa Flour。
写入MATLAB脚本以测量每个细胞的核的Alex Fluor强度的定位。在脚本中，核中的平均强度由如由Hoechst 33342染色所定义的核的两侧上的6个像素定义。
在一些实施例中，用含有质粒和TetR-NLS的融合剂脂质体处理的细胞比用仅含有质粒的融合剂脂质体处理的细胞具有更高的核荧光强度。这一分析可以用于展示将定位DNA有效负载的蛋白质递送到接受者细胞核的融合剂脂质体。
实例121：上调基因表达的合成转录因子的递送
这一实例描述融合剂脂质体与细胞的体外融合。在一个实施例中，融合剂脂质体与细胞的体外融合导致将转录因子递送到接受者细胞核。
由如前述实例中所描述的方法中的任一种产生的细胞衍生的囊泡或细胞衍生的细胞生物制剂产生的融合剂脂质体组合物含有编码翻译地融合到无核酸酶的化脓性链球菌cas9(VPR-dCas9)的C端的VP64-p65-Rta的mRNA和靶向原间隔子的向导RNA。作为阴性对照，融合剂脂质体组合物含有编码具有加扰向导RNA的VPR-dCas9的mRNA。VP64-p65-RTA为将转录机构募集到基因的三个转录活化子(VP64、p65和RTA)的翻译融合物。在这个实例中，受VP64-p65-RTA影响的基因是由如向导RNA引导的dCas9结合DNA的位置确定，例如如Chavez等人,《自然方法(Nature Methods)》2015doi:10.1038/nmeth.3312中所描述。
然后将足够数目的融合剂脂质体与具有整合于微型-CMV启动子核tdTomato的原间隔子上游的基因组中的接受者HEK293细胞系在37℃核5％CO2下在含有20％胎牛血清核1×青霉素/链霉素中一起培育48小时的时段。作为额外的阴性对照，相同的HEK293细胞不暴露于任何融合剂脂质体。
在48小时培育之后，使细胞成像。在使细胞成像之前，用1μg/mL Hoechst 33342染色细胞以标记核。将细胞在维持于37℃和5％CO2下时，在具有63×油浸物镜的Zeiss LSM710共聚焦显微镜上成像。Hoechst经受405nm激光激发，并且tdTomato经受561nm激光激发。基于Hoechst的存在鉴别细胞并且测量每个细胞的tdTomato荧光的量。
在一些实施例中，用含有VPR-dCas9和靶向原间隔子的向导RNA的融合剂脂质体处理的细胞将具有比用VPR-dCas9和加扰向导RNA处理的细胞或不经融合剂脂质体处理的细胞更高的tdTomato荧光。这一分析可以用于展示将蛋白质传递到接受者细胞核的融合剂脂质体，其改变靶基因的转录水平。
实例122：递送改变基因表达的合成表观遗传因子
这一实例描述融合剂脂质体与细胞的体外融合。在一个实施例中，融合剂脂质体与细胞的体外融合导致将表观遗传调控子递送到接受者细胞核。
由如前述实例中所描述的方法中的任一种产生的细胞衍生的囊泡或细胞衍生的细胞生物制剂产生的融合剂脂质体组合物含有编码翻译地融合到无核酸酶的化脓性链球菌cas9(Tet1-dCas9)的C端的Tet1酶域的mRNA和靶向Snrpn启动子区的向导RNA。作为阴性对照，融合剂脂质体组合物含有编码具有加扰向导RNA的Tet1-dCas9的mRNA。在5-胞嘧啶上的Tet1(十-十一易位)双加氧酶甲基形成5-羟甲基胞嘧啶，然后将其恢复到未经修饰的胞嘧啶。5-胞嘧啶处的甲基化抑制邻近DNA序列转录，因此Tet1通过去除这些甲基而活化转录。在这个实例中，受Tet1影响的基因是由如向导RNA引导的dCas9结合DNA的位置确定，例如如Liu等人,《细胞》167(1):233-247,2016中所描述。
然后将足够数目的融合剂脂质体与报告分子系在37℃和5％CO2下在含有20％胎牛血清和1×青霉素/链霉素的DMEM中一起培育72小时的时段。报告分子系为具有整合于Dazl启动子基因座处的基因组中的HEK293细胞系，其为控制GFP表达的合成甲基化-感测启动子(来自压印基因的启动子的保守序列元件，Snrpn)(Stelzer等人,《细胞》163:218-229,2015)。Dazl启动子为高度甲基化的，并且因此Snrpn启动子不具有活性并且GFP不在这些细胞中表达。作为额外的阴性对照，相同的HEK293细胞不暴露于任何融合剂脂质体。
在72小时培育之后，用流式细胞测量术测量mCherry荧光。细胞在具有561nm激光激发并且在590+/-20nm处收集发射的FACS细胞仪美国加利福尼亚州圣何塞的百克顿-迪金森公司)上运行。设置门以测量阳性tdTomato表达。选择门以使得未暴露于任何融合剂脂质体的HEK293细胞对于tdTomato表达为阴性的。然后测量对tdTomato表达呈阳性的细胞的百分比。
在一些实施例中，用含有Tet1-dCas9和靶向Snrpn启动子区的向导RNA的融合剂脂质体处理的细胞将具有比用Tet1-dCas9和加扰向导RNA处理的细胞或不经融合剂脂质体处理的细胞更高的tdTomato荧光。这一分析可以用于展示将蛋白质传递到接受者细胞核的融合剂脂质体，其改变靶基因的表观遗传状态。
实例123：天然靶向线粒体的蛋白质的递送
这一实例描述融合剂脂质体与细胞的体外融合。在一个实施例中，融合剂脂质体与细胞的体外融合导致将蛋白质递送到接受者细胞线粒体。
由如前述实例中所描述的方法中的任一种产生的细胞衍生的囊泡或细胞衍生的细胞生物制剂产生的融合剂脂质体组合物含有编码鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)的mRNA。作为阴性对照，融合剂脂质体组合物含有具有错义突变的mRNA，其阻止OTC的翻译。
然后将足够数目的融合剂脂质体与接受者HEK293细胞系在37℃和5％CO2下在含有10％胎牛血清和1×青霉素/链霉素的DMEM中一起培育24小时的时段。
在24小时培育之后，制备细胞以进行成像。细胞用Mitotracker深红色FM(赛默飞世尔，目录号M22426)染色、固定、渗透、阻断并且用抗OTC体(例如艾碧康目录号ab91418)免疫染色。在免疫染色之后，细胞用结合到Alexa Fluor 488的二级抗体(例如，艾碧康目录号ab150077)进行反向染色。
在这个实例中，将细胞在维持于37℃和5％CO2下时，在具有63×油浸物镜的ZeissLSM 710共聚焦显微镜上成像。Mitotracker深红色FM经受632nm激光激发并在665±20nm处捕获发射，并且Alexa Fluor经受488nm激光激发并在510±15nm处捕获发射。
通过基于MitoTracker深红色荧光掩蔽线粒体区域，接着确定Alexa Fluor 488在线粒体区域中和线粒体区域外部的平均荧光强度计算Alexa Fluor 488(OTC信号)与Mitotracker深红色标记的线粒体的共定位。在ImageJ(NIH)中处理所有图像，并且使用矩阈值算法对线粒体区域进行阈值处理以识别在减去背景之后的区域。
平均线粒体OTC信号被定义为线粒体区域内的Alexa Fluor 488的平均荧光强度，并且平均非线粒体OTC信号被定义为线粒体区域外(但在由平行相位对比图像指定的细胞边界内)的Alexa Fluor 488的平均荧光强度。给定细胞的标准化线粒体OTC信号被计算为标准化到非线粒体OTC信号的平均线粒体OTC信号。对于每个组，使至少30-40个细胞成像并分析。
在一些实施例中，用含有OTC mRNA的融合剂脂质体处理的细胞将在线粒体区域内具有比用含有错义OTC mRNA的融合剂脂质体处理的细胞更高的Alexa Fluor 488的平均荧光强度。在一些实施例中，用含有OTC mRNA的融合剂脂质体处理的细胞将具有比用含有错义OTC mRNA的融合剂脂质体处理的细胞更高的标准化线粒体OTC信号。这一分析可以用于展示将治疗蛋白递送到接受者细胞的线粒体的融合剂脂质体。
实例124：除了添加线粒体定位序列外，不天然靶向线粒体的蛋白质的递送
这一实例描述融合剂脂质体与细胞的体外融合。在一个实施例中，融合剂脂质体与细胞的体外融合导致将蛋白质递送到接受者细胞线粒体。
由前述实例种所描述的方法中的任一种产生的细胞衍生的囊泡或细胞衍生的细胞生物制剂产生的融合剂脂质体组合物含有编码EGFP与线粒体定位序列(例如，表6-2中的线粒体定位序列中的一个)之间的翻译融合物的mRNA。作为阴性对照，融合剂脂质体组合物含有编码EGFP而不编码线粒体定位序列的mRNA。
然后将足够数目的融合剂脂质体与接受者HEK293细胞系在37℃和5％CO2下在含有10％胎牛血清和1×青霉素/链霉素的DMEM中一起培育12小时的时段。
在24小时培育之后，使细胞成像。在使细胞成像之前，用Mitotracker深红色FM(赛默飞世尔目录号M22426)染色细胞以标记线粒体并且用标记质膜的染色剂(例如CellMask橙质膜染色，赛默飞世尔，目录号C10045)染色细胞。在这个实例中，将细胞在维持于37℃和5％CO2下时，在具有63×油浸物镜的Zeiss LSM 710共聚焦显微镜上成像。质膜染色经受554nm激光激发，其中在580±20nm处捕获发射，Mitotracker深红色FM经受632nm激光激发，其中在665±20nm下捕获发射，并且EGFP经受488nm激光激发，其中在510±15nm下捕获发射。
通过基于MitoTracker深红色荧光掩蔽线粒体区域，接着确定EGFP在线粒体区域中和线粒体区域外部的平均荧光强度计算EGFP与Mitotracker深红色标记的线粒体的共定位。在ImageJ(NIH)中处理所有图像，并且使用矩阈值算法对线粒体区域进行阈值处理以识别在减去背景之后的区域。
平均线粒体EGFP信号被定义为线粒体区域内的EGFP的平均荧光强度，并且平均非线粒体EGFP信号被定义为线粒体区域外(但在由质膜染色指定的细胞边界内)的EGFP的平均荧光强度。给定细胞的标准化线粒体EGFP信号被计算为标准化到非线粒体EGFP信号的平均线粒体EGFP信号。对于每个组，使至少30-40个细胞成像并分析。
在一些实施例中，用含有线粒体靶向EGFP mRNA的融合剂脂质体处理的细胞将具有比用含有非线粒体靶向EGFP mRNA的融合剂脂质体处理的细胞更高的平均线粒体EGFP信号。在一些实施例中，用含有线粒体靶向EGFP mRNA的融合剂脂质体处理的细胞将具有比用含有非线粒体靶向EGFP mRNA的融合剂脂质体处理的细胞更高的标准化线粒体EGFP信号。这一分析可以用于展示将蛋白质递送到接受者细胞的线粒体的融合剂脂质体。
实例125：通过独立于溶酶体酸化的路径递送融合剂脂质体
通常，通过内吞作用来实现复杂的生物货物进入靶细胞。内吞作用需要货物进入内体，所述内体成熟为酸化的溶酶体。不利的是，通过内吞作用进入细胞的货物可能会被困在内体或溶酶体中并且不能到达细胞质或靶细胞的其它所要隔室。货物也可能被溶酶体中的酸性条件破坏。一些病毒能够非内吞进入靶细胞；然而，这个过程尚未被完全理解。这个实例表明病毒融合剂可以与病毒的其余部分分离并且在缺乏其它病毒蛋白的融合剂脂质体上赋予非内吞进入。
根据超速离心的标准程序通过Ficoll梯度产生来自HEK-293T细胞的融合剂脂质体，所述细胞在细胞表面上表达尼帕病毒受体结合G蛋白和融合F蛋白(NivG+F)并且表达Cre重组酶蛋白，以获得小粒子融合剂脂质体，如本文所描述。为了证实通过非内吞路径将融合剂脂质体递送到接受者细胞，NivG+F融合剂脂质体用于处理接受者HEK-293T细胞，所述细胞被工程改造以在CMV启动子下表达“Loxp-GFP-stop-Loxp-RFP”盒。NivF蛋白为pH非依赖性包膜糖蛋白，已展示其活化和后续融合活性不需要环境酸化(Tamin,2002)。
将接受者细胞以30,000个细胞/孔接种于黑色的透明底96孔培养板中。在接种接受者细胞之后四到六小时，将表达Cre重组酶蛋白的NivG+F融合剂脂质体施加到DMEM培养基中的靶接受者细胞或非靶接受者细胞。首先通过二喹啉甲酸分析(BCA，赛默飞世尔，目录号23225)根据制造商的说明书测量融合剂脂质体样品的总蛋白含量。将接受者细胞用10μg融合剂脂质体处理并且在37℃和5％CO2下培育24小时。为了证实通过非内吞路径经由NivG+F融合剂脂质体递送Cre，将一个平行孔的接受NivG+F融合剂脂质体处理的接受者细胞用内体/溶酶体酸化抑制剂巴弗洛霉素A1(Baf；100nM；西格玛，目录号B1793)共处理。
使用自动显微镜(www.biotek.com/products/imaging-microscopy-automated-cell-imagers/lionheart-fx-automated-live-cell-imager/)对细胞培养板进行成像。通过在DMEM培养基中用Hoechst 33342染色细胞10分钟来确定给定孔中的总细胞群体。Hoechst 33342通过插入到DNA中染色细胞核并且因此用于鉴别个别细胞。使用405nm LED和DAPI滤光立方体对Hoechst染色成像。GFP使用465nmLED和GFP滤光立方体成像，而RFP使用523nm LED和RFP滤光立方体成像。通过首先在阳性对照孔上确立LED强度和积分时间来采集靶细胞和非靶细胞孔的图像，所述阳性对照孔含有用编码Cre重组酶的腺病毒而非融合剂脂质体处理的接受者细胞。
设定采集设置，以使得Hoescht、RFP和GFP强度处于最大像素强度值但不饱和。然后使用确立的设置对所关注的孔成像。通过自动聚焦在Hoescht通道上并且随后使用GFP和RFP通道的已确立的焦平面将焦点设置在每个孔上。用配备有自动荧光显微镜的Gen5软件进行GFP和RFP阳性细胞的分析(https://www.biotek.com/products/software-robotics-software/gen5-microplate-reader-and-imager-software/)。
使用60μm宽的滚球背景减除算法对图像进行预处理。GFP强度显著高于背景强度的细胞为阈值处理的并且排除太小或太大而无法成为GFP阳性细胞的区域。将相同分析步骤应用于RFP通道。然后将RFP阳性细胞(接受Cre的接受者细胞)的数目除以GFP阳性细胞(不展示递送的接受者细胞)和RFP阳性细胞的总和以定量RFP转化百分比，其指示融合剂脂质体与接受者细胞的融合量。
通过这个分析，衍生自在表面上表达NivG+F并且含有Cre重组酶蛋白的HEK-293T细胞的融合剂脂质体展示通过溶酶体非依赖性路径的显著递送，这与通过非内吞路径的进入一致，如通过即使在用Baf共处理接受者细胞以抑制内吞作用介导的摄取时仍由NivG+F融合剂脂质体显著递送Cre货物来证明(下表27)。在这种情况下，Baf共处理对货物递送的抑制为23.4％。
表27：HEK-293T细胞中的RFP转化率
组别
RFP转化％(±SD)
接受者+无融合剂脂质体
0.4±0.2％
接受者+NivG+F融合剂脂质体
88.9±3.4％
接受者+NivG+F融合剂脂质体+Baf
68.1±2.7％
实例126：测量与靶细胞的融合
产生衍生自HEK-293T细胞的融合剂脂质体，所述细胞在细胞表面上表达经工程改造的麻疹病毒的红血球凝集素糖蛋白(MvH)和融合蛋白(F)并且含有Cre重组酶蛋白，如本文所描述。MvH经工程改造以消除其天然受体结合，并且通过识别细胞表面抗原的单链抗体(scFv)提供靶细胞特异性，在这种情况下，scFv被设计成靶向CD8，一种用于T细胞受体的共受体。使用对照融合剂脂质体，其衍生自在表面上表达融合剂VSV-G并且含有Cre重组酶蛋白的HEK-293T细胞。靶细胞为HEK-293T细胞，其经工程改造以在CMV启动子下表达“Loxp-GFP-stop-Loxp-RFP”盒，并且经工程改造以过度表达共受体CD8a和CD8b。非靶细胞为相同的HEK-293T细胞，其表达“Loxp-GFP-stop-Loxp-RFP”盒但没有CD8a/b过度表达。将靶接受者细胞或非靶接受者细胞以30,000个细胞/孔接种于黑色的透明底96孔培养板中，并且在37℃和5％CO2下在具有10％胎牛血清的DMEM培养基中培养。在接种接受者细胞之后四到六小时，将表达Cre重组酶蛋白和MvH+F的融合剂脂质体施加到DMEM培养基中的靶接受者细胞或非靶接受者细胞。将接受者细胞用10μg融合剂脂质体处理并且在37℃和5％CO2下培育24小时。
使用自动显微镜(www.biotek.com/products/imaging-microscopy-automated-cell-imagers/lionheart-fx-automated-live-cell-imager/)对细胞培养板进行成像。通过在DMEM培养基中用Hoechst 33342染色细胞10分钟来确定给定孔中的总细胞群体。Hoechst 33342通过插入到DNA中染色细胞核并且因此用于鉴别个别细胞。使用405nm LED和DAPI滤光立方体对Hoechst成像。GFP使用465nm LED和GFP滤光立方体成像，而RFP使用523nm LED和RFP滤光立方体成像。通过首先在阳性对照孔；即，用编码Cre重组酶的腺病毒而非融合剂脂质体处理的接受者细胞上确立LED强度和积分时间来获得靶细胞和非靶细胞孔的图像。
设定采集设置，以使得Hoescht、RFP和GFP强度处于最大像素强度值但不饱和。然后使用确立的设置对所关注的孔成像。通过自动聚焦在Hoescht通道上并且随后使用GFP和RFP通道的已确立的焦平面将焦点设置在每个孔上。用配备有自动荧光显微镜的Gen5软件进行GFP和RFP阳性细胞的分析(https://www.biotek.com/products/software-robotics-software/gen5-microplate-reader-and-imager-software/)。
使用60μm宽的滚球背景减除算法对图像进行预处理。GFP强度显著高于背景强度的细胞为阈值处理的并且排除太小或太大而无法成为GFP阳性细胞的区域。将相同分析步骤应用于RFP通道。然后将RFP阳性细胞(接受Cre的接受者细胞)的数目除以GFP阳性细胞(不展示递送的接受者细胞)和RFP阳性细胞的总和以定量RFP转化百分比，其描述靶接受者细胞群体和非靶接受者细胞群体内的融合剂脂质体融合的量。对于靶向融合(融合剂脂质体与靶向接受者细胞的融合)的量，将RFP转化百分比值标准化为作为靶接受者细胞(即，表达CD8)的接受者细胞的百分比，其通过用结合到藻红蛋白(PE)的抗CD8抗体染色而评估并且通过流式细胞测量术进行分析。最后，通过从靶细胞融合量减去非靶细胞融合量来确定靶向融合的绝对量(任何<0的值均被视为0)。
通过这个分析，当接受者细胞为表达“Loxp-GFP-stop-Loxp-RFP”盒的靶HEK-293T细胞时，衍生自在表面上表达经工程改造的MvH(CD8)+F并且含有Cre重组酶蛋白的HEK-293T细胞的融合剂脂质体展示25.2+/-6.4％的RFP转化百分比，并且观察到这些接受者细胞中的51.1％为CD8阳性的。根据这些结果，针对靶向融合的标准化RFP转化百分比或靶向融合的量被确定为49.3+/-12.7％。当接受者是表达“Loxp-GFP-stop-Loxp-RFP”但不表达CD8的非靶HEK-293T细胞时，相同融合剂脂质体展示0.5+/-0.1％的RFP转化百分比。基于以上，MvH(CD8)+F融合剂脂质体的靶向融合的绝对量被确定为48.8％并且对照VSV-G融合剂脂质体的靶向融合的绝对量被确定为0％。
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