阅读说明：本技术 利用体外冲击波的向细胞外囊泡内靶物质传递方法 (Method for delivering target substance into extracellular vesicle by using external shock wave ) 是由 权起焕 郑智化 金暻花 于 2018-05-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及包括将靶物质及细胞外囊泡暴露在体外冲击波的步骤的向细胞外囊泡内传递靶物质的方法、导入靶物质的细胞外囊泡的制备方法、通过上述方法制备的细胞外囊泡、包含上述细胞外囊泡的药物载体以及向细胞内传递靶物质的方法。在本发明的方法中,不仅在细胞外将包括动物细胞、植物细胞、病菌及真核细菌的微生物等来源于自然界生物的细胞外囊泡暴露在体外冲击波,还在细胞外将人为制备的细胞外囊泡暴露在体外冲击波,可使用强力的能量强度的体外冲击波,可有效地向体外囊泡内传递靶物质,并且,若以体外冲击波进行处理,则导入靶物质的上述细胞外囊泡向目的细胞的掺入能力也增加,通过本发明的方法能够以高效率向细胞内传递靶物质,从而可利用于各种领域。(The present invention relates to a method for delivering a target substance into an extracellular vesicle, which comprises a step of exposing the target substance and the extracellular vesicle to an in vitro shock wave, a method for producing the extracellular vesicle into which the target substance is introduced, the extracellular vesicle produced by the above method, a drug carrier comprising the above extracellular vesicle, and a method for delivering the target substance into a cell. In the method of the present invention, not only extracellular vesicles derived from a natural organism, such as microorganisms including animal cells, plant cells, germs, and eukaryotic bacteria, are exposed to an extracorporeal shock wave outside the cells, but also extracellular vesicles prepared artificially are exposed to an extracorporeal shock wave outside the cells, and thus, a target substance can be efficiently delivered into the extracellular vesicles using the extracorporeal shock wave having a strong energy intensity.)

利用体外冲击波的向细胞外囊泡内靶物质传递方法

技术领域

本发明涉及包括将靶物质及细胞外囊泡暴露在体外冲击波的步骤的向细胞外囊泡内传递靶物质的方法、导入靶物质的细胞外囊泡的制备方法、通过上述方法制备的细胞外囊泡、包含上述细胞外囊泡的药物载体及向细胞内传递靶物质的方法。

背景技术

冲击波为通过特定声波发生器生成的连续的单一声波，具有100MPa为止的高峰值压力的振幅，具有小于1μs的短的持续时间，能够以0.005mJ/mm²至1.0mJ/mm²范围的能量密度向特定靶部位传递。

高能量的体外冲击波碎石术(extracorporeal shock-wavelithotripsy，ESWL)为向人体特定部位照射35MPa至100MPa的压力的治疗方法，自从用于分解肾和胆管的结石以来，作为新的治疗方法在各种领域尝试。最近，体外冲击波碎石术用于肌肉骨骼疾病治疗，对抗炎症作用及血流增加有效。

细胞外囊泡为由双层脂质膜形成的具有数十nm至数百nm的大小的纳米囊泡，由蛋白质、脂质、基因等生物活性的物质构成。在以往，将这种细胞外囊泡视作在细胞中分泌的残渣，最近，随着出现细胞外囊泡的临床意义，进行各种研究。尤其，作为被细胞排出的球形小泡的外泌体具有母细胞的蛋白质、DNA等的各种信息，因此，积极研究将外泌体用作生物标记物的癌症诊断标记物及传感器。如一例，具有提出如下的可能性的研究，即，在存在于患者的血液内的细胞外囊泡中，基于变形的形态的EGFRⅧ的基因探测与否，诊断胶质母细胞瘤。并且，还具有在存在于患者的小便内的细胞外囊泡中，通过分析来源于癌细胞的细胞外囊泡的基因组来确认作为***癌生物标记物的PCA-3及TMPRSS2：ERG的存在的研究结果。同时，在韩国专利授权第10-1704828号揭示通过分析在体液内的细胞外囊泡内存在的炎症疾病关联基因表达量来诊断炎症疾病的方法。

另一方面，在韩国专利授权第10-1719569号中，在本发明之前，本发明人通过确认在进行体外冲击波处理的细胞中导入所要的靶物质的外泌体、核外颗粒体、微泡或凋亡小体等的细胞外囊泡的生成及分泌增加，来确认了生成含靶物质的细胞的方法。但是，上述方法仅确认转化过程以通过向细胞施加的体外冲击波生成的细胞外囊泡为媒介进行，细胞外囊泡，尤其，未揭示利用外泌体本身的机制及直接利用其的转化方法。相比于利用细胞的治疗方法，基于外泌体的药物传递或治疗没有血管闭合效应，可降低诱发二次继发性微血管血栓形成的风向及肿瘤形成的风险。并且，可通过少量的细胞获取大量外泌体，如上所述，所获取的大量的外泌体具有稳定性、容易储存、不诱发免疫排斥反应、容易适用于临床的诸多优点。因此，相比于以细胞为媒介的治疗法，需要研究得到改善的利用外泌体本身的细胞治疗法。

发明内容

技术问题

因此，本发明人在研究转化过程中向作为传递靶物质的介质的细胞外囊泡内传递靶物质的方法时，经确认，与以往的授权专利第10-1719569号不同地，若在细胞外囊泡处理能量等级高的体外冲击波，靶物质向细胞外囊泡的导入率增加，对于导入上述靶物质的细胞外囊泡的细胞的掺入能力增加。并且，作为负载靶物质的细胞外囊泡，捕集内壳利用包括动物细胞、植物细胞、病菌及真核细菌的微生物等来源于自然界生物的细胞外囊泡，还可利用人为制备的细胞外囊泡，经确认，若利用体外冲击波，向所目的的细胞传递靶物质的效率增加，从而完成了本发明。

因此，本发明的目的在于，提供包括将靶物质及细胞外囊泡暴露在体外冲击波的步骤的向细胞外囊泡内传递靶物质的方法、导入靶物质的细胞外囊泡的制备方法、通过上述方法制备的细胞外囊泡、包含上述细胞外囊泡的药物载体及向细胞内传递靶物质的方法。

解决问题的方案

为实现上述目的，本发明提供包括将靶物质及细胞外囊泡暴露在体外冲击波的步骤的向细胞外囊泡内传递靶物质的方法。

并且，本发明提供包括将靶物质及细胞外囊泡暴露在体外冲击波的步骤的导入靶物质的细胞外囊泡的制备方法。

并且，本发明提供通过上述方法制备的细胞外囊泡。

并且，本发明提供包含上述细胞外囊泡的药物载体。

并且，本发明提供向细胞内传递靶物质的方法，包括：步骤(a)，将靶物质及细胞外囊泡暴露在体外冲击波，来向细胞外囊泡内导入靶物质；以及步骤(b)，利用导入靶物质的上述细胞外囊泡处理细胞。

前述发明内容仅仅是说明性的，并不旨在以任何方式进行限制。除了以上描述的说明性方面、实施例和特征之外，其它方面、实施例和特征将通过参考附图和以下详细描述变得明显的。

发明的效果

在本发明的方法中，不仅在细胞外将包括动物细胞、植物细胞、病菌及真核细菌的微生物等来源于自然界生物的细胞外囊泡暴露在体外冲击波，还在细胞外将人为制备的细胞外囊泡暴露在体外冲击波，可使用强力的能量强度的体外冲击波，可有效地向体外囊泡内传递靶物质。并且，若进行体外冲击波处理，则导入靶物质的上述细胞外囊泡向目的细胞的掺入能力也增加，通过本发明的方法能够以高效率向细胞内传递靶物质，从而可利用于各种领域。

附图说明

图1为示出根据体外冲击波处理与否测定外泌体分散溶液的ζ-电位的变化的结果的图。

图2为示出利用纳米颗粒跟踪分析(NTA)设备测定根据体外冲击波与否的外泌体大小变化的结果的图。

图3为示出在人血管内皮细胞——人脐静脉内皮细胞(HUVEC)对进行体外冲击波处理的来源于血管内皮细胞——人脐静脉内皮细胞的外泌体进行处理，并根据能量等级比较分析通过体外冲击波的细胞内外泌体掺入(incorporation)程度的实验结果的图。

图4为示出通过各种等级的体外冲击波向外泌体导入siRNA(siGlo)及比较分析导入siRNA的上述外泌体的掺入能力的结果的图。

图5为示出通过各种等级的体外冲击波向外泌体导入红色荧光蛋白及比较分析导入蛋白质的上述外泌体的掺入能力的结果的图。

图6为示出通过各种等级的体外冲击波向外泌体导入microRNA及比较分析导入microRNA的上述外泌体的掺入能力的结果的图。

图7为示出在各种细胞中与对照组ESW X比较利用通过体外冲击波导入核酸的来源于人脐静脉内皮细胞的细胞外囊泡ESW O的microRNA(Cel-miR-39)的转化率的结果的图。

图8为示出在各种细胞中与对照组ESW X比较利用通过体外冲击波导入核酸的来源于间充质干细胞(MSC)的细胞外囊泡ESW O的micro RNA(Cel-miR-39)的转化率的结果的图。

图9为示出在各种细胞中与对照组ESW X比较利用通过体外冲击波导入核酸的来源于血管平滑肌细胞(VSMC)的细胞外囊泡ESW O的micro RNA(Cel-miR-39)的转化率的结果的图。

图10为示出在人血管内皮细胞——人脐静脉内皮细胞对进行体外冲击波处理的来源于牛乳外泌体进行处理，并与对照组比较分析通过体外冲击波的细胞内外泌体掺入程度的结果的图。

图11为示出人血管内皮细胞——人脐静脉内皮细胞对进行体外冲击波处理的来源于西柚的外泌体进行处理，并与对照组比较分析通过体外冲击波的细胞内外泌体掺入程度的结果的图。

具体实施方式

在下面的详细描述中，对附图做出的参考构成其一部分。在详细描述、附图和权利要求中描述的说明性实施例并不表示是限制性的。在不脱离本文呈现的主题的精神或范围下，可以采用其它实施例并且可以进行其它改变。

本发明提供包括将靶物质及细胞外囊泡暴露在体外冲击波的步骤的向细胞外囊泡内传递靶物质的方法。

以下，更加详细地说明本发明。

在本发明中使用的术语“靶物质”中，只要是向细胞内传递来表达所要目的的效果的物质，则上述靶物质就没有限制，优选地，上述靶物质可为选自由核酸、蛋白质及化合物组成的组中的一种以上。并且，上述核酸为自然界中的核酸，还可包含人为制备的核酸，优选地，可为DNA、RNA、微小RNA(microRNA，miRNA)、小RNA(Small RNA，smRNA)、小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)、piRNA(Piwi-interacting RNA)、小核仁RNA(smallnucleolar RNA，snoRNA)、来源于t-RNA-的小RNA(tRNA-derived small RNA，tsRNA)、来源于小rDNA的RNA(small rDNA-derived RNA，srRNA)、小核RNA(small nuclear RNA，U-RNA)及长非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)，但并不限定于此。

本发明中使用的术语“体外冲击波”为通过特定声波发生器生成的连续的单一声波，具有100MPa为止的高峰值压力的振幅，具有小于1μs的短的持续时间，能够以0.005mJ/mm²至1.0mJ/mm²范围的能量密度向特定靶部位传递。与以往的授权专利第10-1719569号不同地，本发明具有如下的优点，即，在外泌体进行体外冲击波处理，可使用在以往的专利中对活细胞进行体外冲击波处理来使细胞灭绝而无法使用的0.09mJ/mm²以上的体外冲击波，可使用以往的授权专利的实施例中未具体确认效果的0.05mJ/mm²以上的体外冲击波。

在使用如上所述的高能量等级的0.05mJ/mm²以上的体外冲击波的本发明的一实施例中，经确认，靶物质向细胞外囊泡的导入率增加及导入靶物质的上述细胞外囊泡向细胞的掺入能力也增加，由此，经确认，向所目的的细胞内传递靶物质的传递效率也增加。并且，经确认，不仅可利用如上所述的来源于动物细胞的细胞外囊泡，还可利用来源于植物细胞的细胞外囊泡，从而可拓宽作为药物载体的利用性。

由此，本发明中使用的上述体外冲击波可在0.05mJ/mm²至0.9mJ/mm²的能量范围内处理，具体地，可在0.05mJ/mm²至0.89mJ/mm²的能量范围内处理，更具体地，可在0.05mJ/mm²至0.70mJ/mm²的能量范围内处理。上述体外冲击波的强度根据施加体外冲击波的细胞外囊泡的容积、形成细胞外囊泡的细胞种类、所形成的细胞外囊泡的种类不同。在本发明的一实施例中，以0.07mJ/mm²以上的强度的上述体外冲击波处理细胞外囊泡。

本发明的术语“细胞外囊泡”为被来源于细胞的膜包围的小球体，这种球体的名称根据所形成的细胞的来源或形成方法多种多样。在本发明中，可包含选自由根据在细胞形成的方法命名的外泌体(exosome)、核外颗粒体(ectosome)、微泡(microvesicle)及凋亡小体(apoptotic body)组成的组中的一种，但并不限定于此。上述细胞外囊泡可为来源于自然界，如植物、动物、微生物的细胞外囊泡或人为制备的细胞外囊泡。并且，上述细胞可为从自然界生物个体分离的细胞。并且，上述细胞可来源于包括人及非人哺乳类的一种动物、植物，可为各种种类的免疫细胞、肿瘤细胞等。并且，在本发明的一实施例中，上述细胞使用人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)、间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)或血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)。

并且，如本发明的具体实施例，本发明人将细胞外囊泡用作外泌体，使用来源于植物或动物的上述外泌体并导入靶物质，以此有效地向细胞外囊泡内传递靶物质。

因此，相比于未施加体外冲击波的情况，施加体外冲击波来向细胞外囊泡内导入靶物质的情况的效率更优秀，经确认，导入靶物质的上述细胞外囊泡呈现出向其他细胞内的优秀的转化效率，本发明的方法可利用于与此相关的各种领域。

并且，本发明提供包括将靶物质及细胞外囊泡暴露在体外冲击波的步骤的导入靶物质的细胞外囊泡的制备方法。

在本发明的导入靶物质的细胞外囊泡的制备方法中，上述体外冲击波可在0.05mJ/mm²至0.9mJ/mm²的能量范围内处理，具体地，可在0.05mJ/mm²至0.89mJ/mm²的能量范围内处理，更具体地，可在0.05mJ/mm²至0.70mJ/mm²的能量范围内处理，来有效地向细胞内导入靶物质。在本发明的一实施例中，以0.07mJ/mm²以上的强度的上述体外冲击波在细胞外囊泡处理，来有效地制备了导入靶物质的细胞外囊泡。

在本发明的方法中，细胞外囊泡可使用选自由外泌体、核外颗粒体、微泡及凋亡小体构成的组中的一种，但并不限定于此。上述细胞外囊泡可为来源于由具有细胞外囊泡的一种植物、动物及微生物形成的自然界生物或人为制备，本发明的一实施例中使用外泌体。

并且，本发明提供通过上述方法制备的细胞外囊泡。

若利用通过本发明的包括将靶物质及细胞外囊泡暴露在体外冲击波的步骤的导入靶物质的细胞外囊泡的制备方法制备的细胞外囊泡，则可使细胞外囊泡不破损地向细胞外囊泡传递靶物质。

在本发明的一实施例中，在以0.02mJ/mm²的体外冲击波处理的情况下，与作为体外冲击波未处理组的对照组没有差异，在以0.07mJ/mm²能量等级的体外冲击波处理的情况下，相比于对照组，外泌体分散溶液的ζ-电位值增加20％以上。并且，在通过上述方法制备的细胞外囊泡中，在本发明的一实施例中确认外泌体的大小分布度变化的不同，经确认，由于体外冲击波，外泌体的大小分布不同。通过上述结果确认，在不影响从细胞外囊泡向目标细胞掺入的范围内的细胞外囊泡自身物性变化。

并且，通过本发明的方法制备的细胞外囊泡向细胞的掺入能力增加，相比于未暴露在体外冲击波的对照组，ζ-电位(Zeta potential)上升。

并且，本发明提供包含上述细胞外囊泡的药物载体。

若利用通过本发明的方法制备的细胞外囊泡，则可使细胞外囊泡不破损地向细胞外囊泡传递靶物质，由此，可有效地向目标细胞传递靶物质，可有效地制备药物载体。

因此，本发明的细胞外囊泡呈现向细胞的掺入能力增加的特征，因此，若利用本发明的药物载体，则可有效实现细胞内传递，可有效地向目标细胞内传递靶物质，从而可实现如疾病治疗的目的。

作为可负载于本发明的药物载体的药物，只要是作为可通过体外冲击波向外泌体内传递的物质的靶物质，即，向细胞内传递来表达所目的的效果的物质，则可无限制地使用，优选地，上述靶物质可为选自由核酸、蛋白质及化合物组成的组中的一种以上。并且，上述核酸为自然界中的核酸，还可包括人为制备的核酸，优选地，可为DNA、RNA、微小RNA(microRNA，miRNA)、小RNA(Small RNA，smRNA)、小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)、piRNA(Piwi-interacting RNA)、小核仁RNA(small nucleolar RNA，snoRNA)、来源于t-RNA-的小RNA(tRNA-derived small RNA，tsRNA)、来源于小rDNA的RNA(small rDNA-derived RNA，srRNA)、小核RNA(small nuclear RNA，U-RNA)及长非编码RNA(longnoncoding RNA，lncRNA)，但并不限定于此。

并且本发明提供向细胞内传递靶物质的方法，包括：步骤(a)，将靶物质及细胞外囊泡暴露在体外冲击波，来向细胞外囊泡内导入靶物质；以及步骤(b)，利用导入靶物质的上述细胞外囊泡处理细胞。

若利用本发明的向细胞内传递靶物质的方法，则导入靶物质的细胞外囊泡向细胞的掺入能力增加，由此，可增加将靶物质向所目的的细胞内的传递。并且，可无限制地利用从包括如上所述的动物细胞在内的植物细胞获取的细胞外囊泡，可拓宽作为药物载体的利用性。

在本发明的向细胞内传递靶物质的方法的步骤(a)中，体外冲击波可在0.05mJ/mm²至0.9mJ/mm²的能量范围内处理，具体地，可在0.05mJ/mm²至0.89mJ/mm²的能量范围内处理，更具体地，可在0.05mJ/mm²至0.70mJ/mm²的能量范围内处理。

以下，为帮助理解本发明，例举实施例来进行详细说明。但是，下述实施例仅用于例示本发明的内容，本发明的范围并不限定于下述实施例。本发明的实施例用于使本技术领域的普通技术人员更完整地理解本发明。

实施例1.外泌体的分离

来源于各种细胞(人脐静脉内皮细胞、间充质干细胞及血管平滑肌细胞)的外泌体分离

为分离来源于人脐静脉内皮细胞的外泌体，利用包含5％的胎牛血清(FBS)及1％的抗生素/抗真菌剂的M200培养基在5％的CO₂、37℃的条件培养人脐静脉内皮细胞。在此情况下，细胞以2至3日一次的频率在直径为10cm的金属板传代培养。为从细胞分离外泌体，去除培养基的细胞碎片(debris)后，利用0.2μM孔隙(pore)大小的针筒式滤器分离了外泌体。外泌体分离实验通过使用在32000rpm中进行1小时30分钟的离心分离的去除外泌体的胎牛血清来执行。以3000g的条件进行30分钟的离心分离来浓缩所分离的外泌体，并利用纳米颗粒跟踪分析(Nanoparticle tracking Analysis，NTA)设备确认后使用。

为从间充质干细胞或血管平滑肌细胞分离外泌体，仅将分离开始细胞用作间充质干细胞或血管平滑肌细胞，通过与上述人脐静脉内皮细胞的分离方法相同的方法分离了外泌体。

来源于牛乳及西柚的外泌体的分离

除细胞之外，作为可获取大量外泌体的来源于动物及植物的材料选择牛乳及西柚，并从其分离外泌体。为分离来源于牛乳的外泌体，购入并使用在市场销售中的牛乳。以20000g的条件进行2小时的离心分离来去除奶油层(cream layer)后，通过密度梯度(Density Gradient)离心分离方法(Optiprep分离液)分离了外泌体。作为分离方法，向离心管(Centrifuge tubes)下侧添加0.5ml的50％Optiprep分离液、上侧添加1ml的10％Optiprep分离液、剩余上侧添加10ml的牛乳，并以100000g的条件进行16小时的离心分离，来分离在50％、10％层之间生成的外泌体。

为分离来源于西柚的外泌体，对西柚进行榨汁来使用。以3000g的条件在30分钟内进行两次离心分离来去除细胞碎片后，通过Optiprep分离液方法分离了外泌体。在分离方法中，向离心管下侧添加1ml的50％Optiprep分离液、上侧添加1ml的10％Optiprep分离液、剩余上侧添加10ml的西柚汁，以100000g的条件进行2小时的离心分离，来分离在50％、10％层之间生成的外泌体。

牛乳和西柚均分离外泌体后利用纳米颗粒跟踪分析确认来使用。

将从来源于细胞、动物及植物材料分离的外泌体用于下述实施例。

实施例2.通过体外冲击波处理的外泌体的物性变化

2.1确认通过体外冲击波处理的外泌体ζ-电位的变化

在进行体外冲击波处理的情况下，为确认外泌体的物理特性是否变化，执行了如下的实验，即，使体外冲击波的大小不同，并测定作为基于此的粒子表面电位的ζ-电位的变化。在各个实验组包含每孔1×10¹⁰个来源于人脐静脉内皮细胞的分离的外泌体，对各个实验组，未进行体外冲击波处理或者分别以0.02mJ/mm²及0.07mJ/mm²能量等级进行处理，来利用ζ-电位测定装置ELSZ-2000设备(大冢电子有限公司(Otsuka Electronics Co.，Ltd))测定根据体外冲击波处理与否的外泌体分散溶液的ζ-电位的变化，并在图1示出其结果。

如图1所示，在以0.02mJ/mm²的体外冲击波处理的情况下，与作为体外冲击波未处理组的对照组没有差异，在以0.07mJ/mm²能量等级的体外冲击波处理的情况下，经确认，相比于对照组，外泌体分散溶液的ζ-电位值增加20％以上。ζ-电位的绝对值的增加意味着在液体中漂浮的胶体粒子的电斥力变大，在没有凝聚现象的情况下均匀地在液体漂浮。在外泌体以0.05mJ/mm²以上的体外冲击波处理的情况下，经确认，外泌体分散溶液的胶体粒子的电斥力变强，体外冲击波处理诱导外泌体的物性变化。

2.2确认根据体外冲击波处理的外泌体大小变化

在进行体外冲击波处理的情况下，为确认外泌体的物理特性是否变化，确认了与作为物性中的一种的外泌体大小有关的影响。各个实验组包含每孔3×10⁹的来源于人脐静脉内皮细胞的分离的外泌体。将未进行体外冲击波处理的组命名为对照组，此外，在各个实验组以0.02mJ/mm²、0.07mJ/mm²、0.09mJ/mm²及0.12mJ/mm²的各种能量等级的体外冲击波进行处理，利用纳米颗粒跟踪分析设备测定根据体外冲击波处理与否的外泌体大小变化，并在图2示出外泌体大小变化。

如图2所示，经确认，体外冲击波的能量等级越增加，呈进行体外冲击波处理后的100～200nm大小的外泌体数量大大增加的倾向。尤其，在以0.12mJ/mm²的能量等级进行处理的情况下，相比于对照组，100～200nm大小的外泌体数量增加10倍左右，此外，经确认，200nm以上的外泌体数也均显著增加。由此，在对外泌体进行体外冲击波处理的情况下，经确认，其外泌体的大小分布度变得不同，从而确认通过体外冲击波使外泌体的大小分布变得不同的外泌体物性的变化。

2.3确认根据体外冲击波的来源于人脐静脉内皮细胞的外泌体的掺入能力增加

以每孔3×10⁹个包含在实施例1中分离的来源于人血管内皮细胞——人脐静脉内皮细胞的外泌体，以PKH26对上述外泌体进行染色，将未进行体外冲击波处理的组命名为对照组，此外，在各个实验组以0.02mJ/mm²、0.07mJ/mm²、0.09mJ/mm²及0.12mJ/mm²的各种能量等级的体外冲击波进行处理。之后，在人血管内皮细胞——人脐静脉内皮细胞对进行体外冲击波处理的外泌体进行处理，1小时后，比较分析根据体外冲击波能量等级的向目标细胞内的外泌体掺入，并在图3示出实验结果。

如图3所示，在以0.02mJ/mm²能量等级的体外冲击波进行处理的情况下，未确认到根据体外冲击波处理的向细胞内的外泌体掺入的变化。相反，经确认，相比于未进行体外冲击波处理的对照组，以0.07mJ/mm²至0.12mJ/mm²能量等级的体外冲击波进行处理的外泌体实验组的向人脐静脉内皮细胞细胞内的外泌体掺入增加。因此，在对外泌体进行体外冲击波处理的情况下，经确认，向来源于人细胞的外泌体的目标细胞内的掺入能力定量增加，从而可确认根据体外冲击波处理的外泌体的物性变化。

实施例3.确认根据体外冲击波的向各种靶物质的外泌体内导入和由此的转化

3.1确认通过体外冲击波的向siRNA(siGlo)的外泌体导入及由此的转化

若进行体外冲击波处理，则能够以优秀的效率向外泌体导入各种靶物质，在对导入各种靶物质的上述外泌体进行体外冲击波处理的情况下，向其他细胞内的掺入也增加，为确认是否可向所要的目标细胞传递靶物质，将作为siRNA中的一个的siGlo用作靶物质来进行实验。混合以红色标记的50nM的siGlo和在实施例1中分离的来源于血管内皮细胞——人脐静脉内皮细胞的外泌体后，将未进行体外冲击波处理的组命名为对照组，此外在各个实验组以0.02mJ/mm²、0.07mJ/mm²、0.09mJ/mm²及0.12mJ/mm²等各种能量等级的体外冲击波进行处理。之后，在人血管内皮细胞——人脐静脉内皮细胞对进行体外冲击波处理的外泌体进行处理，1小时后，比较分析根据体外冲击波能量等级的向目标细胞内的外泌体掺入，并在图4示出实验结果。

如图4所示，在体外冲击波能量等级为0.02mJ/mm²的情况下，未确认到根据体外冲击波处理与否的向细胞内的外泌体掺入的变化。相反，相比于对照组，以0.07mJ/mm²以上能量等级的体外冲击波进行处理的外泌体实验组的向细胞内的外泌体掺入明显增加。因此，在以0.07mJ/mm²以上的体外冲击波进行处理的情况下，作为靶物质的siGlo向外泌体的导入增加，同时，向细胞内的外泌体本身的掺入也定量增加。因此，若利用体外冲击波，则可有效地向目标细胞内传递导入于外泌体内的靶物质。

3.2确认通过体外冲击波向外泌体导入红色荧光(RFP)蛋白及由此的转化

若进行体外冲击波处理，能够以优秀的效率向外泌体导入各种靶物质，在对导入各种靶物质的上述外泌体进行体外冲击波的情况下，向其他细胞内的掺入也增加，为确认是否可向所要的目标细胞传递靶物质，将作为蛋白质的红色荧光蛋白用作靶物质来进行实验。混合红色的2μg的红色荧光蛋白和在实施例1中分离的来源于血管内皮细胞——人脐静脉内皮细胞的外泌体后，将未进行体外冲击波处理的组命名为对照组，此外，对各个实验组以0.02mJ/mm²、0.07mJ/mm²、0.09mJ/mm²及0.12mJ/mm²各种能量等级的体外冲击波进行处理。之后，在人血管内皮细胞——人脐静脉内皮细胞对进行体外冲击波处理的外泌体进行处理，1小时后，比较分析根据体外冲击波能量等级的向目标细胞内的外泌体掺入，并在图5示出实验结果。

如图5所示，在体外冲击波能量等级为0.02mJ/mm²的情况下，未确认到根据体外冲击波处理与否的向细胞内的外泌体掺入变化。相反，相比于对照组，以0.09mJ/mm²以上能量等级的体外冲击波进行处理的外泌体实验组的向细胞内的外泌体掺入明显增加。因此，可以确认在以0.09mJ/mm²以上的体外冲击波进行处理的情况下，作为靶物质的红色荧光蛋白向外泌体的导入增加，同时，向细胞内的外泌体本身的掺入也定量增加。由此，若利用体外冲击波，则可有效地向所要的目标细胞内传递向外泌体内导入的靶物质。

3.3确认通过体外冲击波向microRNA的外泌体的导入及由此的转化

若进行体外冲击波处理，则能够以优秀的效率向外泌体导入各种靶物质，在对导入靶物质的上述外泌体进行体外冲击波处理的情况下，向其他细胞内的掺入也增加，为确认是否可向所要的目标细胞传递靶物质，将microRNA用作靶物质来进行实验。混合以绿色标记的50nM的microRNA模拟(mimic)和在实施例1中分离的来源于血管内皮细胞——人脐静脉内皮细胞的外泌体后，将未进行体外冲击波处理的组命名为对照组，此外，在各个实验组以0.02mJ/mm²、0.07mJ/mm²、0.09mJ/mm²及0.12mJ/mm²等各种能量等级的体外冲击波进行处理。之后，在人血管内皮细胞——人脐静脉内皮细胞对进行体外冲击波处理的外泌体进行处理，1小时后，比较分析根据体外冲击波能量等级的向目标细胞内的外泌体掺入，并在图6示出实验结果。

如图6所示，在体外冲击波能量等级为0.02mJ/mm²的情况下，未确认到根据体外冲击波处理与否的向细胞内的外泌体掺入的变化。相反，相比于对照组，以0.07mJ/mm²以上能量等级的体外冲击波进行处理的外泌体实验组的向细胞内的外泌体掺入明显增加，可确认，定量增加2倍以上的掺入量。因此，在以0.07mJ/mm²以上的体外冲击波进行处理的情况下，作为靶物质的microRNA向外泌体的导入增加，同时，向细胞内的外泌体本身的掺入也优秀地定量增加。因此，若利用体外冲击波，则可有效地向所要的目标细胞内传递向外泌体内导入的靶物质。

实施例4.确认根据体外冲击波向来源于各种细胞的外泌体内导入核酸及通过导入核酸的外泌体的细胞的转化效率

4.1根据体外冲击波向来源于各种细胞的外泌体内导入核酸

以3000g的条件对从人脐静脉内皮细胞、间充质干细胞及血管平滑肌细胞中分离的外泌体进行30分钟的离心分离并浓缩，并利用纳米颗粒跟踪分析确认并使用。向圆锥管添加2ml的培养基、从上述人脐静脉内皮细胞、间充质干细胞或血管平滑肌细胞获取的1×10⁸个/ml的外泌体并在2μM的秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)添加miR-39(Cel-miR-39，Qiagen)来混合。以0.07mJ/mm²的强度向上述混合物施加4分钟的1000shot的体外冲击波，来获取导入核酸的外泌体。将未施加体外冲击波而获取的外泌体命名为对照组。通过使用在32000rpm进行1小时30分钟的离心分离的胎牛血清在去除已存在于细胞培养液的外泌体的状态进行外泌体分离实验。

4.2确认借助通过体外冲击波导入核酸的外泌体的转化效率

4.2.1确认通过来源于人脐静脉内皮细胞的外泌体的向各种细胞内的核酸传递及转化效率

首先，以4×10⁵cells/well的浓度向6-孔金属板分注人脐静脉内皮细胞、永生化的小鼠大动脉内皮细胞(immortalized mouse aortic endothelial cell，iMAEC)、血管平滑肌细胞或心肌细胞细胞株(cardiomyocyte cell line)H9C2细胞。培养24小时后，向各个孔添加1×10⁸个/ml的在实施例4.1中制备的来源于人脐静脉内皮细胞的外泌体。在37℃的温度条件下培养1小时的添加外泌体的细胞，并利用磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗，在各个孔添加2ml的培养基后，再培养24小时，并获取培养的细胞。根常规方法，利用QIAzol(QIAzen)溶液从上述细胞抽取RNA，并利用260nm的紫外线吸收波长分光光度计(NanoDropTechnologies Inc.，USA)对抽取的RNA进行定量。向定量的RNA添加蒸馏水，上述蒸馏水添加有焦碳酸二乙酯(DEPC)，来使RNA浓度成为1μg/μl。混合10μl的RNA及焦碳酸二乙酯蒸馏水，并添加4μl的5X miScript HiFlex buffer(德国凯杰(QIAGEN，Germany))、2μl的10XmiScript Nucleics Mix(德国凯杰)、2μl的10X miScript Reverse Transcriptase Mix(德国凯杰)来在37℃的温度条件下进行1小时的逆转录反应。向1μl的合成的上述cDNA添加2μl的下述表1的引物、2μl的10X miScript Universal引物(德国凯杰)、10μl的2XSYBRgreen I mixture(Applied Biosystems)及5μl的蒸馏水并混合。利用ABI 7900HT(Applied Biosystems)通过常规方法对上述混合物进行实时聚合酶链式反应。之后，测定了在未存在于人细胞而在靶细胞检测到的情况下，可确认通过外泌体进行传递的Cel-miR-39的表达量，并在图7示出测定表达量的结果。在此情况下，以作为内部对照组的RNU-6为基准，对microRNA的表达量进行定量，所有实验重复三次，通过曼-惠特尼检验法检验其结果并以平均值示出。

表1

用于实施聚合酶链式反应的引物

引物	引物序列(5‘->3’)
		U6-Fw(序列1)	CTCGCTTCGGCAGCACA
Mature Cel-miR-39(序列2)	AGCTGATTTCGTCTTGGTAATA

如图7所示，确认了，相比于对照组，通过体外冲击波处理导入micro RNA的来源于人脐静脉内皮细胞的外泌体的人脐静脉内皮细胞、iMAEC、血管平滑肌细胞及H9C2细胞的Cel-miR-39的表达量明显增加。即，可以确认，相比于未施加体外冲击波的情况，施加0.07mJ/mm²以上的体外冲击波来将向作为细胞外囊泡的外泌体内导入核酸的情况的效率更优秀，向各种细胞内的导入也更好。

4.2.2确认通过来源于间充质干细胞的外泌体向各种细胞内传递核酸及转化效率

向人脐静脉内皮细胞、间充质干细胞或血管平滑肌细胞添加在实施例4.1中制备的来源于间充质干细胞的外泌体，除此之外，以与实施例4.2.1相同的条件及方法进行实验，并在图8示出实验结果。

如图8所示，确认了，相比于对照组，通过体外冲击波处理导入micro RNA的来源于间充质干细胞的外泌体的人脐静脉内皮细胞、间充质干细胞及血管平滑肌细胞的Cel-miR-39的表达量明显增加3倍左右。即，可以确认，相比于未施加体外冲击波的情况下，在对包括来源于人脐静脉内皮细胞的外泌体在内的来源于间充质干细胞的外泌体施加0.07mJ/mm²以上的体外冲击波来向来源于间充质干细胞的外泌体内导入核酸的情况的效率更优秀，向各种细胞内的转化也更好。

4.2.3确认通过来源于血管平滑肌细胞的外泌体向各种细胞内传递核酸及转化效率

向人脐静脉内皮细胞、iMAEC或血管平滑肌细胞添加在实施例4.1中制备的来源于血管平滑肌细胞的外泌体，除此之外，以与实施例4.2.1相同的条件及方法进行实验，并在图9示出实验结果。

如图9所示，确认了，相比于对照组，通过体外冲击波处理导入micro RNA的来源于血管平滑肌细胞的外泌体的人脐静脉内皮细胞、iMAEC及血管平滑肌细胞的Cel-miR-39的表达量明显增加。因此，相比于未施加体外冲击波的情况，施加0.07mJ/mm²以上的体外冲击波来向来源于血管平滑肌细胞的外泌体内导入核酸的情况的效率更优秀，向各种细胞内的转化也更好。

实施例5.确认通过体外冲击波处理的各种来源的外泌体的转化效率上升

5.1确认通过体外冲击波的来源于动物外泌体的转化效率

在对从除来源于人细胞之外的其他来源获取外泌体进行体外冲击波处理的情况下，为确认向细胞内的外泌体掺入是否增加，从可获取较多外泌体的作为动物来源材料中的一种牛乳分离外泌体来进行实验。使各个孔包含3×10⁹个在实施例1中分离的来源于牛乳的外泌体，利用PKH26对上述外泌体染色后，将未进行体外冲击波处理的组命名为对照组，将以0.07mJ/mm²能量等级的体外冲击波进行处理的组命名为实验组。之后，在人血管内皮细胞——人脐静脉内皮细胞对进行体外冲击波处理的外泌体进行处理，1小时后，比较分析根据体外冲击波能量等级的向目标细胞内的外泌体掺入，并在图10示出实验结果。

如图10所示，确认了，相比于未进行体外冲击波处理的对照组，以0.07mJ/mm²能量等级的体外冲击波进行处理的外泌体的向血管内皮细胞内的掺入增加2倍左右。因此，在对来源于动物外泌体进行体外冲击波处理的情况下，也定量增加向细胞内的外泌体掺入。

5.2确认通过体外冲击波的来源于植物的外泌体的转化效率

在对从除来源于人细胞之外的其他来源获取外泌体进行体外冲击波处理的情况下，为确认向细胞内的外泌体掺入是否增加，从可获取较多外泌体的作为植物来源材料中的一种西柚分离外泌体来进行实验。使各个孔包含3×10⁹个在实施例1中分离的来源于西柚的外泌体，利用PKH26对上述外泌体染色后，将未进行体外冲击波处理的组命名为对照组，将以0.07mJ/mm²能量等级的体外冲击波进行处理的组命名为实验组。之后，在人血管内皮细胞——人脐静脉内皮细胞对进行体外冲击波处理的外泌体进行处理，1小时后，比较分析根据体外冲击波能量等级的向目标细胞内的外泌体掺入，并在图11示出实验结果。

如图11所示，确认了，相比于未进行体外冲击波处理的对照组，以0.07mJ/mm²能量等级的体外冲击波进行处理的外泌体的向血管内皮细胞内的掺入增加2倍左右。因此，在对来源于以西柚为代表的植物的外泌体进行体外冲击波处理的情况下，也定量增加向细胞内的外泌体掺入。

综上所述，可以确认，在以0.07mJ/mm²能量等级以上的体外冲击波进行处理的情况下，其来源不同的外泌体向所要的目标细胞的靶物质的传递率均上升，本发明的方法为可不拘泥于外泌体的来源来使用的技术。

根据前述内容，将理解的是，出于举例说明的目的已经在本文中描述了本公开的各种实施例，并且在不脱离本公开的范围和精神下可以进行各种修改。因此，本文公开的各种实施例不旨在为限制性的，其中真正的范围和精神由所附权利要求表示。

序列表

<110> 艾科索伦斯生物科技

<120> 利用体外冲击波的向细胞外囊泡内靶物质传递方法

<130> PIIC6190718P

<150> KR10-2017-0069309

<151> 2017-06-02

<150> KR10-2018-0055994

<151> 2018-05-16

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> U6-Fw PCR引物

<400> 1

ctcgcttcgg cagcaca 17

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Mature Cel-miR-39 PCR引物

<400> 2

agctgatttc gtcttggtaa ta 22