阅读说明：本技术 一种超声介导细胞内空化作用进行基因转染的新型生物纳泡-细胞体系及其制备方法和应用 (Novel biological nanobubble-cell system for gene transfection through ultrasonic-mediated cellular internalization and preparation method and application thereof ) 是由 刘红梅 王宇 严飞 于 2019-10-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种超声介导细胞内空化作用进行基因转染的新型生物纳泡-细胞体系及其制备方法和应用,其由阳离子小分子聚乙烯亚胺将带负电荷的微生物合成的蛋白质外壳包被的纳米气泡颗粒与质粒DNA连接起来形成载基因微生物合成纳泡复合体,然后将上述载基因微生物合成纳泡复合体与细胞共孵育后粘附在细胞表面,被细胞主动吞噬入胞,制成生物纳泡-细胞基因转染体系。以超声辐照该细胞体系,激发细胞内空化效应的方式来启动转染,让声孔效应直接在细胞内发生,在细胞核膜表面形成小孔,把纳米气泡携带的外源性基因直接递送至细胞核中,减少被溶酶体等的灭活,从而提高基因递送效率及表达量。(The invention discloses a novel biological nanobubble-cell system for gene transfection by ultrasonic-mediated intracellular internalization and a preparation method and application thereof. The cell system is irradiated by ultrasonic waves, transfection is started in a mode of exciting intracellular cavitation effect, the sonoporation effect is directly generated in cells, small holes are formed on the surface of a cell nucleus membrane, exogenous genes carried by nano bubbles are directly delivered to cell nucleus, inactivation of lysosomes and the like is reduced, and therefore gene delivery efficiency and expression quantity are improved.)

一种超声介导细胞内空化作用进行基因转染的新型生物纳 泡-细胞体系及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及细胞基因转染领域，具体涉及一种低频超声介导细胞内空化效应进行基因转染的新型生物纳泡-细胞体系及其制备方法和应用。

背景技术

细胞基因转染技术是采用一定的方法和途径将外源分子如DNA、RNA等导入特定的细胞，使目的基因在细胞中有效、适度地表达特定功能的蛋白质分子。细胞转染的主要目的是通过增强或抑制细胞中特定基因的表达来研究基因、基因产物及重组蛋白的功能，甚至以此来达到相应的治疗目的。基因治疗是一种新的治疗手段，可以治疗多种疾病，包括癌症、遗传性疾病、感染性疾病和自身免疫性疾病等，更重要的是，基因治疗可以从疾病产生或病情改善的本源入手，疗效显著且确切。随着临床上基因治疗、功能研究的兴起，基因转染技术的应用越来越广泛，此方面的研究有着广阔的发展前景。

为了更高效地让外源基因在真核细胞中表达，人们一直在研究向细胞内递送质粒DNA的有效途径。理想的细胞转染方法应该具有较高的转染效率，低细胞毒性，对细胞的正常生理特性影响较小，且便于实施及具有较好的可重复性。常用方法有：生物学方法(即以病毒为载体的转染法)、化学方法(磷酸钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法、阳离子聚合物法)、物理方法(显微注射法、基因枪法、电穿孔法、激光照射法、声孔效应法、磁性纳米颗粒等)。以病毒载体的生物学方法、阳离子脂质体转染和电穿孔等物理方法虽然都有较高的转染效率，但病毒载体安全性较差，脂质体表达率较低、持续时间较短、稳定性欠佳且细胞毒性较高，物理方法对细胞损伤较大等弊端，都不能作为最理想的转染方法。

近年研究发现，超声靶向微泡破坏效应(Ultrasound Targeted MicrobubbleDestruction，UTMD)介导的细胞转染法，即声孔效应(Sonaporation)介导的细胞转染法，为基因治疗的临床应用提供了新的技术可能。其原理是利用含气的超声微泡，在一定能量的声场中，微泡随着声波频率发生压缩和扩张，并伴随着气泡内压力和体积的反复变化，产生空化效应。空化效应的作用机制是在声场与微泡造影剂相互作用下，微泡因急剧压缩、闭合破裂而形成微流、冲击波及射流等激烈过程，使周围组织的细胞膜上出现可逆性或不可逆性小孔，提高了细胞膜通透性，外加微泡破裂产生的冲击力，将外源性基因从微孔道推入细胞中，达到基因递送的目的。这种方法具有细胞毒性低、免疫排斥反应小、可修饰性强等优势，在各种疾病的基因治疗中极有应用前景。Bez等在迷你猪胫骨骨折模型中，在骨折处埋入胶原支架后，用促BMP-6转染，成功的使骨折愈合完全。尽管如此，目前在批准进入临床试验的基因治疗中，病毒型载体促基因转染占75％，其促基因转染效率常在90％以上，而UTMD促基因转染效率不高、不稳定，大部分研究仍处于临床前阶段。因此，探讨如何改善UTMD促基因转染效率仍然是目前研究的重点，而其切入点在于如何使更多的基因被递送至细胞核内，才能使外源基因被更大量转染、表达。而直接使超声介导的空化效应在细胞内产生，增加细胞核膜通透性，促使质粒DNA入核是一种新颖而有效的解决方案。

幸运的是，大量的研究证明：许多真核细胞在体外具有吞噬大量纳米级颗粒的能力。Zhe-Zhen Yu等制作了两种低浓度的氨基酸外壳包被的磁性纳米颗粒，体外成功观察到其被骨髓间充质干细胞(BMSCs)成功吞噬入胞。此前研究较多的纳米级超声颗粒主要包括声学脂质体、氟碳纳米液滴、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)等。但上述化学合成纳米气泡都存在着粒径不均一、胞内稳定性差、细胞毒性大等问题，并不适用于细胞吞泡后的基因递送。

研究发现，一类从古细菌嗜盐杆菌、水华鱼腥藻和微囊藻等细胞内裂解提取出的蛋白质外壳包被的纳米气囊结构——Gas Vesicles(GVs，伪空胞)有粒径均一及超声成像效果佳的优势。并且，我们研究发现这种微生物合成的新型纳米气泡能够与BMSCs或4T1等肿瘤细胞共孵育后，被细胞大量吞噬入胞且能在细胞内长时间稳定存在的现象，说明其有着细胞相容性好、毒性小的优势，是用于制备这种细胞内空化转染基因复合体的优选纳米气泡颗粒。

因此，本研究利用细胞吞噬纳米气泡的特性，使用阳离子小分子聚乙烯亚胺将带负电荷的纳米级气泡颗粒与质粒DNA连接起来，形成纳米气泡颗粒-DNA阳离子复合体，该阳离子复合体与细胞共孵育后粘附在细胞表面，被细胞主动吞噬入胞，制成生物纳泡-细胞基因转染体系，其后使用超声辐照促使纳米气泡***，引发纳米气泡在细胞内空化作用，提高细胞核膜通透性，这种效应能够使携带的外源基因直接进入细胞核，提高基因向核内递送的效率，从而提高基因转染效率。另一方面，基于纳米气泡在超声下的成像特点，还可实现基因转染体系的体内示踪导航，以选择合适的转染激发时间点和部位，在提高传统UTMD法转染效率的同时，达到在体基因定时定点转染的目的。

发明内容

针对现有利用传统超声靶向微泡破坏技术进行外源基因递送的不足，本发明的目的在于提供一种新型超声介导下生物纳泡-细胞基因转染体系的制备方法及一种利用超声激发的细胞内空化效应实现高效基因递送的方法，其能大大提高外源基因的递送及转染效率，同时又有着生物安全性高、细胞毒性小的优点，并且可以实现超声可视化在体基因转染。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：

一种超声介导细胞内空化作用进行基因转染的载基因微生物合成纳泡复合体，其包括微生物合成的蛋白质外壳包被的纳米气泡颗粒和质粒DNA。

进一步地，微生物合成纳米气泡结构由一定强度的蛋白质外壳包裹空气形成，宽45-250nm，长100-600nm，呈纺锤形或长杆状。

进一步地，载基因微生物合成纳泡复合体由阳离子小分子聚乙烯亚胺将带负电荷的微生物合成的蛋白质外壳包被的纳米气泡颗粒与质粒DNA连接起来形成；优选地，聚乙烯亚胺的分子量为25k。

进一步地，微生物合成纳米气泡的制备方法为：

1)产纳泡微生物的培养：取冻存的适量微生物原液加入已高温高压消毒的微生物培养基中，无菌培养摇床37-42度、130-150rpm条件下，培养至培养液变为粉白色；

2)产纳泡优势微生物的筛选：将1)中培养的微生物倒入分液漏斗中，室温下静置直到瓶中液体上层可见一层环状浮游微生物层，从分液漏斗中分离出上层优势浮游生物层及下层培养液；

3)微生物合成纳米气泡的提取纯化：向筛选出的上层优势浮游生物中加入其等体积-2倍体积的TMC裂解液充分混匀(具体加入量随分离的上层优势浮游菌量而决定)，混匀后，于4-8度300g离心3-4h，离心后可见管中溶液分为三层(上层漂浮微生物及乳白色GVs、中层澄清培养基、下层裂解的细胞废物及培养基杂质，下层物质紧密黏附在管底)，小心去除中下层物质；在剩余的上层漂浮物中加入其等体积-2倍体积的PBS缓冲液(具体加入量随需要的纳泡浓度而定)，继续用上述离心条件离心，重复去除下层溶液、补入PBS缓冲液、离心的步骤，并且每次离心逐渐降低离心转速及时间，直至上层漂浮微生物完全裂解为乳白色GVs，离心管下层溶液完全呈澄清无色透明为止；所述TMC裂解液为10mmol/L Tris-HCl，2.5mmol/L MgCl₂和2mmol/L CaCl₂，pH 7.0-7.8，这三个试剂都是粉状的，配成裂解液的时候，在裂解液中的终浓度是这个就可以的，Tris-HCL在配置时其实加的就是tris粉末，最后用HCL调ph的时候结合变成TRIS-HCL。

其中最后一次离心提取纯化前将补充的PBS缓冲液换为含体积百分数10-20％商用青霉素/链霉素双抗溶液的PBS缓冲液以抗菌保存；

优选地，使用封口膜(paraflim)代替离心管盖对GVs进行密封。

进一步地，微生物为细胞内含有纳米气泡结构的浮游微生物，优选为古细菌嗜盐杆菌、水华鱼腥藻或微囊藻。

一种超声介导细胞内空化作用进行基因转染的载基因微生物合成纳泡复合体的制备方法，包括以下步骤：

1)将上述制备好的已抗菌微生物合成纳米气泡下层的澄清溶液去除，直至纳泡浓度OD500＝1.0-2.0；

2)将1-10mg/ml的PEI水溶液(PH＝7，优选浓度为1mg/ml，水溶液浓度过高容易导致Halo GVs团聚)与1)中得到的抗菌微生物合成纳米气泡按照体积比1:1-2:1混匀，置于37度环境下静置孵育30-40min后，于室温150g-200g低速离心30-45min(在保证所有阳离子GVs被分离至液面上层的情况下，离心强度和时间可尽量减小、缩短)直至将溶液彻底分为上层被阳离子化的纳米气泡及下层含游离PEI的澄清溶液，去除下层含游离PEI的澄清溶液；

3)向阳离子化的纳米气泡中加入适量质粒DNA并混匀，质粒与2)中加入的PEI小分子的质量比为1:2-3，置于37度环境下静置孵育15-30min，即制成载基因微生物合成纳泡复合体；

优选地，所述聚乙烯亚胺的分子量为25k。

上述所述的载基因微生物合成纳泡复合体在制备超声介导细胞内空化作用进行基因转染的生物纳泡-细胞体系中的应用。

一种超声介导细胞内空化作用进行基因转染的新型生物纳泡-细胞体系，其包括上述所述的载基因微生物合成纳泡复合体。

进一步地，将上述所述的载基因微生物合成纳泡复合体与细胞共孵育后粘附在细胞表面，被细胞主动吞噬入胞，制成生物纳泡-细胞基因转染体系。

一种超声介导细胞内空化作用进行基因转染的新型生物纳泡-细胞体系的制备方法，将上述所述的载基因微生物合成纳泡复合体加入过夜培养的细胞中，加入量由转染所需的细胞种类及数量决定，并补充含体积百分数1％商用青霉素\链霉素双抗的无血清细胞培养基，培养基量在维持细胞基本营养的前提下应该尽量少加，以确保细胞与上层漂浮载基因微生物合成纳泡复合体充分接触，置于37度、体积分数5％CO₂的细胞培养箱中共孵育6-8h，之后充分洗涤并更换为普通完全培养基，即制成超声介导下的生物纳泡-细胞基因转染体系。

上述所述的超声介导细胞内空化作用进行基因转染的新型生物纳泡-细胞体系在基因转染中实现高效基因递送的应用。

一种利用超声激发的细胞内空化效应实现高效基因递送的方法，利用适当强度的平面超声对上述所述的生物纳泡-细胞基因转染体系进行超声辐照，以激发被细胞主动吞噬入细胞内的载基因微生物合成纳泡复合体产生空化作用，其引发的微流、冲击波及射流效应，使细胞核膜上出现小孔，增加细胞核膜通透性，直接提高质粒DNA向细胞核内的递送效率。

进一步地，具体操作方法如下：室温下使用1W/cm²强度的平面超声辐照制成的超声引导下基因转染细胞体系2-3min，即转染完成。

本发明中用于制备载基因纳米气泡复合体的纳米气泡材料为新型的微生物合成纳米气泡材料。其来源于一些浮游微生物，如古细菌嗜盐杆菌、水华鱼腥藻和微囊藻等，它们的细胞结构内存在一种纳米级的蛋白质外壳包被的气囊结构——Gas Vesicles(GVs，伪空胞)，通过动态调节伪空胞的气囊数，微生物能够控制其浮力，加快上浮速度，使其能够得到更充足的光照和养分。微生物体内的纳米气泡可以通过简单安全的低渗冲击法裂解细胞获得。这种纳米气泡由一定强度的壳蛋白外壳包裹空气形成，宽45-250nm，长100-600nm，呈纺锤形或长杆状，有着良好的超声成像性能。超声波遇见壳蛋白包裹气体形成的气囊时就会发生散射，出现云雾状的回声。并且，由于其粒径均一微小、气泡内外气压平衡稳定性高且为生物来源，因而容易被细胞吞噬，且能在细胞中长时间稳定存在，用于细胞吞泡体系的构建中发挥着独特的优势。

同时，由于这种纳米气泡主要是细菌及某些藻类来源，普通传统低渗裂解方法提取后仍然可能有细菌残留，对后续转染的细胞造成污染。我们在传统方法中使用的PBSbuffer中加入较高浓度的商用青霉素\链霉素双抗溶液(10-20％)，起到一定的抗菌杀菌作用，但这种作用可能会随着保存时间的延长而减弱，因此建议微生物合成纳米气泡提取后应在3个月内使用完毕。

本发明中使用阳离子小分子聚乙烯亚胺(PEI)将微生物合成纳米气泡及质粒DNA连接起来，这是因为微生物合成纳米气泡及质粒DNA都带负电荷，两者并不能直接相连，需要阳离子两者连接起来，因此我们选择分子量25k的阳离子小分子PEI。更小分子量的PEI(如2k)也能将微生物合成纳米气泡阳离子化，但是容易造成纳泡团聚，团聚后的纳泡粒径可达微米级，不利于细胞的吞噬。另一方面，PEI也有着一定的基因转染作用，所以我们需要在PEI与纳泡混匀孵育后，采用离心并尽量去除下层澄清溶液的方式，来去除游离的PEI。通过这种方式制备的载基因微生物合成纳泡复合体带正电荷，能更多地与细胞相连，被大量吞噬。

在传统的UTMD法进行基因递送中，一般将超声微泡与质粒DNA混合后添加到细胞孔内后，直接置于超声辐照场中，进行超声辐照。采用这种方法，微泡经超声刺激后震荡甚至***，细胞膜表面形成了瞬时性孔道，外加微泡破裂产生的冲击力，将外源性基因从微孔道推入细胞中。研究发现溶酶体等细胞器对进入细胞的外来物质有一定的消灭作用，因此用这种方式向细胞内递送的基因不一定能够进入细胞核内，而基因转染并成功表达的关键恰恰在此。

而本发明中采用超声辐照激发细胞内空化效应的方式来启动转染，使上述所说的声孔效应直接在细胞内发生，在细胞核膜表面形成小孔，把纳米气泡携带的外源性基因直接递送至细胞核中，减少被溶酶体等的灭活，从而提高基因递送效率及表达量。同时，微生物合成纳泡被细胞吞噬后，让细胞在超声下成像效果更佳，在超声观察下实时启动超声辐照，对在体激发基因转染的时间和部位进行把控，让基因的在体实时递送变为可能。

本发明构建了超声介导的基因转染细胞体系，并通过超声辐照引发细胞内空化效应的技术手段将外源基因递送至细胞，可以很好的改善传统UTMD方法对部分真核细胞(如：骨髓间充质干细胞等)基因递送困难的问题。

概括而言，本发明的优点在于：

(1)选用微生物合成的纳米气泡作为制备超声引导下基因转染细胞体系的材料，该新型纳泡粒径微小且均一、生物安全性高、能被细胞大量吞噬并在其内长时间稳定存在。

(2)选用25k的阳离子PEI将带负电的质粒DNA及纳泡相连，产生的载基因微生物合成纳泡复合物亦带正电荷，不会团聚，并且与表面电位为负的细胞共孵育后，能够大量粘附在细胞上，促进细胞吞噬，构建出吞噬大量载基因纳泡复合体的基因转染细胞体系。

(3)对传统的UTMD转染法进行了适当改进，使细胞空化效应在细胞内发生，直接提高细胞核膜的通透性，提高基因递送效率，减少基因在细胞内被溶酶体灭活的可能性。

(4)所用的微生物合成纳米气泡有良好的超声成效性能，被细胞吞噬后能够增强细胞的超声成像能力，使细胞的可视化在体示踪成为可能；进一步可以实现基因的在体定时定点基因转染，超声实时成像指导基因转染，使今后的临床基因治疗更加准确、安全。

附图说明

图1为本发明所述体内含生物纳泡微生物Halo细菌培养及Halo GVs提取纯化示意图，其中(a)为培养完成的产纳泡细菌Halo；(b)为静置中的产纳泡细菌Halo，上层可见环状漂浮细菌层；(c)为提取纯化的Halo GVs(摇匀前)；(d)为提取纯化的Halo GVs(摇匀后)。

图2为本发明所述微生物合成纳泡Halo GVs的透射电镜图。

图3为本发明所述微生物合成纳米超声造影剂Halo GVs使用PEI阳离子化前后的粒径分布及电位对比图，其中(a-c)分别为普通Halo GVs、阳离子化的Halo GVs、载基因Halo纳泡复合体的粒径分析图；(d)为普通Halo GVs、阳离子化的Halo GVs、载基因Halo纳泡复合体的zeta电位对比图。

图4为超声介导的细胞内空化效应进行基因转染后基因表达的情况，其中(a)为未经超声辐照激发细胞内空化效应转染的生物纳泡-干细胞体系的绿色荧光蛋白基因表达情况；(b)为超声辐照激发细胞内空化效应转染的生物纳泡-干细胞体系的绿色荧光蛋白基因表达情况。

图5为Halo生物纳泡被干细胞吞噬后在胞浆中的稳定性。

图6为超声介导的细胞内空化效应进行基因转染对靶细胞活性的影响。

图7为吞噬生物纳泡Halo后，BMSCs在超声下的成像效果。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施方法对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限以下实施例。

下面通过使用嗜盐杆菌(Halo bacteria)作为GVs提取原材料微生物，以现研究认为较难实现超声微泡破坏技术转染的骨髓间充质干细胞(BMSCs)作为靶细胞进行实验，进一步说明本发明的具体实施方式及优势。

说明书和权利要求书中所使用的缩写及英文的含义列于下表中：

缩写及英文	含义
		PEI	聚乙烯亚胺
Halo	嗜盐杆菌
		GVs	纳米气泡
BMSCs	骨髓间充质干细胞
		UTMD	超声微泡靶向破坏技术

实施例1

该实施例是说明Halo微生物的培养及Halo微生物合成纳米气泡的提取纯化方法。如图1所示：将冻存的1ml Halo细菌接种至200ml高盐细菌培养基内，使用500ml锥形瓶培养，以让瓶中细菌在培养时充分呼吸空气。在细菌培养箱中使用42度、150rpm进行培养，直至菌液变为粉白色。将培养好的细菌倒入灭菌后的分液漏斗中，静置约3-4天，待液面上层漂浮一层粉白色环状层，打开分液漏斗下面阀门，放出下层培养液，分离出上层漂浮细菌至离心管中，加入等体积TMC裂解液((10mmol/L Tris-HCl，2.5mmmol/L MgCl₂和2mmmol/LCaCl₂，pH 7.5))，充分混匀后，于4度300g离心4h。离心后可见管中物质分为三层(上层漂浮菌液、中层澄清培养基、下层裂解的细胞废物及培养基杂质，下层物质紧密黏附在管底)。去除中下层溶液及废物，分离出上层漂浮细菌，加入等倍体积的PBS缓冲液并分装至2ml ep管中继续用上述离心条件离心，此次离心后可见ep管上层白色环状层，为裂解出来的纳米气泡。重复去除下层溶液、补入PBS缓冲液、离心的步骤，直至离心管下层溶液完全呈澄清无色透明为止。每次离心可逐渐降低离心转速，缩短离心时间，使用封口膜代替盖子密封，以避免离心能量过大及气压冲击破坏纳米气泡。最后一次离心时将补充的PBS换为含10％商用青霉素/链霉素双抗的PBS对纳米气泡进行抗菌操作，即制成抗菌halo微生物合成纳米气泡GVs。微生物合成纳泡Halo GVs的透射电镜图如图2所示，Halo GVs呈纺锤型，蛋白质外壳形态规整，表面可见少许皱褶，视野内所见纳泡形态大小均一。

实施例2

该实施例是说明使用halo微生物合成纳泡制备载基因微生物合成纳泡复合体的方法及表征。使用注射器将实施例1中制备好的已抗菌微生物合成纳米气泡下层的澄清溶液去除，直至最后ep管中终体积100ul，酶标仪对浓度进行定量为OD500＝2.0；1mg/ml的25kPEI溶液(PH＝7)与抗菌halo微生物合成纳米气泡按照体积比1:1混匀，置于37度环境下静置孵育40min后，室温条件200g低速离心45min可见溶液完全分离为上层被阳离子化的纳米气泡及下层含游离PEI的澄清溶液，使用注射器尽量去除下层含游离PEI的澄清溶液；向阳离子化的纳米气泡中加入适量含eGFP的空质粒DNA并混匀，质粒与加入PEI质量比为1:2，置于37度环境下静置孵育30min，即制成载基因halo微生物合成纳泡复合体。将实施例1中制备的halo微生物合成纳泡、实施例2中制备的阳离子化的Halo GVs、载基因Halo微生物合成纳泡复合体进行粒径、表面电位的表征，其结果如图3所示，单纯halo GVs粒径约268.3nm，电位为-29mV；被PEI阳离子化后，粒径曲线表明多数纳米气泡粒径仍处于200-300nm区间，平均粒径约238.4nm，电位为19mV；加入质粒DNA后形成载基因纳泡复合体，其平均粒径为396.3nm多数复合体粒径范围仍处于300-500nm之间，电位为25mV，说明PEI能够成功将微生物合成纳泡阳离子化，使基因与纳泡相连，并且产生的载基因复合体亦粒径微小带正电荷，能更好的粘附在靶细胞表面，被其大量吞噬。

实施例3

该实施例是说明超声介导下的生物纳泡-细胞基因转染体系的制备方法。将大鼠BMSCs以2*10^{^4}个/孔种植于24孔板中，过夜培养，待细胞贴壁后，将实施例2中制备的载基因halo微生物合成纳泡复合体加入过夜培养的细胞中，加入量为每孔加入含10ug基因的纳泡复合体，并补充300ul含1％商用青霉素\链霉素双抗溶液的无血清细胞培养基，以确保细胞与上层漂浮载基因微生物合成纳泡复合体充分接触，置于37度、体积分数5％CO2的细胞培养箱中共孵育8h，之后充分洗涤并更换为普通完全培养基，即制成超声介导下的基因转染细胞体系。

实施例4

该实施例是说明使用平面超声激发细胞体系进行基因转染的方法及基因转染效果的检测。室温下使用1W/cm²强度的平面超声辐照实施例3中制成的超声引导下基因转染细胞体系3min。转染后，放入细胞培养箱中继续培养，转染后24、48、72小时分别使用倒置荧光显微镜对转染细胞的eGFP绿色荧光蛋白表达情况进行检测，对照组为未被超声辐照的Halo生物纳泡-干细胞基因转染体系，如图4所示。结果表明：超声辐照激发转染后48h，超声辐照组和对照组干细胞绿色荧光蛋白eGFP有表达，超声辐照组明显较多。

实施例5

该实施例说明检测阳离子化的生物纳泡被BMSCs吞噬后，在细胞内的稳定性的方法。将大鼠BMSCs以2*10^{^4}个/孔种植于24孔板中，过夜培养，待细胞贴壁。向被PEI阳离子化后的halo生物纳泡中加入diI脂蛋白荧光染色染料，体积比为1:100，混匀后避光室温染色10min，染色完成后使用4度、200g条件离心40min。离心后，ep管中溶液分为上层漂浮染色阳离子halo纳泡，下层为未与纳泡结合的diI。使用注射器去除下层溶液，将适量染色halo纳泡加入BMSCs中，每孔补充300ul含1％青霉素/链霉素双抗的无血清干细胞培养基，并放入细胞培养箱中共孵育8h。8h后，去除培养基，用PBS冲洗3次后，更换为普通干细胞培养基。分别在共孵育后0-5天每天使用倒置荧光显微镜对干细胞中的halo纳泡稳定性进行观察，如图5所示。结果表明，DiI染色的Halo生物纳泡被BMSCs吞噬后，24h-120h在细胞中的显影：0-5天干细胞内都可见红色点状荧光显影，为被diI染色的Halo纳泡，其后因为干细胞长满状态不佳，难以继续观察，说明Halo生物纳泡在干细胞中至少可以较稳定存在5天。

实施例6

该实施例说明检测超声激发载基因纳米气泡细胞体系转染后干细胞的细胞活性的方法。在96孔板中种植SD大鼠骨髓间充质干细胞(每孔5000个细胞，3个复孔)，铺板过夜。向每孔加入含2.5μg eGFP质粒DNA的载基因halo微生物合成纳泡复合体，并补充100ul无血清干细胞培养基，细胞培养箱中共孵育8h后，弃去培养基，PBS冲洗3次后，1W/cm²的超声辐照细胞3min以启动细胞内空化效应进行基因转染。对照组为普通BMSCs及使用PEI进行基因转染的MSCs。转染后过夜培养，去除细胞培养基，使用CCK-8法检测采用超声介导的细胞内空化效应进行基因转染对靶细胞活性的影响，如图6所示。结果表明：与完全对照普通BMSCs相比，超声辐照启动细胞内空化效应进行基因转染对靶细胞活性有一定的影响，但是与单纯pei阳离子基因转染相比，对靶细胞的杀伤力明显更低。

实施例7

该实施例说明检测吞噬halo微生物合成纳米气泡后的BMSCs超声成像能力的方法。将第3代处于对数生长期的骨髓间充质干细胞接种到T75细胞培养瓶中，在37度、5％CO₂细胞培养箱中培养至细胞密度70-80％后，更换为2mL含有20％阳离子Halo微生物合成纳米气泡的完全培养基继续培养，让纳泡与骨髓间充质干细胞共孵育8h。空白对照组为普通骨髓间充质干细胞。8h后，去除培养基后用PBS冲洗3次，用胰酶消化细胞，调整细胞浓度至4*10^{^6}/200ul，分别将细胞悬液加入琼脂仿体孔中，使用体外超声成像装置在B-mode及contrast mode进行超声造影成像，如图7所示。实验结果表明：与普通干细胞相比，吞噬halo纳泡的干细胞在B-mode及contrast mode都有着更优良的超声成像能力。

以上所述仅为本发明的具体实施方式，不是全部的实施方式，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。