一种借助花粉管通道在玉米中实现基因编辑的方法
阅读说明：本技术 一种借助花粉管通道在玉米中实现基因编辑的方法 (Method for realizing gene editing in corn by means of pollen tube channel ) 是由 郭嘉 李楠 朱旭 贺红霞 李毅丹 于 2021-07-20 设计创作，主要内容包括：本发明属于玉米转基因技术领域,具体为一种借助花粉管通道在玉米中实现基因编辑的方法,包括步骤一：玉米果穗选取,选取自授粉后的24-28h,抽丝期一致的玉米果穗；步骤二：基因编辑质粒的制备；步骤三：花粉介导转化：借助花粉管通道将基因编辑载体导入,用待转化的质粒溶液处理花粉粒,使花粉粒携带含有Cas9基因和sgRNA的质粒,然后授粉；步骤四：后代材料的抗性筛选；步骤五：后代遗传性特征研究和PCR检测结果,本发明利用花粉管进入胚囊时所形成的通道,将外源DNA导入受体,实现基因编辑,具有无基因型限制和易于实现大规模转化的特点,可以对玉米实现基因编辑,而且不需要昂贵的仪器设备和繁复的组织培养,并省去了组织培养过程。(The invention belongs to the technical field of corn transgenosis, and particularly relates to a method for realizing gene editing in corn by means of a pollen tube channel, which comprises the following steps: selecting corn ears, namely selecting the corn ears which are 24-28 hours after self-pollination and have consistent silking period; step two: preparing a gene editing plasmid; step three: pollen-mediated transformation: introducing the gene editing vector by virtue of a pollen tube channel, treating pollen grains by using a plasmid solution to be transformed to enable the pollen grains to carry plasmids containing the Cas9 gene and the sgRNA, and then pollinating; step four: resistance screening of progeny material; step five: the invention relates to a progeny hereditary feature research and PCR detection result, which utilizes a channel formed when a pollen tube enters a blastocyst to introduce exogenous DNA into a receptor to realize gene editing, has the characteristics of no genotype limitation and easy realization of large-scale transformation, can realize the gene editing of corn, does not need expensive instruments and complicated tissue culture, and saves the tissue culture process.)
技术领域
本发明涉及玉米转基因技术领域，具体为一种借助花粉管通道在玉米中实现基因编辑的方法。
背景技术
玉米是当今世界总产量最高的农作物之一,是重要的粮食和饲料来源,同时还是工业原料。由于世界人口的持续增加和耕地面积的不断减少及环境变化,玉米的需求将继续增加,如何提高单位面积的玉米产量仍是一个重要而且被广泛关注的课题。玉米产量是单位面积果穗数、穗粒数和粒重协调发展的结果,而这些性状也是受到诸如:遗传因素、激素水平和环境因子等多方面控制。
在玉米遗传转化方面，直到80年代后期才取得突破。第一例成功的玉米自交系A188培养出再生植株报道于1975年。一直到1988年，Klein等人用基因枪法把cat基因转移到玉米的胚状体和非胚状体细胞中，并发现有短暂表达。与此同时，基因表达和标记系统也得到发展。到1996年，农杆菌共培养法才成功用于转化瞬息万变交系A188。1986年Fromm研究小组获得了第一个转基因玉米愈伤组织。应用基因枪法可用Ⅰ型和Ⅱ型愈伤组织及未成熟胚来做DNA转移。以组织培养如愈伤组织培养为基础的玉米转化方法存在一些缺点。1993年报道了成功地把DNA转移到早期合子胚的分生组织中，其转化频率4％-45％(随基因型不同而有差异)，1995年获得了转基因玉米茎。随后在这方面做了大量工作。转基因玉米大概分为三个阶段；1988年以前属于研究方法的探索阶段，直到第一个转基因玉米的成功获得，1988-1994年玉米遗传转化进入第二个阶段，转化方法的不断探索发展，1995年之后，玉米愈伤组织进一步系统化，使转基因玉米发展迅速。现在，玉米转基因方法不断增加和完善。大致有基因枪法、农杆菌介导法、花粉管通道法、子房注射法、电击法、PEG方法等等。在转基因技术上的不断完善，人们已经育出了一批抗虫、抗病、抗逆性环境及产量高的优良玉米品种，并成为商品化。
目前，基因枪法、农杆菌介导法和是外源基因导入玉米的主要途径。基因枪法的最大优点是不受宿主植物的限制，并且可以同时导入多个基因，但缺点是仪器设备昂贵和容易引起外源基因的多拷贝。农杆菌介导法则成本低廉，并可以避免许多栽培品种的原生质体难以再生的问题，且通常为低考贝或单拷贝整合，大多符合孟德尔遗传规律，但玉米对农杆菌不敏感，转化率不高，因此上述的基因导入方式在玉米遗传转化方面存在一定的局限性。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施方式的一些方面以及简要介绍一些较佳实施方式。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
因此，本发明的目的在于提供一种借助花粉管通道在玉米中实现基因编辑的方法，旨在解决传统基因枪法的基因导入方式在玉米遗传转化方面存在一定的局限性的问题。
为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：
一种借助花粉管通道在玉米中实现基因编辑的方法，其包括如下步骤：
步骤一：玉米果穗选取，选取自授粉后的24-28h，抽丝期一致的玉米果穗；
步骤二：基因编辑质粒的制备；
步骤三：花粉介导转化：借助花粉管通道将基因编辑载体导入，用待转化的质粒溶液处理花粉粒，使花粉粒携带含有Cas9基因和sgRNA的质粒，然后授粉；
步骤四：后代材料的抗性筛选；
步骤五：后代遗传性特征研究和PCR检测结果，获取目标基因完成靶向编辑的后代。
作为本发明所述的一种借助花粉管通道在玉米中实现基因编辑的方法的一种优选方案，其中：所述步骤三中的花粉介导转化过程为：将2g花粉加入2ml 含有20μg质粒DNA、10％蔗糖和0.9％NaCl的溶液中，然后用超声波细胞粉碎机处理混合液，选择超声功率为280-400W，使花粉和质粒DNA充分混匀。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：通过该一种借助花粉管通道在玉米中实现基因编辑的方法的设置，结构设计合理，通过花粉管通道法：利用花粉管进入胚囊时所形成的通道，将外源DNA导入受体，具有无基因型限制和易于实现大规模基因转化的特点，而且不需要昂贵的仪器设备和繁复的组织培养，省去了组织培养过程，从而避免了玉米组织培养过程中可能会出现的对植物基因型的依赖和各种无法预测的体细胞变异对后代的不利影响，一般不会形成嵌合体。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将结合附图和详细实施方式对本发明进行详细说明，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明步骤流程结构示意图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施方式的限制。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步地详细描述。
实施例1
本发明提供以下技术方案：一种借助花粉管通道在玉米中实现基因编辑的方法，包括以下步骤：
S1、玉米果穗选取，选取自授粉后的24-28h，抽丝期一致的玉米果穗；
S2、基因编辑质粒的制备；
S3、花粉介导转化：借助花粉管通道将基因编辑载体导入，用待转化的质粒溶液处理花粉粒，使花粉粒携带含有Cas9基因和sgRNA的质粒，然后授粉；
S4、后代材料的抗性筛选；
S5、后代遗传性特征研究和PCR检测结果，获取目标基因完成靶向编辑的后代。
S1步骤中实验玉米材料为自交系B73，属于较难实现遗传转化的基因型。目前该自交系已完成基因组测序，如果编辑成功，非常容易进行相应的分子检测。
S2步骤中用于转化的pBUE411-ZmU6-sgRNA质粒由实验室保存,其中包括编辑Waxy1基因的sgRNA、Cas9基因(Cas9)和PPT乙酰转移酶基因(bar)，具体的waxy1基因编辑靶点为CGTCCTTCGATTTCATCGAC。该质粒保存在大肠杆菌DH5 α中。
首先调配溶液I、溶液II和溶液III三种溶液，溶液I为：52mmol/L葡萄糖、27mmol/LTris-Cl(pH8.0)和10mmol/LEDTA(Ph8.0)；溶液II为：0.6mol/LNaOH 和2％SDS；溶液III为：5mol/L乙酸钾60.0ml、冰乙酸11.5ml和H2O30ml。溶液I在配置好后，应首先高压灭菌，然后于4℃-4.5℃冰箱保存，液体II在使用时现用现配，室温下使用，液体III配置后也需要利用高压灭菌，于4℃ -4.5℃冰箱保存，用时置于冰上。
具体的，挑取单菌落于加有一定浓度的抗生素的LB液体培养基中， 200r/min，37℃震荡培养过夜，将菌液转移到1.5ml的离心管中，10000r离心 1-1.5min，弃上清，将管子倒置于滤纸上，使残液流尽，加入200μ液体I，于涡旋振荡器上震荡，使菌液充分重悬，加入新配制好的400μ液体II，盖紧管子快速颠倒混匀，不可剧烈震荡，静置5-6min，加入预冷的300μ液体III，颠倒离心管数次，冰浴5-6min，12000r离心5-10min，上清转入干净的离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)，混匀，静置5-10min，12000r离心10min，上清移入干净离心管，加入2/3体积的异丙醇或2倍体积的无水乙醇，混匀，静置沉淀20-25min，12000离心10-12min，弃上清，倒置离心管使残液流尽，用75％的乙醇洗涤两次，弃上清，倒置离心管使残液流尽，将离心管离心几分钟将残液离到管底，用枪头将残液吸干，吹干，将沉淀溶于30μ的TE溶液中，于 4℃或-40℃保存备用，最终获得质粒DNA。
S3步骤中的花粉介导转化过程为：将2g花粉加入2ml含有20μg质粒DNA、 10％蔗糖和0.9％NaCl的溶液中，然后用超声波细胞粉碎机处理混合液，选择超声功率为280-400W，使花粉和质粒DNA充分混匀。随后用毛刷蘸取混合液涂抹花丝进行授粉。此后进行正常的田间管理，收获后代种子。
S4步骤中的后代材料抗性筛选所采取的方式为Basta抗性筛选、bar基因 PCR检测和waxy1基因编辑靶位点PCR产物酶切检测。
Basta抗性筛选：将Basta原药稀释为多种不同浓度的溶液，用毛刷在玉米叶片上涂抹1-1.5cm2大小,正常光照下2-3d后就能观察到Basta抗性表达与否的清晰结果，用毛笔把Basta溶液涂抹于玉米叶片(每株取1叶)中段,面积约 1-1.5cm2，实验将涂抹后第3d-4d时涂抹处出现黄褐色枯斑的植株判定为对 Basta敏感植株；而涂抹处仍保持原有绿色的判定为Basta抗性植株。
bar基因PCR检测：选取Basta抗性筛选阳性植株，提取总DNA为模板。bar 基因的引物为BAR-1F：AGTCGACCGTGTACGTCTCC和BAR-1R： GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC，PCR产物长度是242bp。对抗性植株进行PCR检测，可检测到bar基因的PCR扩增目的片段为阳性植株。
靶点检测：针对bar基因PCR检测阳性的后代材料，进一步利用靶位点PCR+ 酶切(Hpy99I)鉴定的方式检测其是否发生了基因编辑。在未编辑样品中，利用检测引物Cp3-523f：TACCAGTCCCACGGCATCTA和Cp3-523r： GTGAGGCGCATGATGTTGTC进行Waxy1基因编辑位点的PCR扩增，能够获得523bp 的PCR产物。由于未发生编辑的目标靶点中含有Hpy99I的识别位点，该PCR扩增产物经Hpy99I酶切后会产生249bp和274bp的两个片段；而如果waxy1基因在靶位点发生了编辑，则PCR产物中靶位点上的Hpy99I识别位点会被破坏， Hpy99I则无法对PCR产物进行酶切。依据此标准可判断后代材料中waxy1基因靶点上是否发生了编辑事件。
虽然在上文中已经参考实施方式对本发明进行了描述，然而在不脱离本发明的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的部件。尤其是，只要不存在结构冲突，本发明所披露的实施方式中的各项特征均可通过任意方式相互结合起来使用，在本说明书中未对这些组合的情况进行穷举性的描述仅仅是出于省略篇幅和节约资源的考虑。因此，本发明并不局限于文中公开的特定实施方式，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。
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