具体实施方式

以下对本发明进行详细说明，但以下的说明旨在详细地说明本发明，并未意图限定本发明。

1.目标物质的制造方法

关于当利用细菌的糖酵解体系在厌氧条件下从葡萄糖生产丙酮酸时妨碍丙酮酸的生产效率的原因，本发明者推测如下。在糖酵解体系的反应途径中从葡萄糖生产丙酮酸的期间，从1摩尔的葡萄糖生产2摩尔的NADH，但不存在消耗NADH的反应，因此NADH在菌体内蓄积。但是，在厌氧条件下的物质生产中，培养液中溶解氧的量少，无法利用氧将细菌所生产的NADH氧化。菌体内所蓄积的NADH阻碍生产NADH的酶(3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH))的活性，妨碍糖酵解体系的反应的顺利进行，其结果，防碍了丙酮酸的生产效率。

本发明者基于上述推测，发现通过添加硝酸盐，与丙酮酸的生产一起进行利用硝酸呼吸消耗NADH的反应，结果可提高丙酮酸的生产效率。

另外，关于经由丙酮酸作为中间代谢物来进行生物合成的化合物(以下，也称为丙酮酸衍生物)，本发明者也确认到：在从葡萄糖生产丙酮酸衍生物的反应途径中NADH在菌体内蓄积的情况下，通过硝酸盐的添加，利用硝酸呼吸消耗NADH，由此可提高丙酮酸衍生物的生产效率。

上文所述的提高丙酮酸或丙酮酸衍生物的生产效率的效果是基于以下情况：通过硝酸盐的添加，利用硝酸呼吸消耗NADH，由此消除NADH在菌体内的蓄积。由此，可恢复因NADH的蓄积而受到阻碍的所有酶的活性。因此，本发明并不限于丙酮酸或丙酮酸衍生物的生产，可一般化为“经过蓄积NADH的反应途径从起始物质生产目标物质的任意情况”。

即，根据经一般化的发明，提供一种经过蓄积NADH的反应途径从起始物质制造目标物质的方法，所述方法包括：

在好氧条件下培养细菌；以及

随后对所述细菌在所述起始物质与硝酸根离子的存在下、在厌氧条件下进行培养，从而生产所述目标物质。

若依照所述方法而在起始物质与硝酸根离子的存在下、在厌氧条件下培养细菌，则细菌实质上不会增殖，因此可将起始物质效率良好地用于物质生产，并且与硝酸根离子的还原反应共轭地，通过氧化反应来消耗物质生产的过程中蓄积的NADH，可消除NADH在菌体内的蓄积。由此，可效率良好地生产目标物质。

当细菌将硝酸根离子还原时，会生成亚硝酸根离子。已知亚硝酸根离子显示细胞毒性。因此，所述方法可还包括：使通过细菌将硝酸根离子还原而生成的亚硝酸根离子与过氧化氢反应，从而氧化为硝酸根离子。

具体而言，“蓄积NADH的反应途径”为：

包括伴有NADH产生的反应(即，NAD⁺向NADH的还原反应)、但不包括伴有NADH消耗的反应(即，NADH向NAD⁺的氧化反应)的反应途径；或者

包括伴有NADH产生的反应以及伴有NADH消耗的反应，且在伴有NADH产生的反应中生产的NADH分子的总数比在伴有NADH消耗的反应中消耗的NADH分子的总数多的反应途径。此处，“NADH分子的总数”也可改称为“NADH分子的总摩尔数”。

作为前者的反应途径，可列举用于从葡萄糖制造丙酮酸的反应途径。用于从葡萄糖制造丙酮酸的反应途径包括伴有NADH产生的反应，但不包括伴有NADH消耗的反应，在使用了1分子的葡萄糖的情况下，生产出2分子的NADH。作为后者的反应途径，可列举用于从葡萄糖经过乙酰辅酶A(CoA)制造乙醛的反应途径。用于从葡萄糖经过乙酰CoA制造乙醛的反应途径包括伴有NADH产生的反应以及伴有NADH消耗的反应，在使用了1分子的葡萄糖的情况下，生产出4分子的NADH，并消耗2分子的NADH。

关于起始物质及目标物质的组合，只要从起始物质至目标物质的反应途径为“蓄积NADH的反应途径”，则并无特别限制。起始物质及目标物质的组合可列举：起始物质为葡萄糖、目标物质为丙酮酸的情况；起始物质为葡萄糖、目标物质为乙酸的情况；起始物质为葡萄糖、目标物质为草酰乙酸的情况；起始物质为乙醇、目标物质为乙醛的情况；起始物质为乳酸、目标物质为丙酮酸的情况；起始物质为木糖、目标物质为丝氨酸的情况；起始物质为琥珀酸、目标物质为苹果酸的情况等。

所述方法利用的是在好氧条件下进行细菌的增殖培养、随后在厌氧条件下进行物质生产的现有的发酵技术。因此，所述方法除了在硝酸根离子的存在下进行厌氧条件下的物质生产以外，可利用现有的发酵技术来实施。若利用现有的发酵技术，则可根据所欲制造的目标物质的种类，适当设定所使用的细菌的种类、增殖培养的条件、用于物质生产的培养的条件等。为了实施所述方法，必要时也可参照后述的“2.丙酮酸或丙酮酸衍生物的制造方法”一栏的记载。

在所述方法中，“硝酸根离子”可以硝酸盐的形式添加至培养液中。硝酸盐可在培养液中电离而产生硝酸根离子。作为硝酸盐，例如可使用硝酸铵、硝酸钠、硝酸钾、或它们的组合。

培养液中的硝酸盐的浓度在添加的时刻优选处于10mM～500mM的范围内，更优选处于100mM～500mM的范围内，进而优选处于200mM～300mM的范围内。另外，可与硝酸根离子伴随目标物质的生产而减少对应地进行硝酸盐的追加添加。

在所述方法中，如后述的“2.丙酮酸或丙酮酸衍生物的制造方法”一栏中所记载，细菌优选为进行了基因操作以使得所述细菌在厌氧条件下不生产以葡萄糖为原料会大量生产的发酵物质(例如，乳酸、乙酸或甲酸)的细菌。另外，如后述的“2.丙酮酸或丙酮酸衍生物的制造方法”一栏中所记载，细菌优选为进行了基因操作以使得从葡萄糖生成丙酮酸的生物体内的反应途径(即糖酵解体系)的中间代谢物不会被糖酵解体系的反应以外的反应代谢的细菌。

因此，细菌优选为欠缺选自由对乳酸脱氢酶进行编码的基因(ldh)、对磷酸烯醇丙酮酸羧化酶进行编码的基因(ppc)、对丙酮酸氧化酶进行编码的基因(pox)及对丙酮酸甲酸裂解酶进行编码的基因(pfl)所组成的群组中的一个以上的基因的功能。

如后述的“2.丙酮酸或丙酮酸衍生物的制造方法”一栏中所记载，细菌若欠缺所述基因中的任一基因的功能，则无法进行图1及图2所示的各反应，由此，可使作为起始物质而加入的糖类效率良好地朝向目标物质的生产。其结果，与未欠缺基因的功能的细菌相比，所述基因操作细菌可提高目标物质的生产效率。

在细菌欠缺所述基因中的任一基因的功能的情况下，起始物质优选为“糖类”，目标物质优选为“丙酮酸”或“经由糖酵解体系的代谢产物作为中间代谢物来进行生物合成的化合物”。

“糖类”可使用后述的“2.丙酮酸或丙酮酸衍生物的制造方法”一栏中所记载的糖类。例如，作为糖类，可列举：单糖，例如果糖或葡萄糖；二糖，例如蔗糖；多糖，例如包含葡萄糖作为构成单糖的多糖；或者利用糖化酶对植物(例如非可食用农产废弃物或能量作物)进行处理而获得的糖化液。

“经由糖酵解体系的代谢产物作为中间代谢物来进行生物合成的化合物”是经由以下的“糖酵解体系的代谢产物”作为中间代谢物来进行生物合成的化合物：所述“糖酵解体系的代谢产物”选自由葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、果糖-1,6-双磷酸、二羟基丙酮磷酸、甘油醛-3-磷酸、1,3-双磷酸甘油酸、3-磷酸甘油酸、磷酸烯醇丙酮酸及丙酮酸所组成的群组。“经由糖酵解体系的代谢产物作为中间代谢物来进行生物合成的化合物”例如可列举：经由3-磷酸甘油酸作为中间代谢物来进行生物合成的丝氨酸、经由磷酸烯醇丙酮酸作为中间代谢物来进行生物合成的草酰乙酸、经由丙酮酸作为中间代谢物来进行生物合成的乙酸、经由丙酮酸作为中间代谢物来进行生物合成的乙醛。

在特定的实施方式中，可将起始物质设为“糖类”，可将目标物质设为“丙酮酸”或“经由糖酵解体系的代谢产物作为中间代谢物来进行生物合成的化合物”。即，根据此实施方式，提供一种方法，其经过蓄积NADH的反应途径，从糖类制造“丙酮酸”或“经由糖酵解体系的代谢产物作为中间代谢物来进行生物合成的化合物”，所述方法包括：

在好氧条件下培养细菌；以及

随后对所述细菌在糖类与硝酸根离子的存在下、在厌氧条件下进行培养，从而生产“丙酮酸”或“经由糖酵解体系的代谢产物作为中间代谢物来进行生物合成的化合物”。

2.丙酮酸或丙酮酸衍生物的制造方法

以下，以起始物质为“糖类”、目标物质为“丙酮酸”或“经由丙酮酸作为中间代谢物来进行生物合成的化合物(以下，也称为丙酮酸衍生物)”的情况为例，对本发明进行说明。如上所述，本发明的理念为：通过硝酸根离子的还原反应消耗NADH，消除NADH在菌体内的蓄积，由此效率良好地生产“经过蓄积NADH的反应途径生产的物质”。因此，本发明并不限定于丙酮酸或丙酮酸衍生物的生产。以下的说明是以帮助理解本发明为目的而记载。

2-1.第一实施方式

根据第一实施方式，经过蓄积NADH的反应途径从糖类制造丙酮酸或经由丙酮酸作为中间代谢物来进行生物合成的化合物的方法包括：

在好氧条件下培养细菌；以及

随后对所述细菌在糖类与硝酸根离子的存在下、在厌氧条件下进行培养，从而生产丙酮酸或经由丙酮酸作为中间代谢物来进行生物合成的化合物。

在所述方法中，如语句上所规定，“丙酮酸”是经过蓄积NADH的反应途径而从糖类所生产，“经由丙酮酸作为中间代谢物来进行生物合成的化合物”是经过蓄积NADH的反应途径而从糖类经由丙酮酸所生产。因此，在本说明书中，“经由丙酮酸作为中间代谢物来进行生物合成的化合物”这一术语并非“从糖类经由丙酮酸而生产的所有化合物”，而是指“经过蓄积NADH的反应途径而从糖类经由丙酮酸所生产的化合物”。“经由丙酮酸作为中间代谢物来进行生物合成的化合物”例如为乙酸、乙醛。

所述方法利用的是在好氧条件下进行细菌的增殖培养、随后在厌氧条件下进行物质生产的现有的发酵技术。

＜细菌＞

细菌可使用具有将葡萄糖分解成丙酮酸的生物体内的反应途径(即糖酵解体系)的任意细菌。细菌一般为好氧性细菌，例如为棒状细菌或大肠杆菌(Escherichia coli)。

所谓棒状细菌，是伯杰氏细菌鉴定手册[Bergey's Manual of DeterminativeBacteriology，第8卷(Vol.8)，599(1974)]中所定义的一群组微生物，只要是在通常的好氧条件下增殖的微生物，则并无特别限定。若列举具体例，则可列举：棒状杆菌属菌、短杆菌(Brevibacterium)属菌、节杆菌(Arthrobacter)属菌、分枝杆菌(Mycobacterium)属菌、微球菌(Micrococcus)属菌等。在棒状细菌中，优选为棒状杆菌属菌。

作为棒状杆菌属菌，可列举：谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、有效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)、产氨棒状杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)、耐盐棒状杆菌(Corynebacterium halotolerance)、解烷棒状杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)等。其中，优选为谷氨酸棒状杆菌。作为适宜的菌株，可列举：谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)R株(FERM P-18976)、美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)13032株、ATCC13869株、ATCC13058株、ATCC13059株、ATCC13060株、ATCC13232株、ATCC13286株、ATCC13287株、ATCC13655株、ATCC13745株、ATCC13746株、ATCC13761株、ATCC14020株、ATCC31831株、MJ-233(FERM BP-1497)、MJ-233AB-41(FERM BP-1498)等。其中，优选为R株(FERM P-18976)、ATCC13032株、ATCC13869株。

此外，根据分子生物学的分类，黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、散枝短杆菌(Brevibacterium divaricatum)、百合棒状杆菌(Corynebacterium lilium)等棒状细菌的菌名也统一于谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)中[利布尔等人(Liebl,W.et al.),散枝短杆菌DSM20297T、“黄色短杆菌”DSM20411、“乳糖发酵短杆菌”DSM 20412和DSM 1412、与谷氨酸棒状杆菌的转化及其利用rRNA基因限制性图案的区分(Transfer of Brevibacteriumdivaricatum DSM 20297T,“Brevibacterium flavum”DSM 20411,“Brevibacteriumlactofermentum”DSM 20412and DSM 1412,and Corynebacterium glutamicum and theirdistinction by rRNA gene restriction patterns).国际系统菌学杂志(InternationalJournal of Systematic Bacteriology，Int J Syst Bacteriol.)41:255-260.(1991)，驹形和男等，棒状细菌的分类，发酵与工业，45:944-963(1987)]。

旧分类的乳糖发酵短杆菌ATCC13869株、黄色短杆菌的MJ-233株(FERM BP-1497)、MJ-233AB-41株(FERM BP-1498)等也是适宜的谷氨酸棒状杆菌。

作为短杆菌属菌，可列举产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)(例如ATCC6872株)等。

作为节杆菌属菌，可列举球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)(例如ATCC8010株、ATCC4336株、ATCC21056株、ATCC31250株、ATCC31738株、ATCC35698株)等。

作为分枝杆菌属菌，可列举牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)(例如ATCC19210株、ATCC27289株)等。

作为微球菌属菌，可列举弗氏微球菌(Micrococcus freudenreichii)(例如No.239株(FERM P-13221))、藤黄微球菌(Micrococcus leuteus)(例如No.240株(FERM P-13222))、脲微球菌(Micrococcus ureae)(例如IAM1010株)、玫瑰色微球菌(Micrococcusroseus)(例如IFO3764株)等。

细菌优选为进行了基因操作以使得所述细菌在厌氧条件下不生产以葡萄糖为原料会大量生产的发酵物质(例如，乳酸、乙酸或甲酸)的细菌。作为所述基因操作细菌，可列举以下的细菌：

在细菌(基因操作前)是在厌氧条件下会生产乳酸作为发酵物质的细菌(例如，棒状细菌、大肠杆菌)的情况下，是进行了基因操作以使对参与乳酸发酵的乳酸脱氢酶进行编码的基因(ldh)的功能欠缺的细菌；

在细菌(基因操作前)是在厌氧条件下会生产乙酸作为发酵物质的细菌(例如，棒状细菌)的情况下，是进行了基因操作以使对参与乙酸发酵的丙酮酸氧化酶进行编码的基因(pox)的功能欠缺的细菌；及

在细菌(基因操作前)是在厌氧条件下会生产甲酸作为发酵物质的细菌(例如，大肠杆菌)的情况下，是进行了基因操作以使对参与甲酸发酵的丙酮酸甲酸裂解酶进行编码的基因(pfl)的功能欠缺的细菌。

此外，在细菌对所述酶具有同工酶(isozyme)的情况下，只要进行基因操作以使对它们中的一个进行编码的基因的功能欠缺即可。

另外，细菌优选为进行了基因操作以使得从葡萄糖生成丙酮酸的生物体内的反应途径(即糖酵解体系)的中间代谢物不会被糖酵解体系的反应以外的反应代谢的细菌。作为所述基因操作细菌，例如可列举如下细菌：以使对磷酸烯醇丙酮酸羧化酶进行编码的基因(ppc)的功能欠缺的方式进行了基因操作，使得磷酸烯醇丙酮酸(在糖酵解体系中为丙酮酸的前体)不被草酰乙酸代谢。

因此，细菌优选为欠缺选自由对乳酸脱氢酶进行编码的基因(ldh)、对磷酸烯醇丙酮酸羧化酶进行编码的基因(ppc)、对丙酮酸氧化酶进行编码的基因(pox)及对丙酮酸甲酸裂解酶进行编码的基因(pfl)所组成的群组中的一个以上的基因的功能。

欠缺对乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)进行编码的基因(ldh)的功能的细菌无法将丙酮酸转换为乳酸(参照图1及图2中记载的“LDH”)。欠缺对磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase，PPC)进行编码的基因(ppc)的功能的细菌无法将磷酸烯醇丙酮酸转换为草酰乙酸(参照图1及图2中记载的“PPC”)。欠缺对丙酮酸氧化酶(pyruvic oxidase，POX)进行编码的基因(pox)的功能的细菌无法将丙酮酸转换为乙酸(参照图1及图2中记载的“POX”)。欠缺对丙酮酸甲酸裂解酶(pyruvate formate lyase，PFL)进行编码的基因(pfl)的功能的细菌无法将丙酮酸转换为甲酸(参照图2中记载的“PFL”)。

因此，细菌若欠缺所述基因中的任一基因的功能，则无法进行图1及图2所示的各反应，由此，可使作为起始物质而加入的糖类效率良好地朝向丙酮酸或丙酮酸衍生物的生产。其结果，与未欠缺基因的功能的细菌相比，所述基因操作细菌可提高丙酮酸或丙酮酸衍生物的生产效率。

在本说明书中，所谓“欠缺…基因的功能”，不仅包括通过基因操作而使所述基因的功能欠缺的情况，还包括由于细菌本来便不包含所述基因而欠缺所述基因的功能的情况。

另外，在本说明书中，所谓“通过基因操作而使所述基因的功能欠缺”包括：

通过对基因的一部分或全部进行修饰(例如，缺失、置换和/或插入)，不再表达酶蛋白质，或基因的表达产物不作为酶发挥作用；以及

通过对基因的启动子的一部分或全部进行修饰(例如，缺失、置换和/或插入)，不表达酶蛋白质。

在本说明书中，将通过基因操作使基因的一部分或全部缺失而欠缺基因的功能的细菌称为“缺失株”。缺失株可依照现有的方法制作。例如，缺失株可通过以下方式制作：制作以不产生由对象基因编码的酶蛋白质的方式进行了修饰的缺失型基因，利用包含缺失型基因的脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)对野生型株进行转化，使缺失型基因与野生型株的染色体上的基因之间发生同源重组。

细菌可为对乳酸脱氢酶进行编码的基因(ldh)的缺失株，可为对乳酸脱氢酶进行编码的基因(ldh)及对磷酸烯醇丙酮酸羧化酶进行编码的基因(ppc)的缺失株，也可为对乳酸脱氢酶进行编码的基因(ldh)、对磷酸烯醇丙酮酸羧化酶进行编码的基因(ppc)及对丙酮酸氧化酶进行编码的基因(pox)的缺失株。这些缺失株优选为棒状细菌的缺失株。

或者，细菌可为对丙酮酸甲酸裂解酶进行编码的基因(pfl)的缺失株，也可为对丙酮酸甲酸裂解酶进行编码的基因(pfl)及对乳酸脱氢酶进行编码的基因(ldh)的缺失株。这些缺失株优选为大肠杆菌的缺失株。

＜好氧条件下的培养＞

细菌首先在好氧条件下进行培养。由此，细菌进行增殖，可制备高浓度的菌体。因此，在以下的说明中，好氧条件下的培养也称为“增殖培养”。

“好氧条件”具体是指在培养的整个期间以对于细菌的增殖而言充分的量向培养液供给氧的条件。好氧条件例如可通过对收容有含细菌的培养液的容器在大气环境下进行振荡来实现。或者，好氧条件例如可通过一边将空气通入含细菌的培养液一边搅拌含细菌的培养液来实现。

增殖培养中使用的培养液可使用适于细菌的增殖的培养液，具体而言，可使用含有碳源、氮源、无机盐类等的天然培养基或合成培养基。在本说明书中，培养液中的各成分的浓度是指添加了各成分的时刻下的培养液中的最终浓度。

作为“碳源”，只要是细菌可作为营养源加以利用的物质，则可使用任意物质。作为碳源，例如可使用糖类(例如，葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖等单糖；蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖(cellobiose)、木二糖(xylobiose)、海藻糖等二糖；纤维素、淀粉等多糖；糖蜜)；甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、甘油(glycerin)等糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸、葡萄糖酸等有机酸；乙醇、丙醇、核糖醇(ribitol)等醇；正烷烃(normalparaffin)等烃。碳源可使用一种，或者也可混合使用两种以上。培养液中的碳源的浓度通常可设为约0.1(w/v)％～约30(w/v)％，优选设为约1(w/v)％～约10(w/v)％。另外，可与碳源伴随培养而减少对应地进行碳源的追加添加。

作为“氮源”，例如可使用氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钠、硝酸钾、乙酸铵等无机或有机的铵盐；尿素；氨水等。另外，也可使用玉米浆(corn steep liquor)、肉提取物、酵母提取物、蛋白胨、NZ-胺、大豆水解物、酪蛋白分解物等蛋白质水解物、氨基酸等含氮的有机化合物。氮源可使用一种，或者可混合使用两种以上。培养液中的氮源的浓度也根据所使用的氮化合物而不同，但通常可设为约0.1(w/v)％～约10(w/v)％。

作为“无机盐类”，例如可使用磷酸盐、硫酸盐、镁、钾、锰、铁、锌等的金属盐。具体而言，可使用磷酸二氢钾、磷酸氢钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸铁(II)、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、碳酸钙等。无机盐类可使用一种，也可混合使用两种以上。培养液中的无机盐类的浓度也根据所使用的无机盐类而不同，但通常可设为约0.01(w/v)％～约1(w/v)％。

进而，视需要也可添加营养物质。作为营养物质，例如可列举：肉提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨(polypeptone)、酵母提取物、干燥酵母、玉米浆、脱脂乳粉、脱脂大豆盐酸水解物、动植物或微生物菌体的提取物及它们的分解物。培养液中的营养物质的浓度也根据所使用的营养物质而不同，但通常可设为约0.1(w/v)％～约10(w/v)％。

进而，视需要也可添加促进细菌的增殖的因子，具体而言为维生素类、核苷酸或氨基酸。作为维生素类，例如可列举：生物素、硫胺素(维生素B1)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇、烟酸。所述维生素类也可由肉提取物、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白氨基酸(casaminoacid)等代替。另外，为了抑制培养期间的发泡，可在培养液中以适当的量添加市售的消泡剂。

进而，视需要也可添加适当的抗生素。作为抗生素，例如可列举卡那霉素(Kanamycin)及壮观霉素(Spectinomycin)。

培养液的pH只要是适于细菌的增殖的pH，则可为任意的pH。培养液的pH可设为例如5～9的范围内，优选为6～8的范围内。培养液的pH的调整可使用包含无机或有机的酸、氢氧化钾水溶液等碱性溶液、尿素、碳酸钙、氨、4-吗啉基丙烷磺酸等的pH缓冲液进行。在增殖培养期间，视需要也可调整培养液的pH。

增殖培养可在适于细菌的增殖的温度下、持续细菌的增殖所需的期间进行。增殖培养的培养温度一般适宜为20℃～42℃，优选为30℃～39℃。增殖培养的培养时间通常为1天～6天。

＜厌氧条件下的培养＞

在增殖培养后，对细菌在糖类与硝酸根离子的存在下、在厌氧条件下进行培养。由此，细菌可从糖类生产丙酮酸或丙酮酸衍生物。因此，在以下的说明中，厌氧条件下的培养也称为“生产培养”。

细菌当被置于厌氧条件下时实质上不会增殖，因此可将糖类效率良好地用作物质生产的原料，而非用作用于增殖的能量源。另外，细菌当被置于硝酸根离子的存在下时，通过下述反应式(1)将硝酸根离子还原为亚硝酸根离子，可在此反应时消耗NADH。

NO₃ ^-+NADH+H⁺→NO₂ ^-+NAD⁺+H₂O…(1)

通过此反应，细菌消耗从葡萄糖生产丙酮酸的过程中所产生的NADH，消除NADH在菌体内的蓄积，由此可促进糖类向菌体内的纳入，并且促进从糖类生产丙酮酸的反应。

因此，通过在糖类与硝酸根离子的存在下、在厌氧条件下进行生产培养，细菌可效率良好地从糖类生产丙酮酸或丙酮酸衍生物。

另外，已知亚硝酸根离子(NO₂ ^-)显示细胞毒性，因此通过添加双氧水，因所述反应式(1)的反应而蓄积的亚硝酸根离子可通过下述反应式(2)而再次恢复为硝酸根离子(NO₃ ^-)。

NO₂ ^-+H₂O₂→NO₃ ^-+H₂O…(2)

即，通过使用过氧化氢，包括反应式(1)与反应式(2)的循环能够永久地重复。若考虑到过氧化氢对细胞带来的影响，则反应式(2)的反应理想的是在从生产培养的培养液中分离出细菌的状态下进行。具体而言，可在生产培养期间，在培养液中的亚硝酸根离子的浓度变高的时间点，从培养液中分离去除细菌，向不含细菌的培养液中添加双氧水而使其反应规定时间，然后将经分离去除的细菌放回培养液中继续进行生产培养。

因此，丙酮酸或丙酮酸衍生物的制造方法可还包括：使通过细菌将硝酸根离子还原而生成的亚硝酸根离子与过氧化氢反应，从而氧化为硝酸根离子。

以下，对生产培养的培养条件进行详细说明。

生产培养是在糖类与硝酸根离子的存在下、在厌氧条件下进行。

“在糖类与硝酸根离子的存在下对细菌进行培养”可通过在包含糖类及硝酸根离子的培养液中对细菌进行培养来进行。更具体而言，“在糖类与硝酸根离子的存在下对细菌进行培养”可通过在添加了糖类及硝酸盐的培养液中对细菌进行培养来进行。

“厌氧条件”具体而言是指在培养的整个期间并不向含细菌的培养液积极地供给氧的条件。更具体而言，厌氧条件是指培养液中的溶解氧浓度处于0ppm～2ppm的范围内的条件，优选是指培养液中的溶解氧浓度处于0ppm～1ppm的范围内的条件，更优选是指培养液中的溶解氧浓度处于0ppm～0.5ppm的范围内的条件。培养液中的溶解氧浓度例如可使用溶解氧仪来测定。

严格而言，“厌氧条件”是指明在培养液中不存在溶解氧的条件的技术术语。另一方面，生产培养中采用的“厌氧条件”只要可抑制细菌的增殖、提高丙酮酸或丙酮酸衍生物的生产效率，则也可为在培养液中以微量存在溶解氧的条件。因此，在本说明书中，“厌氧条件”这一术语不仅包括“在培养液中不存在溶解氧的条件”，还包括“在培养液中以微量存在溶解氧的条件”。

厌氧条件例如可通过在大气环境下不对含细菌的培养液进行振荡而予以静置，从而在经过规定时间后培养液中的溶解氧的量减少来实现。或者，厌氧条件例如可通过向含细菌的培养液中通入惰性气体、具体为氮气来实现。或者，厌氧条件例如可通过将收容有含细菌的培养液的容器密闭来实现。

生产培养优选在使细菌高密度地悬浮于培养液中的状态下进行。若在此种状态下对细菌进行培养，则可更有效率地生产丙酮酸或丙酮酸衍生物。

“使细菌高密度地悬浮于培养液中的状态”例如是指以细菌的湿菌体重量％成为1(w/v)％～50(w/v)％的范围内的方式使细菌悬浮于培养液中的状态。“使细菌高密度地悬浮于培养液中的状态”优选是指以细菌的湿菌体重量％成为3(w/v)％～30(w/v)％的范围内的方式使细菌悬浮于培养液中的状态。

生产培养优选在使细菌高密度地悬浮于培养液中的状态下进行，但增殖培养优选在细菌容易增殖的环境下进行，因此优选在使细菌以比生产培养中采用的所述密度低的密度悬浮于培养液中的状态下进行。

生产培养可在增殖培养后进行培养液的更换之后进行。具体而言，在增殖培养后，将包含培养液以及悬浮于培养液中的细菌的容器放入离心分离机而使细菌沉淀，然后从容器中去除增殖培养用的培养液，将分离出的细菌悬浮于生产培养用的培养液中，由此可进行生产培养。

或者，生产培养也可通过在增殖培养后向含细菌的培养液中加入生产培养所需的追加成分(即，糖类及硝酸盐)，而在不进行培养液的更换的情况下连续地进行。

生产培养可在包含糖类与硝酸根离子的培养液中进行。在本说明书中，培养液中的各成分的浓度是指添加了各成分的时刻下的培养液中的最终浓度。

作为“糖类”，只要是细菌可纳入生物体内且可转变为丙酮酸的糖类，则可使用任意的糖类。具体而言，作为糖类，可列举：葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖等单糖；蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖(cellobiose)、木二糖(xylobiose)、海藻糖等二糖；淀粉等多糖；糖蜜等。其中，优选为单糖，更优选为果糖及葡萄糖，进而优选为葡萄糖。另外，也优选为包含葡萄糖作为构成单糖的糖类，具体而言，也优选为蔗糖等二糖、包含葡萄糖作为构成单糖的寡糖、包含葡萄糖作为构成单糖的多糖。糖类可使用一种，也可混合使用两种以上。另外，糖类可以糖化液(其含有葡萄糖、木糖等多种糖类)的形式添加至培养液中，所述糖化液是通过利用糖化酶等对稻草、蔗渣(bagasse)、玉米秸秆(corn stover)等非可食用农产废弃物、或柳枝稷(switchgrass)、象草(napier grass)、芒草(miscanthus)等能量作物加以糖化而获得。

在不妨碍丙酮酸或丙酮酸衍生物的生产的范围内，可尽可能地提高培养液中的糖类的浓度。培养液中的糖类的浓度优选处于约0.1(w/v)％～约40(w/v)％的范围内，更优选处于约1(w/v)％～约20(w/v)％的范围内。另外，可与糖类伴随丙酮酸或丙酮酸衍生物的生产而减少对应地进行糖类的追加添加。

“硝酸根离子”可以硝酸盐的形式添加至培养液中。硝酸盐可在培养液中电离而产生硝酸根离子。作为硝酸盐，例如可使用硝酸铵、硝酸钠、硝酸钾、或它们的组合。

培养液中的硝酸盐的浓度优选处于10mM～500mM的范围内，更优选处于100mM～500mM的范围内，进而优选处于200mM～300mM的范围内。另外，可与硝酸根离子伴随丙酮酸或丙酮酸衍生物的生产而减少对应地进行硝酸盐的追加添加。

“包含糖类与硝酸根离子的培养液”也可含有其他必要的成分。作为其他必要的成分，例如可列举：糖类以外的碳源、硝酸盐以外的氮源、或无机盐类等。

作为“糖类以外的碳源”，可列举：甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、甘油等糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸、葡萄糖酸等有机酸；乙醇、丙醇、核糖醇等醇；正烷烃等烃、二氧化碳或包含碳酸根离子的盐等。糖类以外的碳源可使用一种，也可混合使用两种以上。糖类以外的碳源在培养液中通常可设为约0.1(w/v)％～约20(w/v)％。

作为“硝酸盐以外的氮源”，可列举：氯化铵、硫酸铵、乙酸铵等无机铵化合物或有机铵化合物、尿素、氨水等。另外，硝酸盐以外的氮源也可使用玉米浆、肉提取物、酵母提取物、蛋白胨、NZ-胺、大豆水解物、酪蛋白分解物等蛋白质水解物、氨基酸等含氮的有机化合物等。硝酸盐以外的氮源可使用一种，也可混合使用两种以上。硝酸盐以外的氮源也根据所使用的氮化合物而不同，但在培养液中通常可设为约0.1(w/v)％～约10(w/v)％。

作为“无机盐类”，例如可使用磷酸盐、硫酸盐、镁、钾、锰、铁、锌等的金属盐。具体而言，可列举：磷酸二氢钾、磷酸氢钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸铁(II)、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴、碳酸钙等。无机盐类可使用一种，也可混合使用两种以上。培养液中的无机盐类的浓度也根据所使用的无机盐类而不同，但通常可设为约0.01(w/v)％～约1(w/v)％。

进而，视需要，培养液也可含有维生素类。作为维生素类，可列举：生物素、硫胺素(维生素B1)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇、烟酸等。

培养液的pH只要是适于丙酮酸或丙酮酸衍生物的生产的pH，则可为任意的pH。培养液的pH优选可设为6～8的范围内。培养液的pH的调整可使用包含无机或有机的酸、氢氧化钾水溶液等碱性溶液、尿素、碳酸钙、氨、4-吗啉基丙烷磺酸等的pH缓冲液进行。在生产培养期间，视需要也可调整培养液的pH。

生产培养可在适于丙酮酸或丙酮酸衍生物的生产的温度下、持续丙酮酸或丙酮酸衍生物的生产所需的期间进行。生产培养的培养温度优选为约20℃～约50℃，更优选为约25℃～约47℃。生产培养的培养时间优选为约3小时～7天，更优选为约1天～3天。

生产培养可为批次式、流加式、连续式的任一种。其中，优选为批次式。

＜丙酮酸或丙酮酸衍生物的回收＞

依照所述第一实施方式进行增殖培养及随后的生产培养后，在培养液中生产出丙酮酸或丙酮酸衍生物。

可通过在生产培养后回收培养液来回收丙酮酸或丙酮酸衍生物，但也可进一步利用现有的方法从培养液中分离纯化丙酮酸或丙酮酸衍生物。作为此种现有的方法，可列举：蒸馏法、浓缩法、离子交换树脂法、活性炭吸附溶离法、溶媒提取法、结晶法等。可根据所欲回收的物质的种类，选择适当的分离纯化方法。例如，丙酮酸可通过溶媒提取法进行分离纯化。例如，乙酸可通过蒸馏法进行分离纯化。

＜棒状细菌的反应途径＞

将棒状细菌生产丙酮酸或丙酮酸衍生物的工艺示于图1。图1使用葡萄糖作为糖类的一例。

如图1所示，纳入至棒状细菌的葡萄糖通过糖酵解体系转变为丙酮酸。从1摩尔的葡萄糖生产出2摩尔的丙酮酸，在此生产工艺中，生产出2摩尔的NADH。从葡萄糖生产丙酮酸的工艺不包括伴有NADH消耗的反应。因此，在从葡萄糖生成丙酮酸的反应途径中，过剩地生产、蓄积NADH。若向培养液中添加硝酸盐，则在硝酸根离子转变为亚硝酸根离子时会消耗NADH，因此消除NADH在菌体内的蓄积，从葡萄糖生成丙酮酸的反应顺畅地进行，结果，认为丙酮酸的生产效率提高。

如图1所示，所生产的丙酮酸通过丙酮酸氧化酶(POX)转变为乙酸。从1摩尔的葡萄糖生产出2摩尔的乙酸，在此生产工艺中，生产出4摩尔的NADH。从葡萄糖生产乙酸的工艺不包括伴有NADH消耗的反应。因此，在从葡萄糖生成乙酸的反应途径中，过剩地生产、蓄积NADH。若向培养液中添加硝酸盐，则在硝酸根离子转变为亚硝酸根离子时会消耗NADH，因此消除NADH在菌体内的蓄积，从葡萄糖生成乙酸的反应顺畅地进行，结果，认为乙酸的生产效率提高。

如图1所示，所生产的丙酮酸通过乳酸脱氢酶(LDH)转变为乳酸。从1摩尔的葡萄糖生产出2摩尔的乳酸，在此生产工艺中，生产出2摩尔的NADH，消耗2摩尔的NADH。因此，在从葡萄糖生成乳酸的反应途径中，NADH的生产量与消费量相同。关于乳酸的生产，由于未发生NADH的过剩生产，因此无法期待通过硝酸盐的添加带来的生产效率的提高效果。

如图1所示，作为丙酮酸的前驱物质的磷酸烯醇丙酮酸通过磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PPC)转变为草酰乙酸，随后转变为琥珀酸。从1摩尔的葡萄糖生产出2摩尔的琥珀酸，在此生产工艺中，生产出2摩尔的NADH，消耗4摩尔的NADH。因此，在从葡萄糖生成琥珀酸的反应途径中，过剩地消耗NADH。关于琥珀酸的生产，由于未发生NADH的过剩生产，因此无法期待通过硝酸盐的添加带来的生产效率的提高效果。此外，除了生成琥珀酸的所述反应途径外，琥珀酸也可通过作为弱活性的反应途径的、丙酮酸通过丙酮酸羧化酶(pyruviccarboxylase，PYC)而转变为草酰乙酸的反应途径来生产。

＜大肠杆菌的反应途径＞

将大肠杆菌生产丙酮酸或丙酮酸衍生物的工艺示于图2。图2使用葡萄糖作为糖类的一例。

如图2所示，纳入至大肠杆菌的葡萄糖通过糖酵解体系转变为丙酮酸。从1摩尔的葡萄糖生产出2摩尔的丙酮酸，在此生产工艺中，生产出2摩尔的NADH。从葡萄糖生产丙酮酸的工艺不包括伴有NADH消耗的反应。因此，在从葡萄糖生成丙酮酸的反应途径中，过剩地生产、蓄积NADH。若向培养液中添加硝酸盐，则在硝酸根离子转变为亚硝酸根离子时会消耗NADH，因此消除NADH在菌体内的蓄积，从葡萄糖生成丙酮酸的反应顺畅地进行，结果，认为丙酮酸的生产效率提高。

如图2所示，所生产的丙酮酸通过丙酮酸氧化酶(POX)转变为乙酸。从1摩尔的葡萄糖生产出2摩尔的乙酸，在此生产工艺中，生产出4摩尔的NADH。从葡萄糖生产乙酸的工艺不包括伴有NADH消耗的反应。因此，在从葡萄糖生成乙酸的反应途径中，过剩地生产、蓄积NADH。若向培养液中添加硝酸盐，则在硝酸根离子转变为亚硝酸根离子时会消耗NADH，因此消除NADH在菌体内的蓄积，从葡萄糖生成乙酸的反应顺畅地进行，结果，认为乙酸的生产效率提高。

如图2所示，所生产的丙酮酸通过乳酸脱氢酶(LDH)转变为乳酸。从1摩尔的葡萄糖生产出2摩尔的乳酸，在此生产工艺中，生产出2摩尔的NADH，消耗2摩尔的NADH。因此，在从葡萄糖生成乳酸的反应途径中，NADH的生产量与消费量相同。关于乳酸的生产，由于未发生NADH的过剩生产，因此无法期待通过硝酸盐的添加带来的生产效率的提高效果。

如图2所示，所生产的丙酮酸通过丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)转变为甲酸。从1摩尔的葡萄糖生产出2摩尔的甲酸，在此生产工艺中，生产出2摩尔的NADH，消耗2摩尔的NADH。因此，在从葡萄糖生成甲酸的反应途径中，NADH的生产量与消耗量相同。关于甲酸的生产，由于未发生NADH的过剩生产，因此无法期待通过硝酸盐的添加带来的生产效率的提高效果。另外，也已知甲酸在硝酸存在下会转变为二氧化碳。

如图2所示，作为丙酮酸的前驱物质的磷酸烯醇丙酮酸通过磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PPC)转变为草酰乙酸，随后转变为琥珀酸。从1摩尔的葡萄糖生产出2摩尔的琥珀酸，在此生产工艺中，生产出2摩尔的NADH，消耗4摩尔的NADH。因此，在从葡萄糖生成琥珀酸的反应途径中，过剩地消耗NADH。关于琥珀酸的生产，由于未发生NADH的过剩生产，因此无法期待通过硝酸盐的添加带来的生产效率的提高效果。

2-2.第二实施方式。

根据第二实施方式，经过蓄积NADH的反应途径从糖类制造丙酮酸或经由丙酮酸作为中间代谢物来进行生物合成的化合物(以下也称为丙酮酸衍生物)的方法包括：

在糖类与硝酸根离子的存在下、在厌氧条件下，培养欠缺选自由对乳酸脱氢酶进行编码的基因(ldh)、对磷酸烯醇丙酮酸羧化酶进行编码的基因(ppc)、对丙酮酸氧化酶进行编码的基因(pox)及对丙酮酸甲酸裂解酶进行编码的基因(ppc)所组成的群组中的一个以上的基因的功能的细菌，从而生产丙酮酸或经由丙酮酸作为中间代谢物来进行生物合成的化合物。

第二实施方式的方法包括厌氧条件下的生产培养，且可包括或可不包括好氧条件下的增殖培养。除了使用上述的“欠缺选自由ldh、ppc、pox及pfl所组成的群组中的一个以上的基因的功能的细菌”以外，第二实施方式的方法可按照与第一实施方式的方法相同的流程实施。

“欠缺选自由ldh、ppc、pox及pfl所组成的群组中的一个以上的基因的功能的细菌”可参照“2-1.第一实施方式”一栏的说明。

“欠缺选自由ldh、ppc、pox及pfl所组成的群组中的一个以上的基因的功能的细菌”可为对乳酸脱氢酶进行编码的基因(ldh)的缺失株，可为对乳酸脱氢酶进行编码的基因(ldh)及对磷酸烯醇丙酮酸羧化酶进行编码的基因(ppc)的缺失株，也可为对乳酸脱氢酶进行编码的基因(ldh)、对磷酸烯醇丙酮酸羧化酶进行编码的基因(ppc)及对丙酮酸氧化酶进行编码的基因(pox)的缺失株。这些缺失株优选为棒状细菌的缺失株。

或者，“欠缺选自由ldh、ppc、pox及pfl所组成的群组中的一个以上的基因的功能的细菌”可为对丙酮酸甲酸裂解酶进行编码的基因(pfl)的缺失株，也可为对丙酮酸甲酸裂解酶进行编码的基因(pfl)及对乳酸脱氢酶进行编码的基因(ldh)的缺失株。这些缺失株优选为大肠杆菌的缺失株。

若作为细菌而使用“欠缺选自由ldh、ppc、pox及pfl所组成的群组中的一个以上的基因的功能的细菌”，则如“2-1.第一实施方式”一栏中所说明，可使作为起始物质而加入的糖类效率良好地朝向丙酮酸或丙酮酸衍生物的生产。

另外，细菌当被置于厌氧条件下时实质上不会增殖，因此可将糖类效率良好地用作物质生产的原料，而非用作用于增殖的能量源。

另外，细菌当被置于硝酸根离子的存在下时，通过下述反应式(1)将硝酸根离子还原为亚硝酸根离子，可在此反应时消耗NADH。

NO₃ ^-+NADH+H⁺→NO₂ ^-+NAD⁺+H₂O…(1)

通过此反应，细菌消耗从葡萄糖生产丙酮酸的过程中所产生的NADH，消除NADH在菌体内的蓄积，由此可促进糖类向菌体内的纳入，并且促进从糖类生产丙酮酸的反应。

因此，若依照第二实施方式在厌氧条件下、在糖类与硝酸根离子的存在下培养欠缺特定的基因的功能的细菌，则细菌可效率良好地从糖类生产丙酮酸或丙酮酸衍生物。

3.优选实施方式

将本发明的优选实施方式汇总示于以下。

[A1]一种经由蓄积NADH的反应途径从起始物质制造目标物质的方法，所述方法包括：

在好氧条件下培养细菌；以及

随后对所述细菌在所述起始物质与硝酸根离子的存在下、在厌氧条件下进行培养，从而生产所述目标物质。

[A2]根据[A1]所述的方法，其中，对所述细菌在所述起始物质与硝酸根离子的存在下进行培养是通过对所述细菌在包含所述起始物质及硝酸根离子的培养液中进行培养来进行。

[A3]根据[A1]或[A2]所述的方法，其中，对所述细菌在所述起始物质与硝酸根离子的存在下进行培养是通过对所述细菌在添加了所述起始物质及硝酸盐的培养液中进行培养来进行。

[A4]根据[A3]所述的方法，其中，所述硝酸盐为硝酸铵、硝酸钠、硝酸钾、或它们的组合。

[A5]根据[A3]或[A4]所述的方法，其中，所述硝酸盐在所述培养液中添加至10mM～500mM、优选为100mM～500mM、更优选为200mM～300mM的浓度。

[A6]根据[A1]至[A5]中任一项所述的方法，其中，所述细菌为好氧性细菌。

[A7]根据[A1]至[A6]中任一项所述的方法，其中，所述细菌为棒状细菌，优选为棒状杆菌属(Corynebacterium)菌，更优选为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。

[A8]根据[A1]至[A6]中任一项所述的方法，其中，所述细菌为大肠杆菌(Escherichia coli)。

[A9]根据[A1]至[A8]中任一项所述的方法，其中，所述细菌欠缺选自由对乳酸脱氢酶进行编码的基因、对磷酸烯醇丙酮酸羧化酶进行编码的基因、对丙酮酸氧化酶进行编码的基因及对丙酮酸甲酸裂解酶进行编码的基因所组成的群组中的一个以上的基因的功能。

[A10]根据[A1]至[A9]中任一项所述的方法，其中，所述起始物质为糖类。

[A11]根据[A1]至[A10]中任一项所述的方法，其中，所述起始物质为糖类，所述目标物质为“丙酮酸”或“经由糖酵解体系的代谢产物作为中间代谢物来进行生物合成的化合物”。

[A12]根据[A10]或[A11]所述的方法，其中，所述糖类为：单糖，例如果糖或葡萄糖；二糖，例如蔗糖；多糖，例如包含葡萄糖作为构成单糖的多糖；或者利用糖化酶对植物(例如非可食用农产废弃物或能量作物)进行处理而获得的糖化液。

[A13]根据[A10]至[A12]中任一项所述的方法，其中，所述糖类为葡萄糖。

[A14]根据[A1]至[A13]中任一项所述的方法，还包括：使通过所述细菌将所述硝酸根离子还原而生成的亚硝酸根离子与过氧化氢反应，从而氧化为硝酸根离子。

[A15]根据[A1]至[A14]中任一项所述的方法，其中，对所述细菌在厌氧条件下进行培养是在使所述细菌高密度地悬浮于培养液中的状态下进行。

[A16]根据[A1]至[A15]中任一项所述的方法，其中，对所述细菌在厌氧条件下进行培养是在以细菌的湿菌体重量％成为1(w/v)％～50(w/v)％、优选成为3(w/v)％～30(w/v)％的范围内的方式使所述细菌悬浮于培养液中的状态下进行。

[A17]根据[A1]至[A16]中任一项所述的方法，还包括回收所生产的所述目标物质。

[A18]根据[A1]至[A17]中任一项所述的方法，其中，蓄积NADH的所述反应途径为：

包括伴有NADH产生的反应，但不包括伴有NADH消耗的反应的反应途径；或者

包括伴有NADH产生的反应以及伴有NADH消耗的反应，在伴有NADH产生的反应中生产的NADH分子的总数比在伴有NADH消耗的反应中消耗的NADH分子的总数多的反应途径。

[B1]一种方法，经过蓄积NADH的反应途径，从糖类制造丙酮酸或经由丙酮酸作为中间代谢物来进行生物合成的化合物，所述方法包括：

在好氧条件下培养细菌；以及

随后对所述细菌在糖类与硝酸根离子的存在下、在厌氧条件下进行培养，从而生产丙酮酸或经由丙酮酸作为中间代谢物来进行生物合成的化合物。

[B2]根据[B1]所述的方法，其中，所述细菌欠缺选自由对乳酸脱氢酶进行编码的基因、对磷酸烯醇丙酮酸羧化酶进行编码的基因、对丙酮酸氧化酶进行编码的基因及对丙酮酸甲酸裂解酶进行编码的基因所组成的群组中的一个以上的基因的功能。

[B3]一种方法，经过蓄积NADH的反应途径，从糖类制造丙酮酸或经由丙酮酸作为中间代谢物来进行生物合成的化合物，所述方法包括：

在糖类与硝酸根离子的存在下、在厌氧条件下，培养欠缺选自由对乳酸脱氢酶进行编码的基因、对磷酸烯醇丙酮酸羧化酶进行编码的基因、对丙酮酸氧化酶进行编码的基因及对丙酮酸甲酸裂解酶进行编码的基因所组成的群组中的一个以上的基因的功能的细菌，从而生产丙酮酸或经由丙酮酸作为中间代谢物来进行生物合成的化合物。

[B4]根据[B1]至[B3]中任一项所述的方法，其生产丙酮酸。

[B5]根据[B1]至[B3]中任一项所述的方法，其生产经由丙酮酸作为中间代谢物来进行生物合成的化合物。

[B6]根据技术方案[B1]、[B2]、[B3]或[B5]所述的方法，其中，经由丙酮酸作为中间代谢物来进行生物合成的所述化合物为乙酸。

[B7]根据[B1]至[B6]中任一项所述的方法，其中，所述细菌是对乳酸脱氢酶进行编码的基因的缺失株。

[B8]根据[B1]至[B6]中任一项所述的方法，其中，所述细菌是对乳酸脱氢酶进行编码的基因及对磷酸烯醇丙酮酸羧化酶进行编码的基因的缺失株。

[B9]根据[B1]至[B6]中任一项所述的方法，其中，所述细菌是对乳酸脱氢酶进行编码的基因、对磷酸烯醇丙酮酸羧化酶进行编码的基因及对丙酮酸氧化酶进行编码的基因的缺失株。

[B10]根据[B1]至[B9]中任一项所述的方法，其中，所述细菌为好氧性细菌，优选为棒状细菌，更优选为棒状杆菌属(Corynebacterium)菌，进而优选为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。

[B11]根据[B1]至[B6]中任一项所述的方法，其中，所述细菌是对丙酮酸甲酸裂解酶进行编码的基因的缺失株。

[B12]根据[B1]至[B6]中任一项所述的方法，其中，所述细菌是对丙酮酸甲酸裂解酶进行编码的基因及对乳酸脱氢酶进行编码的基因的缺失株。

[B13]根据[B1]至[B6]、[B11]及[B12]中的任一项所述的方法，其中，所述细菌为好氧性细菌，优选为大肠杆菌(Escherichia coli)。

[B14]根据[B1]至[B13]中任一项所述的方法，其中，对所述细菌在所述糖类与硝酸根离子的存在下进行培养是通过对所述细菌在包含所述糖类及硝酸根离子的培养液中进行培养来进行。

[B15]根据[B1]至[B14]中任一项所述的方法，其中，对所述细菌在所述糖类与硝酸根离子的存在下进行培养是通过对所述细菌在添加了所述糖类及硝酸盐的培养液中进行培养来进行。

[B16]根据[B15]所述的方法，其中，所述糖类在所述培养液中添加至0.1(w/v)％～40(w/v)％、优选为1(w/v)％～20(w/v)％的浓度。

[B17]根据[B15]或[B16]所述的方法，其中，所述硝酸盐在所述培养液中添加至10mM～500mM、优选为100mM～500mM、更优选为200mM～300mM的浓度。

[B18]根据[B1]至[B17]中任一项所述的方法，其中，所述糖类为：单糖，例如果糖或葡萄糖；二糖，例如蔗糖；多糖，例如包含葡萄糖作为构成单糖的多糖；或者利用糖化酶对植物(例如非可食用农产废弃物或能量作物)进行处理而获得的糖化液。

[B19]根据[B1]至[B18]中任一项所述的方法，其中，所述糖类为葡萄糖。

[B20]根据[B1]至[B19]中任一项所述的方法，其中，所述硝酸根离子以硝酸盐的形态添加至培养液中，所述硝酸盐为硝酸铵、硝酸钠、硝酸钾、或者它们的组合。

[B21]根据[B1]至[B20]中任一项所述的方法，还包括：使通过所述细菌将所述硝酸根离子还原而生成的亚硝酸根离子与过氧化氢反应，从而氧化为硝酸根离子。

[B22]根据[B1]至[B21]中任一项所述的方法，其中，对所述细菌在厌氧条件下进行培养是在使所述细菌高密度地悬浮于培养液中的状态下进行。

[B23]根据[B1]至[B22]中任一项所述的方法，其中，对所述细菌在厌氧条件下进行培养是在以细菌的湿菌体重量％成为1(w/v)％～50(w/v)％、优选成为3(w/v)％～30(w/v)％的范围内的方式使所述细菌悬浮于培养液中的状态下进行。

[B24]根据[B1]至[B23]中任一项所述的方法，还包括回收所生产的丙酮酸或经由丙酮酸作为中间代谢物来进行生物合成的化合物。

[B25]根据[B1]至[B24]中任一项所述的方法，其中，蓄积NADH的所述反应途径为：

包括伴有NADH产生的反应，但不包括伴有NADH消耗的反应的反应途径；或者

包括伴有NADH产生的反应以及伴有NADH消耗的反应，在伴有NADH产生的反应中生产的NADH分子的总数比在伴有NADH消耗的反应中消耗的NADH分子的总数多的反应途径。

[实施例]

1.ldh基因的缺失株(Δldh)的制作

谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的缺失株通过以下的方法制作。

对于SacB基因，根据pNIC28-Bsa4(源生物科学(Source BioScience))，使用引物：

5'-GGGGAAGCTTGACGTCCACATATACCTGCC-3'(序列号1)

5'-ATTCGGATCCGTATCCACCTTTAC-3'(序列号2)、

使用酶：原恒星(PrimeSTAR)MAX(宝(TAKARA))、并使用热循环仪(thermalcycler)：T100^TM(伯乐(BIO-RAD))进行扩增。对所得的DNA片段及质粒pHSG299(宝(TAKARA))利用BamHI及HindIII进行限制性酶处理后，利用DNA连接试剂盒(DNA ligation Kit)第二版(Ver.2)(宝(TAKARA))进行连接，获得pGE015。

进而，以ATCC13032的基因组DNA为模板，对ldh基因的上游1000bp使用：

5'-GACGGCCAGTGAATTTTTCATACGACCACGGGCTA-3'(序列号3)

5'-GACAATCTTGTTACCGACGG-3'(序列号4)、

对下游1000bp使用：

5'-GGTAACAAGATTGTCACCCTGCGCGAAATTCAGAA-3'(序列号5)

5'-TACCGAGCTCGAATTGAACTCACTGAAAAATGCTG-3'(序列号6)并

通过同样的方法进行扩增。将所得的DNA片段使用因福森克隆试剂盒(In-Fusioncloning kit)(宝(TAKARA))克隆至利用EcoRI对pGE015进行限制性酶处理后的载体中，将此作为pGE033。

质粒pGE033包含缺失了ldh基因的片段，从而是在棒状杆菌属内无法进行复制的质粒。将质粒pGE033依照电脉冲法(2500V，25μF，200Ω；范德雷斯特等人(Van der Rest etal.)应用微生物学与生物技术(Applied Microbiology and Biotechnology，Appl.Microbiol Biotechnol)52，541-545，1999)的方法，导入谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032株中，并涂布于包含卡那霉素25μg/ml的A琼脂培养基(1L[组成：将尿素：2g、(NH₄)₂SO₄：7g、KH₂PO₄：0.5g、K₂HPO₄：0.5g、MgSO₄·7H₂O：0.5g、FeSO₄·7H₂O：6mg、MnSO₄·n H₂O：4.2mg、D-生物素：200μg、盐酸硫胺素：200μg、酵母提取物：2g、酪蛋白氨基酸：7g、葡萄糖：20g、琼脂：16g在蒸馏水中溶解1000ml(pH 6.6)])。

在所述包含卡那霉素25μg/ml的A琼脂培养基上增殖的生长株是pGE033与染色体上的野生型ldh基因发生了1处同源性重组并连同质粒一起组入基因组DNA中的株。当将此株涂布于加入了10％蔗糖的LB琼脂培养基(细菌蛋白胨(Bacto Peptone)：10g/1L，酵母提取物：5g/1L，氯化钠：10g/1L，琼脂：16g/1L)时，带有SacB基因的菌体因细胞中积聚有毒性物质而无法存活，从而仅残存SacB基因已脱落的株。此时，在质粒按照原来的pGE033的形式脱落的情况下会恢复为野生型ATCC13032株，但在质粒携带ldh基因脱除的情况下，残留ldh基因的缺失株。

关于ldh基因的缺失株的选择，使用引物：

所述5'-GACGGCCAGTGAATTTTTCATACGACCACGGGCTA-3'(序列号3)

所述5'-TACCGAGCTCGAATTGAACTCACTGAAAAATGCTG-3'(序列号6)，

并通过以菌落为模板的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)法(菌落PCR)进行。若为缺失株，则应可获得缺失了2kb的ldh基因的DNA片段，对此通过琼脂糖电泳(agarose electrophoresis)法(分子克隆(Molecular Cloning),萨姆布鲁克等人(Sambrook et al.),1989冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress))进行确认，选择确认到缺失片段的菌落作为缺失株(ATCC13032Δldh)。

2.ldh基因及ppc基因的缺失株(ΔldhΔppc)的制作

ppc基因的缺失是依照与ldh基因的缺失相同的方法并以如下方式进行。以ATCC13032的基因组DNA为模板，对ppc基因的上游1000bp使用：

5'-CCATGATTACGAATTCGGGAAACTTTTTTAAGAAA-3'(序列号7)

5'-TAACTACTTTAAACACTCTT-3'(序列号8)、

对下游1000bp使用：

5'-TGTTTAAAGTAGTTATCCAGCCGGCTGGGTAGTAC-3'(序列号9)

5'-TACCGAGCTCGAATTGAAGTATTCAAGGGGATTTC-3'(序列号10)并

通过相同的方法进行扩增。将所得的DNA片段使用因福森克隆试剂盒(In-Fusioncloning kit)(宝(TAKARA))克隆至利用EcoRI对pGE015进行限制性酶处理后的载体中，将此作为pGE020。将质粒pGE020依照电脉冲法的方法导入ATCC13032Δldh株中，并通过与上述相同的方法，获得ldh基因及ppc基因的缺失株(ATCC13032ΔldhΔppc)。

3.ldh基因、ppc基因及pox基因的缺失株(ΔldhΔppcΔpox)的制作

pox基因的缺失是依照与ldh基因的缺失相同的方法并以如下方式进行。以ATCC13032的基因组DNA为模板，对pox基因的上游1000bp使用：

5'-GACGGCCAGTGAAAACGTTAATGAGGAAAACCG-3'(序列号11)

5'-AATTAATTGTTCTGCGTAGC-3'(序列号12)、

对下游1000bp使用：

5'-GCAGAACAATTAATTCTCGAGTCGAACATAAGGAATATTCC-3'(序列号13)

5'-TACCGAGCTCGAATTTTCCAGGTACGGAAAGTGCC-3'(序列号14)并

通过相同的方法进行扩增。将所得的DNA片段使用因福森克隆试剂盒(In-Fusioncloning kit)(宝(TAKARA))克隆至利用EcoRI对pGE015进行限制性酶处理后的载体中，将此作为pGE191。将质粒pGE191依照电脉冲法的方法导入ATCC13032ΔldhΔppc株中，并通过与上述相同的方法，获得ldh基因、ppc基因及pox基因的缺失株(ATCC13032ΔldhΔppcΔpox)。

4.pflB基因的缺失株(Δpflb)的制作

大肠杆菌的缺失株的制作依照了达森口与万纳(Datsenko and Wanner)(美国科学院院报(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America，Proc Natl Acad Sci USA)2000,97：6640-6645.)的方法。对于在大肠杆菌BW25113株中利用pKD46(生命科学市场(Life Science Market))进行转化而成的株，在向30℃、100ml的LB培养基中加入10mM的阿拉伯糖后的培养基中进行培养，直至OD600达到0.6附近。利用10％甘油将菌体清洗3次，最终悬浮于1ml的10％甘油中。在pflB基因缺失株的制作中，使用以pKD13(生命科学市场(Life Science Market))为模板并利用以下的引物进行了扩增的基因片段。

5'-CGAAGTACGCAGTAAATAAAAAATCCACTTAAGAAGGTAGGTGTTACATGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3'(序列号15)

5'-TTTTACTGTACGATTTCAGTCAAATCTAATTACATAGATTGAGTGAAGGTTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3'(序列号16)

PCR产物使用牛克劳斯宾凝胶与PCR清除(NucleoSpin Gel and PCR Clean-up)(宝(TAKARA))进行纯化。

向上述中所制备的感受态细胞150μl中，加入上述中所制备的PCR产物10μl，利用电脉冲法(2500V，25μF，200Ω)进行基因导入。选择在包含卡那霉素50μg/ml的LB琼脂培养基上增殖的生长株。缺失的确认是通过对菌体进行培养并对上清液进行有机酸分析而不再生产甲酸来进行。在有机酸的测定中，使用TSKgel OApak(东曹(Tosoh))的柱并通过高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)分析来进行鉴定。

对于在BW25113ΔpflB::Km株中利用pCP20(生命科学市场(Life ScienceMarket))在30℃下进行转化而成的株，在不包含化学药剂的LB平板上划线(streak)，在42℃下进行培养。pCP20以在高温下表达出使卡那霉素抗性基因的组件(cassette)脱落的Flp重组酶的方式设计。从在42℃下进行了培养的平板中，选择对卡那霉素成为感受性的菌落，并将其作为pflB基因的缺失株(BW25113ΔpflB)。

5.pflB基因及ldhA基因的缺失株(ΔpflBΔldh)的制作

对于在BW25113ΔpflB株中利用pKD46(生命科学市场(Life Science Market))进行转化而成的株，利用上述方法制备了感受态细胞，利用上述方法转化ldhA经卡那霉素抗性基因置换的DNA片段。ldhA经卡那霉素抗性基因置换的DNA片段是以pKD13为模板，利用以下的引物进行PCR反应而制备。

5'-CTGCCGGGAAATGACTGTCCGCAAGGAAAAGAGTGTGAGGAAAAACAATGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3'(序列号17)

5'-AAAGAAGTAATGTTTTCTTCATCATCACCTCAGAAAAGATCGCTACGAGTTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3'(序列号18)

PCR产物使用牛克劳斯宾凝胶与PCR清除(NucleoSpin Gel and PCR Clean-up)(宝(TAKARA))进行纯化。转化体的缺失的确认是通过对菌体进行培养并对上清液进行有机酸分析而不再生产乳酸来进行。由此，获得pflB基因及ldhA基因的缺失株(BW25113ΔpflBΔldh)。

6.丙酮酸及丙酮酸衍生物的制造例1

对谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032、ATCC13032Δldh、ATCC13032ΔldhΔppc、ATCC13032ΔldhΔppcΔpoxB分别在5ml的A培养基中进行预培养(试验管)，并将其在放入至2L烧瓶的500ml的A培养基中以33℃、180rpm进行20小时振荡培养(增殖培养)。

培养后，细胞进行离心而去除培养液，并悬浮于50ml的BT液((NH₄)₂SO₄：7g/L、KH₂PO₄：0.5g/L、K₂HPO₄：0.5g/L、MgSO₄·7H₂O：0.5g/L、FeSO₄·7H₂O：6mg/L、MnSO₄·nH₂O：4.2mg/L)中，调整为OD成为100附近(湿菌体重量12(w/v)％)。将其移至装有搅拌器的100ml培养基瓶中，进而加入2.5ml的50％葡萄糖、以及2.5ml的6M NaNO₃(表1中表述为“+NaNO₃”)或2.5ml的水(表1中表述为“-NaNO₃”)的任一者。NaNO₃在培养液中为250mM。

将此培养基瓶放入33℃的恒温槽中静置，一边搅拌一边反应(生产培养)。关于pH，使用pH控制器，利用2.5N KOH调节为pH6.5。

1小时后，取0.5ml反应液进行离心而取上清液，测定所消耗的葡萄糖的量与所生产的有机酸的量。

葡萄糖的测定使用生物传感器BF-7(王子计测机器股份有限公司)进行。有机酸的测定是将TSKgel OA-pack(东曹股份有限公司)的管柱安装于有机酸分析HPLC装置(岛津制作所)来进行。

将结果示于以下的表中。

[表1]

如表1所示，在使用ATCC13032、ldh基因的缺失株(Δldh)、ldh基因及ppc基因的缺失株(ΔldhΔppc)、ldh基因、ppc基因及pox基因的缺失株(ΔldhΔppcΔpox)中的任一棒状细菌的情况下，均为与未添加硝酸钠的情况相比，添加了硝酸钠的情况可增大丙酮酸的生产量及乙酸的生产量。其中，仅ΔldhΔppcΔpox未能通过硝酸钠的添加来生产乙酸，其原因在于缺失了pox基因。关于此结果，根据从葡萄糖经过乙酰CoA生成乙酸的途径(pta-ackA、ctfA)并未启动、以及9成以上的碳以丙酮酸的形式排出来考虑，也示出丙酮酸还原酶(AceEF、Ldh)未发挥作用。消除NADH的蓄积也可通过吹入空气(氧气)来进行，但在此情况下，丙酮酸还原酶会发挥作用，三羧酸(tricarboxylic acid，TCA)循环也会启动。另一方面，通过添加硝酸盐来消除NADH的蓄积可在不启动丙酮酸还原酶的情况下消除NADH的蓄积，就此方面而言是极其优异的方法。

根据添加了硝酸钠的情况下的数据可知以下内容(参照表1的ATCC13032(+NaNO₃)、Δldh(+NaNO₃)、ΔldhΔppc(+NaNO₃)、及ΔldhΔppcΔpoxB(+NaNO₃)的数据)。使ATCC13032的ldh基因缺失后，可进一步增大丙酮酸的生产量。使ldh基因的缺失株(Δldh)的ppc基因缺失后，可进一步增大丙酮酸的生产量。使ldh基因及ppc基因的缺失株(ΔldhΔppc)的pox基因缺失后，可进一步增大丙酮酸的生产量。

7.丙酮酸及丙酮酸衍生物的制造例2

在制造例1中，生产培养是在增殖培养后进行培养液的更换之后进行，但在制造例2中，生产培养通过在增殖培养后不进行培养液的更换而追加葡萄糖及硝酸钠来进行。

对ATCC13032ΔldhΔppcΔpoxB在5ml的A培养基中进行预培养(试验管)，并将其在放入至500mL烧瓶的50ml的A培养基中以33℃、180rpm进行20小时振荡培养(增殖培养)。

培养后，不进行向BT液的置换而移至装有搅拌器的100ml培养基瓶中，进而加入1ml的50％葡萄糖、以及1ml的6M NaNO₃(表2中表述为“+NaNO₃”)或1ml的水(表2中表述为“-NaNO₃”)的任一者。NaNO₃在培养液中为100mM。将此培养基瓶放入33℃的恒温槽中静置，一边搅拌一边反应(生产培养)。关于pH，使用pH控制器，利用2.5N KOH调节为pH6.5。

8小时后，取0.5ml反应液进行离心而取上清液，测定所消耗的葡萄糖的量与所生产的有机酸的量。

将结果示于以下的表中。

[表2]

如表2所示，ldh基因、ppc基因及pox基因的缺失株(ΔldhΔppcΔpox)在添加了硝酸钠的情况下，与未添加硝酸钠的情况相比，可增大丙酮酸的生产量。ΔldhΔppcΔpox未能通过硝酸钠的添加来生产乙酸，但其原因在于缺失了pox基因。

根据此结果可知，在增殖培养与生产培养之间不一定需要进行培养基更换。

8.丙酮酸及丙酮酸衍生物的制造例3

对大肠杆菌BW25113、BW25113ΔpflB、BW25113ΔpflBΔldhA分别在5ml的LB培养基中进行预培养(试验管)，将其在放入至500mL烧瓶的100ml的超级(terrific)培养基(细菌蛋白胨：12g、酵母提取物：24g、甘油：4ml、KH₂PO₄：2.31g、K₂HPO₄：12.54g)中以37℃、180rpm进行20小时振荡培养(增殖培养)。

培养后，细胞进行离心而去除培养液，并悬浮于50ml的BT液中，将浓度调整为OD成为24附近(湿菌体重量3(w/v)％)。将其移至装有搅拌器的100ml培养基瓶中，进而加入1ml的50％葡萄糖、以及1ml的6M NaNO₃(表3中表述为“+NaNO₃”)或1ml的水(表3中表述为“-NaNO₃”)的任一者。NaNO₃在培养液中为120mM。

将此培养基瓶放入37℃的恒温槽中静置，一边搅拌一边反应(生产培养)。关于pH，使用pH控制器，利用2.5N KOH调节为pH6.5。

4小时后，取0.5ml反应液进行离心而取上清液，测定所消耗的葡萄糖的量与所生产的有机酸的量。

将结果示于以下的表中。

[表3]

如表3所示，在使用BW25113、pflB基因的缺失株(ΔpflB)、pflb基因及ldh基因的缺失株(ΔpflBΔldh)中的任一大肠杆菌的情况下，均为与未添加硝酸钠的情况相比，添加了硝酸钠的情况可增大丙酮酸的生产量及乙酸的生产量。

根据添加了硝酸钠的情况下的数据可知以下内容(参照表3的BW25113(+NaNO₃)、ΔpflB(+NaNO₃)及ΔpflBΔldh(+NaNO₃)的数据)。使BW25113的pflB基因缺失后，可进一步增大丙酮酸的生产量。使pflB基因的缺失株(Δpflb)的ldh基因缺失后，可进一步增大丙酮酸的生产量。

<110> 绿色地球研究所株式会社

<120> 经过蓄积NADH的反应途径从起始物质制造目标物质的方法

<130> 18F0420PCT

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sacB 基因的正向引物

<400> 1

ggggaagctt gacgtccaca tatacctgcc 30

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> sacB 基因的反向引物

<400> 2

attcggatcc gtatccacct ttac 24

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ldh 基因的上游的正向引物

<400> 3

gacggccagt gaatttttca tacgaccacg ggcta 35

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ldh 基因的上游的反向引物

<400> 4

gacaatcttg ttaccgacgg 20

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ldh 基因的下游的正向引物

<400> 5

ggtaacaaga ttgtcaccct gcgcgaaatt cagaa 35

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ldh 基因的下游的反向引物

<400> 6

taccgagctc gaattgaact cactgaaaaa tgctg 35

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ppc 基因的上游的正向引物

<400> 7

ccatgattac gaattcggga aactttttta agaaa 35

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ppc 基因的上游的反向引物

<400> 8

taactacttt aaacactctt 20

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ppc 基因的下游的正向引物

<400> 9

tgtttaaagt agttatccag ccggctgggt agtac 35

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ppc 基因的下游的反向引物

<400> 10

taccgagctc gaattgaagt attcaagggg atttc 35

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pox 基因的上游的正向引物

<400> 11

gacggccagt gaaaacgtta atgaggaaaa ccg 33

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pox 基因的上游的反向引物

<400> 12

aattaattgt tctgcgtagc 20

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pox 基因的下游的正向引物

<400> 13

gcagaacaat taattctcga gtcgaacata aggaatattc c 41

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pox 基因的下游的反向引物

<400> 14

taccgagctc gaattttcca ggtacggaaa gtgcc 35

<210> 15

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于清除pflB 基因的正向引物

<400> 15

cgaagtacgc agtaaataaa aaatccactt aagaaggtag gtgttacatg attccgggga 60

tccgtcgacc 70

<210> 16

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于清除pflB 基因的反向引物

<400> 16

ttttactgta cgatttcagt caaatctaat tacatagatt gagtgaaggt tgtaggctgg 60

agctgcttcg 70

<210> 17

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于清除ldhA 基因的正向引物

<400> 17

ctgccgggaa atgactgtcc gcaaggaaaa gagtgtgagg aaaaacaatg attccgggga 60

tccgtcgacc 70

<210> 18

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于清除ldhA 基因的反向引物

<400> 18

aaagaagtaa tgttttcttc atcatcacct cagaaaagat cgctacgagt tgtaggctgg 60

agctgcttcg 70