阅读说明：本技术 一种间歇式流式电转染装置 (Intermittent flow type formula electrotransfection device ) 是由 戴晓兵 沈琦 于 2018-09-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种间歇式流式电转染装置,包括管体,第一电极,第二电极,其特征在于,所述第一电极、第二电极平行处于所述管体的两端管口,所述管体和第一电极、第二电极的内部形成具有容纳目标液体样本的腔体；所述管体设置至少一个液体进出口和至少一个液体进出阀门,所述液体进出阀门位于所述管体的液体进出口处,控制液体进出口的打开和关闭；所述第一电极和/或第二电极能够沿所述管体相对移动。本发明的间歇式流式电转染装置利用压力避免电转染过程产生气泡,提高电转染效率,实现快速处理大量样品。(The invention discloses an intermittent flow type electrotransfection device, which comprises a tube body, a first electrode and a second electrode, and is characterized in that the first electrode and the second electrode are positioned at the tube orifices at two ends of the tube body in parallel, and a cavity for containing a target liquid sample is formed in the tube body, the first electrode and the second electrode; the tube body is provided with at least one liquid inlet and outlet and at least one liquid inlet and outlet valve, and the liquid inlet and outlet valve is positioned at the liquid inlet and outlet of the tube body and used for controlling the opening and closing of the liquid inlet and outlet; the first electrode and/or the second electrode can move relatively along the tube. The intermittent flow type electrotransfection device disclosed by the invention avoids bubbles generated in the electrotransfection process by utilizing pressure, improves the electrotransfection efficiency and realizes the rapid treatment of a large number of samples.)

一种间歇式流式电转染装置

技术领域

本发明涉及电转染领域，涉及一种间歇式流式电转染装置，更具体而言，本发明涉及一种通过电极移动加压的方式抑制电转染产生气泡的间歇式流式电转染装置。

背景技术

细胞膜是包围在细胞外周的一层薄膜，是细胞与外界进行选择性物质交换的通透性屏障。细胞膜使细胞成为一个独立的生命单位，并拥有一个相对稳定的内环境。周围环境中的一些物质可以通过细胞膜，其它的物质则不行。细胞可以通过细胞膜从周围环境摄取养料，排出代谢产物，使物质的转运达到平衡状态。所以，细胞膜的基本功能就是维持细胞内微环境的相对稳定并有选择地与外界环境进行物质交换。

研究发现，如果对细胞施加一定强度的电刺激并持续一段时间，就可以诱导细胞膜上产生一些微孔，使细胞的通透性增强，所谓细胞电穿孔(Electroporation)就是指细胞在外加脉冲电场的作用下，细胞膜脂双层上形成瞬时微孔的生物物理过程。电转染(Electrotransfection)是利用电穿孔技术将外源的生物大分子，如DNA、RNA或蛋白质导入细胞的技术。当细胞膜发生电穿孔时，其通透性和膜电导会瞬时增大，使亲水分子、DNA、蛋白质、病毒颗粒、药物颗粒等正常情况下不能通过细胞膜的分子得以通过微孔进入细胞。在短时间内撤除电刺激后，细胞膜上微孔消失，细胞膜重新成为选择性通透屏障。与传统的化学转染和病毒转染相比，由于电转染具有无化学污染、不会对细胞造成永久性损伤、效率较高等优点，在生物物理学、分子生物学、临床医学等领域有着广阔的应用前景。

虽然电转染作用的机理并不完全清楚，但在本文中细胞电转染是公知的，包括细胞膜脂双层的移动，导致在膜上形成暂时性的微孔，允许外源性分子通过微孔进入细胞。

现有技术中，主要有三类方法来完成细胞电转染的过程：

将细胞放置于一对相距数毫米至数厘米的平行电极之间。使细胞在电极之间的电场中受到电刺激，以实现电转染的目的。例如，美国专利US5389069。

使用微型针状电极扎入组织或细胞液中对细胞进行电击，达到电转染的目的。例如，美国专利US5389069。

将一个腔室放置在一对平行电极之间，使得细胞的悬浮溶液在腔室中流动的同时受到电击。例如，美国专利US6773669。

中国专利CN201010242144公开了一种流式电转染装置及系统，该系统包括：流式电转染装置，其中包括：基板，以及制作在基板上的电极，所述的电极，是平行并成对放置的，每对电极包括相对设置的阳极和阴极；置于电极之上的限制流体流动的通道；所述通道起始端具有多个入口分支通道，并汇聚成一条主通道，结束端具有多个出口分支通道，所述通道上方设置具有多个流体入口及出口的顶盖；注射泵，由管道连接到所述流式电转染装置中顶盖的入口及出口控制流体的流速；电压源，由电连接件连接电极设定并产生脉冲电压。流式电转染系统利用流体通道以及相连接的注射泵来实现各种悬浮液在流体通道中的连续流动，从而使细胞被电转染的过程能够持续进行，实现快速处理大量样品。

中国专利CN201610806987公开了用于细胞的电转染的一次性用品，其包括：在所述一次性用品的内部的流体隔室；第一流体端口，其用于向所述流体隔室提供细胞悬液；以及第二流体端口，其用于将包括待被电转染到所述细胞中的至少一种化合物的流体递送至所述流体隔室；设置在所述流体隔室中的第一电极和第二电极；至少一个出口端口，其递送来自所述流体隔室的所述流体，其中所述第一流体端口和所述第二流体端口与混合通道流体连通，所述混合通道与所述流体隔室流体连通。

但是上述公开的流式电转染装置在实际电转染过程中均会产生大量气泡，产生的气泡附着在电极板上影响电场均匀性，从而导致电转染效果不稳定。发明人经过检索发现，在流式电转染领域还没有解决电转染过程产生气泡的技术问题。

本发明是针对上述现有的技术存在的技术问题，提供了一种通过可移动的电极加压的方式，抑制电转染过程中产生气泡的间歇式流式电转染装置。本发明的另一目的是提高电转染装置的稳定性，提高电转染的效率。

为了达到上述目的，本发明所提供的间歇式流式电转染装置的技术方案概述如下：一种间歇式流式电转染装置，包括管体，第一电极，第二电极，其特征在于，所述第一电极、第二电极平行处于所述管体的两端管口，所述管体和第一电极、第二电极的内部形成具有容纳目标液体样本的腔体；所述管体设置至少一个液体进出口和至少一个液体进出阀门，所述液体进出阀门位于所述管体的液体进出口处，控制液体进出口的打开和关闭；所述第一电极和/或第二电极能够沿所述管体相对移动。

优选，所述管体设置通气管，通气管设置通气阀门，进一步优选所述通气管与管体连接处设置通气阀门，所述通气管位于所述第一电极和第二电极之间，所述通气管的末端设置空气过滤装置。

优选，所述管体设置至少两个液体进出口，所述液体进出口既可以是液体进口，也可以是液体出口，相应的设置至少两个液体进出阀门；所述液体进出阀门既可以是液体进样单向阀，也可以是液体出样单向阀；进一步优选所述管体设置至少一个液体进口和一个液体出口，至少一个液体进样单向阀和一个液体出样单向阀；

优选，所述第一电极和第二电极的横截面与所述管体内部的横截面相同或接近，进一步优选所述管体内部的横截面的形状为方形，也可以设置成圆形或其它的形状；

优选，所述第一电极和第二电极与管体接触处设置密封装置，所述密封装置优选密封垫圈、密封胶条或其它具有密封性能的装置等；

优选，当所述液体进出阀门和通气阀门关闭时，所述管体和第一电极、第二电极的内部形成密闭式腔体；

优选，当所述液体进出阀门和通气阀门关闭时，所述第一电极和/或第二电极相对管体移动后，所述密闭式腔体内部的压力值为1.0-2.5Mpa；进一步优选所述腔体内部的压力值为1.1-2.0Mpa；进一步优选所述腔体内部的压力值为1.2-1.5Mpa；

优选，所述装置还包括导管若干，分为进液管和出液管，导管与管体密封设置；

优选，所述装置还包括泵，用于使液体流出或流入腔体，或者用于排出或充入腔体内的气体，泵的种类包括但不限于蠕动泵，气泵，液泵，注射泵等；

优选，所述装置还包括使所述第一电极和/或第二电极能够沿所述管体相对移动的加压装置，所述加压装置的种类包括但不限于气囊、液压杆、气压杆、螺旋加压装置、电磁力加压装置等；

优选，所述第一电极和/或第二电极设置工作位置和非工作位置，所述电极从非工作位置移动到工作位置，能够为腔体内部提供压力；进一步优选所述液体进出口位于所述第一电极和第二电极之间。进一步优选所述液体进出口位于所述第一电极和/或第二电极设置的工作位置和非工作位置之间。

优选，所述第二电极固定设置于管体的一端管口。

本发明所述装置的制备方法，首先制备管体，选择能够加热后固化的塑料作为管体的材料，利用制备管体的模具制备管体，在管体上分别设置液体进样口和液体出样口，在管体两端各设置一个相对平行的电极，电极为两片相同形状、大小的金属片注塑于塑料框内，为第一电极和第二电极。在电极不接触腔体的一侧与加压装置连接，电极塑料框四周设置软性胶条。将第二电极固定安装、第一电极与加压装置连接，使第一电极可以在加压装置产生的压力下产生位移；或者将第一电极和第二电极分别与加压装置连接，使第一电极和第二电极都可以在加压装置产生的压力下产生位移。

本发明技术方案带来的有益效果：

本发明的间歇式流式电转染装置能够处理大量液体样品。

本发明的间歇式流式电转染装置在电转染过程中对液体加压，抑制气泡产生，减小因气泡附着导致的电转染效率波动，提高电转染装置的稳定性。

本发明的间歇式流式电转染装置结构设计新颖，具有开创性。

附图说明

图1本发明间歇式流式电转染装置示例图；

图2本发明间歇式流式电转染装置示例图；

附图注释：1-第一电极，2-第二电极，3-管体，4-进液管，5-出液管，6-加压装置，7-第一电极非工作位置，8-第一电极工作位置，9-第二电极非工作位置，10-第二电极工作位置，11-进样单向阀，12-出样单向阀，13-通气管，14-通气阀门。

实施方式

实施例一

整体结构设计(一)

本发明提供的间歇式流式电转染装置整体结构如图1所示，所述管体(3)的两端管口封端密封设置，其中管口一封端采用第二电极(2)作为密封设置，管口另一封端采用第一电极(1)作为密封设置，所述管体(3)设置通气管(13)，所述通气管(13)与管体(3)连接处设置通气阀门(14)。所述第一电极(1)在管体(3)中设置工作位置(8)和非工作位置(7)，第一电极(1)与加压装置(6)连接，加压装置(6)优选液压杆，加压装置(6)能够推动第一电极(1)从非工作位置(7)移动到工作位置(8)，使腔体内部承载的液体承受一定的压力。在第一电极(1)和第二电极(2)上施加电脉冲，电脉冲使腔体内形成电场，使得细胞膜形成微孔，从而使液体样本内的目标物质能够进入细胞中。电转染完成后，加压装置(6)能够将第一电极(1)从工作位置(8)拉回至非工作位置(7)。重复上述操作进行间歇式流式电转染。

实施例二

整体结构设计(二)

本发明提供的间歇式流式电转染装置整体结构如图2所示，所述管体(3)的两端管口封端分别采用第一电极(1)和第二电极(2)密封设置，其中第一电极(1)、第二电极(2)与加压装置(6)连接，加压装置(6)优选液压杆。所述管体(3)设置通气管(13)，所述通气管(13)与管体(3)连接处设置通气阀门(14)。第一电极(1)在管体(3)中设置工作位置(8)和非工作位置(7)，第二电极(2)在管体中设置工作位置(10)和非工作位置(9)。根据第一电极(1)和第二电极(2)的相对移动情况，可以设置以下三种工作状态。

第一种工作状态，两端管口的加压装置(6)推动第一电极(1)、第二电极(2)从非工作位置(7)(9)移动到工作位置(8)(10)，使腔体内部的液体承受一定的压力，此时在第一电极(1)和第二电极(2)上施加电脉冲，电脉冲使腔体内形成电场，使得细胞膜上形成微孔，从而使液体样本内的目标物质能够进入细胞中。电转染完成后，加压装置(6)能够将第一电极(1)、第二电极(2)从工作位置拉回至非工作位置。

第二种工作状态，第二电极(2)在非工作位置(9)固定，加压装置(6)推动第一电极(1)从非工作位置(7)移动到工作位置(8)，使腔体内部的液体承受一定的压力，此时在第一电极(1)和第二电极(2)上施加电脉冲，电脉冲使腔体内形成电场，使得细胞膜上形成微孔，从而使液体样本内的目标物质能够进入细胞中。电转染完成后，加压装置(6)能够将第一电极(1)从工作位置(8)拉回至非工作位置(7)。

第三种工作状态，第一电极(1)在非工作位置(7)固定，加压装置(6)推动第二电极(2)从非工作位置(9)移动到工作位置(10)，使腔体内部的液体承受一定的压力，此时在第一电极(1)和第二电极(2)上施加电脉冲，电脉冲使腔体内形成电场，使得细胞膜具有通透性，从而使液体样本内的目标物质能够进入细胞中。电转染完成后，加压装置(6)能够将第二电极(2)从工作位置(10)拉回至非工作位置(9)。

实施例三

液体间歇式进液方式

进液时，进样单向阀(11)打开，出样单向阀(12)关闭，打开通气阀门(14)，用气泵通过通气管(13)抽出与管体(3)等体积的气体，目标液体样本从进液管(4)进入腔体内部；或者不使用气泵通过通气管(13)抽出与管体(3)等体积的气体，利用蠕动泵将目标液体样本从进液管(4)压入腔体内部；腔体充满后，关闭进样单向阀(11)和通气阀门(14)。

电转染完成后，打开出样单向阀(12)与通气阀门(14)，用气泵通过通气管(14)向管体充入与腔体等体积的气体，目标液体样本从出液管(5)排出；或者不使用气泵通过通气管(14)向腔体充入与管体等体积的气体，借助重力将目标液体样本从出液管(5)排出；目标液体样本完全排出后，出样单向阀(12)关闭，进样单向阀(11)打开，并重复以上进液的动作。

实施例四

腔内液体加压方式

目标液体通过进样单向阀(11)进入并充满腔体后，进样单向阀(11)关闭，此时通过加压装置(6)对第一电极(1)和/或第二电极(2)施加特定的压力，使其从非工作位置(7)(9)移动到工作位置(8)(10)，完成对液体的加压，液体的电转染在加压状态进行。

实施例五

生物测定(一)

收集处于对数生长期的CHO-S细胞(中国仓鼠卵巢细胞)，转速1000转/分离心5分钟，弃上清，用电转染缓冲液重悬细胞，使得细胞的密度为1X10⁷个/ml，加入需要电转染转入细胞的质粒pCDNA3.1-GFP，使质粒的浓度为20ug/ml，轻柔混合均匀。使用的间歇式流式电转染装置如图1所示，所述管体的两端管口封端分别采用第一电极和第二电极密封设置，第一电极与液压杆连接。在液体进入腔体前，进样单向阀打开，出样单向阀关闭，打开通气阀门，用气泵通过通气管抽出与管体等体积的气体，目标液体样本从进液管进入腔体内部；腔体充满后，关闭进样单向阀和通气阀门。使第一电极保持在非工作位置，液体不加压。此时在第一电极和第二电极上施加电脉冲，脉冲电压180伏特，脉冲宽度6毫秒，脉冲次数2次，脉冲间隔1秒，电脉冲使腔体内形成电场，使得细胞膜形成微孔，从而使液体样本内的目标物质能够进入细胞中。电转染完成后，打开出样单向阀与通气阀门，用气泵通过通气管向管体充入与腔体等体积的气体，目标液体样本从出液管排出。将转染后的细胞悬液置于离心管内，1000转/分钟，离心5分钟。弃上清，加入CD-OptiCHO培养基重悬细胞，接种与三角锥形瓶内培养，培养密度2×10⁶/ml,然后置于摇床上培养，摇床转速125rpm/min，培养条件：温度37℃，二氧化碳浓度5％。24小时后在荧光显微镜下观察，并用流式细胞仪检测电转染效率和细胞存活率。

实施例六

生物测定(二)

收集处于对数生长期的CHO-S细胞(中国仓鼠卵巢细胞)，转速1000转/分离心5分钟，弃上清，用电转缓冲液重悬细胞，使得细胞的密度为1X10⁷个/毫升，加入需要电转染转入细胞的质粒pCDNA3.1-GFP，使质粒的浓度为20ug/ml，轻柔混合均匀。使用的间歇式流式电转染装置如图1所示，所述管体的两端管口封端分别采用第一电极和第二电极密封设置，第一电极与液压杆连接。在液体进入腔体前，进样单向阀打开，出样单向阀关闭，打开通气阀门，用气泵通过通气管抽出与管体等体积的气体，目标液体样本从进液管进入腔体内部；腔体充满后，关闭进样单向阀和通气阀门。液压杆推动第一电极从非工作位置移动到工作位置，使腔体内部的液体承受一定的压力。此时在第一电极和第二电极上施加电脉冲，脉冲电压180伏特，脉冲宽度6毫秒，脉冲次数2次，脉冲间隔1秒，电脉冲使腔体内形成电场，使得细胞膜形成微孔，从而使液体样本内的目标物质能够进入细胞中。待电转染完成后，液压杆能够将第一电极从工作位置拉回至非工作位置。电转染完成后，打开出样单向阀与通气阀门，用气泵通过通气管向管体充入与腔体等体积的气体，目标液体样本从出液管排出。将转染后的细胞悬液置于离心管内，1000转/分钟，离心5分钟。弃上清，加入OptiCHO培养基重悬细胞，接种与三角锥形瓶内培养，培养密度2×10⁶/ml,然后置于摇床上培养，摇床转速125rpm/min，培养条件：温度37℃，二氧化碳浓度5％。24小时后在荧光显微镜下观察，并用流式细胞仪检测电转染效率和细胞存活率。

实验结果观察：

实验五中能明显观察到，在脉冲过后，腔体内出现少量气泡，而实验六中腔体内仍然充满液体，并无气泡产生。

24小时后检测到实验五细胞染转率为61％-63％，细胞存活率为70％-81％；实验六细胞转染率83-％87％，细胞存活率为81％-84％。

综上可见，本发明提供的加压腔体能够提高电转染效率，降低气泡产生的效果明显。

虽然已详细描述本发明，但是在本发明的精神和范围内的修改对于本领域技术人员将是显而易见的。应当理解以上叙述的和/或在所附的权利要求书中的本发明的方面和各种实施方案的部分以及各种特征可进行组合或全部或部分进行互换。如本领域技术人员将意识到的，在前述各种实施方案的描述中，指代另一实施方案的那些实施方案可适当地与其它实施方案组合。此外，本领域普通技术人员将意识到前述描述是仅作为举例，且不意欲限制本发明。