本发明公开了一种Nluc标记的重组猪δ冠状病毒感染性克隆质粒构建及其应用,针对猪δ冠状病毒,采用BAC系统和CRISPR/Cas9技术相结合的方式,基于已构建成功的PDCoV感染性克隆质粒,先通过CRISPR/Cas9切割PDCoV感染性克隆质粒,再通过同源重组方式获得Nluc基因替换NS6基因的重组质粒,转染细胞后拯救出稳定表达Nluc的重组病毒,通过药物实验证实该重组病毒可为抗猪δ冠状病毒药物的筛选研究提供非常有价值的技术工具。

本发明公开了基于Cre-FloxP系统的CNN3基因敲除小鼠模型的构建方法,方法包括：在CNN3基因的第二外显子的两边分别插入FloxP基因片段,构建Cas9/gRNA靶点并构建同源重组模板,将同源重组模板与所述供体DNA一起显微注射到小鼠的受精卵中得到创始Cnn3-FloxP小鼠,并与雌鼠进行交配后自交,得到稳定遗传的纯合子CNN3～(fl/fl)小鼠；将所述纯合子CNN3～(fl/fl)小鼠与组织特异性表达的Cre小鼠交配后进行自交,经基因鉴定筛选出基因型为Cre～(+/-)/CNN3～(fl/fl)小鼠。本发明设计基因技术领域,可高效构建得到特异性组织或特异性细胞CNN3基因敲除的小鼠,大幅提高了选择性敲除CNN3小鼠模型的构建效率及构建成功率。

本发明提供了一种确定长链非编码核糖核酸相互作用蛋白的新方法。本发明提供了由BASU和dCasRx形成的融合蛋白、用于表达所述融合蛋白的哺乳动物表达载体。本发明确定lncRNA相互作用蛋白的方法包括：通过将表达所述融合蛋白的哺乳动物表达载体和特异的靶向目标lncRNA的gRNA共转染到靶细胞中,使BASU对附近的效应蛋白进行特异的生物素化标记；使用链霉素亲和偶联的磁珠分离生物素化的蛋白质,然后进行洗脱,胰蛋白酶消化和质谱的无标记定量分析。本发明可以高度可信地确定与lncRNA相互作用的蛋白质。

本发明公开了一种辅酶Q10的高表达重组菌株的构建方法及应用,包括以下步骤,S1：以类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides2,4,1)为出发菌,提取其基因组DNA为目的基因；S2：将所述目的基因进行PCR同源扩增；S3：获得的PCR扩增产物经引物整合至载体pKLAC2中得外源目的基因；S4：以乳酸克鲁维酵母菌(Kluyveromyces lactis GG799)为宿主菌,将所述外源目的基因组整合至所述乳酸克鲁维酵母菌的染色体LAC4位点上得到高表达重组菌株。本发明效果：一是本发明以PCR介导的同源置换,整合片段不需通过酶切,只需通过一对含有同源整合位点的引物,以含有目的基因的载体位模板,通过PCR就可简单的高拷贝扩增目的基因组；二是获得的高表达重组菌株在高产量的同时具有高遗传稳定性。

本发明公开EYFP敲入到Et.Actin基因的鸡柔嫩艾美尔球虫虫株的制备。该专利将FnCas12a蛋白,体外合成的crRNA和同源重组片段(含有P2A-DHFR-EYFP表达框的Et.Actin基因)利用Lonza 4D-Nucleofector核转仪导入鸡柔嫩艾美尔球虫子孢子,实现对鸡柔嫩艾美尔球虫的编辑。将编辑虫株经过鸡体内乙胺嘧啶筛选,获得高纯度的基因编辑虫株。然后,利用PCR和Sanger测序技术对基因编辑虫株进行验证,证明EYFP成功标记了Et.Actin基因。通过细胞培养该虫株的子孢子并感染鸡后,取盲肠粘膜并涂片显示该EYFP在基因编辑虫株的整个生活史中都有表达。此基因编辑方法能够对鸡球虫的基因进行定点标记,有助于解析球虫基因的功能。本专利对新型抗球虫药物和疫苗的研发也具有重要意义。

一种基因敲入方法,是向基因组DNA的靶部位敲入外源性DNA的方法,包括向细胞导入包含所述外源性DNA的供体DNA以及以Cas9蛋白质和其向导RNA作为构成要素的CRISPR－Cas9系统的工序,所述供体DNA从5’侧依次包含由可通过微同源介导的连接与所述基因组DNA的所述靶部位的5’侧的第1核苷酸序列连接的第1’核苷酸序列构成的5’－微同源区域、所述外源性DNA、由可通过微同源介导的连接与所述基因组DNA的所述靶部位的3’侧的第2核苷酸序列连接的第2’核苷酸序列构成的3’－微同源区域,所述CRISPR－Cas9系统是如下系统：将所述基因组DNA中的所述靶部位与第1核苷酸序列之间的第1被切断区域以及所述靶部位与第2核苷酸序列之间的第2被切断区域切断,并且将所述供体DNA中的所述5’－微同源区域的5’侧的第3被切断区域、所述外源性DNA与所述5’－微同源区域之间的第4被切断区域、所述外源性DNA与所述3’－微同源区域之间的第5被切断区域以及所述3’－微同源区域的3’侧的第6被切断区域切断；在所述基因组DNA的第1核苷酸序列与第2核苷酸序列之间插入所述外源性DNA。

公开了可用于免疫治疗的具有被抑制的自噬基因的淋巴细胞。淋巴细胞可表达抗原靶向受体,例如嵌合抗原受体(CAR)或者内源性或经改造T细胞受体,以靶向表达肿瘤特异性抗原的细胞。公开了制备和使用这样的淋巴细胞的方法。一些这样的淋巴细胞可用于进行CAR-T或TCR-T治疗。

本发明公开了一种目的基因多拷贝整合到酿酒酵母染色体rDNA的方法,是将待转化的酿酒酵母先在含有羟基脲的培养基上进行预培养,然后再通过常规转化方法将两端带有rDNA同源序列的DNA片段转入酿酒酵母,最后在筛选培养基上筛选转化子实现。本发明方法利用rDNA拷贝动态平衡的特点,建立了一次转化过程即在rDNA上整合了18个拷贝目的基因的方法。该方法以rDNA为整合靶点,操作便捷,无需额外引入除了重组DNA片段之外的其他DNA；并且,由于其所依赖的特殊机制,理论上可以和现有其他各种高拷贝重组方法联用,实现目的基因更高拷贝的整合,为基因编辑又提供了一种方法和有力的工具。

本发明提供了一种近乎完整染色体倒置的平衡染色体以及具有平衡染色体动物模型的构建方法,使用位点特异性重组酶系统介导的重组技术,在染色体着丝粒侧插入片段1,包括位点特异性重组酶系统一侧识别位点,该位点的上游具有正选择标记基因表达元件片段A；在端粒侧插入片段2,包括位点特异性重组酶系统另侧识别位点,该位点的上游具有反向的正选择标记基因表达元件片段B,经相应的位点特异性重组酶诱导实现两个位点特异性重组酶系统识别位点之间的序列倒置,正选择标记基因表达元件片段A和B组合实现正选择标记基因的表达,利用正负筛选法筛选得到平衡染色体。本发明所述方法可用于建立所有染色体近乎全部倒置的平衡染色体动物品系。

本发明属于生物医药技术领域,公开了一种用于药物代谢研究的CYP酶人源化大鼠动物模型的构建方法及其应用。所述构建方法包括基因型鉴定,人源基因表达鉴定,人源基因功能验证。本发明首先利用CRISPR系统进行CYP酶人源化大鼠的构建,包括基因编辑靶点的选择、sgRNA与Cas9 mRNA的体外合成与转录、同源重组模板构建、假孕母鼠的制备、单细胞胚胎的体外显微注射与移植、大鼠的繁殖,最后得到纯合子CYP基因人源化大鼠。然后对纯合子人源化大鼠从蛋白水平进行CYP酶表达检测,以及进行其代谢功能验证,以证明该CYP人源化大鼠构建成功。本发明构建的CYP1A2人源化大鼠具有和人更相似的代谢特征,消除了大鼠与人之间CYP1A2介导药物代谢的种属差异,为CYP介导的药物代谢研究提供了新的大鼠动物模型。