本发明公开了hACE2人源化转基因猪的构建方法及应用。采用CRISPR-Cas9基因编辑技术,用hACE2cDNA替换猪自身的ACE2基因,避免了人源ACE2表达的同时猪内源ACE2也表达,由此造成猪模型无法很好地再现人类疾病特征的问题。本发明构建的hACE2人源化猪模型是能够模拟人类COVID-19临床症状和治疗反应的理想大动物猪模型,可用于SARS-CoV-2感染和发病机制的研究,特别适合于由SARS-CoV-2感染所致的多器官病症、重症、慢性疾病以及后遗症的研究,并可供诊断技术、抗病毒疗法和疫苗的开发与测试,候选药物疗效和安全性的评价,该模型有助于解决当前缺乏有效新冠肺炎动物模型的困境。

本发明公开了一种提高卵母细胞体外成熟质量的添加剂,通过向体外卵母细胞培养液中添加PF4蛋白添加剂来提高卵母细胞体外培养的质量。通过提高卵母细胞体外培养的质量,进而应用在卵母细胞体外成熟、体细胞克隆技术、孤雌胚胎领域上。一方面能促进各物种卵母细胞的体外成熟,并能制备质量更优的体外受精胚胎和克隆胚胎,有助于人类辅助生殖的卵母细胞体外成熟培养；另一方面制备的优质胚胎与其产生的动物用于医学、生命科学、畜牧业等领域的研究,进一步推进生产实践的发展。

本发明涉及基因编辑领域,具体涉及一种载体系统、制备猪成纤维细胞和基因编辑猪的方法。所述载体系统包括CD163基因敲除载体和MSTN基因敲除载体,所述CD163基因敲除载体包括载体骨架以及连接到该载体骨架上的核苷酸序列SEQ ID NO：1；所述MSTN基因敲除载体包括载体骨架以及连接到该载体骨架上的核苷酸序列SEQ ID NO：2。本发明载体系统和方法具有降低基因操作难度、提高敲除效率,在短时间内快速将CD163基因和MSTN基因敲除的优点。本发明方案无需药物筛选,不带有外源筛选标记,具有较为简便的细胞筛选流程。可以一次性获得双基因缺失的细胞系,大大缩短了双/多基因编辑动物的制备流程。