一个改良棉花产量性状的糖苷水解酶基因和启动子及其应用

文档序号：81229 发布日期：2021-10-08 浏览：35次 >En<

阅读说明：本技术 一个改良棉花产量性状的糖苷水解酶基因和启动子及其应用 (Glycoside hydrolase gene and promoter for improving yield traits of cotton and application thereof ) 是由张天真韩泽刚何璐胡艳方磊于 2021-06-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一个改良棉花产量性状的糖苷水解酶基因及其启动子及其应用。该基因GHLP1基因组序列为：SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.12,启动子序列为：SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.13。基因GHLP1的外显子区域包含一个非同义突变的单核苷酸多态性位点,位于编码区序列的1174bp位置处,该位点碱基是T或G,对应的氨基酸为Ser或Arg；同时该基因上游471bp的启动子区域中包含一个单核苷酸多态性变异位点,该位点碱基是A或C。该基因启动子区域的单核苷酸多态性变异与棉花衣分性状和籽指性状密切关联,并且启动子单倍型CC的棉花品种(系)的产量性状显著优于单倍型AA的棉花材料。该基因在高效鉴定高产陆地棉品种、提升棉花产量性状以及培育棉花高产新品种中具有重要的研究价值和应用前景。(The invention discloses a glycoside hydrolase gene for improving yield traits of cotton, a promoter thereof and application thereof. The genome sequence of the gene GHLP1 is as follows: SEQ ID No.2 or SEQ ID No.12, the promoter sequence is: SEQ ID NO.3 or SEQ ID NO. 13. The exon region of the gene GHLP1 contains a single nucleotide polymorphism site with non-synonymous mutation, which is positioned at the position of 1174bp of the coding region sequence, the base of the site is T or G, and the corresponding amino acid is Ser or Arg; meanwhile, the promoter region of 471bp upstream of the gene contains a single nucleotide polymorphism variation site, and the base of the site is A or C. The single nucleotide polymorphism variation of the gene promoter region is closely related to the coat division character and the seed finger character of cotton, and the yield character of the cotton variety (line) of the promoter haplotype CC is obviously superior to that of the cotton material of the haplotype AA. The gene has important research value and application prospect in efficiently identifying high-yield upland cotton varieties, improving the yield characters of cotton and cultivating high-yield new varieties of cotton.)

技术领域

本发明属于生物技术应用领域，涉及一个与棉花产量性状相关的糖苷水解酶基因及其启动子。

背景技术

棉花作为天然纤维的主要来源，是一种重要的经济作物。棉花生产不仅对我国农业乃至国民经济的发展有着重要的影响，而且在世界棉花贸易市场上也起着举足轻重的作用。此外，棉花纤维是优良的、使用最为广泛的天然纤维，更是纺织工业的重要原材料，在国民经济发展中具有举足轻重的地位。随着人们生活水平的提高，对天然纯棉织物的需求不断增加，对纤维品质的要求也愈来愈高。因此，深入挖掘和利用棉花品质相关的遗传变异就显得格外重要。

全基因组关联分析(Genome-wide association study；GWAS)是以基因组中数以百万计的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)为分子遗传标记，进行全基因组水平上的相关性分析，通过比较发现影响复杂性状的基因变异的一种新策略。随着基因组测序技术的提高及测序成本的降低，并结合生物信息学的高度发展，GWAS成为挖掘和剖析人类疾病及作物农艺性状及抗性性状基因及其相关遗传机制最有效的方法之一。利用全基因组关联分析挖掘和克隆农艺性状相关基因，无需事先假定候选基因，其检测能力强，精度高，是分子育种研究的热点。Belo等(2008)对553份优良自交系的8,950的SNP进行了GWAS分析，鉴定出与油酸含量相关的位点，这是玉米首次真正意义上的全基因组关联分析。Huang等(2011)利用第二代测序技术对517份水稻地方种进行了重测序并获得上百万的SNP，然后对水稻的14个农艺性状进行GWAS分析，并成功鉴定出80个性状关联的位点。此外，他们还对多达950份水稻群体进行重测序，对开花期和10个产量相关性状进行GWAS分析，鉴定出了很多已知功能基因(Huang et al.2012)。Lin等(2014)对世界各地的360份番茄种质进行全基因组重测序，通过群体分化分析，首次发现决定粉果果皮颜色的关键变异位点，即SlMYB12基因启动子区域的603bp缺失，进而抑制该基因的表达，从而使得成熟的粉果番茄果皮中不能积累类黄酮，导致鲜食番茄和加工番茄的差异。Zhou等(2015)对302份大豆野生、地方品种以及改良品种进行重测序，结合GWAS分析技术，发现96个GWAS关联位点与之前报道的QTL有关联，并鉴别出含油量、株高和茸毛生成相关的新的关联位点。Fang等(2017)通过对318份陆地棉材料进行全基因组重测序，鉴定出25个棉花改良过程中的选择信号，通过GWAS分析，共鉴定出119个关联位点，其中产量相关的关联位点71个，纤维品质相关的位点45个，还有3个位点与黄萎病抗性相关(Fang et al,2017)。Ma等(2018)重测序分析419个核心种质的陆地棉材料，发现7383个SNP与这些性状显著相关，位于4820个基因内或基因附近。并且对控制开花，影响纤维长度，纤维强度的部分候选基因进行了重点分析(Ma et al.,2018)。Liu等(2021)则利用290份陆地棉栽培种组成的自然群体经过多年田间鉴定，结合高密度的SNP标记对棉花枯萎病抗性进行了全基因组关联分析，鉴定得到主效抗病位点Fov7，并确定基因GhGLR4.8是一种新的植物非典型主效抗病基因(Liu et al.,2021)。以上结果充分说明，全基因组关联分析具有很高的定位精度，甚至可以达到单基因的水平，利用获得的与目标性状相关的功能标记，进行目标性状的筛选，可以大大加快育种进程和效率。

植物糖苷水解酶(Glycosyl hydrolase)，在生物体糖和糖缀合物的水解与合成过程中扮演着重要角色，他们能够参与植物生长发育及对环境应答反应的多种信号传导过程，在植物生命活动中发挥着重要的生物学功能(刘莉,2010)。其中1,4-β-内切木聚糖酶(Endo-1,4-beta-xylanase)是使木聚糖完全水解最关键的酶，其可以作用于木聚糖主链的木聚糖苷键，随机切断主链内的糖苷键，水解木聚糖而生成分子量大小不同的寡糖(张迎春，2020)。木聚糖酶在种子萌发、植物授粉、果实成熟软化以及茎杆发育过程中发挥重要作用(王庆东，2020)。

发明内容

本发明的目的是提供一个糖苷水解酶基因lint percentage related(GHLP1)及其启动子。全基因组关联分析结果表明该基因及其启动子与棉花衣分性状密切相关。

本发明的另一目的是提供该基因及其启动子的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

糖苷水解酶(Glycosyl hydrolase)基因GHLP1，其隶属于木聚糖酶类中的1,4-β-内切木聚糖酶(Endo-1,4-beta-xylanase)。所述的糖苷水解酶基因GHLP1在四倍体陆地棉TM-1中的cDNA序列为：SEQ ID NO.1，基因组序列为：SEQ ID NO.2，启动子序列为：SEQ IDNO.3；所述的糖苷水解酶基因GHLP1上含有SNP位点，位于编码区序列的1174bp位置处，该SNP位点碱基从T突变为G(cDNA序列：SEQ ID NO.11，基因组序列：SEQ ID NO.12)，对应的氨基酸从Ser突变为Arg；同时该基因上游471bp的启动子区域中包含一个SNP位点，该SNP位点碱基从A突变为C(基因组序列：SEQ ID NO.13)。并且基因型为CC的棉花品种的衣分、籽指等产量性状均显著高于基因型为AA的棉花品种。

本发明所述的糖苷水解酶基因GHLP1及其启动子在鉴定高产陆地棉品种中的应用。若待测棉花的基因组包含所述的糖苷水解酶基因GHLP1的启动子的基因型为C即鉴定为高产陆地棉品种。

本发明所述的糖苷水解酶基因GHLP1及其启动子在改良棉花产量性状中的应用。

本发明所述的糖苷水解酶基因GHLP1及其启动子在通过基因工程手段培育棉花高产新品种中的应用。具体为：

通过将低产陆地棉品种基因组GHLP1启动子单倍型AA中的SNP位点进行定点突变，改造成高产单倍型从而培育高产棉花新品种，改良棉花产量性状。

本发明还提供了一种用于检测GHLP1启动子的SNP位点的引物对，上游引物为：SEQID NO.8，下游引物为：SEQ ID NO.9。

所述的引物对在筛选高产棉花品种中的应用。

一种筛选高产棉花品种的方法，检测所述的一个SNP位点，选择该基因上游启动子序列的471bp位置上的碱基为C的棉花即为高产棉花品种，其扩增产物序列如SEQ ID NO.10所示。

本发明的优点表现在：

本发明通过棉花品种群体重测序和全基因组关联分析挖掘了一个与棉花衣分性状密切关联的糖苷水解酶基因GHLP1。本发明的糖苷水解酶基因GHLP1及其启动子在全基因组关联分析中与棉花衣分性状密切相关。本发明提供的GHLP1 cDNA、基因组序列及其两千碱基对的启动子序列由PCR技术获得，该技术具有起始模板量小，试验步骤简单易行而且灵敏度高的优点。

GHLP1在棉花不同组织和发育时期的表达水平分析由转录组测序所得。该基因在棉花开花前-3天、-1天、0天的胚珠，开花后1天、3天、5天、10天、20天、25天胚珠种子中优势表达，表明该基因与棉花的产量性状有关。

GHLP1在相对高产和低产品种群体中的SNP基因型通过PCR技术进行了验证，易操作、灵敏度高且准确性好。

根据GHLP1的不同SNP基因型可以将品种群体分为两大类，即单倍型为CC和单倍型为AA。统计学分析方法发现，这两类群体之间的衣分、籽指均存在显著性差异，进一步证明该基因与棉花产量性状之间的相关性。

GHLP1的不同SNP基因型在泗棉3号(单倍型为CC)和新陆早42号(单倍型为AA)中的胚珠、纤维组织中的相对表达量存在差异，特别是在高衣分的泗棉3号的20天的胚珠组织中，其相对表达量显著高于低衣分的新陆早42号。

附图说明

图1.棉花衣分性状GWAS关联分析结果。

横坐标表示染色体上的位置(Mb)，纵坐标表示SNP位点关联的显著性，用-log₁₀(Pvalue)表示。

图2.棉花衣分性状GWAS关联的曼哈顿图及关联位点附近的连锁不平衡衰减热图。

图中上半部分为棉花衣分性状GWAS关联的曼哈顿图，下半部分为SNP位点附近的连锁不平衡衰减热图。

图3.GHLP1的序列信息和不同单倍型的鉴定。

在品种群体中检测到GHLP1编码区序列的1174bp位置处，该SNP位点碱基从T突变为G，对应的氨基酸从Ser突变为Arg；同时该基因上游471bp的启动子区域中包含一个SNP位点，该SNP位点碱基从A突变为C。

图4.GHLP1在棉花不同组织和发育时期的表达水平。

横坐标代表基因的表达水平(以每百万测序碱基中每千个转录子测序碱基中所包含的测序片断数FPKM表示)。纵坐标代表不同组织，包括根、茎、叶、胚珠和纤维。胚珠组织包括了开花前3和1天、开花当天、开花后1到25天；纤维组织包括开花后5到25天。

图5.GHLP1的不同单倍型之间产量性状的比较分析。

箱图代表品种群体的产量性状的分布情况。横坐标为不同的种植环境，纵坐标为相应的产量性状数值，分别为产量性状中的衣分性状及籽指性状。含有AA和CC两种单倍型的品种分别是114和276个。方框内的横线代表性状分布的中值。**表示在0.01水平上有差异。

图6.GHLP1在两个棉花品种胚珠及纤维组织中的表达分析。

横坐标代表不同时期的胚珠及纤维组织；纵坐标代表GHLP1基因的相对表达量。黑色代表泗棉3号，其单倍型为CC；白色代表新陆早42号，其单倍型为AA。*表示在0.05水平上有差异，**表示在0.01水平上有差异。

具体实施方式

实施例1棉花衣分性状关联的糖苷水解酶基因GHLP1的挖掘：

针对486份现代陆地棉品种或者品系，从2016到2017年，分别在新疆库尔勒、新疆石河子每个品种田间种植三个重复进行了衣分性状的详细调查。同时，对这486份棉花品种(系)进行了全基因组重测序，获得7.55Tb测序数据，平均测序深度10.51×。将这些序列比对到棉花陆地棉TM-1的基因组序列，利用生物信息学软件进行全基因组SNP的鉴定，共挖掘到4 489 601个高质量的SNP(最小基因频率>0.05)用于后续分析。首先进行全基因组关联分析，再根据P<1×10^-6筛选SNP关联信号位点。对这些关联位点进行分析，我们发现了D01染色体上的一个SNP信号关联位点(D01:54812810)可以关联棉花的衣分性状(图1)。在该关联信号的连锁不平衡衰减的热点区域内(图2)，发现一个SNP位点(D01:54689390，T/G)正好处于基因外显子区，并造成了氨基酸序列的突变，一个SNP变异(D01:54691881，A/C)正好处于该基因上游471bp的启动子区域(图3)。该基因为糖苷水解酶基因，隶属于木聚糖酶类中的1,4-β-内切木聚糖酶，命名为GHLP1。

实施例2糖苷水解酶基因GHLP1的获得：

从陆地棉基因组序列中获取了GHLP1的cDNA序列，基因组序列及启动子序列，见SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。根据cDNA两端设计基因全长引物，进行PCR扩增，引物序列为F1：SEQ ID NO.4和R1：SEQ ID NO.5。根据启动子两端设计基因全长引物，进行PCR扩增，引物序列为F2：SEQ ID NO.6和R2：SEQ ID NO.7。PCR反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30sec，60℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。PCR扩增产物进行测序，与cDNA及启动子序列进一步比对确定序列的准确性。

实施例3 GHLP1在棉花不同组织和发育时期的表达水平分析：

本实验采集了棉花TM-1品种不同组织和不同发育时期的RNA样本进行转录组测序。样本材料包括了根、茎、叶、胚珠和纤维。胚珠组织包括了开花前3和1天、开花当天、开花后1到25天。纤维组织包括开花后5到25天。转录组测序采用Illumina HiSeq 2500平台，每个样本平均测序深度达到6Gb。基因表达水平的计算是将测序得到的reads与陆地棉基因组进行比对，计算出的表达水平以每百万测序碱基中每千个转录子测序碱基中所包含的测序片断数(FPKM)表示。实验结果如图4所示，该基因在TM-1棉花开花前-3、-1天的胚珠，开花当天及开花后1天、3天、5天、10天、20天胚珠种子中优势表达(图4)，表明该基因与产量性状构成因子相关。

实施例4 GHLP1基因及其启动子在鉴定高产棉花品种和提升产量性状中的应用：

根据全基因组重测序及生物信息学分析结果，分析该SNP位点(D01:54691881)上每个品种群体的基因型。我们证实了GHLP1基因的上游471bp处启动子区域中含有一个非同义突变的SNP位点，该SNP位点碱基从A突变为C。根据该SNP位点的碱基信息，将陆地棉现代品种(系)分为AA及CC两种单倍型(图5)。

根据GHLP1基因上游471bp处启动子区域中的SNP变异，我们从该自然群体中鉴定出单倍型AA材料114个，单倍型CC的材料276个(图5和表1)。其中对于我国陆地棉品种选育工作做出了突出贡献的岱字棉15，斯字棉2B均为高产单倍型CC，而108Ф，KK1543，C1470等均为低产单倍型AA，进一步反映了美棉品种对我国棉花品种改良的深远影响，以及黄河流域、长江流域棉区引种至新疆棉区后对新疆棉区棉花品种改良的积极作用(Fang et al.,2017；Han et al.,2020)。

利用t-test统计学检测方法，我们计算了两组单倍型之间产量性状的相关性(图5)。结果显示，单倍型CC的衣分在2016年石河子、两年两点(2016石河子，2016库尔勒，2017石河子，2017库尔勒)的均值，库尔勒2016、2017两年的均值以及石河子2016、2017两年的均值等四个环境中均优于AA单倍型的棉花材料，均呈现出极显著差异(P<0.01)；同时，单倍型CC的棉花材料，其籽指在2016库尔勒，2017库尔勒以及库尔勒2016、2017两年的均值等三个环境中也低于AA单倍型材料，同样均呈现出极显著差异(P<0.01)。

此外，GHLP1的启动子不同SNP基因型在泗棉3号(单倍型为CC)和新陆早42号(单倍型为AA)中，基因GHLP1在胚珠及纤维组织中的相对表达量存在差异，特别是在高衣分的泗棉3号的20天的胚珠组织中，其相对表达量显著高于低衣分的新陆早42号(图6)。证明该基因启动子变异后可以通过提高GHLP1的基因表达量提高棉花的产量。

综合以上结果可以看出，基因GHLP1在改良棉花产量性状以及培育棉花高产新品种中具有重要的研究价值。一方面可以根据基因GHLP1的单倍型设计分子标记，从而有效的鉴定棉花的产量性状，在高产棉花品种选育研究中具有很好的应用价值。另一方面，可以将GHLP1启动子单倍型AA中的SNP位点进行定点突变，改造成高产单倍型，从而培育高产棉花新品种。

表1高产量和低产量单倍型在群体品种材料中的鉴定

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一个改良棉花产量性状的糖苷水解酶基因和启动子及其应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1668

<212> DNA

<213> Gossypium hirsutum

<400> 1

ttacaaatga atgctgaagt gtttagtttc accgctaggg gggagtgaga aagtaaaatt 60

tgcagccctg tctccatatc caacattgac cttgtattcg cctaagaatc cataaaagct 120

gtatgaacca tgctcacctg ttaccccctt catctccccg ctttcccatt ctttcagcag 180

cttgtcaacc acatcacccg ctgggagatt cttaaaattc ccatcagtta aacacatttc 240

gtaacaccct tttggatgga gagccgtcca cagcattatc ccattcactg aagggtgtga 300

aaacccttct cttagtacct gttctaggta caccccctgt aattctttac caaccgaact 360

gctaatatct acctctgtta gccatatggg gagtctgagg gtagccaatt tgtctatcac 420

ggctcgcatt agaggaaggt ttggcactgt aaaatgactt tccaacccaa ttccatccat 480

gtacatgcca ccgctttcaa gctctcttat cctttcaatg taagtgtcaa ctgttgattt 540

aacatcactg caggtttcca caacattaaa ttcattcatg aacagggttg ctaaagggtc 600

cgattgatgt gcagtctcgt agaaatgcaa ggttgcatca ggtccaagtc gttgctcgta 660

aaaatcaaag tggagcatct cattactgac atcccagtgt atgaattctt ctttgtattt 720

gctcattaag ctctgtatcc tggaattaac tgctgattgt aggtcagggc ctgtaaggtt 780

ccgaacccat gcaggcgtgt acttggggtc ttcccagaat atgttgtggc ctctggctat 840

tatttggtgg gctctaacaa actccaacat ttggtcagct aaggtgtagt tggtcttccc 900

ttgatctggt tctgttgcat accatttcag ttcattttca aacactgctg cattgaatcg 960

ttcaacaaac cagttctgat agggcaaatt cccaagaatg gtgtgtgcta ttgcagaacc 1020

aaatggaaaa tcctttgaga cttggtttat agttattgct gctccttgca acctattacc 1080

ttgttgatct gagacatgta ttgttacagc acgcttcctt tgagtgttaa tcatgaattg 1140

ctggttgaac ctccattctt gatcagtaaa tgactgtaac gaggaactat caattgttat 1200

atcaatgtct ttatcatctg agttctggaa tagcagtaaa gctaaatttg aaggtgaatc 1260

aagaacaaat ccacctttga gaaatgacca gcaaccattc ttagccaaaa cagtccctat 1320

acaattatat gttctgtttt ctgtcttcaa gcttgcccta atgagagctg aatttgcacc 1380

ttgtattttg atccaagtgg agaaacagta aaaattgccc acggtgagat tcttcaagag 1440

aaaagctgga gtgtaaaaac cagttgcagt tttgccaaaa atggcaggtc tcataatggg 1500

cgtctcatct ttcagaatcc ctccttggta cagtggctcc tctggctgtg ctttacactc 1560

tgtgtaagca gtaaaatcat ataaaggccc atcatatgaa gcaaccaagg aaccactaag 1620

aagaatgaag aaagcccaga agccaccaaa aacaagagaa tgtttcat 1668

<210> 2

<211> 2515

<212> DNA

<213> Gossypium hirsutum

<400> 2

atgaaacatt ctcttgtttt tggtggcttc tgggctttct tcattcttct tagtggttcc 60

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ctaatgggtt ttcagaaaac ttaagtgggt tctttttctt tttattgctg cagatgggcc 180

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ttgttgatga tgttgttggt ttgcagtgta aagcacagcc agaggagcca ctgtaccaag 360

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tacaggccct gacctacaat cagcagttaa ttccaggata cagagcttaa tgagcaaata 1800

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gcaacgactt ggacctgatg caaccttgca tttctacgag actgcacatc aatcggaccc 1920

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<210> 3

<211> 2000

<212> DNA

<213> Gossypium hirsutum

<400> 3

gttcctgttt tgaacaaact gctattgaat tgaacaaatg ctgaagctta cattatatac 60

catacagaaa aaaaatatga aatgatttcg gatatcagga gaaagagggg gagtgtacct 120

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ttgctcacat gttttactta agggtttcat ttgatgtgaa cttcaaataa acttgtcttt 240

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ttggaaaaaa aaaagcacaa gctgtacaag gattgaagat gggtaattaa tgggaagtgg 720

gttggaaata ggtgaagtct gctttagatt aaagtctagt cctccattgt cagaccagtt 780

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<210> 4

<211> 20

<212> DNA