红比利时杜鹃花瓣RhCHS基因启动子及花色育种应用
阅读说明：本技术 红比利时杜鹃花瓣RhCHS基因启动子及花色育种应用 (Rhododendron erythropolis petal RhCHS gene promoter and flower color breeding application ) 是由 贾永红 吴月燕 于 2020-06-19 设计创作，主要内容包括：本发明从红比利时杜鹃(Rhododendron hybridum)花瓣组织中获得一个具有较高启动活性的启动子。该启动子全长1477bp,能高效启动查尔酮合成酶(Chalcone synthase,CHS)基因的表达,本发明的启动子可借助基因重组技术置换其他物种中低表达水平的CHS基因的启动子,提高CHS酶活,加大花色苷代谢通路下游途径中花青素和花青苷的合成,从而影响花瓣的颜色表现,本发明在促进包括杜鹃花在内的诸多园艺花卉育种研究中具有重要作用,具有良好的经济价值和社会价值。(The invention obtains a promoter with higher promoter activity from Rhododendron roseum petal tissue. The total length of the promoter is 1477bp, the expression of a Chalcone synthase (CHS) gene can be efficiently started, the promoter can replace the CHS gene promoter with low expression level in other species by means of a gene recombination technology, the CHS enzyme activity is improved, and the synthesis of anthocyanin and anthocyanin in downstream pathways of anthocyanin metabolic pathways is increased, so that the color expression of petals is influenced.)
技术领域
本发明属于基因工程
技术领域
，具体涉及一个来源于红比利时杜鹃花瓣组织中的查尔酮合成酶(Chalcone synthase，CHS)基因启动子的获得及其在花色育种研究中的应用。背景技术
启动子是位于结构基因5'端上游区的一段DNA序列，长度在1000-2000bp不等。该段DNA序列能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确结合并开启转录。基因的特异性转录取决于酶与启动子能否有效形成二元复合物，启动子的序列会影响其与RNA聚合酶的亲和力，从而影响基因表达水平。在启动子核心区域的转录起始位点附近通常含有序列为TATAAA的TATA box结构；在转录起始位点5’端上游通常含有序列为CCAAT的CAAT box和序列为GGCGGG的GC box结构，这些结构能干扰启动子活性表现，决定转录特异性和活性。因此，克隆、分析并验证启动子的序列、顺式作用元件组成和功能表现，不但能提高功能基因时空表达规律的认识，而且能针对性控制外源刺激因子以调控功能基因表达效果都具有重要作用。
杜鹃花，位居中国十大名花座次之六，享“繁花似锦”之美誉。该花以枝繁叶茂、花色艳丽而蜚声中外，具较高观赏价值和商业价值。红比利时杜鹃作为重要的观赏杜鹃之一，有红、白、粉、淡绿、嵌色系等许多类型，也是世界盆栽花卉生产的主要种类之一。作为苯丙氨酸代谢途径(general phenylpropanoid pathway)的限速酶，CHS对花色苷前体物合成的结果具有重要影响。作为调控CHS基因表达效率的启动子，能够影响CHS酶的表达产量，最终也会影响植物花瓣花色的表现。
本发明对红比利时杜鹃花瓣组织中的CHS基因的上游启动子进行研究，并对获得的序列做顺式作用元件分析。通过重组技术构建包含本启动子的重组载体并注射烟草叶片组织，借助GUS组织染色方法观察染色效果，从而确定该启动子的活性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种红比利时杜鹃花瓣RhCHS基因启动子以解决目前红比利时杜鹃花瓣组织中CHS基因启动子研究不足的问题，并提供该启动子的应用以提高杜鹃花的分子育种水平。
为了解决上述问题，本发明提供以下方案：
一种红比利时杜鹃花瓣RhCHS基因启动子，其序列为：
(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列(起始密码子为atg)。
SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中发生一处或多处点突变，但依然具备RhCHS基因启动子功能的核苷酸序列。
一个重组载体，由权利要求1所述的启动子与pCAMBIE1301质粒经基因重组技术构建。
本发明涉及到的重组载体由pCAMBIE1301骨架和启动子序列构建而成。pCAMBIE1301质粒通过PstI和NcoI双酶切，去掉GUS基因前的35S Promoter。回收载体骨架并与本启动子连接，反应产物经转化实验、测序验证等步骤，成功构建重组载体。
一个用于启动子扩增的重组细胞，由权利要求2所述的重组载体与大肠杆菌感受态DH5α制备而成。
一个用于瞬时转化的重组细胞，由权利要求2所述的重组载体与根农杆菌GV3101制备而成。
一种用于制备权利要求1所述红比利时杜鹃花瓣RhCHS基因启动子的方法，其特征在于，包含以下步骤：以红比利时杜鹃花瓣DNA为模板，使用3条特异性引物扩增而得到，所述3条特异性引物的序列如SEQ ID NO2、NO3、NO4所示。
上述红比利时杜鹃花瓣RhCHS基因启动子在园艺植物花色育种研究与实践中的应用，具体为将RhCHS基因的启动子用于置换低活性基因的启动子而实现提高基因表达效率的研究，特别是在园艺花卉产业的花色育种研究中的研究运用。
比利时杜鹃花作为观赏性植物受到大众的喜爱，而对于其查尔酮合成酶在花色育种方面的应用较为少见，本发明提供了一种红比利时杜鹃花RhCHS基因启动子以及其制备方法，填补了目前基因工程中对于该基因启动子的空缺，提供了一种比利时杜鹃花查尔酮合成酶启动子的克隆方式，为今后杜鹃花以及相关植物的研究提供了理论依据，为今后利用基因工程技术改了植物品质、获得不同花色的植物提供理论依据，具有较高的应用价值。
附图说明
图1为本发明红比利时杜鹃花瓣中RhCHS基因启动子顺式作用元件类型及其在序列中的位置图；
图2为本发明重组载体中RhCHS基因启动子序列的分析图；
图3为本发明实施例中脱色中的样品图(从左至右为RhCHS基因启动子重组载体、1301阳性载体、阴性载体)；
图4为本发明实施例中烟草叶片瞬转脱色结果示意图(从上至下为RhCHS基因启动子重组载体、1301阳性载体、阴性载体)(各三个重复试验)。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明做详细具体的进一步说明。
实施例1、杜鹃花RsCHS基因启动子克隆
(一)红比利时杜鹃DNA的抽提
实验所用红比利时杜鹃的花瓣采自宁波北仑亿润花卉有限公司。采样植株要求健康、花朵繁茂、花色艳丽，实验花瓣要求瓣面干净匀称、色彩均匀、无虫斑。活体植株的花瓣先用洗瓶清洗表面浮尘，采集花瓣并迅速液氮冷冻。冷冻花瓣样品在实验室中采用CTAB法提取杜鹃基因组DNA备用。
(二)Tail-PCR引物设计与验证
参照Genome Walking Kit(CodeNo.6108)试剂盒的说明书，设计3条R端引物SP1、SP2、SP3(表1)，与试剂盒中的4条随机引物分别配对，进行3轮巢式PCR扩增。另外，设计两条OFR验证引物CHS-F、CHS-R(表1)。
表1：Tail-PCR中3条R端引物SP1、SP2、SP3的序列
引物名称
核酸序列(5’---3’)
功能
SP1
CAAACATAAGTCAGTAACCGTCACCC
Tail-PCR第一轮PCR下游引物
SP2
AAGGCTCATCCGACGACGATTC
Tail-PCR第二轮PCR下游引物
SP3
ACCCCCGTAATCAGAATATATGCACG
Tail-PCR第三轮PCR下游引物
CHS-F
ACTGCGACCCCACCGAACTG
CHS的ORF验证引物
CHS-R
CCATGTCCTGCCTAGCGTCC
CHS的OFR验证引物
(三)Tail-PCR实验过程
以红比利时杜鹃基因组DNA为模板，使用Vazyme公司的phantamaxfidelity DNApolymerase试剂盒，参照说明书PCR程序，以设计好的SP1、SP2、SP3等三条引物为下游引物，以试剂盒内的4条随机引物(AP1、AP2、AP3和AP4)为上游引物，分别进行三轮PCR扩增。三轮扩增实验过程如下：
第一轮PCR扩增(20个循环)：模板为红比利时基因组DNA，4条随机引物AP1、AP2、AP3、AP4与SP1引物分别配对进行4组第一轮PCR扩增，扩增程序为如下：
②1st PCR反应条件如下：
第二轮PCR扩增(20个循环)：分别取第一轮扩增的4组产物2μl为本轮模板，使用上述4条随机引物与SP2引物再次分别配对进行4组第二轮PCR扩增，扩增程序如下：
②2nd PCR反应条件如下：
第三轮CPR扩增(25个循环)：分别取第二轮扩增的4组产物2μl为本轮模板，使用上述4条随机引物与SP3引物再次分别配对进行4组第三轮PCR扩增(25个循环)。
②3rd PCR反应条件如下：
以上三轮PCR扩增结果表明，第三轮扩增产物中AP1-SP3扩增结果有明显条带，割胶回收此位置约2000bp的电泳条带。回收产物末端加A尾后，连接pMD19-T载体，构建T克隆，转化大肠杆菌后并经引物对CHS-F和SP3验证后，挑取阳性克隆送样测序，测序引物为通用引物M13(-47)，测序结果拼接后得到CHS基因的启动子序列，结果SEQ ID NO.1所示。
实施例2、红比利时杜鹃花RhCHS基因启动子的顺式作用元件分析
借助PlantCARE对获得的1477个启动子序列做顺式作用元件分析，顺式元件名称、数量和位置如表2、图1所示。
表2：红比利时杜鹃RhCHS基因启动子顺式作用元件类型、位置与数量表
实例3、重组载体的构建
PstI和NcoI双酶切pCambia1301载体，切除GUS基因前的35S Promoter，回收载体骨架后和CHSP片段进行重组反应。反应产物转化大肠杆菌DH5α，涂布Kana抗性平板，37℃过夜培养后挑取8个抗性菌落，用上述扩增引物进行PCR鉴定阳性菌落后，挑取15号克隆进行测序。双向测序引物为M13-R:CAGGAAACAGCTATGAC、Gus-R:GAAAAGGGTCCTAACCAAGA。
结果显示，重组载体中所获得的启动子序列与Tail-PCR实验所获得的启动子序列完全一致，证明重组载体构建成功。测序结果及分析结果见图2。
实施例4、重组载体转化拟南芥验证活性
(一)农杆菌注射接种本氏烟草(Nicotiana benthamiana)
采用冻融法将重组质粒转化农杆菌株GV3101感受态(同时转化pCambia1301空载体和去除GUS基因的1301载体分别作为阳性和阴性对照)，涂布在加有抗生素(含kana50mg/L、Rif 25mg/L、Gen 25mg/L)的LB培养基平板，挑取抗性单克隆进行PCR验证后，接入5ml YEP液体培养基(含上述同样抗生素)中，在28℃、160rmp转速的培养箱中过夜培养。培养物离心收集后用5ml的重悬液(含10mM MgCl2、10mM MES、150μM As)重悬并室温静止3h。静置后的农杆菌注射5叶期的本氏烟草(约生长1个月)的叶片(下表皮)，每株可以注射2-3个叶片(处于植株的相同位置，生长状态、大小相近)，每个处理注射3片，设为3个重复。注射后的植株在25℃黑暗过夜后，转移到16h光照，8h黑暗条件下生长。
(二)GUS染色
农杆菌注射后3-5天，采集注射叶接种部位(3个重复)，加GUS染液于37℃过夜染色。染色后的叶片再用75％的乙醇脱色(去除叶绿素)，也于37℃过夜。倒掉脱色乙醇后再用75％乙醇清洗后观察并拍照，结果如图3、图4所示。
如图3、图4所示，可以明显地看出RhCHS基因启动子重组载体的颜色深于1301阳性载体深于阴性载体，这也验证了本发明的红比利时杜鹃花查尔酮合成酶在花色表达方面的作用。
如图3、图4所示，可以明显地看出RhCHS基因启动子重组载体的GUS染色要明显深入pCAMBIA1301阳性对照。结果表明，RhCHS基因启动子具有明显促进RhCHS基因表达的活性，后期可通过改变启动子的序列实施对RhCHS基因表达活性的调节，继而调整组织中花色苷的含量，在花色育种中发挥作用。
本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合生物基因工程领域的市售产品。
以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。
序列表
<110> 浙江万里学院
<120> 红比利时杜鹃花瓣RhCHS基因启动子及花色育种应用
<130> 2020.6.2
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1477
<212> DNA
<213> 比利时杜鹃花(Rhododendron of Belgium)
<400> 1
tttaagtgca tacaaattta aatcgtccat tgctcggtta aaatccgaaa tgtcgattgg 60
caaaataagc gaccgatctg accggattgg ccgctctgca gggagcccat tcccccttca 120
tcccatttcg ccaacccgtc ttgaccacct cacctaacta acacttcccc acaactaaaa 180
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ctaagaataa atatatttag aaggaattca caaaaattac tgaaaacgaa acaaagttga 720
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aaaaattttg ataaaatatt taaaaacatt gaataaatag aaaacgcgaa accatgcgta 900
acttcttcat cccaaaaaat ctcttacaaa aacataacag acataaagca atttcccttt 960
ccatgtttta taagggaagt gccggagaga aatcatcttt cgttttttcc gaaacctaat 1020
tttgataacc ctcaacgctc aaaaagcttg ttctaggacg gaatactaat gtaagcacgt 1080
gtaggagtgc gtgtttgtct gtcttcgtga gcttattcta aaataatctt tatggtattt 1140
ttttatttta aaaattatct tgcaacccat gttttcccta ttaaatgaat tattatgaag 1200
taggtataca agaatctcca tatcatgtgg aggcttttga agggggaaat gtagatacac 1260
caaaacccaa ctcacgtgct agccggcctc tccaagtagt catagcacgt gattccaaac 1320
taccatttct attggtcaca tatatatacc acccacaata ccaccaagtt ttgtcacaag 1380
ctgatcaaca attatctacc actccaagct gcttgtacta acacctacaa accacaaaaa 1440
ctccggccac cgctaaatta ttttttccgg cgaaaag 1477
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> SP1
<400> 2
caaacataag tcagtaaccg tcaccc 26
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> SP2
<400> 3
aaggctcatc cgacgacgat tc 22
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> SP3
<400> 4
acccccgtaa tcagaatata tgcacg 26
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