构建体、载体、蛋白、细胞、制备方法、产品及应用
阅读说明：本技术 构建体、载体、蛋白、细胞、制备方法、产品及应用 (Construct, vector, protein, cell, preparation method, product and application ) 是由 韦治明 韩昆昆 李华顺 于 2021-09-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种构建体,携带IL15super激动剂基因序列,构建体的组成包括依次连接的用于编码信号肽的核苷酸序列、IL15super激动剂基因序列、IgG FC核苷酸序列、胞外区核苷酸序列、跨膜区核苷酸序列、胞内区核苷酸序列。本发明方案所公开的构建体在生物学功能方面有效地提高了抗肿瘤功效,且具有靶点广谱性和特异性可以用于制备抗肿瘤细胞药物。(The invention discloses a construct carrying an IL15super agonist gene sequence, which comprises a nucleotide sequence for coding a signal peptide, the IL15super agonist gene sequence, an IgG FC nucleotide sequence, an extracellular region nucleotide sequence, a transmembrane region nucleotide sequence and an intracellular region nucleotide sequence which are sequentially connected. The construct disclosed by the scheme of the invention effectively improves the anti-tumor efficacy in the aspect of biological functions, has broad target spot spectrum and specificity, and can be used for preparing anti-tumor cell medicines.)
技术领域
本发明是关于生物技术，特别是关于一种构建体、载体、蛋白、细胞、制备方法、免疫治疗产品及应用。
背景技术
免疫疗法为当下肿瘤治疗领域最受关注和最具前景的发展方向之一，随着免疫疗法的研究深入和应用范围逐渐扩大，尤其以CAR-T细胞疗法为代表的新兴免疫细胞治疗技术在治疗血液肿瘤方面(急性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤)取得显著疗效，甚至有些患者完全缓解，这是恶性肿瘤治疗领域中里程碑式的突破。据研究数据统计，在临床前研究和临床试验中CAR-T 疗法表现出良好的靶向性、杀伤性和持久性，展示了巨大的应用潜力和发展前景。例如，CD19 CAR-T细胞在CD19阳性恶性血液肿瘤患者的成功应用，证明这种方法用于癌症免疫治疗的可行性。
虽然以CAR-T为代表的免疫细胞治疗技术针对复发/难治性恶性血液肿瘤取得巨大成功，但CAR-T疗法分离培养过程耗时较长、费用昂贵、患者采集的T细胞状态参差不齐降低了临床扩展性并增加了操作难度，导致该疗法目前仅有望在部分患者收益；除此之外，临床试验也发现CAR-T疗法存在较为严重的细胞因子释放综合征CRS、神经毒性等严重毒副作用、复发率高、实体肿瘤疗效不佳等使其广泛应用面临重大挑战。
近年来，NK细胞免疫疗法也表现出巨大的发展潜力，嵌合抗原受体(CARs) 修饰后的NK细胞表现出增强的抗肿瘤活性，并且已有的动物体内实验及临床试验均表明，该疗法相较于CAR-T疗法，尤其在实体肿瘤中，安全性和有效性方面都具有更大的优势。
NK92细胞系来源于非霍奇金淋巴瘤患者的外周血单核细胞，是一株白细胞介素(IL2)高度依赖性NK细胞，具有较好的细胞毒活性，并且作为一种肿瘤细胞能够在体外无限增殖和规模化制备，并表现出良好的临床安全性和有效性，也是目前FDA批准的唯一可用于临床实验的NK细胞系。但该细胞通过过继疗法输入机体后，由于人体内IL2浓度较低，不足以维持NK92细胞的生长，因此，该细胞在体内存活时间非常短暂，在一定程度上，可能限制了该疗法的临床效果；但又因为在高浓度IL2条件下，会发生严重的不良反应，并刺激免疫抑制Treg细胞的优先扩增，这限制了通过CAR-NK联合IL2 方法在癌症治疗中的应用。
白细胞介素(IL-15)在结构上与IL-2具有同源性，他们共用受体(IL2/15 βγ)的β和γ链，但结合不同的α受体链(IL-2Rα/IL-15Rα)，IL15作为一个被广泛研究的抗肿瘤候选药物，与IL2具有许多共同的生物学活性，包括激活T细胞、B细胞和NK细胞，并促进这些细胞的增殖和存活。此外， IL15能激活、维持和扩增CD8+记忆性T细胞，而不参与调节性T细胞功能的维持。该细胞因子不仅能够刺激并维持IL2依赖的细胞系的增殖，又具有类似IL2的生物学功能，因而成为一种较为理想的细胞因子治疗候选药物。
但IL15作为细胞因子药物仍然存在较多不足，主要体现在以下几个方面： 1.IL15的抗肿瘤效果依赖于高浓度的IL15的持续产生或给予；2.IL15的半衰期较短，药效的维持需要持续反复给药，增加了给药难度和安全性风险；3. IL15单体生物活性较低，限制了其进一步的应用；4.IL15的作用是全身性的，可能会致使免疫系统广泛性激活，并常常伴随较为致命的风险。所以需要一种增强型的IL15药物或其CAR-NK联合体，使其靶向性作用于肿瘤部位的同时，又不影响正常组织，从而发挥出联合体用药的优势。
公开于该
背景技术
部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种构建体、载体、蛋白、细胞、制备方法、产品及应用，其能够提供一种携带IL15 super激动剂基因序列的构建体，通过在 ROBO1 CAR-NK细胞的基础上增加IL15 super激动剂基因，从而进一步增强 CAR-NK细胞的生物学功能活性和安全性。
为实现上述目的，本发明的实施例提供了一种构建体，该构建体包括依次连接的用于编码信号肽的核苷酸序列、IL15 super激动剂基因序列、IgG FC 核苷酸序列、胞外区核苷酸序列、跨膜区核苷酸序列、胞内区核苷酸序列。
在本发明的一个或多个实施方式中，该构建体能够提供一种携带IL15 super激动剂基因序列。其中，IL15 super激动剂基因序列包括IL15序列与 IL15Rα受体胞外域序列的不同组合体。
在本发明的一个或多个实施方式中，构建体还包括Linker序列，所述 Linker核苷酸序列为如SEQ ID NO：1或如SEQ ID NO：2所示，其中Linker序列排列于如下任一：IL15核苷酸序列和IL15R α受体胞外域序列之间、 IL15super激动剂基因序列和IgG FC核苷酸序列之间。进一步优选的，其中 Linker序列排列于如下任一：IL15 super激动剂基因序列和IgG FC序列之间、野生型的IL15核苷酸序列和IL15Rα受体胞外域全长核苷酸序列之间、或野生型的IL15序列和IL15Rα-sushi序列之间、IL15 N72D和IL15Rα受体胞外域全长核苷酸序列之间、IL15 N72D和IL15Rα-sushi序列之间。
在本发明的一个或多个实施方式中，用于编码信号肽的核苷酸序列可选自：CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、 CD37、CD134、CD137、ICOS和CD154中的一种或多种，本发明中，用于编码信号肽的核苷酸序列为CD8信号肽核苷酸序列：所述CD8信号肽核苷酸序列选自如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列、满足以所述CD8信号肽核苷酸序列编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列具有至少约98％同一性的核苷酸序列。
在本发明的一个或多个实施方式中，IgG FC核苷酸序列为如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列、满足以所述IgG FC核苷酸序列编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列具有至少约98％同一性的核苷酸序列。通过在构建体中加入IgG FC序列与IL15super基因共同表达后能增加IL15 的生物活性并延长其半衰期。
在本发明的一个或多个实施方式中，胞外区核苷酸序列可选自：CD28、 CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD134、 CD137、ICOS和CD154中的一种或多种。本发明的胞外区核苷酸序列为CD8 胞外区序列，所述CD8胞外区核苷酸序列选自如SEQID NO：5所示的核苷酸序列、满足以所述CD8胞外区核苷酸序列编码的氨基酸序列与SEQ IDNO：19 所示的氨基酸序列具有至少约98％同一性的核苷酸序列。
在本发明的一个或多个实施方式中，跨膜区核苷酸序列可选自：CD28、 CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD134、 CD137、ICOS和CD154中的一种或多种。本发明中所述跨膜区为CD8跨膜区，所述CD8跨膜区核苷酸序列选自如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列、满足以所述CD8跨膜区核苷酸序列编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列具有至少约98％同一性的核苷酸序列。
在本发明的一个或多个实施方式中，胞内区核苷酸序列可选自：CD28、 CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD134、 CD137、ICOS和CD154中的一种或多种。本发明中所述胞内区为CD8胞内区序列，所述CD8胞内区核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，或编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：21至少约98％同一性的氨基酸序列所示；通过利用CD8 的胞外区、跨膜区和部分胞内区使表达后的蛋白能固定在细胞表面进行稳定的膜表面表达，减少因分泌表达对机体的影响。
在本发明的一个或多个实施方式中，IL15 super激动剂基因序列至少包括 IL15序列与IL15Rα受体胞外域序列的组合中的一种。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述IL15核苷酸序列包括如下任一：1)野生型的IL15核苷酸序列，所述野生型的IL15核苷酸序列选自SEQ ID NO： 8、以所述野生型的IL15核苷酸序列编码的氨基酸序列具有与SEQ ID NO： 22至少约98％同一性；
2)编码野生型IL15的第72位氨基酸Asn突变成Asp，命名为N72D核苷酸序列，所述N72D核苷酸序列选自SEQ ID NO：9、以所述N72D核苷酸序列编码的氨基酸序列与SEQ IDNO：23所示氨基酸序列具有至少约98％同一性；通过IL15第72位氨基酸Asn突变成Asp首先增加了其本身的生物活性，其次在IL15 super激动剂中再与IL15Rα受体胞外域共价结合形成 IL15-IL15Rα复合物，解决其单体活性过低的缺陷。
在本发明的一个或多个实施方式中，IL15Rα受体胞外域核苷酸序列包括如下任一：1)IL15Rα受体胞外域核苷酸全长序列，所述IL15Rα受体胞外域核苷酸全长序列选自如SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列、满足以所述 IL15Rα受体胞外域核苷酸全长序列编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：24所示氨基酸序列具有至少约98％同一性的核苷酸序列；
2)IL15Rα-sushi结构域核苷酸序列，所述IL15Rα-sushi结构域核苷酸序列选自如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列、满足以所述IL15Rα-sushi 结构域核苷酸序列选编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：25所示氨基酸序列具有至少约98％同一性的核苷酸序列。
在本发明的一个或多个实施方式中，构建体所携带的IL15 super激动剂基因包括IL15核苷酸序列与IL15Rα受体胞外域核苷酸序列的不同组合体，该组合体包括如下任一：1)野生型的IL15核苷酸序列与IL15Rα-sushi结构域核苷酸序列的核苷酸序列组合，所诉核苷酸序列组合的序列选自SEQ ID NO： 12所示的核苷酸序列、满足以编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：26所示氨基酸序列具有至少约98％同一性的核苷酸序列。该组合所构成的构建体依次包括串联的用于编码CD8信号肽的核苷酸序列、野生型的IL15序列与IL15Rα -sushi结构域核苷酸序列的组合、用于编码Linker的核苷酸序列、IgG FC序列、CD8胞外区序列、CD8跨膜区序列、CD8胞内区序列，该构建体命名为IL15DEL；2)野生型的IL15核苷酸序列与IL15Rα受体胞外域全长核苷酸序列的核苷酸序列组合，所诉核苷酸序列组合的序列选自SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列、满足以编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：27所示氨基酸序列具有至少约98％同一性的核苷酸序列；该组合所构成的构建体依次包括串联的用于编码CD8信号肽的核苷酸序列、野生型的IL15核苷酸序列与IL15Rα受体胞外域全长核苷酸序列的组合、用于编码Linker的核苷酸序列、IgG FC核苷酸序列、CD8胞外区核苷酸序列、CD8跨膜区核苷酸序列、CD8胞内区核苷酸序列，该构建体命名为IL15FCTM；3)N72D核苷酸序列与IL15Rα-sushi 结构域核苷酸序列的核苷酸序列组合，所诉核苷酸序列组合的序列选自SEQID NO：14所示的核苷酸序列、满足以编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：28所示氨基酸序列具有至少约98％同一性的核苷酸序列；该组合所构成的构建体依次包括串联的用于编码CD8信号肽的核苷酸序列、N72D核苷酸序列与 IL15Rα-sushi结构域核苷酸序列的组合、用于编码Linker的核苷酸序列、IgG FC核苷酸序列、CD8胞外区核苷酸序列、CD8跨膜区核苷酸序列、CD8胞内区核苷酸序列，该构建体命名为IL15N72DDEL；4)N72D核苷酸序列与IL15R α受体胞外域核苷酸序列的核苷酸序列组合，所诉核苷酸序列组合的序列选自SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列、满足以编码的氨基酸序列与 SEQ ID NO：29所示氨基酸序列具有至少约98％同一性的核苷酸序列。该组合所构成的构建体依次包括串联的编码CD8信号肽的核苷酸序列、N72D序列与IL15Rα受体胞外域核苷酸序列的组合、用于编码Linker的核苷酸序列、IgG FC核苷酸序列、CD8胞外区核苷酸序列、CD8跨膜区核苷酸序列、CD8胞内区核苷酸序列，命名为IL15N72D。
在本发明的一个或多个实施方式中，所携带IL15 super激动剂基因的构建体的序列包括如下任一的序列：如SEQ ID NO：12-SEQ ID NO：15任一所示的核苷酸序列、满足以编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：26-SEQ ID NO：29 任一所示氨基酸序列具有至少约98％同一性的核苷酸序列。
在本发明的一个或多个实施方式中，载体，为克隆有如前述构建体的慢病毒。
在本发明的一个或多个实施方式中，蛋白，包括如前述的构建体编码的氨基酸或如前述的载体表达的蛋白。
在本发明的一个或多个实施方式中，细胞，为由如前述的构建体或如前述的蛋白进行转化或转染的宿主细胞。
在本发明的一个或多个实施方式中，宿主细胞为哺乳动物基因工程化的的免疫细胞。
在本发明的一个或多个实施方式中，宿主细胞至少为如下任一：T细胞、γδT细胞、NK细胞、NKT细胞、TIL细胞、CIK细胞。
在本发明的一个或多个实施方式中，NK细胞为表达嵌合抗原受体的 CAR-NK细胞。
在本发明的一个或多个实施方式中，NK细胞为特异性识别肿瘤抗原 ROBO1的CAR-NK细胞。
在本发明的一个或多个实施方式中，特异性识别肿瘤抗原ROBO1的 CAR-NK细胞(简写为427A)中嵌合抗原受体包括依次串联的单链抗体、跨膜结构和共刺激信号传导区组成，所述单链抗体为能够特异性识别ROBO1的单链抗体，所述嵌合抗原受体的核苷酸序列选自如SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列、满足以所述嵌合抗原受体的核苷酸序列编码的氨基酸序列与 SEQ ID NO：30所示氨基酸序列具有至少约98％同一性的核苷酸序列。
在本发明的一个或多个实施方式中，构建体制备方法，包括如下步骤：合成和扩增如前述构建体，并将构建体克隆到慢病毒载体；通过四质粒系统包装慢病毒载体，并转染宿主细胞获得携带IL15 super激动剂基因的ROBO1 CAR-NK的目标细胞即427A。
在本发明的一个或多个优选实施例中，携带IL15 super激动剂的427A细胞根据IL15 super激动剂的不同组合体的名称(IL15DEL、IL15FCTM、IL15N72DDEL、IL15N72D)，统一命名为427AIL15DEL、427AIL15FCTM、 427AIL15N72DDEL、427AIL15N72D。
在本发明的一个或多个实施方式中，免疫治疗产品，包括如前述的细胞。可以为应用于癌症治疗中的制剂等。
在本发明的一个或多个实施方式中，应用，如前述的构建体或如前述的蛋白或如前述的细胞或如前述的免疫产品在癌症诊疗中的应用。
在本发明的一个或多个实施方式中，癌症至少为肝癌或乳腺癌或结肠癌或胰腺癌或前列腺癌或神经胶质瘤或肺癌。
本发明还提供一种药物组合物，包含上述的携带IL15 super激动剂基因的427AIL15DEL、427AIL15FCTM、427AIL15N72DDEL、427AIL15N72D细胞或上述方法制备的携带IL15super激动剂基因的427AIL15DEL、 427AIL15FCTM、427AIL15N72DDEL、427AIL15N72D细胞。
在本发明的一个优选实施例中，所述药物组合物还包括药学可接受辅料。
按照本发明所属技术领域的一些通用方法，本发明的药物可制成药学上可接受的各种剂型，如片剂、胶囊剂、口服液剂、锭剂、注射剂、软膏剂、颗粒剂或各种缓控释制剂等。优选为注射剂，可经皮下注射给药。
本发明的有益效果为：1.我们在ROBO1 CAR-NK细胞的基础上，通过慢病毒包装，转染技术，将IL15 super激动剂基因整合至ROBO1 CAR-NK细胞基因组中，形成带有携带IL15super激动剂基因的CAR-NK，进一步增加了其安全性、有效性以及工艺质量可控性；2.借助IL15 super激动剂的强力增效作用，CAR-NK细胞在机体内能有效扩增并减少细胞衰竭；3.表达IL15 super的ROBO1 CAR-NK细胞为现货即用型治疗产品，具有通用性，可适用于不同个体，无植物抗宿主病(GVHD)反应，制备后可长期冻存；4.IL15 super 激动剂中N72D该组合体，通过对编码野生型IL15第72位氨基酸天冬酰胺(简写为N)突变成天冬氨酸(D)，即N-D氨基酸的突变，以及加入IgG FC增加IL15的生物活性并延长其半衰期；另外利用CD8的胞外段、跨膜区和部分胞内端使其固定在细胞表面进行稳定的膜表面表达，减少因分泌表达对机体的影响；5.本发明中的IL15 super激动剂构建体可以表达后作为蛋白类药物单独或联合其他抗肿瘤药物使用，也可与各种免疫细胞疗法联合使用，将该构建体转导至其他工程改造的细胞上均能提升该细胞杀伤等方面的功能。
附图说明
图1A-1B为IL15 super激动剂构建体结构设计、插入慢病毒载体位置信息及质粒电泳结果；设计的携带IL15 super激动剂基因不同组合体的构建体，分别命名为IL15DEL，IL15FCTM，IL15N72DDEL，IL15N72D。该载体经过 XbaI和BamHI酶切、连接，将酶切后的片段通过PCR的方法，构建至慢病毒载体中，其中图1A为IL15 super激动剂不同组合形式的构建体结构设计及插入慢病毒载体位置信息；图1B为质粒电泳结果。
图2为制备所携带IL15 super激动剂不同组合体的构建体的慢病毒高速离心浓缩前后的病毒滴度测定结果，APC-H为标记IgG FC的荧光信号，通过检测构建体上的IgG FC基因表达，计算慢病毒包装滴度。
图3A-3B为本发明提供的427AIL15DEL，427AIL15FCTM， 427AIL15N72DDEL，427AIL15N72D细胞的制备及鉴定结果；图3A为FACS 检测427AIL15DEL，427AIL15FCTM，427AIL15N72DDEL，427AIL15N72D 细胞表达IL15super激动剂基因的阳性率；图3B为Western B1ot检测 427AIL15DEL，427AIL15FCTM，427AIL15N72DDEL，427AIL15N72D细胞中IL15的表达水平(包括添加加IL2培养(标记为+IL2)和撤去IL2培养(标记为-IL2)的细胞)；图3C为PCR扩增427AIL15DEL，427AIL15FCTM， 427AIL15N72DDEL，427AIL15N72D细胞中的ROBO1和IL15 super激动剂基因序列结果。
图4为427AIL15DEL，427AIL15FCTM，427AIL15N72DDEL， 427AIL15N72D单克隆细胞株的筛选及阳性率检测。
图5A-图5K为携带四种IL15 super激动剂基因的427A单克隆细胞杀伤不同癌细胞的实验结果，图5A为427AIL15DEL，427AIL15FCTM， 427AIL15N72DDEL，427AIL15N72D单克隆细胞对T47D的杀伤率；图5B 为427AIL15DEL，427AIL15FCTM，427AIL15N72DDEL，427AIL15N72D 单克隆细胞对敲除ROBO1后的T47D(简写T47D.KO)细胞的杀伤效率情况；图5C为427AIL15DEL，427AIL15FCTM，427AIL15N72DDEL，427AIL15N72D 单克隆细胞对RescueT47D-KO细胞(简写T47D.KO.Recue.ROBO1)的杀伤情况；图5D为427AIL15DEL，427AIL15FCTM，427AIL15N72DDEL， 427AIL15N72D单克隆细胞对HeLa细胞杀伤情况；图5E为427AIL15DEL， 427AIL15FCTM，427AIL15N72DDEL，427AIL15N72D单克隆细胞对HCT116 细胞杀伤情况；图5F为427AIL15DEL，427AIL15FCTM，427AIL15N72DDEL， 427AIL15N72D单克隆细胞对过表达ROBO1的HCT116(简写 HCT116-ROBO1)细胞杀伤情况；图5G为427AIL15DEL，427AIL15FCTM， 427AIL15N72DDEL，427AIL15N72D单克隆细胞对HBL100细胞杀伤情况；图5H为427AIL15DEL，427AIL15FCTM，427AIL15N72DDEL， 427AIL15N72D单克隆细胞撤去IL2培养后对MDA-MB453细胞杀伤情况(标记为(427AIL15super(-IL2)-MDA-MB453))；图5I为427AIL15DEL， 427AIL15FCTM，427AIL15N72DDEL，427AIL15N72D单克隆细胞撤去IL2 培养后对T47D细胞杀伤情况(标记为(427AIL15super(-IL2)-T47D))；图 5J为427AIL15DEL，427AIL15FCTM，427AIL15N72DDEL，427AIL15N72D 单克隆细胞撤去IL2培养后对T47D.KO细胞杀伤情况(标记为 (427AIL15super(-IL2)-T47D.KO))；图5K为427AIL15DEL，427AIL15FCTM， 427AIL15N72DDEL，427AIL15N72D单克隆细胞撤去IL2培养后对T47D.KO.Rescue-ROBO1细胞杀伤情况(标记为 (427AIL15super(-IL2)-T47D.KO.Rescue.ROBO1))。其中427AIL15DEL细胞选择单克隆编号为3C10和1G4的两株细胞；427AIL15FCTM选择单克隆编号为2G10和1B7的两株细胞；427AIL15N72DDEL选择1C11，1F9，1E10 三株细胞；427AIL15N72D选择2C9和2F11两株细胞进行杀伤实验。
图6为427AIL15DEL，427AIL15FCTM，427AIL15N72DDEL， 427AIL15N72D细胞表型检测。
图7A-7D为427AIL15DEL，427AIL15FCTM，427AIL15N72DDEL， 427AIL15N72D细胞对MDA-MB453靶细胞杀伤2h时各细胞因子分泌情况；图7A为427AIL15DEL细胞对MDA-MB453靶细胞杀伤2h时各细胞因子分泌情况；图7B为427AIL15FCTM细胞对MDA-MB453靶细胞杀伤2h时各细胞因子分泌情况；图7C为427AIL15N72DDEL细胞对MDA-MB453靶细胞杀伤2h时各细胞因子分泌情况；图7D为427AIL15N72D细胞对MDA-MB453 靶细胞杀伤2h时各细胞因子分泌情况。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
本发明主要通过将四种不同组合形式的IL15 super激动剂基因构建到慢病毒载体(PRRLSIN)上，通过病毒包装技术可获得稳定表达该抗原的慢病毒，将其慢病毒侵染427A细胞后经过多轮流式分选富集及单克隆化后获得能稳定表达该抗原并维持较为优异的体外杀伤活性的单克隆细胞株。
本公开采用的主要试剂及耗材如下：KOD DNA聚合酶(TOYOBO， KOD201)，NuclcoBond Xtra EF plasmid Purification (MACHEREY-NAGEL，740420)，CPT高效转染试剂盒(维诺赛生物，R001)， PBS(培源，B310KJ)，基因组DNA提取试剂盒(培源，B310KJ)，LEGENDplex Muli-Analyte Flow Assy Kit Human CG8/NK Panel 13-plex (Biolegend，740267))，DMEM高糖培养基(培源，L110KJ)，双抗(HyClone，SV30010)，胎牛血清(CAPRICORN，FBS-12A)，TrypLE Select Enzyme (Gibco，12563-029)，MEM-α培养基(培源，L560KJ)，anti-IL15 antibody (Abcam，ab273625)，β-actin Rabbit mAb(CST，4970S)，APCanti-DYKDDDDK(BioLegend，637308)，APC-anti-human IgG Fc(BioLegend， 410712)，96孔细胞培养板(NEST，701001)，6孔细胞培养板(Corning， 3516)，T75细胞瓶(Coming，430641)。
细胞系：
将Lenti-X-293T贴壁细胞培养在37℃、含5％CO2的特定培养环境中(Thermo 311细胞培养箱)，采用DMEM高糖完全培养基进行培养；NK92 及427A细胞系培养在37℃、含5％CO2的特定培养环境中(Thermo 311细胞培养箱)，采用MEM完全培养基进行培养。
改进型慢病毒载体：
在一个技术方案中，改进型慢病毒载体为以 pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE慢病毒载体为基础进行一系列优化改进后获得，所述改进方式为：1.将hPGK启动子替换成EF-1α启动子；2.在EF-1α后BamHI酶切位点前加NheI、SpeI、XbaI、XmaI克隆位点；3.剔除EGFP基因；4.所述质粒命名为pRRLSIN.cPPT.EF-1α.MCS-WPRE。
现在将参照附图来详细描述本发明的各种示例性实施例。应注意到：除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的方法和步骤的参数数值不限制本发明的范围。
以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。
对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法当被视为说明书的一部分。
除非特别指明，本文中的“NK细胞”包括“外周血NK细胞、NK92细胞和其他NK细胞”。
除非特别指明，本文中的“ROBO1 CAR-NK”是指“以ROBO1为靶点的嵌合抗原受体细胞，特别是一种以ROBO1为靶点的加强型CAR-T细胞和 CAR-NK细胞”，且本文中出现的英文名称不区分大小写，如ROBO1、Robo1、 robo1等表示的含义相同；Robo1 CAR-NK、Robo1-CARNK、Robo1-CAR-NK 表示的含义相同；其具体制备过程参加下述实施例及申请号为“CN201811394153.3”，发明名称为“编码CAR的核苷酸序列、表达该CAR 的ROBO1 CAR-NK细胞及其制备和应用”。
除非特别指明，本文中的“427A”是指“ROBO1 CAR-NK”细胞。
除非特别指明，本文中的“427AIL15DEL细胞”是指“携带构建体IL15DEL 的427A细胞”。
除非特别指明，本文中的“427AIL15FCTM”是指“携带构建体IL15FCTM 的427A细胞”。
除非特别指明，本文中的“427AIL15N72DDEL”是指“携带构建体 IL15N72DDEL的427A细胞”。
除非特别指明，本文中的“427AIL15N72D”是指“携带构建体IL15N72D 的427A细胞”。
除非特别指明，本文中所述的敲除ROBO1后的T47D细胞是指T47D.KO 细胞。
除非特别指明，本文中所述的Rescue T47D-KO细胞是指在T47D.KO细胞中回补ROBO1后的细胞标记为T47D.KO.Rescue.ROBO1。
除非特别指明，本文中所述的过表达ROBO1的HCT116细胞是指 HCT116-ROBO1细胞。
除非特别指明，本文中所述的“293T细胞”是指“Lenti-X-293T”细胞。
除非特别指明，本发明所述的“NK”为人体正常NK细胞或NKT细胞或NK细胞系，其包括NK92细胞，YT细胞，NKL细胞，HANK-1细胞， NK-YS细胞，KHYG-1细胞，SNK-6细胞和IMC-1细胞等。本发明的具体实施例中以NK92细胞为例进行说明。
除非特别指明，本文中的“载体”为物质组合物，其包括分离的核酸，并且其可用于传递分离的核酸至细胞内部。很多载体在本领域中是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两性分子化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语也应被解释为包括便于将核酸转移入细胞的非质粒和非病毒化合物，诸如例如聚赖氨酸化合物、脂质体等等。病毒载体的例子包括但不限于，腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等等。
除非特别指明，本文中的试剂均为分析级纯，且可从正规渠道商购获得。
实施例1慢病毒载体的制备
首先委托金唯智生物科技有限公司合成构建体IL15FCTM中IL15 super 激动剂基因片段(简写为IL15FCTM基因片段)至pUC57载体中，然后通过 PCR扩增目的基因后，经过片段纯化试剂盒回收纯化目的条带，将该片段和 pRRLSIN.cPPT.EF-1α.MCS-WPRE载体用限制性核酸内切酶(Xba I和BamH I)于37℃酶切2h，胶回收载体和目的片段后进行连接反应，再转至感受态细胞，菌液PCR筛选阳性克隆、酶切、测序验证，鉴定质粒构建情况，测序验证后委托金维智生物科技有限公司在该质粒的基础上进行点突变或缺失突变改造(并将这四个质粒分别命名为pRRLSIN.cPPT.EF-1 α.MCS-WPRE-IL15DEL、pRRLSIN.cPPT.EF-1α.MCS-WPRE-IL15FCTM、 pRRLSIN.cPPT.EF-1α.MCS-WPRE-IL15N72DDEL、pRRLSIN.cPPT.EF-1 α.MCS-WPRE-IL15N72D)，具体实施步骤如下：
由金唯智生物科技有限公司合成IL15FCTM基因片段至pUC57载体中；
引物信息：按表1合成引物：
表1 IL15FCTM基因片段扩增与检测引物
目的基因的获取：以带目的基因序列的pUC57质粒为模板以表1引物进行PCR扩增IL15FCTM基因片段；
纯化上述酶切产物，并测定产物浓度；
将上述纯化产物以及载体进行双酶切(37℃酶切2h)；
用1％Agarose gel进行电泳，用相应的DNA maker作为对照，验证PCR 产物是否正确，割取凝胶条带，回收剩下的PCR产物；
将上述纯化产物与载体进行连接；
转化连接产物；
挑取LB平板上的单克隆到事先加有200μL LB(Amp)培养基的无菌1.5 mL管中，37℃，250rpm，培养3h后，进行Colony PCR筛选阳性克隆；
经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，选取阳性克隆摇瓶中，37℃、250rpm摇床培养14-16h；
质粒提取后进行测序；
将测序正确的质粒按交由金维智进行点突变和缺失突变改造。
上述质粒构建结果如图1A和图1B所示：
其中图1A为IL15 super激动剂构建体结构设计及插入慢病毒载体位置信息；图1B质粒电泳结果。根据实验结果可知，构建的质粒在相应位置处均出现特异性条带，且条带分子大小均正确，与后续测序结果相一致，该结果表明质粒构建正确；
实施例2慢病毒的制备及滴度测定
以IL15FCTM构建体为例，说明制备IL15FCTM构建体的慢病毒的制备过程，IL15DEL、IL15N72DDEL、IL15N72D构建体慢病毒制备过程与其相同。
慢病毒包装浓缩：
(1)转染前24小时，以每皿约2E7个细胞将293T细胞接种至15cm培养皿中。确保转染时细胞在85％左右的汇合度且均匀分布于培养皿中。
(2)准备溶液A和溶液B
溶液A：2.5mL BufferA缓冲液。
溶液B：分别加入以下质粒的混合物：74μg PRRLSIN-IL15FCTM；32μg pMD2.G；53μgpRSV-REV；53μg PMDLgpRRE；250μL Buffer A溶液；2.25mL 无菌水，溶液B总体积：2.5mL。
充分混匀溶液B，轻轻涡旋溶液A的同时，逐滴加入溶液B，静置5-15min。轻轻涡旋上述A和B的混合溶液，逐滴加入含Lenti-X-293T细胞的培养皿中，轻轻前后晃动培养皿使DNA混合物均匀分布。放置于培养箱中培养16-18h。更换新鲜培养基，继续培养，分别在48小时和72小时后收集含病毒的上清液。2500rpm，25℃离心10分钟，PES膜(0.45μm)过滤。以70％乙醇消毒贝克曼库尔特Ultra-clear SW28 centrifuge tubes，并置于紫外灯下消毒30分钟。将已过滤的含慢病毒的上清液转移至离心管中，25000rpm，4℃离心2小时。小心取出离心管，倒掉上清液，倒置离心管去掉残余液体。加入适量MEM培养基，密封离心管，在4℃放置过夜，1500rpm离心1分钟，收集病毒上清，置于-80℃保存。
滴度测定：
选取处于对数生长期的用于感染慢病毒的细胞，1000rpm离心5-10min 收集，PBS洗涤一次。
弃上清，用新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞密度调整为E6个/mL。每个细胞株取细胞悬液100μL/孔加入到24孔板中；
24h后加入梯度稀释的慢病毒，再分别加入Polybrene 0.5μL/孔，混匀后，放入37度5％CO2培养箱中培养2天，流式检测目的基因的阳性率。
根据图2结果表明：通过现有包装体系成功包装出表达IL15 super激动剂的慢病毒，经过高速离心后，慢病毒回收率在40％-73％之间。
实施例3 427AIL15DEL，427AIL15FCTM，427AIL15N72DDEL， 427AIL15N72D细胞的制备及鉴定
将427A细胞密度调整至适当浓度，加入病毒200μL及1000μL细胞，同时添加聚凝胺8μg/mL；
次日，将所有的细胞离心，加入新鲜的培养基，继续培养。每隔1天进行补液，使维持细胞密度在3E5个/mL；待细胞生长起来后用流式细胞仪检测阳性率，同时流式分选阳性细胞并扩大培养。每天观察培养基的颜色变化、细胞密度、细胞形态并作相应记录；
之后进行2-3轮流式分选富集细胞，待细胞生长起来后利用流式细胞仪检测细胞阳性率；同时撤去IL2后进行细胞培养，如细胞生长状态不受影响，即证明IL15 super激动剂可以促进NK细胞生长以及增殖的功能；
取2-3轮分选的细胞，Western Blot检测IL15 super激动剂中IL15的表达情况，并同时检测撤去IL2培养后的细胞中IL15的表达情况。其中427A作为阴性对照，瞬转构建体IL15N72D基因的Lenti-X-293T细胞作为阳性对照，通过对细胞进行计数，确保每个泳道上样E5个细胞；
取2-3轮分选的细胞，提取RNA后进行反转录，以此作为模板，扩增 ROBO1-CAR和IL15 super激动剂基因，并通过测序验证基因插入情况。
对经过2-3轮流式分选后的细胞通过流式细胞仪进行阳性率的检测，结果统计如图3A所示，图中纵坐标阳性率(％)为APC荧光标记的抗体(该抗体可以用于检测IL15super分子的表达)检测的细胞阳性率统计结果。从结果中可以看出，这四株细胞稳定表达IL15super激动剂，且阳性率达到80％以上。进一步地，可进行单克隆分选实验；Western Blot是对IL15 super激动剂中IL15蛋白是否表达的验证，图3B结果表明这四株细胞无论是在含有IL2 (标记为+IL2)或撤去IL2(标记为-IL2)的培养条件下，均可以成功表达IL15 蛋白，进一步验证427A细胞稳定表达IL15 super激动剂；图3C所示的为这四株细胞中插入基因的扩增情况及测序结果，该结果表明从这四株细胞中均可正确扩增出ROBO1和IL15super激动剂基因的特异性条带。
实施例4 427AIL15DEL，427AIL15FCTM，427AIL15N72DDEL， 427AIL15N72D单克隆细胞株的筛选及阳性率检测
以构建体IL15FCTM为例，详细说明427AIL15FCTM细胞的制备过程， 427AIL15DEL、427AIL15N72DDEL、427AIL15N72D细胞制备过程与其相同。
取2-3轮分选的427AIL15FCTM等细胞，置于15mL EP中，1000rpm离心5min；
弃上清后，用5mL 427AIL15FCTM细胞培养上清重悬沉淀，取20μL进行计数；
调整细胞密度至E5个/mL后，按200μL/孔加入至96孔细胞培养板中，即1个/孔；
放置于37℃，5％CO2培养箱中培养；
待96孔板种的单克隆细胞生长起来后，挑选细胞团较大且为单个细胞克隆的细胞至24孔细胞培养板中；
细胞生长足够多时，各取500μL培养的细胞悬液移至1.5mL EP管中， 1500rpm离心3min；
弃上清，用1mL的PBS清洗一遍，1500rpm离心3min，弃上清；
用100μL的PBS重悬沉淀，分别加入2μL的APC-anti-human IgG Fc和 PE anti-DYKDDDDK混匀，避光室温孵育30min；
用1mL的PBS清洗一遍，1500rpm离心3min，弃上清，重复该步骤一次；
弃去上清，用200μL PBS重悬细胞沉淀，流式细胞仪进行检测。
部分单克隆阳性率筛选流式统计结果如图4所示，其中427AIL15DEL细胞选择单克隆编号为3C10和1G4的两株细胞；427AIL15FCTM选择单克隆编号为2G10和1B7的两株细胞；427AIL15N72DDEL选择1C11，1F9，1E10 三株细胞；427AIL15N72D选择2C9和2F11两株细胞，四种携带IL15 super 激动剂构建体的427A细胞均筛选出阳性率在90％以上的单克隆细胞。
实施例5细胞杀伤试验
对根据实施例4筛选得到的阳性率在90％以上的单克隆细胞进行体外杀伤实验，并根据靶细胞贴壁情况选择两种方式进行，具体步骤如下：
CCK8法：
靶细胞铺板(包括乳腺癌细胞T47D，T47D敲除ROBO1的细胞T47D.KO， T47D敲除ROBO1后Rescue ROBO1的单克隆细胞株T47D.KO.Recue.ROBO1， HeLa细胞，HCT116和HCT116过表达ROBO1的单克隆细胞株 HCT116-ROBO1，MDA-MB453等细胞)：靶细胞弃掉培养基，先用PBS润洗1次，吸掉PBS，加入3mL 0.25％胰酶，37℃、5％CO2消化8min，终止消化后，1500rpm离心5min，弃上清，用1mL新鲜培养基重悬，计数，根据细胞类型调整靶细胞密度，加入96孔板，每孔100μL，放入培养箱培养；
效应细胞计数：靶细胞贴壁后(约18-24h)，取427AIL15DEL，427AIL15FCTM，427AIL15N72DDEL，427AIL15N72D效应细胞，1500rpm 离心5min，弃上清，用1mL新鲜培养基重悬，计数，调整每株效应细胞密度，根据效靶比例加入相应体积的效应细胞，不足100μL补加培养基至100μL；
加效/靶细胞：取出培养箱中96孔板，弃去上清，按照一定的效靶比例，每孔加入100μL调整好密度的效应细胞，一组不加效应细胞作为阴性对照， 37℃、5％CO2杀伤2h；
加入CCK8反应2h后，吸掉上清，用200μL PBS清洗2次96孔板，吸掉PBS后，加入含10％CCK8的PBS，每孔100μL，放入培养箱孵育1小时，上机检测(OD450)OD450。
细胞杀伤(CFSE法)：
将HBL100靶细胞弃掉培养基，先用PBS润洗1次，吸掉PBS，加入3mL 0.25％胰酶，37℃、5％CO2消化2min，终止消化后，1500rpm离心5min，弃上清，用1mL新鲜培养基重悬；
HBL100靶细胞染色：每2E6个细胞中加入20μL的CFSE(使用浓度为 50μM)，37℃避光孵育15min。PBS清洗两次，新鲜培养基重悬，计数调整细胞密度至1.6E5/mL；500μL/管，分装至1.5mL离心管中待用；
效应细胞计数，根据实验需求以及效靶比例(效靶比例为1：1和2：1)，计算所需要的效应细胞和靶细胞数目；
杀伤孵育：37℃、5％CO2杀伤2h后离心，弃培养基，用PBS清洗2遍， 100μL PBS重悬，加入5μL 7-AAD，放于37℃避光孵育2h；
流式检测：CFSE为FITC通道；7-AAD为PerCP通道；在分析时首先对靶细胞和效应细胞进行圈门，区分靶细胞和效应细胞所在的位置，选定靶细胞后，然后对PerCP通道(标记死细胞)进行分析。
结果如图5A-图5K所示，可以看出，本发明中携带IL15 super激动剂的 ROBO1CAR-NK细胞对靶细胞T47D(图5A，图5I)、MDA-MB453(图5H))、HeLa(图5D)等有较好地杀伤效率，通过对T47D.KO(图5B，图5J)和 T47D.KO.Recue.ROBO1(图5C，图5K)细胞的杀伤结果可以看出， 427AIL15DEL，427AIL15FCTM，427AIL15N72DDEL，427AIL15N72D细胞具有较强的靶点特异性性，对细胞的杀伤为特异性杀伤。从对HBL100细胞 (图5G)的杀伤结果来看，这些细胞的脱靶效率很低，安全性较好。另外，用无IL2添加培养条件下生长起来的427AIL15DEL，427AIL15FCTM， 427AIL15N72DDEL，427AIL15N72D细胞对MDA-MB453(图5H)、T47D (图5I)、T47D.KO(图5J)、T47D.KO.Rescue.ROBO1(图5K)靶细胞进行杀伤，该杀伤结果表明：与用含有IL2培养条件下的细胞杀伤效果无显著性差异，说明该细胞可以不依赖于IL2的方式增殖，并保持原有对靶细胞的特异性杀伤能力，且安全性好。
实施例6 427AIL15DEL，427AIL15FCTM，427AIL15N72DDEL， 427AIL15N72D细胞表型检测
通过检测427AIL15DEL，427AIL15FCTM，427AIL15N72DDEL， 427AIL15N72D细胞中NKG2D激活型受体的表达水平来评估这些细胞本身的活化水平，以及对靶细胞的杀伤能力，具体检测步骤如下：
取出500μL的427AIL15DEL，427AIL15FCTM，427AIL15N72DDEL， 427AIL15N72D效应细胞至1.5mL离心管中，1500rpm离心5min；
1mL PBS重悬、洗涤一遍；
100μL PBS重悬，留取一管作为对照，其余均加入2μL的PE-NKG2D抗体，室温避光染色30min；
加1mL PBS，1500rpm离心5min，弃上清后再加入1mL的PBS重悬， 1500rpm离心5min，弃上清后加100μL的PBS重悬后，上流式仪进行检测。
结果表明427AIL15DEL，427AIL15FCTM，427AIL15N72DDEL， 427AIL15N72D细胞中NKG2D的表达水平均呈现明显的上调，证明在ROBO1 CAR-NK细胞株中携带IL15 super激动剂后能明显的增强其细胞的活化水平；并且根据实施例5对靶细胞杀伤能力的检测结果可知，4种携带不同IL15 super激动剂形式的ROBO1 CAR-NK细胞的杀伤效率与其细胞表面激活性受体的表达高低有一定相关性；
实施例7 427AIL15DEL，427AIL15FCTM，427AIL15N72DDEL， 427AIL15N72D细胞因子分泌情况检测
将MDA-MB453与效应细胞共孵育杀伤2h后，取上清，进行细胞因子的检测。该检测结果可用于评估杀伤前后靶细胞对效应细胞的刺激情况、效应细胞的杀伤潜能和潜在的细胞因子风暴的风险，具体检测步骤如下：
1.细胞杀伤操作步骤参考实施例5(CFSE法)；
2.对靶细胞杀伤两小时之后，离心3500rpm，5min，取新的1.5mL管收集细胞上清；
3.细胞因子样本处理：按照本实验购买的细胞因子试剂盒说明书(试剂盒名称：LEGENDplex Multi-Analyte Flow Assay Kit，Human CD8/NK Panel 13-plex；厂家：BioLegend；货号：740267)进行处理样本，简单操作步骤见下；
4.标准品准备：①用250μL Assay Buffer重悬标准品；②室温静置10分钟，然后将标准液转移到1.5mL EP管中，这将用作最高标准液C7；③将6个1.5 mL EP管分别标记为C6，C5，C4，C3，C2和C1；④六个1.5mL EP管中各加75μL Assay Buffer，通过将25μL最高标准液C7转移到C6管中来制备最高标准1：4的稀释液，并充分混合。作为C6标准液；⑤以相同的方式，以 1：4的比例进行稀释以获得C5，C4，C3，C2和C1标准液，Assay Buffer将用作0pg/mL标准液(C0)；
5.样品管及标准管处理：①向样品管中添加25μL Assay Buffer，标准管加 25μL细胞培养基；②将25μL的标准液添加到标准管中；③将每个样品25μL 加到样品管中；④将25μL 的Premix加入所有试管中；⑤在所有试管中添加 25μL检测抗体；
6.用铝箔纸覆盖整个板架，以防止管/板受光。室温下，在平板振荡器上摇动(大约600rpm)摇动2小时；
7.在不清洗试管的情况下，向每个试管中添加25μL SA-PE；
8.用铝箔纸覆盖整个板架，在室温下在平板振荡器上摇动(大约600rpm) 摇动30min；
9. 2000rpm离心管5分钟，除去上清液；
10.向所有试管中加入200μL 1X洗涤缓冲液。通过涡旋或在平板振荡器上摇动1分钟，重悬磁珠，以2000rpm的速度离心管5分钟，除去上清液；
11.在每个试管中加入200μL 1X洗涤缓冲液，通过涡旋或振荡器重悬磁珠；
12.通过流式细胞仪分析，读取样品数值；
13.数据处理：从计算机上将结果导出，使用试剂盒中专用软件进行分析，使用说明书中专用步骤进行分析，统计excel中不同因子的数据，使用Graph padprism软件进行编辑、分析。
根据检测结果可知(图7A，图7B，图7C，图7D)，IL6浓度较低，表明潜在的细胞因子风暴风险较低，TNFα、IFNγ在杀伤刺激下有明显提升，该结果表明细胞株具有潜在的激发抗肿瘤反应潜能。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述所述，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
序列表
<110> 阿思科力（苏州）生物科技有限公司
<120> 构件体、载体、蛋白、细胞、制备方法、产品及应用
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
ggaggcggcg gaagcggagg aggaggcagc ggaggcggag gcagc 45
<210> 2
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
ggaggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc ggcggaggcg gaagc 45
<210> 3
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 3
atggctctgc ccgtgacagc tctgctgctg cccctcgctc tgctcctcca tgctgctaga 60
ccc 63
<210> 4
<211> 990
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 4
gccagcacaa agggccctag cgtgtttcct ctcgccccct ccagcaagag cacatccgga 60
ggcaccgctg ctctcggatg tctggtgaaa gactacttcc ccgaacccgt gacagtcagc 120
tggaatagcg gagccctcac atccggcgtg cacacctttc ccgccgtcct ccaatccagc 180
ggactctata gcctcagctc cgtggtgaca gtgcccagct cctccctcgg cacccagaca 240
tacatttgca acgtcaatca caagccttcc aacaccaagg tggacaagaa ggtggagcct 300
aagtccgccg acaagaccca taccgctccc ccttgccccg cccccgaact gctgggagga 360
cctagcgtct ttctcttccc tcccaagccc aaggacaccc tcatgatcag cagaaccccc 420
gaggtcacat gcgtcgtcgt ggatgtcagc catgaagacc ccgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtcgaagt gcataatgcc aagaccaagc ctagagaaga gcagtacaac 540
tccacctata gagtcgtcag cgtgctgaca gtgctccacc aagactggct gaacggcaaa 600
gagtacaagt gcaaggtcag caacaaagct ctgcccgctc ccattgagaa gaccatcagc 660
aaggccaagg gccaacctag agaacctcaa gtgtacaccc tccccccttc tagggacgag 720
ctgaccaaga atcaagtgtc tctgacatgc ctcgtcaagg gcttctaccc tagcgacatc 780
gctgtggagt gggagtccaa tggccagccc gaaaacaact acaagaccac ccctcccgtg 840
ctcgactccg acggcagctt ctttctgtac agcaagctga ccgtggacaa atctaggtgg 900
cagcaaggca acgtctttag ctgcagcgtg atgcacgagg ctctgcacaa ccactacacc 960
caaaagtctc tgtctctgtc ccccggaaaa 990
<210> 5
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 5
accaccacac ccgcccctag acctcccacc cccgccccta ccatcgcttc ccagcctctg 60
tctctgaggc ccgaggcttg tagacccgcc gctggaggcg ctgtccatac aagaggactg 120
gactttgctt gcgac 135
<210> 6
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 6
atttacatct gggcccctct ggctggcaca tgtggagtgc tgctgctgtc tctggtcatc 60
accctctact gt 72
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 7
ctgtactgca accatagaaa tagaagaagg gtg 33
<210> 8
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 8
aactgggtga acgtgatcag cgatctgaag aagatcgagg acctcatcca gtccatgcac 60
attgacgcca cactctacac agagtccgac gtgcatccca gctgcaaggt gacagccatg 120
aagtgctttc tgctcgagct gcaagtgatt tctctggaaa gcggagacgc cagcatccat 180
gacaccgtgg agaacctcat cattctggcc aacaactctc tgagcagcaa tggcaatgtg 240
accgaaagcg gctgcaagga atgtgaggag ctggaggaga agaacatcaa ggagtttctg 300
cagagcttcg tgcacatcgt gcagatgttc atcaacacaa gc 342
<210> 9
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 9
aactgggtga acgtgatcag cgatctgaag aagatcgagg acctcatcca gtccatgcac 60
attgacgcca cactctacac agagtccgac gtgcatccca gctgcaaggt gacagccatg 120
aagtgctttc tgctcgagct gcaagtgatt tctctggaaa gcggagacgc cagcatccat 180
gacaccgtgg agaacctcat cattctggcc aacgactctc tgagcagcaa tggcaatgtg 240
accgaaagcg gctgcaagga atgtgaggag ctggaggaga agaacatcaa ggagtttctg 300
cagagcttcg tgcacatcgt gcagatgttc atcaacacaa gc 342
<210> 10
<211> 525
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 10
atcacatgtc ctccccctat gtccgtggag cacgccgaca tttgggtcaa gagctactcc 60
ctctactcta gggagaggta catctgtaac tccggcttca agaggaaagc cggaaccagc 120
agcctcaccg agtgtgtgct gaacaaggcc accaacgtgg cccattggac caccccctcc 180
ctcaaatgta ttagagaccc cgctctggtc catcagagac ccgcccctcc ctccacagtg 240
accacagctg gagtgacacc tcaacccgag tctctgagcc ccagcggaaa ggagcccgcc 300
gccagcagcc ctagctccaa caataccgcc gctacaaccg ccgctatcgt gcccggcagc 360
cagctgatgc ccagcaaaag cccctccacc ggcaccaccg agatcagcag ccatgaaagc 420
tcccatggca cacctagcca aaccaccgct aaaaactggg agctgacagc cagcgcttcc 480
catcagcccc ccggcgtgta tccccaaggc catagcgaca caacc 525
<210> 11
<211> 195
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 11
atcacatgtc ctccccctat gtccgtggag cacgccgaca tttgggtcaa gagctactcc 60
ctctactcta gggagaggta catctgtaac tccggcttca agaggaaagc cggaaccagc 120
agcctcaccg agtgtgtgct gaacaaggcc accaacgtgg cccattggac caccccctcc 180
ctcaaatgta ttaga 195
<210> 12
<211> 1923
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 12
atggctctgc ccgtgacagc tctgctgctg cccctcgctc tgctcctcca tgctgctaga 60
cccaactggg tgaacgtgat cagcgatctg aagaagatcg aggacctcat ccagtccatg 120
cacattgacg ccacactcta cacagagtcc gacgtgcatc ccagctgcaa ggtgacagcc 180
atgaagtgct ttctgctcga gctgcaagtg atttctctgg aaagcggaga cgccagcatc 240
catgacaccg tggagaacct catcattctg gccaacaact ctctgagcag caatggcaat 300
gtgaccgaaa gcggctgcaa ggaatgtgag gagctggagg agaagaacat caaggagttt 360
ctgcagagct tcgtgcacat cgtgcagatg ttcatcaaca caagcggagg cggcggcagc 420
ggcggcggcg gcagcggcgg aggcggaagc atcacatgtc ctccccctat gtccgtggag 480
cacgccgaca tttgggtcaa gagctactcc ctctactcta gggagaggta catctgtaac 540
tccggcttca agaggaaagc cggaaccagc agcctcaccg agtgtgtgct gaacaaggcc 600
accaacgtgg cccattggac caccccctcc ctcaaatgta ttagaggagg cggcggaagc 660
ggaggaggag gcagcggagg cggaggcagc gccagcacaa agggccctag cgtgtttcct 720
ctcgccccct ccagcaagag cacatccgga ggcaccgctg ctctcggatg tctggtgaaa 780
gactacttcc ccgaacccgt gacagtcagc tggaatagcg gagccctcac atccggcgtg 840
cacacctttc ccgccgtcct ccaatccagc ggactctata gcctcagctc cgtggtgaca 900
gtgcccagct cctccctcgg cacccagaca tacatttgca acgtcaatca caagccttcc 960
aacaccaagg tggacaagaa ggtggagcct aagtccgccg acaagaccca taccgctccc 1020
ccttgccccg cccccgaact gctgggagga cctagcgtct ttctcttccc tcccaagccc 1080
aaggacaccc tcatgatcag cagaaccccc gaggtcacat gcgtcgtcgt ggatgtcagc 1140
catgaagacc ccgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtcgaagt gcataatgcc 1200
aagaccaagc ctagagaaga gcagtacaac tccacctata gagtcgtcag cgtgctgaca 1260
gtgctccacc aagactggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtcag caacaaagct 1320
ctgcccgctc ccattgagaa gaccatcagc aaggccaagg gccaacctag agaacctcaa 1380
gtgtacaccc tccccccttc tagggacgag ctgaccaaga atcaagtgtc tctgacatgc 1440
ctcgtcaagg gcttctaccc tagcgacatc gctgtggagt gggagtccaa tggccagccc 1500
gaaaacaact acaagaccac ccctcccgtg ctcgactccg acggcagctt ctttctgtac 1560
agcaagctga ccgtggacaa atctaggtgg cagcaaggca acgtctttag ctgcagcgtg 1620
atgcacgagg ctctgcacaa ccactacacc caaaagtctc tgtctctgtc ccccggaaaa 1680
accaccacac ccgcccctag acctcccacc cccgccccta ccatcgcttc ccagcctctg 1740
tctctgaggc ccgaggcttg tagacccgcc gctggaggcg ctgtccatac aagaggactg 1800
gactttgctt gcgacattta catctgggcc cctctggctg gcacatgtgg agtgctgctg 1860
ctgtctctgg tcatcaccct ctactgtctg tactgcaacc atagaaatag aagaagggtg 1920
tga 1923
<210> 13
<211> 2253
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 13
atggctctgc ccgtgacagc tctgctgctg cccctcgctc tgctcctcca tgctgctaga 60
cccaactggg tgaacgtgat cagcgatctg aagaagatcg aggacctcat ccagtccatg 120
cacattgacg ccacactcta cacagagtcc gacgtgcatc ccagctgcaa ggtgacagcc 180
atgaagtgct ttctgctcga gctgcaagtg atttctctgg aaagcggaga cgccagcatc 240
catgacaccg tggagaacct catcattctg gccaacaact ctctgagcag caatggcaat 300
gtgaccgaaa gcggctgcaa ggaatgtgag gagctggagg agaagaacat caaggagttt 360
ctgcagagct tcgtgcacat cgtgcagatg ttcatcaaca caagcggagg cggcggcagc 420
ggcggcggcg gcagcggcgg aggcggaagc atcacatgtc ctccccctat gtccgtggag 480
cacgccgaca tttgggtcaa gagctactcc ctctactcta gggagaggta catctgtaac 540
tccggcttca agaggaaagc cggaaccagc agcctcaccg agtgtgtgct gaacaaggcc 600
accaacgtgg cccattggac caccccctcc ctcaaatgta ttagagaccc cgctctggtc 660
catcagagac ccgcccctcc ctccacagtg accacagctg gagtgacacc tcaacccgag 720
tctctgagcc ccagcggaaa ggagcccgcc gccagcagcc ctagctccaa caataccgcc 780
gctacaaccg ccgctatcgt gcccggcagc cagctgatgc ccagcaaaag cccctccacc 840
ggcaccaccg agatcagcag ccatgaaagc tcccatggca cacctagcca aaccaccgct 900
aaaaactggg agctgacagc cagcgcttcc catcagcccc ccggcgtgta tccccaaggc 960
catagcgaca caaccggagg cggcggaagc ggaggaggag gcagcggagg cggaggcagc 1020
gccagcacaa agggccctag cgtgtttcct ctcgccccct ccagcaagag cacatccgga 1080
ggcaccgctg ctctcggatg tctggtgaaa gactacttcc ccgaacccgt gacagtcagc 1140
tggaatagcg gagccctcac atccggcgtg cacacctttc ccgccgtcct ccaatccagc 1200
ggactctata gcctcagctc cgtggtgaca gtgcccagct cctccctcgg cacccagaca 1260
tacatttgca acgtcaatca caagccttcc aacaccaagg tggacaagaa ggtggagcct 1320
aagtccgccg acaagaccca taccgctccc ccttgccccg cccccgaact gctgggagga 1380
cctagcgtct ttctcttccc tcccaagccc aaggacaccc tcatgatcag cagaaccccc 1440
gaggtcacat gcgtcgtcgt ggatgtcagc catgaagacc ccgaggtcaa gttcaactgg 1500
tacgtggacg gcgtcgaagt gcataatgcc aagaccaagc ctagagaaga gcagtacaac 1560
tccacctata gagtcgtcag cgtgctgaca gtgctccacc aagactggct gaacggcaaa 1620
gagtacaagt gcaaggtcag caacaaagct ctgcccgctc ccattgagaa gaccatcagc 1680
aaggccaagg gccaacctag agaacctcaa gtgtacaccc tccccccttc tagggacgag 1740
ctgaccaaga atcaagtgtc tctgacatgc ctcgtcaagg gcttctaccc tagcgacatc 1800
gctgtggagt gggagtccaa tggccagccc gaaaacaact acaagaccac ccctcccgtg 1860
ctcgactccg acggcagctt ctttctgtac agcaagctga ccgtggacaa atctaggtgg 1920
cagcaaggca acgtctttag ctgcagcgtg atgcacgagg ctctgcacaa ccactacacc 1980
caaaagtctc tgtctctgtc ccccggaaaa accaccacac ccgcccctag acctcccacc 2040
cccgccccta ccatcgcttc ccagcctctg tctctgaggc ccgaggcttg tagacccgcc 2100
gctggaggcg ctgtccatac aagaggactg gactttgctt gcgacattta catctgggcc 2160
cctctggctg gcacatgtgg agtgctgctg ctgtctctgg tcatcaccct ctactgtctg 2220
tactgcaacc atagaaatag aagaagggtg tga 2253
<210> 14
<211> 1983
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 14
atggctctgc ccgtgacagc tctgctgctg cccctcgctc tgctcctcca tgctgctaga 60
atggctctgc ccgtgacagc tctgctgctg cccctcgctc tgctcctcca tgctgctaga 120
cccaactggg tgaacgtgat cagcgatctg aagaagatcg aggacctcat ccagtccatg 180
cacattgacg ccacactcta cacagagtcc gacgtgcatc ccagctgcaa ggtgacagcc 240
atgaagtgct ttctgctcga gctgcaagtg atttctctgg aaagcggaga cgccagcatc 300
catgacaccg tggagaacct catcattctg gccaacgact ctctgagcag caatggcaat 360
gtgaccgaaa gcggctgcaa ggaatgtgag gagctggagg agaagaacat caaggagttt 420
ctgcagagct tcgtgcacat cgtgcagatg ttcatcaaca caagcggagg cggcggcagc 480
ggcggcggcg gcagcggcgg aggcggaagc atcacatgtc ctccccctat gtccgtggag 540
cacgccgaca tttgggtcaa gagctactcc ctctactcta gggagaggta catctgtaac 600
tccggcttca agaggaaagc cggaaccagc agcctcaccg agtgtgtgct gaacaaggcc 660
accaacgtgg cccattggac caccccctcc ctcaaatgta ttagaggagg cggcggaagc 720
ggaggaggag gcagcggagg cggaggcagc gccagcacaa agggccctag cgtgtttcct 780
ctcgccccct ccagcaagag cacatccgga ggcaccgctg ctctcggatg tctggtgaaa 840
gactacttcc ccgaacccgt gacagtcagc tggaatagcg gagccctcac atccggcgtg 900
cacacctttc ccgccgtcct ccaatccagc ggactctata gcctcagctc cgtggtgaca 960
gtgcccagct cctccctcgg cacccagaca tacatttgca acgtcaatca caagccttcc 1020
aacaccaagg tggacaagaa ggtggagcct aagtccgccg acaagaccca taccgctccc 1080
ccttgccccg cccccgaact gctgggagga cctagcgtct ttctcttccc tcccaagccc 1140
aaggacaccc tcatgatcag cagaaccccc gaggtcacat gcgtcgtcgt ggatgtcagc 1200
catgaagacc ccgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtcgaagt gcataatgcc 1260
aagaccaagc ctagagaaga gcagtacaac tccacctata gagtcgtcag cgtgctgaca 1320
gtgctccacc aagactggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtcag caacaaagct 1380
ctgcccgctc ccattgagaa gaccatcagc aaggccaagg gccaacctag agaacctcaa 1440
gtgtacaccc tccccccttc tagggacgag ctgaccaaga atcaagtgtc tctgacatgc 1500
ctcgtcaagg gcttctaccc tagcgacatc gctgtggagt gggagtccaa tggccagccc 1560
gaaaacaact acaagaccac ccctcccgtg ctcgactccg acggcagctt ctttctgtac 1620
agcaagctga ccgtggacaa atctaggtgg cagcaaggca acgtctttag ctgcagcgtg 1680
atgcacgagg ctctgcacaa ccactacacc caaaagtctc tgtctctgtc ccccggaaaa 1740
accaccacac ccgcccctag acctcccacc cccgccccta ccatcgcttc ccagcctctg 1800
tctctgaggc ccgaggcttg tagacccgcc gctggaggcg ctgtccatac aagaggactg 1860
gactttgctt gcgacattta catctgggcc cctctggctg gcacatgtgg agtgctgctg 1920
ctgtctctgg tcatcaccct ctactgtctg tactgcaacc atagaaatag aagaagggtg 1980
tga 1983
<210> 15
<211> 2253
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 15
atggctctgc ccgtgacagc tctgctgctg cccctcgctc tgctcctcca tgctgctaga 60
cccaactggg tgaacgtgat cagcgatctg aagaagatcg aggacctcat ccagtccatg 120
cacattgacg ccacactcta cacagagtcc gacgtgcatc ccagctgcaa ggtgacagcc 180
atgaagtgct ttctgctcga gctgcaagtg atttctctgg aaagcggaga cgccagcatc 240
catgacaccg tggagaacct catcattctg gccaacgact ctctgagcag caatggcaat 300
gtgaccgaaa gcggctgcaa ggaatgtgag gagctggagg agaagaacat caaggagttt 360
ctgcagagct tcgtgcacat cgtgcagatg ttcatcaaca caagcggagg cggcggcagc 420
ggcggcggcg gcagcggcgg aggcggaagc atcacatgtc ctccccctat gtccgtggag 480
cacgccgaca tttgggtcaa gagctactcc ctctactcta gggagaggta catctgtaac 540
tccggcttca agaggaaagc cggaaccagc agcctcaccg agtgtgtgct gaacaaggcc 600
accaacgtgg cccattggac caccccctcc ctcaaatgta ttagagaccc cgctctggtc 660
catcagagac ccgcccctcc ctccacagtg accacagctg gagtgacacc tcaacccgag 720
tctctgagcc ccagcggaaa ggagcccgcc gccagcagcc ctagctccaa caataccgcc 780
gctacaaccg ccgctatcgt gcccggcagc cagctgatgc ccagcaaaag cccctccacc 840
ggcaccaccg agatcagcag ccatgaaagc tcccatggca cacctagcca aaccaccgct 900
aaaaactggg agctgacagc cagcgcttcc catcagcccc ccggcgtgta tccccaaggc 960
catagcgaca caaccggagg cggcggaagc ggaggaggag gcagcggagg cggaggcagc 1020
gccagcacaa agggccctag cgtgtttcct ctcgccccct ccagcaagag cacatccgga 1080
ggcaccgctg ctctcggatg tctggtgaaa gactacttcc ccgaacccgt gacagtcagc 1140
tggaatagcg gagccctcac atccggcgtg cacacctttc ccgccgtcct ccaatccagc 1200
ggactctata gcctcagctc cgtggtgaca gtgcccagct cctccctcgg cacccagaca 1260
tacatttgca acgtcaatca caagccttcc aacaccaagg tggacaagaa ggtggagcct 1320
aagtccgccg acaagaccca taccgctccc ccttgccccg cccccgaact gctgggagga 1380
cctagcgtct ttctcttccc tcccaagccc aaggacaccc tcatgatcag cagaaccccc 1440
gaggtcacat gcgtcgtcgt ggatgtcagc catgaagacc ccgaggtcaa gttcaactgg 1500
tacgtggacg gcgtcgaagt gcataatgcc aagaccaagc ctagagaaga gcagtacaac 1560
tccacctata gagtcgtcag cgtgctgaca gtgctccacc aagactggct gaacggcaaa 1620
gagtacaagt gcaaggtcag caacaaagct ctgcccgctc ccattgagaa gaccatcagc 1680
aaggccaagg gccaacctag agaacctcaa gtgtacaccc tccccccttc tagggacgag 1740
ctgaccaaga atcaagtgtc tctgacatgc ctcgtcaagg gcttctaccc tagcgacatc 1800
gctgtggagt gggagtccaa tggccagccc gaaaacaact acaagaccac ccctcccgtg 1860
ctcgactccg acggcagctt ctttctgtac agcaagctga ccgtggacaa atctaggtgg 1920
cagcaaggca acgtctttag ctgcagcgtg atgcacgagg ctctgcacaa ccactacacc 1980
caaaagtctc tgtctctgtc ccccggaaaa accaccacac ccgcccctag acctcccacc 2040
cccgccccta ccatcgcttc ccagcctctg tctctgaggc ccgaggcttg tagacccgcc 2100
gctggaggcg ctgtccatac aagaggactg gactttgctt gcgacattta catctgggcc 2160
cctctggctg gcacatgtgg agtgctgctg ctgtctctgg tcatcaccct ctactgtctg 2220
tactgcaacc atagaaatag aagaagggtg tga 2253
<210> 16
<211> 1482
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 16
atggccctgc ctgtgacagc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgccgctaga 60
cccgattaca aggatgacga cgataagggt ggtggtggtt ctatccagat gacacagact 120
acatcctccc tgtctgcctc tctgggagac agagtcacca tcagttgcag ggcaagtcag 180
gacattagca attttttaaa ctggtatcag cagaaaccag atggaactgt taaactcctg 240
atctacgcga catcaagatt acattctgga gtcccatcaa ggttcagtgg cagtgggtct 300
ggaacagatt tttctctcac cattagcaaa ctggagcaag aagatattgc cacttacttt 360
tgccaacagg gtaatacgct tccacttacg ttcggcgctg ggacaaagtt ggaacttaaa 420
ggtggtggtg gttctggcgg cggcggctcc ggaggaggag gatcgctgca acagtctgga 480
cctgagttgg tgaagcctgg ggcttcagtg aagatttcct gcaaggcttc tggatacaca 540
ttcactgact actacatgaa ttgggtgaag cttagccatg gaaagagcct tgagtggatt 600
ggagatattg ttcctaacaa tggtgatact acttacaacc agaatttcag aggcaaggcc 660
acattgactg tagacaagtc ctccagcaca gcctacatgg agctccgcag cctgacatct 720
gaggactctg cagtctatta ctgtgcaaga ttcagtaatt acgtttaccc ttttgactac 780
tggggccaag gcaccactat cacagtctcc accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 840
ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 900
gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg 960
cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaaa 1020
cggggcagaa agaaactcct gtatatattc aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact 1080
actcaagagg aagatggctg tagctgccga tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa 1140
ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 1200
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1260
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1320
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1380
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1440
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgct aa 1482
<210> 17
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 17
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 18
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 18
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Ala Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 19
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 19
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 20
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 20
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 21
Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Arg Arg Val
1 5 10
<210> 22
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 22
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser
<210> 23
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 23
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser
<210> 24
<211> 175
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 24
Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val
1 5 10 15
Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly
20 25 30
Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn
35 40 45
Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile
50 55 60
Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val
65 70 75 80
Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly
85 90 95
Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala Thr
100 105 110
Thr Ala Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser Pro
115 120 125
Ser Thr Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly Thr
130 135 140
Pro Ser Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala Ser
145 150 155 160
His Gln Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr
165 170 175
<210> 25
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 25
Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val
1 5 10 15
Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly
20 25 30
Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn
35 40 45
Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile
50 55 60
Arg
65
<210> 26
<211> 640
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 26
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1 5 10 15
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20 25 30
Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr
35 40 45
Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe
50 55 60
Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile
65 70 75 80
His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser
85 90 95
Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu
100 105 110
Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg
165 170 175
Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
225 230 235 240
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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115 120 125
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340 345 350
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<211> 640
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<400> 28
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
245 250 255
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Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
485 490 495
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500 505 510
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
515 520 525
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
530 535 540
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
545 550 555 560
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565 570 575
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
580 585 590
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
595 600 605
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610 615 620
Ile Thr Leu Tyr Cys Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Arg Arg Val
625 630 635 640
<210> 29
<211> 750
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 29
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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450 455 460
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
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675 680 685
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Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
725 730 735
Leu Tyr Cys Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Arg Arg Val
740 745 750
<210> 30
<211> 493
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 30
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ser Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu
35 40 45
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Gln Gln Ser Gly
145 150 155 160
Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala
165 170 175
Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Lys Leu Ser
180 185 190
His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Asp Ile Val Pro Asn Asn Gly
195 200 205
Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Asn Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val
210 215 220
Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser
225 230 235 240
Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Ser Asn Tyr Val Tyr
245 250 255
Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Ile Thr Val Ser Thr Thr
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
275 280 285
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
290 295 300
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
305 310 315 320
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
325 330 335
Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
340 345 350
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
355 360 365
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
370 375 380
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
385 390 395 400
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
405 410 415
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
420 425 430
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
435 440 445
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
450 455 460
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465 470 475 480
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