一种提高无细胞体系蛋白质合成的方法
阅读说明：本技术 一种提高无细胞体系蛋白质合成的方法 (Method for improving protein synthesis of cell-free system ) 是由 韩鲲 开雷 连佳长 岳珂 马毅 于 2021-09-03 设计创作，主要内容包括：本发明涉及无细胞体系蛋白质合成技术领域,尤其涉及一种提高无细胞体系蛋白质合成的方法,针对现有的无细胞体系蛋白质合成技术仍存在合成蛋白质的效率较低的问题,现提出如下方案,其中包括以下步骤：S1：材料选择,S2：转录及翻译,S3：蛋白质合成,S4：生物调控,S5：检验成果,本发明的目的是通过荧光标记模板DNA,对蛋白质的合成过程进行观察,便于后续对蛋白质的合成速度进行调控,并通过弱化作用对合成蛋白质的过程进行调控,提高蛋白质的合成效率。(The invention relates to the technical field of cell-free system protein synthesis, in particular to a method for improving the cell-free system protein synthesis, which aims at solving the problem that the existing cell-free system protein synthesis technology still has low protein synthesis efficiency, and provides the following scheme, wherein the method comprises the following steps: s1: material selection, S2: transcription and translation, S3: protein synthesis, S4: biological regulation, S5: the invention aims to observe the synthesis process of protein by fluorescence labeling of template DNA, facilitate subsequent regulation and control of the synthesis speed of protein, regulate and control the process of synthesizing protein by weakening action and improve the synthesis efficiency of protein.)
技术领域
本发明涉及无细胞体系蛋白质合成技术领域，尤其涉及一种提高无细胞体系蛋白质合成的方法。
背景技术
微生物学创始人巴斯德最早采用无细胞体系研究酵母酒精发酵中起作用的酶系问题。20世纪50年代生物学家首次采用兔网织红细胞裂解物(rabbitreticulocytelysate)制备的无细胞系统实现了蛋白质的体外合成。到了20世纪80年代中期，苏联学者Spirin等人通过在无细胞体系中连续流加能量和底物，从而大大的延长了反应时间和提高了蛋白质的合成产量。此后，无细胞蛋白质合成系统成了生物工程领域中的研究前沿和热点之一，发展了多种原核和真核无细胞蛋白质合成系统，在最近20多年中，对无细胞系统中的蛋白质合成的反应机制和调控、能量供应、遗传模板稳定性、反应器设计和操作等方面进行了大量的研究。不仅能够直接应用PCR产物作为模板合成蛋白质，而且在体外重组蛋白质生产、高通量蛋白质合成、功能蛋白质组研究和蛋白质体外定向进化等方面展示了良好的应用前景。但是目前现有的无细胞体系蛋白质合成技术仍存在合成蛋白质的效率较低等问题。
因此，我们提出了一种提高无细胞体系蛋白质合成的方法用于解决上述问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决目前现有的无细胞体系蛋白质合成技术仍存在合成蛋白质的效率较低等问题，而提出的一种提高无细胞体系蛋白质合成的方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种提高无细胞体系蛋白质合成的方法，包括以下步骤：
S1：材料选择：选择无细胞蛋白质合成所需的模板及其他用料；
S2：转录及翻译：以DNA中的一条单链为模板合成RNA链，再以 mRNA作为模板进行翻译，为蛋白质的合成做好准备；
S3：蛋白质合成：在tRNA和rRNA以及许多酶和蛋白质因子的参与下，按mRNA中的酸顺序形成特定的肽链，通过肽链盘区折叠形成蛋白质；
S4：生物调控：通过弱化作用实现对蛋白质合成速度的控制；
S5：检验成果：通过质谱仪对合成的蛋白质进行鉴定，并对鉴定出的蛋白质进行分析；
优选的，所述S1中，选择真核细胞，将真核细胞进行离心获得所需的DNA作为模板，并在细胞抽提物的酶系中补充氨基酸、底物和能量来合成蛋白质的体外系统，其中所述真核细胞进行离心时采用密度梯度离心法获得所需的DNA作为模板，并将获得DNA进行提纯获得高纯度DNA，将得到的高纯度DNA进行荧光标记，其中采用同位素标记法标记硫元素；
优选的，所述S2中，所述转录过程是以DNA中的一条单链为模板，游离碱基为原料，在DNA依赖的RNA聚合酶催化下合成RNA链的过程，所述翻译过程是以mRNA作为模板，tRNA作为运载工具，在有关酶、辅助因子和能量的作用下将活化的氨基酸在核糖体上装配为蛋白质多肽链的过程，其中进行转录时一个基因会被读取并被复制为 mRNA，即特定的DNA片断作为遗传信息模板，通过依赖DNA的RNA聚合酶作为催化剂，通过碱基互补的原则合成前体mRNA，并以所述mRNA 为模板，在核糖体的作用下进行翻译由tRNA将mRNA上的核苷酸序列转换为氨基酸序列合成多肽链的过程，且转录过程中，DNA模板被转录方向是从3′端向5′端，RNA链的合成方向是从5′端向3′端，其中3′端都要加CCA，RNA的转录第一步合成原始转录产物，且转录起始是由RNA聚合酶结合启动子区域形成由酶、DNA和核苷三磷酸 (NTP)构成的三元起始复合物，转录结束是由终止子决定的，释放 RNA聚合酶和合成的RNA；
优选的，所述S3中，通过翻译由tRNA将mRNA上的核苷酸序列转换为氨基酸序列合成多肽链，其中在进行合成多肽链之前需先经过活化，然后再与其特异的tRNA结合，带到mRNA相应的位置上，这个过程需要tRNA合成酶催化，其中tRNA合成酶催化特定的氨基酸与特异的tRNA相结合，生成各种氨基酰tRNA，每种氨基酸都靠其特有合成酶催化，使之和相对应的tRNA结合，在氨基酰tRNA合成酶催化下，利用ATP供能，在氨基酸羧基上进行活化，形成氨基酰-AMP，再与氨基酰tRNA合成酶结合形成三联复合物，此复合物再与特异的tRNA作用，将氨基酰转移到tRNA的3′-末端CCA-OH(氨基酸臂)，形成多肽链后通过多肽链进行盘曲折叠形成蛋白质，形成多肽链后需对多肽链进行加工，其中N端甲酰蛋氨酸是多肽链合成的起始氨基酸需在多肽链折迭成一定的空间结构之前被切除，并通过专一性的酶催化进行修饰，包括糖基化、羟基化、磷酸化和甲酰化对氨基酸进行修饰，最后由专一性的蛋白酶催化，将部分肽段切除，使多肽链在分子内伴侣、辅助酶及分子伴侣的协助下形成特定的空间构象；
优选的，所述S4中，通过荧光标记观察所述蛋白质的合成过程，并通过色氨酸操纵子转录终止的调控，所述调控方法是通过弱化作用实现的，其中弱化作用是通过对转录速度的调控从而调节翻译速度，实现对蛋白质合成速度的调控通过操纵子前导区内衰减子(类似终止子的一段DNA序列)实现对细菌辅助阻遏作用的一种精细调控，且弱化作用只使操纵子的转录开始后还没有进入第一个结构基因时便终止，这种终止作用并不能使所有正在转录的mRNA都中途停止,而仅使部分中途停止，其中前导区的碱基序列包括4个分别以1、2、3和4 表示的片段,以两种不同的方式进行碱基配对,1-2和3-4配对、2-3 配对、3-4配对区正好位于终止密码子的识别区，前导序列有相邻的两个色氨酸密码子,培养基中Trp浓度很低时,负载有Trp的 tR2NATrp变少,此时翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度就变慢,4 区被转录完成时,核糖体滞留1区,这时的前导区结构是2-3配对,不形成3-4配对的终止结构,转录可继续进行，反之核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子,在4区被转录之前,核糖体就到达2区,这样使2-3不能配对,且3-4区可以配对形成终止子结构使转录停止；
优选的，所述S5中，通过质谱仪对合成的蛋白质进行检测，并根据肽质量指纹图谱与蛋白质数据库中蛋白质的理论PMF进行对比，并对蛋白质利用图像分析技术进行分析，通过对斑点进行检测、背景消减、斑点的配比以及数据库的构建对鉴定后的蛋白质进行分析。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、通过荧光标记模板DNA，对蛋白质的合成过程进行观察，便于后续对蛋白质的合成速度进行调控。
2、通过弱化作用对合成蛋白质的过程进行调控，提高蛋白质的合成效率。
本发明的目的是通过荧光标记模板DNA，对蛋白质的合成过程进行观察，便于后续对蛋白质的合成速度进行调控，并通过弱化作用对合成蛋白质的过程进行调控，提高蛋白质的合成效率。
附图说明
图1为本发明提出的一种提高无细胞体系蛋白质合成的方法的流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例一
参照图1，一种提高无细胞体系蛋白质合成的方法，包括以下步骤：
S1：材料选择：选择真核细胞，将真核细胞进行离心获得所需的DNA作为模板，并在细胞抽提物的酶系中补充氨基酸、底物和能量来合成蛋白质的体外系统，其中所述真核细胞进行离心时采用密度梯度离心法获得所需的DNA作为模板，并将获得DNA进行提纯获得高纯度 DNA，将得到的高纯度DNA进行荧光标记，其中采用同位素标记法标记硫元素；
S2：转录及翻译：所述转录过程是以DNA中的一条单链为模板，游离碱基为原料，在DNA依赖的RNA聚合酶催化下合成RNA链的过程，所述翻译过程是以mRNA作为模板，tRNA作为运载工具，在有关酶、辅助因子和能量的作用下将活化的氨基酸在核糖体上装配为蛋白质多肽链的过程，其中进行转录时一个基因会被读取并被复制为mRNA，即特定的DNA片断作为遗传信息模板，通过依赖DNA的RNA聚合酶作为催化剂，通过碱基互补的原则合成前体mRNA，并以所述mRNA为模板，在核糖体的作用下进行翻译由tRNA将mRNA上的核苷酸序列转换为氨基酸序列合成多肽链的过程，且转录过程中，DNA模板被转录方向是从3′端向5′端，RNA链的合成方向是从5′端向3′端，其中 3′端都要加CCA，RNA的转录第一步合成原始转录产物，且转录起始是由RNA聚合酶结合启动子区域形成由酶、DNA和核苷三磷酸(NTP) 构成的三元起始复合物，转录结束是由终止子决定的，释放RNA聚合酶和合成的RNA；
S3：蛋白质合成：通过翻译由tRNA将mRNA上的核苷酸序列转换为氨基酸序列合成多肽链，其中在进行合成多肽链之前需先经过活化，然后再与其特异的tRNA结合，带到mRNA相应的位置上，这个过程需要tRNA合成酶催化，其中tRNA合成酶催化特定的氨基酸与特异的tRNA相结合，生成各种氨基酰tRNA，每种氨基酸都靠其特有合成酶催化，使之和相对应的tRNA结合，在氨基酰tRNA合成酶催化下，利用ATP供能，在氨基酸羧基上进行活化，形成氨基酰-AMP，再与氨基酰tRNA合成酶结合形成三联复合物，此复合物再与特异的tRNA作用，将氨基酰转移到tRNA的3′-末端CCA-OH(氨基酸臂)，形成多肽链后通过多肽链进行盘曲折叠形成蛋白质，形成多肽链后需对多肽链进行加工，其中N端甲酰蛋氨酸是多肽链合成的起始氨基酸需在多肽链折迭成一定的空间结构之前被切除，并通过专一性的酶催化进行修饰，包括糖基化、羟基化、磷酸化和甲酰化对氨基酸进行修饰，最后由专一性的蛋白酶催化，将部分肽段切除，使多肽链在分子内伴侣、辅助酶及分子伴侣的协助下形成特定的空间构象；
S4：生物调控：通过荧光标记观察所述蛋白质的合成过程，并通过色氨酸操纵子转录终止的调控，所述调控方法是通过弱化作用实现的，其中弱化作用是通过对转录速度的调控从而调节翻译速度，实现对蛋白质合成速度的调控通过操纵子前导区内衰减子(类似终止子的一段DNA序列)实现对细菌辅助阻遏作用的一种精细调控，且弱化作用只使操纵子的转录开始后还没有进入第一个结构基因时便终止，这种终止作用并不能使所有正在转录的mRNA都中途停止,而仅使部分中途停止，其中前导区的碱基序列包括4个分别以1、2、3和4表示的片段,以两种不同的方式进行碱基配对,1-2和3-4配对、2-3配对、 3-4配对区正好位于终止密码子的识别区，前导序列有相邻的两个色氨酸密码子,培养基中Trp浓度很低时,负载有Trp的tR2NATrp变少, 此时翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度就变慢,4区被转录完成时,核糖体滞留1区,这时的前导区结构是2-3配对,不形成3-4配对的终止结构,转录可继续进行，反之核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子,在4区被转录之前,核糖体就到达2区,这样使2-3不能配对,且3-4区可以配对形成终止子结构使转录停止；
S5：检验成果：通过质谱仪对合成的蛋白质进行检测，并根据肽质量指纹图谱与蛋白质数据库中蛋白质的理论PMF进行对比，并对蛋白质利用图像分析技术进行分析，通过对斑点进行检测、背景消减、斑点的配比以及数据库的构建对鉴定后的蛋白质进行分析。
实施例二
参照图1，一种提高无细胞体系蛋白质合成的方法，包括以下步骤：
S1：材料选择：选择真核细胞，将真核细胞进行离心获得所需的 DNA作为模板，并在细胞抽提物的酶系中补充氨基酸、底物和能量来合成蛋白质的体外系统，其中所述真核细胞进行离心时采用密度梯度离心法获得所需的DNA作为模板；
S2：转录及翻译：所述转录过程是以DNA中的一条单链为模板，游离碱基为原料，在DNA依赖的RNA聚合酶催化下合成RNA链的过程，所述翻译过程是以mRNA作为模板，tRNA作为运载工具，在有关酶、辅助因子和能量的作用下将活化的氨基酸在核糖体上装配为蛋白质多肽链的过程，其中进行转录时一个基因会被读取并被复制为mRNA，即特定的DNA片断作为遗传信息模板，通过依赖DNA的RNA聚合酶作为催化剂，通过碱基互补的原则合成前体mRNA，并以所述mRNA为模板，在核糖体的作用下进行翻译由tRNA将mRNA上的核苷酸序列转换为氨基酸序列合成多肽链的过程，且转录过程中，DNA模板被转录方向是从3′端向5′端，RNA链的合成方向是从5′端向3′端，其中 3′端都要加CCA，RNA的转录第一步合成原始转录产物，且转录起始是由RNA聚合酶结合启动子区域形成由酶、DNA和核苷三磷酸(NTP) 构成的三元起始复合物，转录结束是由终止子决定的，释放RNA聚合酶和合成的RNA；
S3：蛋白质合成：通过翻译由tRNA将mRNA上的核苷酸序列转换为氨基酸序列合成多肽链，其中在进行合成多肽链之前需先经过活化，然后再与其特异的tRNA结合，带到mRNA相应的位置上，这个过程需要tRNA合成酶催化，其中tRNA合成酶催化特定的氨基酸与特异的tRNA相结合，生成各种氨基酰tRNA，每种氨基酸都靠其特有合成酶催化，使之和相对应的tRNA结合，在氨基酰tRNA合成酶催化下，利用ATP供能，在氨基酸羧基上进行活化，形成氨基酰-AMP，再与氨基酰tRNA合成酶结合形成三联复合物，此复合物再与特异的tRNA作用，将氨基酰转移到tRNA的3′-末端CCA-OH(氨基酸臂)，形成多肽链后通过多肽链进行盘曲折叠形成蛋白质，形成多肽链后需对多肽链进行加工，其中N端甲酰蛋氨酸是多肽链合成的起始氨基酸需在多肽链折迭成一定的空间结构之前被切除，并通过专一性的酶催化进行修饰，包括糖基化、羟基化、磷酸化和甲酰化对氨基酸进行修饰，最后由专一性的蛋白酶催化，将部分肽段切除，使多肽链在分子内伴侣、辅助酶及分子伴侣的协助下形成特定的空间构象；
S4：生物调控：通过色氨酸操纵子转录终止的调控，所述调控方法是通过弱化作用实现的，其中弱化作用是通过对转录速度的调控从而调节翻译速度，实现对蛋白质合成速度的调控通过操纵子前导区内衰减子(类似终止子的一段DNA序列)实现对细菌辅助阻遏作用的一种精细调控，且弱化作用只使操纵子的转录开始后还没有进入第一个结构基因时便终止，这种终止作用并不能使所有正在转录的mRNA都中途停止,而仅使部分中途停止，其中前导区的碱基序列包括4个分别以1、2、3和4表示的片段,以两种不同的方式进行碱基配对,1-2 和3-4配对、2-3配对、3-4配对区正好位于终止密码子的识别区，前导序列有相邻的两个色氨酸密码子,培养基中Trp浓度很低时,负载有Trp的tR2NATrp变少,此时翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度就变慢,4区被转录完成时,核糖体滞留1区,这时的前导区结构是2-3配对,不形成3-4配对的终止结构,转录可继续进行，反之核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子,在4区被转录之前,核糖体就到达2区,这样使2-3不能配对,且3-4区可以配对形成终止子结构使转录停止；
S5：检验成果：通过质谱仪对合成的蛋白质进行检测，并根据肽质量指纹图谱与蛋白质数据库中蛋白质的理论PMF进行对比，并对蛋白质利用图像分析技术进行分析，通过对斑点进行检测、背景消减、斑点的配比以及数据库的构建对鉴定后的蛋白质进行分析。
实施例三
参照图1，一种提高无细胞体系蛋白质合成的方法，包括以下步骤：
S1：材料选择：选择真核细胞，将真核细胞进行离心获得所需的 DNA作为模板，并在细胞抽提物的酶系中补充氨基酸、底物和能量来合成蛋白质的体外系统，其中所述真核细胞进行离心时采用密度梯度离心法获得所需的DNA作为模板，并将获得DNA进行提纯获得高纯度 DNA，将得到的高纯度DNA进行荧光标记，其中采用同位素标记法标记硫元素；
S2：转录及翻译：所述转录过程是以DNA中的一条单链为模板，游离碱基为原料，在DNA依赖的RNA聚合酶催化下合成RNA链的过程，所述翻译过程是以mRNA作为模板，tRNA作为运载工具，在有关酶、辅助因子和能量的作用下将活化的氨基酸在核糖体上装配为蛋白质多肽链的过程，其中进行转录时一个基因会被读取并被复制为mRNA，即特定的DNA片断作为遗传信息模板，通过依赖DNA的RNA聚合酶作为催化剂，通过碱基互补的原则合成前体mRNA，并以所述mRNA为模板，在核糖体的作用下进行翻译由tRNA将mRNA上的核苷酸序列转换为氨基酸序列合成多肽链的过程；
S3：蛋白质合成：通过翻译由tRNA将mRNA上的核苷酸序列转换为氨基酸序列合成多肽链，其中在进行合成多肽链之前需先经过活化，然后再与其特异的tRNA结合，带到mRNA相应的位置上，这个过程需要tRNA合成酶催化，其中tRNA合成酶催化特定的氨基酸与特异的tRNA相结合，生成各种氨基酰tRNA，每种氨基酸都靠其特有合成酶催化，使之和相对应的tRNA结合，在氨基酰tRNA合成酶催化下，利用ATP供能，在氨基酸羧基上进行活化，形成氨基酰-AMP，再与氨基酰tRNA合成酶结合形成三联复合物，此复合物再与特异的tRNA作用，将氨基酰转移到tRNA的3′-末端CCA-OH(氨基酸臂)，形成多肽链后通过多肽链进行盘曲折叠形成蛋白质，形成多肽链后需对多肽链进行加工，其中N端甲酰蛋氨酸是多肽链合成的起始氨基酸需在多肽链折迭成一定的空间结构之前被切除，并通过专一性的酶催化进行修饰，包括糖基化、羟基化、磷酸化和甲酰化对氨基酸进行修饰，最后由专一性的蛋白酶催化，将部分肽段切除，使多肽链在分子内伴侣、辅助酶及分子伴侣的协助下形成特定的空间构象；
S4：生物调控：通过荧光标记观察所述蛋白质的合成过程，并通过色氨酸操纵子转录终止的调控，所述调控方法是通过弱化作用实现的，其中弱化作用是通过对转录速度的调控从而调节翻译速度，实现对蛋白质合成速度的调控通过操纵子前导区内衰减子(类似终止子的一段DNA序列)实现对细菌辅助阻遏作用的一种精细调控，且弱化作用只使操纵子的转录开始后还没有进入第一个结构基因时便终止，这种终止作用并不能使所有正在转录的mRNA都中途停止,而仅使部分中途停止，其中前导区的碱基序列包括4个分别以1、2、3和4表示的片段,以两种不同的方式进行碱基配对,1-2和3-4配对、2-3配对、 3-4配对区正好位于终止密码子的识别区，前导序列有相邻的两个色氨酸密码子,培养基中Trp浓度很低时,负载有Trp的tR2NATrp变少, 此时翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度就变慢,4区被转录完成时,核糖体滞留1区,这时的前导区结构是2-3配对,不形成3-4配对的终止结构,转录可继续进行，反之核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子,在4区被转录之前,核糖体就到达2区,这样使2-3不能配对,且3-4区可以配对形成终止子结构使转录停止；
S5：检验成果：通过质谱仪对合成的蛋白质进行检测，并根据肽质量指纹图谱与蛋白质数据库中蛋白质的理论PMF进行对比，并对蛋白质利用图像分析技术进行分析，通过对斑点进行检测、背景消减、斑点的配比以及数据库的构建对鉴定后的蛋白质进行分析。
实施例四
参照图1，一种提高无细胞体系蛋白质合成的方法，包括以下步骤：
S1：材料选择：选择真核细胞，将真核细胞进行离心获得所需的DNA作为模板，并在细胞抽提物的酶系中补充氨基酸、底物和能量来合成蛋白质的体外系统，其中所述真核细胞进行离心时采用密度梯度离心法获得所需的DNA作为模板，并将获得DNA进行提纯获得高纯度 DNA，将得到的高纯度DNA进行荧光标记，其中采用同位素标记法标记硫元素；
S2：转录及翻译：所述转录过程是以DNA中的一条单链为模板，游离碱基为原料，在DNA依赖的RNA聚合酶催化下合成RNA链的过程，所述翻译过程是以mRNA作为模板，tRNA作为运载工具，在有关酶、辅助因子和能量的作用下将活化的氨基酸在核糖体上装配为蛋白质多肽链的过程，其中进行转录时一个基因会被读取并被复制为mRNA，即特定的DNA片断作为遗传信息模板，通过依赖DNA的RNA聚合酶作为催化剂，通过碱基互补的原则合成前体mRNA，并以所述mRNA为模板，在核糖体的作用下进行翻译由tRNA将mRNA上的核苷酸序列转换为氨基酸序列合成多肽链的过程，且转录过程中，DNA模板被转录方向是从3′端向5′端，RNA链的合成方向是从5′端向3′端，其中 3′端都要加CCA，RNA的转录第一步合成原始转录产物，且转录起始是由RNA聚合酶结合启动子区域形成由酶、DNA和核苷三磷酸(NTP) 构成的三元起始复合物，转录结束是由终止子决定的，释放RNA聚合酶和合成的RNA；
S3：蛋白质合成：通过翻译由tRNA将mRNA上的核苷酸序列转换为氨基酸序列合成多肽链，其中在进行合成多肽链之前需先经过活化，然后再与其特异的tRNA结合，带到mRNA相应的位置上，这个过程需要tRNA合成酶催化，其中tRNA合成酶催化特定的氨基酸与特异的tRNA相结合，生成各种氨基酰tRNA，每种氨基酸都靠其特有合成酶催化，使之和相对应的tRNA结合，在氨基酰tRNA合成酶催化下，利用ATP供能，在氨基酸羧基上进行活化，形成氨基酰-AMP，再与氨基酰tRNA合成酶结合形成三联复合物，此复合物再与特异的tRNA作用，将氨基酰转移到tRNA的3′-末端CCA-OH(氨基酸臂)；
S4：生物调控：通过荧光标记观察所述蛋白质的合成过程，并通过色氨酸操纵子转录终止的调控，所述调控方法是通过弱化作用实现的，其中弱化作用是通过对转录速度的调控从而调节翻译速度，实现对蛋白质合成速度的调控通过操纵子前导区内衰减子(类似终止子的一段DNA序列)实现对细菌辅助阻遏作用的一种精细调控，且弱化作用只使操纵子的转录开始后还没有进入第一个结构基因时便终止，这种终止作用并不能使所有正在转录的mRNA都中途停止,而仅使部分中途停止，其中前导区的碱基序列包括4个分别以1、2、3和4表示的片段,以两种不同的方式进行碱基配对,1-2和3-4配对、2-3配对、 3-4配对区正好位于终止密码子的识别区，前导序列有相邻的两个色氨酸密码子,培养基中Trp浓度很低时,负载有Trp的tR2NATrp变少, 此时翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度就变慢,4区被转录完成时,核糖体滞留1区,这时的前导区结构是2-3配对,不形成3-4配对的终止结构,转录可继续进行，反之核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子,在4区被转录之前,核糖体就到达2区,这样使2-3不能配对,且3-4区可以配对形成终止子结构使转录停止；
S5：检验成果：通过质谱仪对合成的蛋白质进行检测，并根据肽质量指纹图谱与蛋白质数据库中蛋白质的理论PMF进行对比，并对蛋白质利用图像分析技术进行分析，通过对斑点进行检测、背景消减、斑点的配比以及数据库的构建对鉴定后的蛋白质进行分析。
实施例五
参照图1，一种提高无细胞体系蛋白质合成的方法，包括以下步骤：
S1：材料选择：选择真核细胞，将真核细胞进行离心获得所需的 DNA作为模板，并在细胞抽提物的酶系中补充氨基酸、底物和能量来合成蛋白质的体外系统，其中所述真核细胞进行离心时采用密度梯度离心法获得所需的DNA作为模板，并将获得DNA进行提纯获得高纯度 DNA，将得到的高纯度DNA进行荧光标记，其中采用同位素标记法标记硫元素；
S2：转录及翻译：所述转录过程是以DNA中的一条单链为模板，游离碱基为原料，在DNA依赖的RNA聚合酶催化下合成RNA链的过程，所述翻译过程是以mRNA作为模板，tRNA作为运载工具，在有关酶、辅助因子和能量的作用下将活化的氨基酸在核糖体上装配为蛋白质多肽链的过程，其中进行转录时一个基因会被读取并被复制为mRNA，即特定的DNA片断作为遗传信息模板，通过依赖DNA的RNA聚合酶作为催化剂，通过碱基互补的原则合成前体mRNA，并以所述mRNA为模板，在核糖体的作用下进行翻译由tRNA将mRNA上的核苷酸序列转换为氨基酸序列合成多肽链的过程，且转录过程中，DNA模板被转录方向是从3′端向5′端，RNA链的合成方向是从5′端向3′端，其中 3′端都要加CCA，RNA的转录第一步合成原始转录产物，且转录起始是由RNA聚合酶结合启动子区域形成由酶、DNA和核苷三磷酸(NTP) 构成的三元起始复合物，转录结束是由终止子决定的，释放RNA聚合酶和合成的RNA；
S3：蛋白质合成：通过翻译由tRNA将mRNA上的核苷酸序列转换为氨基酸序列合成多肽链，其中在进行合成多肽链之前需先经过活化，然后再与其特异的tRNA结合，带到mRNA相应的位置上，这个过程需要tRNA合成酶催化，其中tRNA合成酶催化特定的氨基酸与特异的tRNA相结合，生成各种氨基酰tRNA，每种氨基酸都靠其特有合成酶催化，使之和相对应的tRNA结合，在氨基酰tRNA合成酶催化下，利用ATP供能，在氨基酸羧基上进行活化，形成氨基酰-AMP，再与氨基酰tRNA合成酶结合形成三联复合物，此复合物再与特异的tRNA作用，将氨基酰转移到tRNA的3′-末端CCA-OH(氨基酸臂)，形成多肽链后通过多肽链进行盘曲折叠形成蛋白质，形成多肽链后需对多肽链进行加工，其中N端甲酰蛋氨酸是多肽链合成的起始氨基酸需在多肽链折迭成一定的空间结构之前被切除，并通过专一性的酶催化进行修饰，包括糖基化、羟基化、磷酸化和甲酰化对氨基酸进行修饰，最后由专一性的蛋白酶催化，将部分肽段切除，使多肽链在分子内伴侣、辅助酶及分子伴侣的协助下形成特定的空间构象；
S4：生物调控：通过荧光标记观察所述蛋白质的合成过程，并通过色氨酸操纵子转录终止的调控，所述调控方法是通过弱化作用实现的，其中弱化作用是通过对转录速度的调控从而调节翻译速度，实现对蛋白质合成速度的调控通过操纵子前导区内衰减子(类似终止子的一段DNA序列)实现对细菌辅助阻遏作用的一种精细调控，且弱化作用只使操纵子的转录开始后还没有进入第一个结构基因时便终止，这种终止作用并不能使所有正在转录的mRNA都中途停止,而仅使部分中途停止，其中前导区的碱基序列包括4个分别以1、2、3和4表示的片段,以两种不同的方式进行碱基配对,1-2和3-4配对、2-3配对、 3-4配对区正好位于终止密码子的识别区，前导序列有相邻的两个色氨酸密码子,培养基中Trp浓度很低时,负载有Trp的tR2NATrp变少, 此时翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度就变慢,4区被转录完成时,核糖体滞留1区,这时的前导区结构是2-3配对,不形成3-4配对的终止结构,转录可继续进行，反之核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子,在4区被转录之前,核糖体就到达2区,这样使2-3不能配对,且3-4区可以配对形成终止子结构使转录停止。
对比例一
与实施利一不同之处在于，S1：材料选择：选择真核细胞，将真核细胞进行离心获得所需的DNA作为模板，并在细胞抽提物的酶系中补充氨基酸、底物和能量来合成蛋白质的体外系统，其中所述真核细胞进行离心时采用密度梯度离心法获得所需的DNA作为模板，S4：生物调控：通过色氨酸操纵子转录终止的调控，所述调控方法是通过弱化作用实现的，其中弱化作用是通过对转录速度的调控从而调节翻译速度，实现对蛋白质合成速度的调控通过操纵子前导区内衰减子(类似终止子的一段DNA序列)实现对细菌辅助阻遏作用的一种精细调控，且弱化作用只使操纵子的转录开始后还没有进入第一个结构基因时便终止，这种终止作用并不能使所有正在转录的mRNA都中途停止, 而仅使部分中途停止，其中前导区的碱基序列包括4个分别以1、2、 3和4表示的片段,以两种不同的方式进行碱基配对,1-2和3-4配对、 2-3配对、3-4配对区正好位于终止密码子的识别区，前导序列有相邻的两个色氨酸密码子,培养基中Trp浓度很低时,负载有Trp的 tR2NATrp变少,此时翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度就变慢,4 区被转录完成时,核糖体滞留1区,这时的前导区结构是2-3配对,不形成3-4配对的终止结构,转录可继续进行，反之核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子,在4区被转录之前,核糖体就到达2区,这样使2-3不能配对,且3-4区可以配对形成终止子结构使转录停止，其余与实施利一相同。
对比例二
与实施利一不同之处在于，S2：转录及翻译：所述转录过程是以 DNA中的一条单链为模板，游离碱基为原料，在DNA依赖的RNA聚合酶催化下合成RNA链的过程，所述翻译过程是以mRNA作为模板，tRNA 作为运载工具，在有关酶、辅助因子和能量的作用下将活化的氨基酸在核糖体上装配为蛋白质多肽链的过程，其中进行转录时一个基因会被读取并被复制为mRNA，即特定的DNA片断作为遗传信息模板，通过依赖DNA的RNA聚合酶作为催化剂，通过碱基互补的原则合成前体 mRNA，并以所述mRNA为模板，在核糖体的作用下进行翻译由tRNA将 mRNA上的核苷酸序列转换为氨基酸序列合成多肽链的过程，其余与实施利一相同。
对比例三
与实施利一不同之处在于，S4：生物调控：通过荧光标记观察所述蛋白质的合成过程，并通过色氨酸操纵子转录终止的调控，所述调控方法是通过弱化作用实现的，其中弱化作用是通过对转录速度的调控从而调节翻译速度，实现对蛋白质合成速度的调控通过操纵子前导区内衰减子(类似终止子的一段DNA序列)实现对细菌辅助阻遏作用的一种精细调控，且弱化作用只使操纵子的转录开始后还没有进入第一个结构基因时便终止，这种终止作用并不能使所有正在转录的mRNA 都中途停止,而仅使部分中途停止，其余与实施利一相同。
实验例
对实施例一、实施例二、实施例三、实施例四和实施例五中一种提高无细胞体系蛋白质合成的方法进行测试，得出结果如下：
实施例一、实施例二、实施例三、实施例四和实施例五制得的无细胞体系蛋白质合成的方法对比现有方法合成速率有了显著提高，且实施例一为最佳实施例。
检测报告
本发明的目的是为了解决目前现有的无细胞体系蛋白质合成技术仍存在合成蛋白质的效率较低等问题，而提出的一种提高无细胞体系蛋白质合成的方法，本发明的实施例提供一种提高无细胞体系蛋白质合成的方法，通过荧光标记模板DNA，对蛋白质的合成过程进行观察，便于后续对蛋白质的合成速度进行调控，并通过弱化作用对合成蛋白质的过程进行调控，提高蛋白质的合成效率。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
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