用于治疗视网膜疾病和癌症的转基因表达盒

文档序号：183826 发布日期：2021-11-02 浏览：33次 >En<

阅读说明：本技术 用于治疗视网膜疾病和癌症的转基因表达盒 (Transgene expression cassette for treating retinal diseases and cancers ) 是由赵锴陈晨杜增民汤丁越凌菲香吴侠王慧蒋威赵阳王利群郑静肖啸于 2021-07-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及涉及编码内皮抑素的核酸分子、包含该核酸分子的转基因表达盒以及包含该转基因表达盒的基因递送系统。本发明的转基因表达盒可用于治疗各种以新生血管为主要病理机制的视网膜疾病以及多种癌症。(The present invention relates to nucleic acid molecules encoding endostatin, transgenic expression cassettes comprising the nucleic acid molecules, and gene delivery systems comprising the transgenic expression cassettes. The transgene expression cassette of the invention can be used for treating various retina diseases taking new vessels as main pathological mechanisms and various cancers.)

用于治疗视网膜疾病和癌症的转基因表达盒

技术领域

本公开涉及编码内皮抑素的核酸分子、包含该核酸分子的转基因表达盒以及包含该转基因表达盒的基因递送系统。

背景技术

病理性新生血管在大量视网膜疾病中出现，并每年在全世界影响数百万人。例如，全球大约有3000万人，尤其是60岁以上的人患有与年龄有关的黄斑变性(AMD)，这是导致老年人失明的主要原因(Klein R，Peto T等，Am J Ophthalmol(2004)137(3)：486-95；Friedman DS，O’Colmain BJ等，Arch Ophthalmol(2004)122(4)：564-72；AI-Zamil WM等，Clin Interv Aging(2017)：28860733)。AMD的特征是在多种因素作用下造成进行性视网膜损伤。其中，有一种严重的AMD被称为湿性AMD，脉络膜新生血管(CNV)逐渐在整个视网膜中扩展，由于血管壁的脆弱性，其内部内容物易于渗漏，这进一步破坏了视网膜结构的完整性并阻碍了视觉功能。糖尿病性视网膜病(DR)和早产儿视网膜病(ROP)中也普遍存在类似的新生血管问题，即新生血管出血和瘢痕形成分别发生在糖尿病人和新生儿身上。

此外，在肿瘤发生期间会引起过度的新生血管生成，以促进向癌细胞供应氧气和营养。第一，可以从预先存在的血管网络诱发新血管形成并浸润肿瘤组织；第二，肿瘤细胞可以募集内皮祖细胞形成次级脉管系统；第三，肿瘤细胞在预先存在的血管周围聚集并以管状方式组织内皮细胞来产生新的脉管系统(Jain RK，Science(2005)307(5706)：58-62；Carmeliet P等，Nature(2011)473(7347)：298-307；Majidpoor J等，Cell Oncol.2021)。

上述病理情况表明了抗血管生成在治疗视网膜疾病和癌症中的重要性。血管内皮生长因子(VEGF)是引发这些疾病中新生血管生长的关键因素。抗VEGF的方法已引起了广泛关注。内皮抑素是由胶原蛋白XVIII的C端产生的20kD片段，血管抑素是由纤溶酶原的蛋白水解裂解产生的含有Kringle结构域的蛋白质。它们都表现出优异的抗血管生成活性并拮抗VEGF的生物学作用。在过去的十年中，这两种血管生成抑制剂已被广泛应用于视网膜病变和癌症治疗中来抑制新生血管形成(O’Reilly MS等，Cell(1994)79(2)：315-28；O’Reilly MS等，Cell(1997)88(2)：277-85；专利号US 9707304 B2和US 2004/0156828 A1)。因此，为了实现对视网膜疾病和癌症更好的治疗效果，还期望获得表达水平更高的内皮抑素编码序列和血管抑素编码序列。

腺相关病毒(AAV，adeno-associated virus)具有低致病性以及在各种器官组织中长期稳定表达蛋白的能力，这些特性使AAV在基因治疗领域具有明显的优势，适用于递送治疗性基因。然而，野生型AAV血清型通常广谱地感染哺乳动物的多个组织/器官，具有广泛的组织靶向性，导致基因传递到脱靶的组织，从而加剧了不良反应。AAV颗粒的衣壳蛋白不仅在复制过程中调节AAV的装配，而且还促进病毒与质膜上的受体相互作用并进入靶细胞。研究显示，AAV载体的组织亲嗜性及细胞转化效率主要由其衣壳决定。鉴于此，为了实现更好的治疗效果，期望对AAV衣壳蛋白进行合适的改造，获得具有器官(例如眼部)特异性的AAV载体。

此外，由于反复注射会给患者带来诸多不便和痛苦，血管生成抑制剂的多次重复给药是不期望的。因此，期望获得可以同时递送两种以上血管生成抑制剂的基因递送系统。

发明内容

为了解决上述技术问题，在第一方面，本公开提供一种编码内皮抑素的核酸分子，其核苷酸序列与SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列具有至少80％的同一性，优选具有至少85％、90％、95％、99％或100％的同一性。

在一个实施方式中，核酸分子包含SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列。在一个优选实施方式中，核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17所示。

本公开的编码内皮抑素的核酸分子包含经密码子优化的人源或鼠源内皮抑素编码核酸序列，与未经密码子优化的原始人源或鼠源内皮抑素编码核酸序列相比具有更高的内皮抑素表达水平。

在第二方面，本公开提供一种编码血管抑素的核酸分子，其核苷酸序列与SEQ IDNO：16或SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列具有至少80％的同一性，优选具有至少85％、90％、95％、99％或100％的同一性。

在一个实施方式中，核酸分子包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列。在一个优选实施方式中，核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18所示。

本公开的编码血管抑素的核酸分子包含经密码子优化的人源或鼠源血管抑素编码核酸序列，与未经密码子优化的原始人源或鼠源血管抑素编码核酸序列相比具有更高的血管抑素表达水平。

在第三方面，本公开提供一种转基因表达盒，其包括：启动子、根据第一方面所述的核酸分子、bGH polyA。

在一个实施方式中，启动子选自：CB启动子、CAG启动子、EF1启动子、泛素启动子、T7启动子、SV40启动子、VP16、VP64启动子、Tuj1启动子、GFAP启动子、波形蛋白启动子、RPE65启动子、VMD2启动子、突触蛋白启动子、VGAT启动子、DAT启动子、TH启动子和骨钙蛋白启动子；优选地，所述启动子为CB启动子。

在一个实施方式中，转基因表达盒还包括：信号肽，例如SP信号肽、ALB信号肽和PLS信号肽；和/或位于两端的两个ITR，所述两个ITR各自独立地为正常ITR或缩短ITR肽。

在一个实施方式中，编码内皮抑素的核苷酸序列和/或编码血管抑素的核苷酸序列带有寡肽标签，例如Flag、6×His、2×HA和Myc。

在一个优选实施方式中，转基因表达盒还包括：编码一种或多种治疗性蛋白质的核苷酸序列，所述治疗性蛋白质不同于内皮抑素；优选地，所述治疗性蛋白质为具有抗血管生成作用的蛋白质；更优选地，所述治疗性蛋白质为血管抑素，例如由根据第二方面的编码血管抑素的核酸分子编码的血管抑素。

在一个优选实施方式中，转基因表达盒还包括连接序列。在一个优选实施方式中，连接序列为Furin蛋白酶序列+连接肽+2A序列，例如P2A、T2A或F2A。使用这样的连接序列可以更好地分开两种以上蛋白质(例如内皮抑素和血管抑素)的表达和分泌。

在一个实施方式中，转基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11所示。

在第四方面，本公开提供一种基因递送系统，其包括：根据第三方面所述的转基因表达盒和AAV衣壳蛋白。

在一个实施方式中，上述AAV衣壳蛋白为天然AAV衣壳蛋白或人工改造的AAV衣壳蛋白。在一个优选实施方式中，上述AAV选自：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11，AAV12、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAV-DJ9、AAVrh8、AAVrh8R和AAVrh10。

在一个实施方式中，上述AAV衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：14所示。

本公开的转基因表达盒和基因递送系统可以表达更高水平的抗血管生成蛋白(内皮抑素和/或血管抑素)，可以实现对视网膜疾病和癌症更好的治疗效果。此外，在转基因表达盒包括编码内皮抑素的核苷酸序列和编码血管抑素的核苷酸序列的情况下，本公开的基因递送系统可以实现两种以上血管生成抑制剂的同时递送。

在第五方面，本公开提供根据第三方面所述的转基因表达盒或根据第四方面所述的基因递送系统在制备用于治疗疾病的药物中的应用，所述疾病以新生血管为主要病理机制或诱发因素。

在第六方面，本公开提供一种药物，其包含：根据第三方面所述的转基因表达盒或根据第四方面所述的基因递送系统；以及赋形剂。在一个实施方式中，药物用于治疗以新生血管为主要病理机制或诱发因素的疾病。

在一个实施方式中，疾病为视网膜疾病或癌症，例如老年视网膜黄斑病变、糖尿病视网膜病变，以及其他由强光引起的视网膜损伤；肺癌、肝癌、肾癌、甲状腺癌、前列腺癌、肾癌、乳腺癌、结肠直肠癌、子宫颈癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤和成胶质细胞瘤。

在第七方面，本公开提供一种治疗视网膜疾病或癌症的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据第九方面所述的药物。

在一个实施方式中，药物通过全身途径或局部途径施用，例如静脉内施用、肌内施用、皮下施用、经口施用、局部接触、腹膜内施用和病灶内施用。在一个优选实施方式中，药物局部施用于眼睛，例如通过玻璃体内注射、视网膜下注射或脉络膜上注射。

在第八方面，本公开提供一种改造的AAV衣壳蛋白，其中，所述AAV衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：14所示。

在第九方面，本公开提供一种核酸分子，其编码根据第八方面所述的AAV衣壳蛋白。在一个实施方式中，核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13所示。

本公开的上述改造的AAV衣壳蛋白可用于生产新型AAV载体，从而开展针对新型AAV载体的相关研究或可用于疾病治疗。包装该改造的AAV衣壳蛋白的新型AAV载体具有良好的视网膜组织靶向性，有更低的毒副作用和更好的安全性潜力，可应用于眼部相关疾病的预防、诊断和治疗。

因此，在第十方面，本公开提供一种AAV载体，其包含根据第八方面所述的AAV衣壳蛋白。

在一个实施方式中，AAV载体还包含外源多核苷酸，所述外源多核苷酸包含编码治疗性蛋白质的核苷酸序列。在一个实施方式中，治疗性蛋白质为具有抗血管生成作用的蛋白质。在一个实施方式中，治疗性蛋白质为内皮抑素和/或血管抑素。

在一个实施方式中，外源多核苷酸包含编码内皮抑素的核苷酸序列；优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17所示。

在一个实施方式中，外源多核苷酸包含编码血管抑素的核苷酸序列；优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18所示。

附图说明

图1A示出了AAV5、AAV8、AAV9、AAVH15、AAVXL32和AAVT13在小鼠视网膜的GFP信号的图像。

图1B示出了图1A所示的GFP信号荧光图像的3D重构。GCL：神经节细胞层；IPL：内部丛状层；INL：内核层；OPL：外丛状层；ONL：外核层；RPE：视网膜色素上皮。

图1C示出了不同AAV血清型相对于AAV5的相对GFP荧光信号强度。n＝4只小鼠/组，***p<0.001。

图2显示了用AAV8、AAV9、AAVH15和AAVT13转导的小鼠的视网膜切片。GFP、DAPI和视锥细胞标记(S-视蛋白)/RPE标记(RPE65)被显示。到达感光层的GFP信号由白色箭头指示。

图3A是B36、B110和B111表达盒的示意图。

图3B显示了B110和B111表达盒在HEK293和Huh7培养基上清中内皮抑素和血管抑素的表达和分泌的蛋白质印迹结果图。编码GFP的质粒用作对照。

图3C显示了B110表达盒(包含密码子优化的人源内皮抑素和人源血管抑素编码序列)和B111表达盒(包含密码子优化的鼠源内皮抑素和鼠源血管抑素编码序列)与原始未经密码子优化的人源或鼠源内皮抑素编码核酸序列相比的表达水平。左图：蛋白质印迹结果图。右图：相对表达水平的定量统计；n＝3，***p<0.001，t检验。

图3D显示了B110表达盒(包含密码子优化的人源内皮抑素和人源血管抑素编码序列)和B111表达盒(包含密码子优化的鼠源内皮抑素和鼠源血管抑素编码序列)与原始未经密码子优化的人源或鼠源血管抑素编码核酸序列相比的表达水平。左图：蛋白质印迹结果图。右图：相对表达水平的定量统计；n＝3，***p<0.001，t检验。

图4A显示了含有GFP的AAVH15(下文称为H15-GFP)以感染复数(MOI)为1×10⁵、1×10⁴和1×10³vg/细胞的比例转导HUVEC，病毒感染3天后拍摄的图像。上图：GFP荧光；下图：明场。比例尺：100μm。

图4B显示了定量GFP阳性HUVEC细胞的百分比。

图4C显示了来自MOI为1×10⁵vg/细胞的、由H15-GFP、H15-B110(AAVH15包装B110表达盒)和H15-B111(AAVH15包装B111表达盒)感染的HUVEC的条件培养基的蛋白质印迹分析。

图4D显示了H15-GFP、H15-B36(AAVH15包装B36表达盒)、H15-B110和H15-B111颗粒以1×10⁵和1×10⁴vg/细胞的MOI感染HUVEC的拍摄图像。比例尺：200μm。

图4E显示了HUVEC成管的定量(每单位面积(mm²)的管长)。n＝5个细胞孔。**p<0.01，***p<0.001，t检验。

图4F显示了HUVEC成管的定量(每单位面积(mm²)的分支点数)。n＝5个细胞孔。**p<0.01，***p<0.001，t检验。

图5A显示了激光诱导新生血管形成的小鼠模型图。向C57BL/6小鼠玻璃体内注射2×10¹⁰vg/眼的AAV颗粒，该颗粒具有H15衣壳且包装了B36、B110或B111表达盒(分别称为激光-B36、激光-B110、激光-B111)。病毒注射后14天，对小鼠进行激光诱导的CNV模型治疗，再过12天后，进行荧光素血管造影(FFA)和免疫荧光(IF)。

图5B显示了激光诱导的新生血管形成和瘢痕。上图：荧光素血管造影。下图：激光诱发的病灶。比例尺：1毫米。

图5C显示了视网膜切片染色的荧光图像，显示了活化的视网膜星形胶质细胞和Müller细胞(GFAP)和血管(IB4)。GFAP白色箭头：CNV簇；IB4白色箭头：与CNV簇相关的GFAP阳性胶质细胞膜。比例尺：100μm。

图5D显示了激光诱导的CNV簇绒面积的定量。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，n＝5眼/组，单向方差分析。

图5E显示了激光诱导的CNV簇绒数量的定量。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，n＝5眼/组，单向方差分析。

图5F显示了激光诱导的病灶大小。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，n＝5眼/组，单向方差分析。

图5G显示了通过GFP阳性神经胶质膜面积与总视野面积之比计算的神经胶质膜覆盖率％。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，n＝5眼/组，单向方差分析。

图6A显示了激光诱导新生血管形成的小鼠模型图。向C57BL/6小鼠玻璃体内注射2×10⁹vg/眼的AAV颗粒，该AAV颗粒以AAVT13为衣壳且包装了B36、B110或B111表达盒(分别称为激光-B36、激光-B110、激光-B111)。病毒注射14天后，对小鼠进行激光诱导的CNV模型，再过12天后，进行荧光素血管造影(FFA)。

图6B显示了激光诱导的新生血管形成和瘢痕。上图：荧光素血管造影。下图：激光诱发的病灶。比例尺：1毫米。

图6C显示了新生血管形成的定量。*p<0.05，**p<0.01，n＝7只眼/组。

图6D显示了激光诱导的病变面积的定量。*p<0.05，**p<0.01，n＝7只眼/组。

图7A显示了小鼠中的肿瘤移植流程图。

图7B显示了在细胞植入和AAV治疗后第21天的代表性肿瘤图像。虚线圆圈标出了右前肢下方的肿瘤位置。

图7C显示肿瘤大小的定量结果。通过公式V＝0.5×L×W2计算肿瘤体积。V：肿瘤体积；L：肿瘤长度；W：肿瘤宽度。***p＜0.001，n＝3只小鼠/组。两向方差分析。

图8显示编码AAVH15衣壳蛋白的核酸序列(SEQ ID NO：1)。

图9显示AAVH15衣壳蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。

图10显示编码AAVT13衣壳蛋白的核酸序列(SEQ ID NO：3)。

图11显示AAVT13衣壳蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。

图12显示CB启动子的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)。

图13显示bGH POLYA的核苷酸序列(SEQ ID NO：6)。

图14显示B36表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：7)。

图15显示B36表达盒的蛋白产物的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。

图16显示B110表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：9)。

图17显示B110表达盒的蛋白产物的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)。

图18显示B111表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：11)。

图19显示B111表达盒的蛋白产物的氨基酸序列(SEQ ID NO：12)。

图20显示编码AAVXL32衣壳蛋白的核酸序列(SEQ ID NO：13)。

图21显示AAVXL32衣壳蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)。

图22显示密码子优化的人源内皮抑素编码核酸序列(SEQ ID NO：15)。

图23显示密码子优化的人源血管抑素编码核酸序列(SEQ ID NO：16)。

图24显示密码子优化的鼠源内皮抑素编码核酸序列(SEQ ID NO：17)。

图25显示密码子优化的鼠源血管抑素编码核酸序列(SEQ ID NO：18)。

图26显示原始(未经密码子优化的)人源内皮抑素编码核酸序列(SEQ ID NO：19)。

图27显示原始(未经密码子优化的)人源血管抑素编码核酸序列(SEQ ID NO：20)。

图28显示原始(未经密码子优化的)鼠源内皮抑素编码核酸序列(SEQ ID NO：21)。

图29显示原始(未经密码子优化的)鼠源血管抑素编码核酸序列(SEQ ID NO：22)。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。

除非另有说明，否则本文列出的核酸或多核苷酸序列是单链形式，方向是从5'至3'，从左至右。本文提供的核苷酸和氨基酸采用IUPACIUB生化命名委员会建议的格式，对于氨基酸采用单字母代码或三字母代码。

除非另有说明，“多核苷酸”是“核酸”的同义词，指任何长度的核苷酸的聚合形式，包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，它们的混合序列或类似物。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，例如甲基化或限制的核苷酸和核苷酸类似物。

在本文中，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即意味着“包括但不限于”)。

在本文中，术语“患者”和“受试者”可互换使用并且以其常规意义使用，指患有或容易患有可通过施用本公开的药物进行预防或治疗的病症的生物体，并且包括人和非人动物(例如，啮齿动物或其他哺乳动物)。

在一个实施方式中，受试者是非人动物(例如，黑猩猩和其他猿和猴物种；农场动物，如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，例如狗和猫；实验动物包括啮齿类动物，如小鼠、大鼠和豚鼠；禽类，包括家禽、野禽和猎禽，如鸡、火鸡和其他鸡类、鸭、鹅等)。在一个实施方式中，受试者是哺乳动物。在一个实施方式中，受试者是人。

在本文中，术语“治疗”包括：(1)抑制病状、疾病或者病症，即，阻止、减少或者延迟疾病的发展或其复发或者其至少一种临床或者亚临床症状的发展；或者(2)缓解疾病，即，引起病状、疾病或者病症或者其临床或者亚临床症状中的至少一种消退。

在本文中，术语“治疗有效量”指产生施用它要达到的治疗效果的剂量。例如，适用于治疗眼部疾病的药物的治疗有效量可为能够预防或改善与该眼部疾病相关的一种或多种症状的量。

在本文中，术语“改善”指与疾病有关的症状的改善，并且可以指至少一种衡量或定量该症状的参数的改善。

在本文中，术语“预防”病状、疾病或者病症包括：预防、延迟或者减少受试者中发展的病状、疾病或者病症的至少一种临床或者亚临床症状出现的发生率和/或可能性，该受试者可能患有或易患该病状、疾病或者病症但尚未经历或者表现出该病状、疾病或者病症的临床或亚临床症状。

在本文中，术语“局部施用”或“局部途径”是指具有局部作用的给药。

在本文中，术语“转导”、“转染”和“转化”是指将外源核酸递送到宿主细胞中，然后多核苷酸产物的转录和翻译的过程，该过程包括使用重组病毒将外源多核苷酸引入宿主细胞。

在本文中，术语“基因送递”指的是将外源多核苷酸引入细胞来进行基因传递，包括靶向、结合、摄取、转运、复制子整合和表达。

在本文中，术语“基因表达”或“表达”是指基因转录、翻译和翻译后修饰产生基因的RNA或蛋白产物的过程。

在本文中，术语“感染”是指包含多核苷酸组分的病毒或病毒颗粒将多核苷酸递送至细胞中并产生其RNA和蛋白质产物的过程，也可指病毒在宿主细胞中的复制过程。

在本文中，术语“靶向”是指病毒优先进入一些细胞或组织，然后进一步在细胞中表达病毒基因组或重组转基因携带的序列。

在本文中，术语“载体”指封装多核苷酸的一个或一系列大分子，其促进多核苷酸在体外或体内递送至靶细胞。载体的种类包括但不限于质粒、病毒载体、脂质体和其他基因递送载体。待递送的多核苷酸有时被称为“表达盒”或“转基因盒”，其可以包含但不限于某些蛋白质或合成多肽(其可以增强、抑制、削弱、保护、触发或预防某些生物学和生理功能)的编码序列、疫苗开发中感兴趣的编码序列(例如表达适于在哺乳动物中引发免疫应答的蛋白质、多肽或肽的多核苷酸)、RNAi材料的编码序列(例如，shRNA、siRNA、反义寡核苷酸)或可选的生物标记。

在本文中，术语“寡肽”是指通过肽键连接的少于20个氨基酸的聚合物。术语“多肽”和“蛋白质”在本文中同义地是指由20个以上的氨基酸组成的聚合物。这些术语还涵盖合成或人工氨基酸聚合物。

在本文中，术语“表达盒”、“转基因盒”和“转基因表达盒”可互换地使用，指编码特定蛋白质、多肽或RNAi元件的多核苷酸片段，其可以克隆到质粒载体中。

在一些实施方式中，“盒”也可以包装到AAV颗粒中并用作病毒基因组以将转基因产物递送到靶细胞中。“盒”还可以包括其他调控元件，例如特异性启动子/增强子、polyA、调控内含子等，以增强或减弱转基因产物的表达。

在一个实施方式中，除了编码蛋白质产物的序列外，转基因盒还包含许多调控元件以使转基因包装到病毒中，例如145bp的正常ITR、长度大约100bp的缩短ITR。在一些实施方式中，转基因盒还包含用于控制蛋白质产物表达的多核苷酸元件，例如复制起点、聚腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点(IRES)或2A信号(例如P2A、T2A、F2A)、启动子和增强子(例如，具有脊椎动物β-肌动蛋白、β-球蛋白或β-球蛋白调节元件的CMV启动子或其他杂种CMV启动子(称为CB和CAG启动子)、EF1启动子、缺氧响应元件、泛素启动子、T7启动子、SV40启动子、VP16或VP64启动子)。启动子和增强子可以被化学药品或激素(例如强力霉素或他莫昔芬)激活，以确保在特定时间点的进行基因表达。此外，启动子和增强子可以是天然或人工或嵌合序列，即原核或真核序列。

在一些优选实施方式中，用于基因表达的诱导型调控元件可以是组织或器官特异性启动子或增强子，其包括但不限于：对各种类型的视网膜细胞具有特异性的启动子，例如，神经节细胞特异性启动子(例如，Tuj1启动子)、星形胶质细胞和Müller细胞特异性启动子(例如GFAP或波形蛋白启动子)和视网膜色素上皮特异性启动子(例如RPE65或VMD2启动子)；多种类型的眼神经元的特异性启动子(例如突触蛋白、VGAT、DAT、TH启动子)；以及成骨细胞谱系的特异性启动子(例如骨钙蛋白启动子)、肝、胰、脾和肺癌细胞特异性启动子。

在本文中，术语“反向末端重复(ITR)”包括形成发夹结构并用作顺式元件以介导病毒复制、包装和整合的任何AAV病毒末端重复或合成序列。本文的ITR包括但不限于来自1-11型AAV(禽类AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV和绵羊AAV的末端重复序列)。此外，AAV末端重复序列不必具有天然末端重复序列，只要该末端重复序列可用于病毒复制、包装和整合即可。

在本文中，术语“顺式元件”是指包装在AAV颗粒中并在靶细胞中表达以产生具有治疗作用的蛋白质产物的转基因盒。

在本文中，术语“密码子优化”是指从其天然形式修饰的多核苷酸序列。这样的修饰导致一个或多个碱基对的差异，其相应的氨基酸序列中有或没有改变，可能增强或抑制基因的表达和/或对修饰的多核苷酸序列的细胞应答。

本领域技术人员已知，AAV衣壳蛋白含有VP1、VP2和VP3蛋白，VP2和VP3蛋白在VP1蛋白内部的起始密码子处经历转录和翻译过程，即，VP1序列包含VP2和VP3序列。本公开提供了AAV衣壳的VP1蛋白的氨基酸序列。

在一个实施方式中，AAV衣壳蛋白可以为任何AAV血清型衣壳蛋白，包括天然AAV衣壳蛋白(例如，天然的1-11型AAV、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV和绵羊AAV的衣壳蛋白)和其他人工改造的AAV衣壳蛋白(例如，人工改造的1-11型AAV、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV和绵羊AAV的衣壳蛋白)。不同AAV血清型的基因组序列、ITR序列、Rep和Cap蛋白在本领域内是已知的。这些序列可以在文献或在公共数据库查找，例如GenBank数据库。

在一个实施方式中，本公开提供了具有抗血管生成作用的治疗工具，可以用于治疗具有相关病理机制的多种疾病，包括但不限于：新生血管性视网膜病变(例如，AMD，ROP，DR)和强光或其他原因引起的眼损伤。此外，本公开的治疗工具还可以治疗发生血管生成促进肿瘤生长和转移的多种类型癌症，例如肺癌、肝癌、肾癌、甲状腺癌、前列腺癌、肾癌、乳腺癌、结肠直肠癌、子宫颈癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤和成胶质细胞瘤。

在一个实施方式中，治疗工具(例如转基因表达盒)的蛋白产物包括具有抗血管生成作用的蛋白质，例如但不限于，Aflibercept、重组VEGF可溶性受体(由RengeronPharmaceuticals生产，可以抑制新血管形成)、抗VEGF抗体(例如贝伐单抗、雷珠单抗和布洛珠单抗)、其他抗血管生成蛋白或多肽(例如内皮抑素、血管抑素、血小板因子4、色素上皮衍生因子)、成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂、金属蛋白酶抑制剂BB94。

在一个实施方式中，治疗工具(例如转基因表达盒)的蛋白质产物还包括具有抗肿瘤的抗体，例如抗PD-1抗体(例如，Nivolumab、Pembrolizumab、Cemiplimab)和PD-L1抗体(例如，Avelumab、Atezolizumab)、抗CTLA-4抗体(例如Ipilimumab)、抗CGRP抗体(例如Fremanezumab、Galcanezumab、Erenumab)、抗HER2抗体(例如Trastuzumab、Pertuzumab)和抗EGFR抗体(例如Cetuximab、Panitumumab、Necitumumab)。

在一些实施方式中，与野生型(WT)血清型相比，具有AAVH15衣壳蛋白(SEQ ID NO：2)的AAV病毒颗粒表现出更加高效的视网膜转导效率，适用于表达抗血管生成蛋白的基因的传递。

在一些实施方式中，与WT血清型相比，具有AAVT13衣壳蛋白(SEQ ID NO：4)的AAV病毒颗粒表现出更加高效的视网膜转导效率，适用于表达抗血管生成蛋白的基因的传递。

在一些实施方式中，与野生型(WT)血清型相比，具有AAVXL32衣壳蛋白(SEQ IDNO：14)的AAV病毒颗粒表现出更加高效的视网膜转导效率，适用于表达抗血管生成蛋白的基因的传递。

在一个实施方式中，编码血管生成抑制剂的转基因表达盒包括CB启动子序列(SEQID NO：5)、bGH聚腺苷酸化(polyA)序列(SEQ ID NO：6)和密码子优化的人源内皮抑素序列(SEQ ID NO：15)，该密码子优化的人源内皮抑素序列带有N末端的ALB信号肽和编码序列内的插入内含子以增强蛋白质表达，如此形成B36表达盒(SEQ ID NO：7)。B36表达盒的两侧是一个正常的ITR和一个缩短的ITR，以实现将B36表达盒作为自互补AAV载体包装到AAV颗粒中。

在一个实施方式中，编码血管生成抑制剂的转基因表达盒包括CB启动子序列(SEQID NO：5)、bGH polyA序列(SEQ ID NO：6)、具有N末端SP信号肽的密码子优化的人源内皮抑素和密码子优化的人源血管抑素序列(SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16)，这两种蛋白质的编码序列通过Furin蛋白酶序列(Lys-Arg-Lys-Arg-Arg)+连接肽(Ser-Gly-Ser-Gly)+F2A序列连接，如此形成B110表达盒(SEQ ID NO：9)。B110表达盒还包含两个ITR，其可使表达盒作为单链AAV载体包装到AAV病毒颗粒中。

在一个实施方式中，编码血管生成抑制剂的转基因表达盒包括CB启动子序列(SEQID NO：5)、bGH polyA序列(SEQ ID NO：6)、具有N末端PLS信号肽的密码子优化的鼠源内皮抑素和密码子优化的鼠源血管抑素序列(SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18)，这两种蛋白质的编码序列通过Furin蛋白酶序列(Lys-Arg-Lys-Arg-Arg)+连接肽(Ser-Gly-Ser-Gly)+P2A序列连接，如此形成B111表达盒(SEQ ID NO：11)。B111表达盒还包含两个ITR，其可使表达盒作为单链AAV载体包装到AAV病毒颗粒中。

在一些实施方式中，通过HEK293细胞的三质粒(质粒1：顺式元件质粒；质粒2：AAVRep/Cap质粒；质粒3：辅助质粒)转染来生产抗血管生成AAV颗粒。

在一个实施方式中，为了产生具有治疗功能的AAV颗粒，按如下进行HEK293细胞的三质粒转染：质粒1：具有ITR的顺式元件质粒(例如，B36、B110和B111表达盒)；质粒2：具有衣壳蛋白(例如，AAVH15、AAVT13和AAVXL32衣壳蛋白)编码序列的AAV Rep/Cap质粒；质粒3：具有腺病毒成分的辅助质粒，其能够促进AAV病毒体的复制、组装和包装。在一个实施方式中，将HEK293细胞产生的AAV颗粒通过亲和层析和碘克沙醇密度梯度超速离心进行纯化(Xiao X等，J Virol(1998)72(3)：2224-32)。

本领域技术人员可以使用已知的标准方法来生产重组和合成的多肽或其蛋白质、设计核酸序列、生产转化细胞、构建重组AAV突变体、改造衣壳蛋白质、包装表达AAV Rep和/或Cap序列的载体，以及瞬时或稳定转染包装细胞。这些技术是本领域技术人员已知的。参见例如，分子克隆(MOLECULAR CLONING)：实验室手册(ALABORATORY MANUAL)，第二版，(冷泉港，纽约州，1989年)。

在一些实施方式中，本公开的基因递送系统用于辅助细胞移植治疗。具体地，具有转基因的AAV颗粒可用于体外转导各种类型的细胞以产生表达蛋白质产物的稳定细胞系，然后可将其体内引入以用于治疗目的。细胞的类型包括但不限于内皮细胞、成肌细胞、成纤维细胞、星形胶质细胞、Müller细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞、杆状细胞和视锥细胞、神经元、造血干细胞、单核细胞、粒细胞、淋巴细胞、破骨细胞和巨噬细胞。

在一个实施方式中，用于移植的细胞是受试者的自体细胞，其允许体外培养。将细胞引入或移植到受试者中的原理和技术是本领域技术人员已知的。

在一个实施方式中，从HEK293细胞的培养基和裂解物中收获AAV颗粒。纯化方法例如亲和色谱、离子交换色谱、氯化铯和碘克沙醇梯度超速离心。与AAV生产和纯化有关的化学物质或试剂包括但不限于：用于细胞培养的化学物质或试剂(例如，细胞培养基的成分，包括牛、马、山羊、鸡或其他脊椎动物血清、谷氨酰胺、葡萄糖、蔗糖、丙酮酸纳、酚红；抗生素，例如青霉素、卡那霉素、链霉素、四环素)；用于细胞裂解、多核苷酸沉淀或超速离心的化学物质或试剂(例如Triton X-100、NP-40、脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、溴化多米芬、钠十二烷基水杨酸酯、氯化钠、氯化镁、氯化钙、氯化钡、硝酸盐、氯化钾、氯化铵、过硫酸铵、硫酸铵、PEG-20、PEG-40、PEG-400、PEG-2000、PEG-6000、PEG-8000、PEG-20000、Tris-HCl、Tris-乙酸盐、氯化锰、磷酸盐、碳酸氢盐、氯化铯、甲醇、乙醇、甘油、碘克沙醇、异丙醇、丁醇、安息香酶、DNase I、RNase)；亲和柱材料(例如AAVX亲和树脂、硫酸肝素蛋白聚糖和粘蛋白树脂、与AAV特异性抗体相关的其他材料)；离子交换色谱材料和洗涤缓冲液中包含的酸、碱和有机物(例如盐酸、硫酸、乙酸、甲酸、硝酸、尿素、丙酮、氯仿、乙腈、三氟乙酸、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钡、氢氧化铵、Tris碱或其他有机胺、泊洛沙姆188、吐温20、吐温40、吐温80、盐酸胍)。

在一个实施方式中，转基因盒编码的蛋白质产物连接寡肽标签(例如，Flag、6×His、2×HA、Myc)，其有助于蛋白质产物的纯化。本领域技术人员理解与蛋白质纯化有关的技术和程序。简而言之，将转基因质粒转染到真核细胞(例如，HEK293和CHO细胞)中，然后通过亲和层析来收集目标蛋白。例如，Flag-M2树脂珠通常用于特异性吸引Flag标记的蛋白，然后用3×Flag可溶性寡肽洗脱。也可以使用次氮基三乙酸镍(Ni-NTA)柱可逆地结合，然后专门纯化6×His标记的蛋白。

在一个实施方式中，本公开的AAV载体可以装载外源多核苷酸用于将基因递送到靶细胞中。因此，本公开的AAV载体可用于在体外或体内将核酸递送至细胞。

在一个实施方式中，由AAV载体递送的外源多核苷酸编码充当报告子的多肽(即报告蛋白)。报告蛋白用于指示被AAV成功感染的细胞。这些报告蛋白包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、荧光素酶和氯霉素乙酰转移酶。

在一个实施方式中，由AAV载体递送到靶细胞的外源多核苷酸编码用于治疗用途的天然蛋白质，所述天然蛋白质经密码子优化或未经密码子优化。

在一个实施方式中，由AAV载体递送到靶细胞的外源多核苷酸编码合成多肽。

在一个实施方式中，本公开的AAV载体或转基因表达盒或基因递送系统被制成药物制剂(例如，注射剂、片剂、胶囊剂、散剂、滴眼剂)施用于人或其他哺乳动物。该药物制剂还包含其他成分，例如药物辅料、水溶性或有机溶剂(例如水、甘油、乙醇、甲醇、异丙醇、氯仿、苯酚或聚乙二醇)、盐(例如氯化钠、氯化钾、磷酸盐、乙酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl和Tris-乙酸盐)、延缓溶解试剂(例如石蜡)、表面活性剂、抗微生物剂、脂质体、脂质复合物、免疫抑制剂(例如可的松、泼尼松、环孢霉素)、非甾体抗炎药(NSAID，例如阿司匹林、布洛芬、对乙酰氨基酚)微球、硬质基质、半固体载体、纳米球或纳米颗粒。此外，药物制剂可以通过吸入、全身或局部(例如，静脉内、皮下、眼内、玻璃体内、视网膜下、脉络膜上、肠胃外、肌内、脑室内、口服、腹膜内和鞘内)的给药方式以单剂量或多剂量递送。

在一个实施方式中，本公开提供了一种药物，其包含本公开的AAV载体或转基因表达盒或基因递送系统和赋形剂。本公开的药物可用于体外转导细胞或体内转导哺乳动物(例如啮齿动物、灵长类动物和人类)，从而治疗各种疾病，例如眼部疾病。

在本文中，眼部疾病选自：视网膜的遗传性营养不良、青光眼、青光眼神经病变、年龄相关性黄斑变性、屈光不正、干眼症、眼部炎症的遗传性营养不良、眼部炎症、葡萄膜炎、眼眶炎症、白内障、过敏性结膜炎、糖尿病视网膜病变、黄斑水肿、角膜水肿、圆锥角膜、增生性玻璃体视网膜病变(纤维化)、视网膜周围纤维化、中心性浆液性脉络膜视网膜病变、玻璃体视网膜病变、玻璃体黄斑牵引和玻璃体出血。在一个实施方式中，眼部疾病涉及眼睛和/或视觉功能的退化。

在一个实施方式中，治疗眼部疾病是指改善接受治疗的患者的视敏度、对比度视力、色觉以及视野。

下面结合附图和实施例对本公开作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本公开而不用于限制本公开的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，系按照本领域已知的常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行操作。

实施例

实施例1：AAVH15、AAVXL32和AAVT13的视网膜亲和性

通过将AAV8的VP1、VP2(氨基酸1-203)的N末端区域替换为AAV5(氨基酸1-192)的N-末端区域(带有点突变位点G257R)并连接到AAV5衣壳蛋白序列上，构建AAVT13衣壳(SEQID NO：4)。进行DNA shuffling实验，构建AAVH15衣壳蛋白(SEQ ID NO：2)和AAVXL32衣壳蛋白(SEQ ID NO：14)。

以WT血清型AAV5、8和9作为对照，在C57BL/6小鼠的玻璃体腔注射能够表达GFP蛋白的AAV颗粒，来研究改良的AAV血清型(AAVH15、AAVXL32和AAVT13)的视网膜亲和性。以2×10⁹vg/眼的剂量，向C57BL/6小鼠玻璃体内注射带有GFP基因的各AAV血清型，注射后3周拍摄的GFP信号的图像如图1A所示。以2×10⁹vg/眼的剂量，向C57BL/6小鼠玻璃体内注射带有GFP基因的AAV颗粒。注射后3周，将视网膜横截面取出进行免疫荧光染色，结果如图2所示。

结果显示，AAVH15和AAVT13组的视网膜GFP荧光水平显著高于AAV5、8、9组(图1A)，高约10-12倍(图1C，***p<0.001，n＝4眼/组)。AAVXL32组的视网膜GFP荧光水平也明显高于AAV5、8、9组(图1A)，高约5倍(图1C，***p<0.001，n＝4眼/组)。由此可见，与野生型AAV相比，AAVH15、AAVXL32和AAVT13具有显著增加的视网膜亲和性和转导效率。

此外，尽管采用玻璃体内给药，但改良的血清型AAVH15和AAVT13仍能够扩散到感光层甚至视网膜色素上皮层(RPE)(图1B和图2)，显著优于AAV5、8、9。由此可见，血清型AAVH15和AAVT13具有更强的视网膜亲和性，能够将基因递送到视网膜各层。

实施例2：密码子优化的人源和鼠源内皮抑素编码核酸序列的表达

在本实施例中，发明人比较了含密码子优化的内皮抑素编码核酸序列的B110和B111与由未经密码子优化的内皮抑素编码核酸序列构建的质粒(同样携带Flag和HA标签)的蛋白表达能力。

用B110和B111质粒转染HEK293细胞，然后用蛋白质印迹法检测细胞裂解液中内皮抑素的表达。未经密码子优化的人源和鼠源内皮抑素构入质粒作为对照组(原始人源，原始鼠源)。定量统计每组相对于原始人源组的内皮抑素蛋白表达。

如图3C所示，B110和B111表达盒的内皮抑素蛋白表达水平显著高于未经密码子优化的对照组。蛋白相对表达水平的定量统计结果显示，B110和B111表达盒的内皮抑素蛋白表达水平与未经密码子优化的序列相比有4-6倍提升(图3C，右图)。上述结果表明，本公开的密码子优化的人源和鼠源内皮抑素编码核酸序列与原始自然蛋白编码序列相比在表达上具有显著优势。

实施例3：密码子优化的人源和鼠源血管抑素编码核酸序列的表达

在本实施例中，发明人比较了含密码子优化的血管抑素编码核酸序列的B110和B111与由未经密码子优化的血管抑素编码核酸序列构建的质粒(同样携带Flag和HA标签)的蛋白表达能力。

用B110和B111质粒转染HEK293细胞，然后用蛋白质印迹法检测细胞裂解液中血管抑素的表达。未经密码子优化的人源和鼠源血管抑素构入质粒作为对照组(原始人源，原始鼠源)。定量统计每组相对于原始人源组的血管抑素蛋白表达。

如图3D所示，B110和B111表达盒的血管抑素蛋白表达水平显著高于未经密码子优化的对照组。蛋白相对表达水平的定量统计结果显示，B110和B111表达盒的血管抑素蛋白表达水平与未经密码子优化的序列相比升高了约4倍(图3D，右图)。上述结果表明，本公开的密码子优化的人源和鼠源血管抑素编码核酸序列与原始自然蛋白编码序列相比在表达上具有显著优势。

实施例4：表达内皮抑素和血管抑素的新型转基因表达盒

为了使抗血管生成多肽更稳定地表达，使用了自互补和单链AAV。如图3A所示，通过将ALB信号肽添加到密码子优化的人源内皮抑素序列的N端并在其内部插入内含子来构建B36转基因盒，该密码子优化的人源内皮抑素序列增强了内皮抑素蛋白的表达和分泌。CB启动子用于促进蛋白质表达，bGH polyA序列用于停止mRNA转录。B36转基因盒的两侧是一个正常的ITR和一个缩短的ITR，从而该表达盒能够作为自互补的AAV载体包装到AAV颗粒中。

此外，还设计了可同时表达内皮抑素和血管抑素并将它们同时释放出细胞的单链AAV转基因表达盒B110和B111。如图3A所示，B110盒包括：两个正常的ITR序列、CB启动子(SEQ ID NO：5)、密码子优化的人源内皮抑素序列(SEQ ID NO：15)、密码子优化的人源血管抑素序列(SEQ ID NO：16)和bGH polyA尾巴(SEQ ID NO：6)。SP信号肽用于控制内皮抑素和血管抑素的分泌到细胞外。两种蛋白质的编码序列通过包含Furin蛋白酶序列(KRKRR)+接头(SGSG)+F2A序列的接头连接，以在翻译过程中更好地分开表达内皮抑素和血管抑素。此外，在内皮抑素和血管抑素上带有Flag标签和2×HA标签，由此可以基于标签依赖性亲和层析制备和纯化内皮抑素和血管抑素。例如，可以使用商业化的Flag M2磁珠(Sigma-Aldrich，货号M8823)进行Flag标记蛋白的纯化。

类似地，以与B110相似的方式构建了B111表达盒，区别在于使用密码子优化的鼠源内皮抑素(SEQ ID NO：17)和密码子优化的鼠源血管抑制素(SEQ ID NO：18)，并且为了更好地分开两种蛋白质的表达和分泌，用P2A替代F2A。

将B110和B111质粒转染到HEK293细胞和Huh7细胞。48小时后，用蛋白质印迹法检测内皮抑素蛋白和血管抑素蛋白在培养基中的表达水平。结果如图3B所示，B110和B111表达盒均实现了显著的内皮抑素蛋白和血管抑素蛋白的表达。由此可见，通过转染B110和B111质粒成功地表达和分泌了内皮抑素和血管抑素，B110和B111表达盒实现了这两种蛋白质的同时稳定表达。

实施例5：新型AAV介导的抗新生血管蛋白的递送对HUVEC成管的抑制作用

通过三质粒转染B36、B110、B111顺式元件质粒、AAVH15衣壳质粒和腺病毒辅助质粒以及0.2-5mg/ml PEI，开始抗血管生成AAV颗粒的生产过程，并使用细胞培养基体积四分之一的10-35g/L CDM4溶液终止。转染40-80小时后裂解HEK293细胞，然后除去多核苷酸。在4000-15000rpm下离心15-45分钟。将具有AAV颗粒的上清液在AAVX亲和柱中上样，然后进行洗脱。将洗脱的AAV颗粒进行碘克沙醇梯度超速离心，浓缩至一定体积以备使用。

测试了AAVH15在HUVEC细胞中的转导效率。根据GFP蛋白的表达情况可知，在MOI为1×10⁵vg/细胞的情况下，约87％的HUVEC细胞被AAVHH15感染；在MOI为1×10⁴vg/细胞的情况下，AAV的细胞转导比率下降至45.8％(图4A和图4B)。当MOI降低至1×10³vg/细胞时，约10.9％的HUVEC细胞显示出明显的GFP荧光信号。

如图4C所示，AAVH15转导的HUVEC细胞成功地将内皮抑素和血管抑素释放到条件培养基中。

用携带B36、B110和B111表达盒(分别称为H15-B36、H15-B110和H15-B111)的AAVH15以MOI为1×10⁵和1×10⁴vg/细胞感染HUVEC细胞。收获细胞并将其转移至铺有Matrigel的24孔板中预孵育45分钟进行成管，6小时后拍摄图像，结果如图4D所示。通过Image J分析每单位面积(mm²)的管长和分支点数。结果显示，与对照组(H15-GFP)相比，H15-B36、H15-B110和H15-B111感染的细胞的管长和分支点数均显著减少(图4E和图4F)。上述结果表明H15-B36、H15-B110和H15-B111病毒载体可以抑制HUVEC成管。

实施例6：AAV介导的内皮抑素和血管抑素的表达抑制视网膜新生血管形成和神经胶质细胞增生

将2×10¹⁰vg/眼的AAV颗粒玻璃体内注射入C57BL/6小鼠体内，AAV颗粒具有H15衣壳且包装了B36、B110或B111表达盒(分别称为激光-B36、激光-B110、激光-B111)。如图5A所示，在病毒注射14天后，对小鼠进行激光诱导的CNV模型，然后在另外12天后进行荧光素血管造影(FFA)和免疫荧光(IF)。

结果显示，在AAVH15介导的内皮抑素和血管抑素处理后，激光诱导的CNV簇的尺寸减少了约75％(图5B和图5D所示)，并且CNV簇的数量也减少了(图5B和图5E)。同时，AAVH15介导的新生血管抑制作用加速了激光诱导的病变的恢复。激光诱导的视网膜损伤12天后，与未治疗的对照组(激光模型)相比，不同治疗组的病灶体积减少了约50-75％(图5B和图5F)。为了进一步研究细胞机制，将视网膜与血管标记物IB4和视网膜胶质细胞标记物GFAP共染色。在健康的视网膜中，血管周围有星形胶质细胞或Müller细胞，显示出清晰的网络(图5C)。激光诱导的损伤后，包括星形胶质细胞和Müller细胞在内的活化的视网膜神经胶质积聚，形成与CNV簇紧密亲和的神经胶质瘢痕膜，而AAVH15介导的内皮抑素和血管抑素的释放显著改善了视网膜情况。如图5G所示，胶质细胞膜覆盖的面积从29.9％急剧下降至12％左右(***p<0.001)，表明抑制了胶质细胞的增生。由此可见，通过AAV(其具有H15衣壳且包装了B36、B110或B111表达盒)的治疗可以减轻新生血管形成和视网膜神经胶质增生。

此外，还研究了低剂量AAV颗粒的治疗效果。向C57BL/6小鼠玻璃体内注射2×10⁹vg/眼的AAV颗粒(带有AAVT13衣壳且包装B36、B110和B111转基因表达盒)。如图6A所示，在病毒注射14天后，对小鼠进行激光诱导的CNV模型，然后在另外12天后进行荧光素血管造影(FFA)和免疫荧光(IF)。

结果表明，如图6B至图6D所示，与未治疗的对照组(激光模型)相比，在B36和B111治疗组中观察到更小的CNV簇和激光诱发的病灶(*p<0.05，**p<0.01，n＝7眼/组)，表明在低剂量下通过AAVT13介导的内皮抑素和血管抑素的表达改善了新生血管形成和病变诱导的疤痕。

实施例7：AAV介导的内皮抑素和血管抑素表达对肿瘤生长的抑制作用

为了研究AAV基因递送系统对癌症治疗的作用，在具有Foxn1基因突变的全身性T细胞和部分B细胞缺陷的CByJ.Cg-Foxn1nu/J的小鼠皮下注射Hepa1-6鼠肝癌细胞，以及带有B36和B111转基因盒的AAVH15(H15-B36和H15-B111)。如图7A所示，将培养皿中生长的Hepa1-6细胞(ATCC CRL-1830)用0.05％胰蛋白酶消化，以800rpm离心5分钟，然后重悬于PBS中进行小鼠注射。向CByJ.Cg-Foxn1nu/J小鼠(Jackson实验室库存号000711)皮下注射2×10⁶个Hepa1-6细胞和1×10¹¹vg的AAVH15(分别包装B36和B111表达盒)的混合物。在植入后7、14和21天测量肿瘤大小。注射Hepa1-6细胞和编码GFP的AAV(AAVH15)的小鼠作为对照。

如图7B和图7C中所观察到的，在癌细胞植入和H15-B36和H15-B111治疗后的第14天，与对照小鼠相比，B36和B111治疗组的肿瘤体积已经显著减小。在治疗后的第21天，B36和B111治疗组的平均肿瘤体积分别为211.3和75.9mm²，小于对照组(平均肿瘤体积为2240mm²)的十分之一。上述结果表明，AAVH15介导的内皮抑素和血管抑素表达对肿瘤生长具有显著抑制作用。

虽然通过参照本公开的某些优选实施方式，已经对本公开进行了图示和描述，但本领域的普通技术人员应该明白，以上内容是结合具体的实施方式对本公开所作的进一步详细说明，不能认定本公开的具体实施只局限于这些说明。本领域技术人员可以在形式上和细节上对其作各种改变，包括做出若干简单推演或替换，而不偏离本公开的精神和范围。

序列表

<110> 上海信致医药科技有限公司

<120> 用于治疗视网膜疾病和癌症的转基因表达盒

<130> PCNCNN211627G

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2214

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> AAVH15编码序列

<400> 1

atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca acctctctga gggcattcgc 60

gagtggtggg acctgaaacc tggagccccg aaacccaaag ccaaccagca aaagcaggac 120

aacggccggg gtctggtgct tcctggctac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180

aagggggagc cggtcaacgc agcagacgcg gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac 240

cagcagctca aagcgggtga caatccgtac ctgcggtata accacgccga cgccgagttt 300

caggagcgtc tgcaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgagc agtcttccag 360

gccaagaaga gggttctcga accttttggt ctggttgagg aaggtgctaa gacggctcct 420

ggaaagaaac gtccggtaga gcagtcgcca caagagccag actcctcctc gggcatcggc 480

aagacaggcc agcagcccgc taaaaagaga ctcaattttg gtcagactgg cgactcagag 540

tcagtcccag accctcaacc tctcggagaa cctccagcaa cccccgctgc tgtgggacct 600

actacaatgg ctacaggcag tggcgcacca atggcagaca ataacgaggg tgccgacgga 660

gtgggtaatg cctcaggaaa ttggcattgc gattccacat ggctgggcga cagagtcatc 720

accaccagca cccgaacatg ggccctgccc acctacaaca accacctcta caagcaaatc 780

tccaacagca catctggagg atcttcaaat gacaacgcct acttcggcta cagcaccccc 840

tgggggtatt ttgatttcaa cagattccac tgccactttt caccacgtga ctggcagcga 900

ctcatcaaca acaattgggg attccggccc aagagactca acttcaaact cttcaacatc 960

caagtcaagg aggtcacgac gaatgacggc gttacgacca tcgctaataa ccttaccagc 1020

acggttcaag tcttctcgga ctcggagtac cagttgccgt acgtcctcgg ctctgcgcac 1080

cagggctgcc tccctccgtt cccggcggac gtgttcatga ttccgcaata cggctacctg 1140

acgctcaaca atggcagcca ggcagtggga cggtcatcct tttactgcct ggaatatttc 1200

ccatcgcaga tgctgagaac gggcaacaac tttaccttca gctacacctt cgaggacgtg 1260

cctttccaca gcagctacgc gcacagccag agcctggacc ggctgatgaa tcctctcatc 1320

gaccagtacc tgtattacct gaacagaact caaaatcagt ccggaagtgc ccaaaacaag 1380

gacttgctgt ttagccgtgg gtctccagct ggcatgtctg ttcagcccaa aaactggcta 1440

cctggaccct gttatcggca gcagcgcgtt tctaaaacaa aaacagacaa caacaacagc 1500

aactttacct ggactggtgc ttcaaaatat aacctcaatg ggcgtgaatc catcatcaac 1560

cctggcactg ctatggcctc acacaaagac gacaaagaca agttctttcc catgagcggt 1620

gtcatgattt ttggaaaaga gagcgccgga gcttcaaaca ctgcattgga caatgtcatg 1680

attacagacg aagaggaaat caaagccact aaccccgtgg ccaccgaaag atttgggacc 1740

gtggcagtca atctccagag cagcagcaca gaccctgcga ccggagatgt gcatgttatg 1800

ggagccttac ctggaatggt gtggcaagat agagacgtgt acctgcaggg tcccatttgg 1860

gccaaaattc ctcacacaga tggacacttt cacccgtctc ctcttatggg cggctttgga 1920

ctcaagaacc cgcctcctca gatcctcatc aaaaacacgc ctgttcctgc gaatcctccg 1980

gcagagtttt cggctacaaa gtttgcttca ttcatcaccc agtattccac aggacaagtg 2040

agcgtggaga ttgaatggga gctgcagaaa gaaaacagca agcgctggaa tcccgaagtg 2100

cagtacacat ccaattatgc aaaatctgcc aacgttgatt ttactgtgga caacaatgga 2160

ctttatactg agcctcgccc cattggcacc cgttacctca cccgtcccct gtaa 2214

<210> 2

<211> 737

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> AAVH15氨基酸序列

<400> 2

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asn Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro

115 120 125

Phe Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly

145 150 155 160

Lys Thr Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro

180 185 190

Ala Thr Pro Ala Ala Val Gly Pro Thr Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly

195 200 205

Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala

210 215 220

Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile

225 230 235 240

Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

245 250 255

Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn

260 265 270

Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg

275 280 285

Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn

290 295 300

Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile

305 310 315 320

Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Val Thr Thr Ile Ala Asn

325 330 335

Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln Leu

340 345 350

Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro

355 360 365

Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn

370 375 380

Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe

385 390 395 400

Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr

405 410 415

Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu

420 425 430

Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn

435 440 445

Arg Thr Gln Asn Gln Ser Gly Ser Ala Gln Asn Lys Asp Leu Leu Phe

450 455 460

Ser Arg Gly Ser Pro Ala Gly Met Ser Val Gln Pro Lys Asn Trp Leu

465 470 475 480

Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Lys Thr Asp

485 490 495

Asn Asn Asn Ser Asn Phe Thr Trp Thr Gly Ala Ser Lys Tyr Asn Leu

500 505 510

Asn Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Pro Gly Thr Ala Met Ala Ser His

515 520 525

Lys Asp Asp Lys Asp Lys Phe Phe Pro Met Ser Gly Val Met Ile Phe

530 535 540

Gly Lys Glu Ser Ala Gly Ala Ser Asn Thr Ala Leu Asp Asn Val Met

545 550 555 560

Ile Thr Asp Glu Glu Glu Ile Lys Ala Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu

565 570 575

Arg Phe Gly Thr Val Ala Val Asn Leu Gln Ser Ser Ser Thr Asp Pro

580 585 590

Ala Thr Gly Asp Val His Val Met Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp

595 600 605

Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro

610 615 620

His Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly

625 630 635 640

Leu Lys Asn Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro

645 650 655

Ala Asn Pro Pro Ala Glu Phe Ser Ala Thr Lys Phe Ala Ser Phe Ile

660 665 670

Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu

675 680 685

Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Tyr Thr Ser

690 695 700

Asn Tyr Ala Lys Ser Ala Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Asn Asn Gly

705 710 715 720

Leu Tyr Thr Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro

725 730 735

Leu

<210> 3

<211> 2205

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> AAVT13编码序列

<400> 3

atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca acctctctga gggcattcgc 60

gagtggtggg cgctgaaacc tggagccccg aagcccaaag ccaaccagca aaagcaggac 120

gacggccggg gtctggtgct tcctggctac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180

aagggggagc ccgtcaacgc ggcggacgca gcggccctgg agcacgacaa ggcctacgac 240

cagcagctgc aggcgggtga caatccgtac ctgcggtata accacgccga cgccgagttt 300

caggagcgtc tgcaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgagc agtcttccag 360

gccaagaagc gggttctcga acctctcggt ctggttgagg aaggcgctaa gacggctcct 420

ggaaagaaga gaccggtaga gccatcaccc cagcgttctc cagactcctc tacgggcatc 480

ggcaagaaag gccaacagcc cgccagaaaa agactcaatt ttggtcagac tggcgactca 540

gagtcagttc cagaccctca acctctcgga gaacctccag cagcgccctc tggtgtggga 600

cctaatacaa tgtctgcggg aggtggcggc ccattgggcg acaataacca aggtgccgat 660

ggagtgggca atgcctcggg agattggcat tgcgattcca cgtggatggg ggacagagtc 720

gtcaccaagt ccacccgaac ctgggtgctg cccagctaca acaaccacca gtaccgagag 780

atcaaaagcg gctccgtcga cagaagcaac gccaacgcct actttggata cagcaccccc 840

tgggggtact ttgactttaa ccgcttccac agccactgga gcccccgaga ctggcaaaga 900

ctcatcaaca actactgggg cttcagaccc cggtccctca gagtcaaaat cttcaacatt 960

caagtcaaag aggtcacggt gcaggactcc accaccacca tcgccaacaa cctcacctcc 1020

accgtccaag tgtttacgga cgacgactac cagctgccct acgtcgtcgg caacgggacc 1080

gagggatgcc tgccggcctt ccctccgcag gtctttacgc tgccgcagta cggttacgcg 1140

acgctgaacc gcgacaacac agaaaatccc accgagagga gcagcttctt ctgcctagag 1200

tactttccca gcaagatgct gagaacgggc aacaactttg agtttaccta caactttgag 1260

gaggtgccct tccactccag cttcgctccc agtcagaacc tcttcaagct ggccaacccg 1320

ctggtggacc agtacttgta ccgcttcgtg agcacaaata acactggcgg agtccagttc 1380

aacaagaacc tggccgggag atacgccaac acctacaaaa actggttccc ggggcccacg 1440

ggccgaaccc agggctggaa cctgggctcc ggggtcaacc gcgccagtgt cagcgccttc 1500

gccacgacca ataggatgga gctcgagggc gcgagttacc aggtgccccc gcagccgaac 1560

ggcatgacca acaacctcca gggcagcaac acctatgccc tggagaacac tatgatcttc 1620

aacagccagc cggcgaaccc gggcaccacc gccacgtacc tcgagggcaa catgctcatc 1680

accagcgaga gcgagacgca gccggtgaac cgcgtggcgt acaacgtcgg cgggcagatg 1740

gccaccaaca accagagctc caccactgcc cccgcgaccg gcacgtacaa cctccaggaa 1800

atcgtgcccg gcagcgtgtg gatggagagg gacgtgtacc tccaaggacc catctgggcc 1860

aagatcccag agacgggggc gcactttcac ccctctccgg ccatgggcgg attcggactc 1920

aaacacccac cgcccatgat gctcatcaag aacacgcctg tgcccggaaa tatcaccagc 1980

ttctcggacg tgcccgtcag cagcttcatc acccagtaca gcaccgggca ggtcaccgtg 2040

gagatggagt gggagctcaa gaaggaaaac tccaagaggt ggaacccaga gatccagtac 2100

acaaacaact acaacgaccc ccagtttgtg gactttgccc cggacagcac cggggaatac 2160

agaaccacca gacctatcgg aacccgatac cttacccgac ccctt 2205

<210> 4

<211> 735

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> AAVT13氨基酸序列

<400> 4

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile

145 150 155 160

Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln

165 170 175

Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro

180 185 190

Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Met Ser Ala Gly Gly

195 200 205

Gly Gly Pro Leu Gly Asp Asn Asn Gln Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn

210 215 220

Ala Ser Gly Asp Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val

225 230 235 240

Val Thr Lys Ser Thr Arg Thr Trp Val Leu Pro Ser Tyr Asn Asn His

245 250 255

Gln Tyr Arg Glu Ile Lys Ser Gly Ser Val Asp Arg Ser Asn Ala Asn

260 265 270

Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg

275 280 285

Phe His Ser His Trp Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn

290 295 300

Tyr Trp Gly Phe Arg Pro Arg Ser Leu Arg Val Lys Ile Phe Asn Ile

305 310 315 320

Gln Val Lys Glu Val Thr Val Gln Asp Ser Thr Thr Thr Ile Ala Asn

325 330 335

Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Asp Asp Tyr Gln Leu

340 345 350

Pro Tyr Val Val Gly Asn Gly Thr Glu Gly Cys Leu Pro Ala Phe Pro

355 360 365

Pro Gln Val Phe Thr Leu Pro Gln Tyr Gly Tyr Ala Thr Leu Asn Arg

370 375 380

Asp Asn Thr Glu Asn Pro Thr Glu Arg Ser Ser Phe Phe Cys Leu Glu

385 390 395 400

Tyr Phe Pro Ser Lys Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Thr

405 410 415

Tyr Asn Phe Glu Glu Val Pro Phe His Ser Ser Phe Ala Pro Ser Gln

420 425 430

Asn Leu Phe Lys Leu Ala Asn Pro Leu Val Asp Gln Tyr Leu Tyr Arg

435 440 445

Phe Val Ser Thr Asn Asn Thr Gly Gly Val Gln Phe Asn Lys Asn Leu

450 455 460

Ala Gly Arg Tyr Ala Asn Thr Tyr Lys Asn Trp Phe Pro Gly Pro Thr

465 470 475 480

Gly Arg Thr Gln Gly Trp Asn Leu Gly Ser Gly Val Asn Arg Ala Ser

485 490 495

Val Ser Ala Phe Ala Thr Thr Asn Arg Met Glu Leu Glu Gly Ala Ser

500 505 510

Tyr Gln Val Pro Pro Gln Pro Asn Gly Met Thr Asn Asn Leu Gln Gly

515 520 525

Ser Asn Thr Tyr Ala Leu Glu Asn Thr Met Ile Phe Asn Ser Gln Pro

530 535 540

Ala Asn Pro Gly Thr Thr Ala Thr Tyr Leu Glu Gly Asn Met Leu Ile

545 550 555 560

Thr Ser Glu Ser Glu Thr Gln Pro Val Asn Arg Val Ala Tyr Asn Val

565 570 575

Gly Gly Gln Met Ala Thr Asn Asn Gln Ser Ser Thr Thr Ala Pro Ala

580 585 590

Thr Gly Thr Tyr Asn Leu Gln Glu Ile Val Pro Gly Ser Val Trp Met

595 600 605

Glu Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro Glu

610 615 620

Thr Gly Ala His Phe His Pro Ser Pro Ala Met Gly Gly Phe Gly Leu

625 630 635 640

Lys His Pro Pro Pro Met Met Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Gly

645 650 655

Asn Ile Thr Ser Phe Ser Asp Val Pro Val Ser Ser Phe Ile Thr Gln

660 665 670

Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Glu Met Glu Trp Glu Leu Lys Lys

675 680 685

Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Asn Asn Tyr

690 695 700

Asn Asp Pro Gln Phe Val Asp Phe Ala Pro Asp Ser Thr Gly Glu Tyr

705 710 715 720

Arg Thr Thr Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu

725 730 735

<210> 5

<211> 772

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CB启动子核苷酸序列

<400> 5

acgcgtggta cctctggtcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 60

caacgacccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg 120

actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat 180

caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc 240

tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctactcg 300

aggccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc cccaccccca attttgtatt 360

tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg gggggggggg gggggggcgc 420

gcgccaggcg gggcggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg 480

gcagccaatc agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg 540

cggccctata aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagcgg gatcagccac cgcggtggcg 600

gccctagagt cgatcgagga actgaaaaac cagaaagtta actggtaagt ttagtctttt 660

tgtcttttat ttcaggtccc ggatccggtg gtggtgcaaa tcaaagaact gctcctcagt 720

ggatgttgcc tttacttcta ggcctgtacg gaagtgttac ttctgctcta aa 772

<210> 6

<211> 208

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> bGH POLYA核苷酸序列

<400> 6

ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60

tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120

tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180

gggaagacaa tagcaggcat gctgggga 208

<210> 7

<211> 2142

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B36表达盒的核苷酸序列

<400> 7

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggaatt cacgcgtggt 120

acgatctgaa ttcggtacaa ttcacgcgtg gtacctctgg tcgttacata acttacggta 180

aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 240

ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 300

aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg 360

tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 420

ctacttggca gtacatctac tcgaggccac gttctgcttc actctcccca tctccccccc 480

ctccccaccc ccaattttgt atttatttat tttttaatta ttttgtgcag cgatgggggc 540

gggggggggg gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg gcggggcgag gggcggggcg 600

gggcgaggcg gagaggtgcg gcggcagcca atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt 660

ttatggcgag gcggcggcgg cggcggccct ataaaaagcg aagcgcgcgg cgggcgggag 720

cgggatcagc caccgcggtg gcggccctag agtcgatcga ggaactgaaa aaccagaaag 780

ttaactggta agtttagtct ttttgtcttt tatttcaggt cccggatccg gtggtggtgc 840

aaatcaaaga actgctcctc agtggatgtt gcctttactt ctaggcctgt acggaagtgt 900

tacttctgct ctaaaagctg cggaattgta cccgcggccg atccaccggt gccaccatga 960

aatgggtcac ctttatcagc ctgctgttcc tgttcagcag cgcctacagc cacagccaca 1020

gagacttcca gcctgtgctg catctggtgg ccctgaactc tccactgagt ggtggcatga 1080

gaggcatcag aggggctgac ttccagtgct tccagcaggt gagtatctca gggatccaga 1140

catggggata tgggaggtgc ctctgatccc agggctcact gtgggtctct ctgttcacag 1200

gccagagctg ttggactggc tggaaccttc agagccttcc tgagcagcag actgcaggac 1260

ctgtacagca ttgtcagaag ggcagacaga gctgctgtgc ccattgtgaa cctgaaggat 1320

gaactgctgt tccctagctg ggaagccctg ttctctggct ctgagggacc tctgaaacct 1380

ggggccagaa tcttcagctt tgatggcaag gatgtgctga gacaccccac ctggcctcag 1440

aaatctgtgt ggcatggctc tgaccccaat ggcagaaggc tgacagagtc ctactgtgaa 1500

acttggagaa cagaggcccc atctgccaca ggccaggcca gttcacttct tggaggtaga 1560

ctgctgggcc agtctgcagc ctcttgtcac catgcctaca ttgtgctgtg cattgagaac 1620

agcttcatga cagccagcaa gtgaaagctt atcaggtgag tggcgggccc tgagctgggg 1680

ggcgggggtg ttggctctgg aggctgggtc tgagcgtaat tttgcacccc cgcgtccctg 1740

caggataccg tcgactagag ctcgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc 1800

atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt 1860

cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct 1920

ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc 1980

tggggagaga tcgatctagg aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc 2040

tcgctcgctc actgaggccg cccgggcaaa gcccgggcgt cgggcgacct ttggtcgccc 2100

ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc aa 2142

<210> 8

<211> 201

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B36蛋白产物氨基酸序列

<400> 8

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala

20 25 30

Leu Asn Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Ile Arg Gly Ala Asp

35 40 45

Phe Gln Cys Phe Gln Gln Ala Arg Ala Val Gly Leu Ala Gly Thr Phe

50 55 60

Arg Ala Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser Ile Val Arg

65 70 75 80

Arg Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro Ile Val Asn Leu Lys Asp Glu Leu

85 90 95

Leu Phe Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly Pro Leu

100 105 110

Lys Pro Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Lys Asp Val Leu Arg

115 120 125

His Pro Thr Trp Pro Gln Lys Ser Val Trp His Gly Ser Asp Pro Asn

130 135 140

Gly Arg Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala

145 150 155 160

Pro Ser Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Gly Gly Arg Leu Leu

165 170 175

Gly Gln Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr Ile Val Leu Cys Ile

180 185 190

Glu Asn Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys

195 200

<210> 9

<211> 3450

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B110表达盒的核苷酸序列

<400> 9

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta gccatgctct 180

aggaagatcg gaattctcta gaacgcgtgg tacctctggt cgttacataa cttacggtaa 240

atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt 300

tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta 360

aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt 420

caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc 480

tacttggcag tacatctact cgaggccacg ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc 540

tccccacccc caattttgta tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc gatgggggcg 600

gggggggggg gggggcgcgc gccaggcggg gcggggcggg gcgaggggcg gggcggggcg 660

aggcggaaag gtgcggcggc agccaatcaa agcggcgcgc tccgaaagtt tccttttatg 720

gcaaggcggc ggcggcggcg gccctataaa aagcaaaccg cgcggcgggc gggagcggga 780

tcagccaccg cggtggcggc ctaaagtcga cgaggaactg aaaaaccaga aagttaactg 840

gtaagttaag tctttttgtc ttttatttca ggtcccggat ccggtggtgg tgcaaatcaa 900

agaactgctc ctcagtggat gttgccttta cttctaggcc tgtacggaag tgttacttct 960

gctctaaaag ctgcggaatt gtacccgcgg ccggccgcca ccatgtggtg gcgtctgtgg 1020

tggctgctgt tgctgctgct tctgctgtgg cctatggtct gggctgacta caaagacgat 1080

gacgacaagc acagccacag agacttccag cctgtgctgc atctggtggc cctgaactct 1140

ccactgagtg gtggcatgag aggcatcaga ggggctgact tccagtgctt ccagcaggcc 1200

agagctgttg gactggctgg aaccttcaga gccttcctga gcagcagact gcaggacctg 1260

tacagcattg tcagaagggc agacagagct gctgtgccca ttgtgaacct gaaggatgaa 1320

ctgctgttcc ctagctggga agccctgttc tctggctctg agggacctct gaaacctggg 1380

gccagaatct tcagctttga tggcaaggat gtgctgagac accccacctg gcctcagaaa 1440

tctgtgtggc atggctctga ccccaatggc agaaggctga cagagtccta ctgtgaaact 1500

tggagaacag aggccccatc tgccacaggc caggccagtt cacttcttgg aggtagactg 1560

ctgggccagt ctgcagcctc ttgtcaccat gcctacattg tgctgtgcat tgagaacagc 1620

ttcatgacag ccagcaagag aaagcggaga agcggatctg gcgcccctgt gaaacagacc 1680

ctgaacttcg acctgctgaa gctggctggc gacgtggaaa gcaaccctgg acctatgtgg 1740

tggcggctct ggtggttgtt gctccttctc ctgctgctct ggcccatggt ttgggccaac 1800

cggaagtcca gcatcatcat ccgcatgcgc gacgtggtgc tgttcgagaa gaaggtgtac 1860

ctgagcgagt gcaagaccgg caacggcaag aactacagag gcaccatgag caagaccaag 1920

aacggcatca cctgtcagaa gtggtccagc acaagccctc acagacccag attcagcccc 1980

gccacacatc caagcgaagg cctggaagag aactactgca gaaaccccga caacgaccct 2040

caaggccctt ggtgctacac caccgatcct gagaagagat acgactactg cgacatcctg 2100

gaatgcgaag aggaatgcat gcactgcagc ggcgagaact acgacggcaa gatctccaag 2160

accatgagcg gactggaatg ccaggcttgg gacagccagt ctcctcacgc tcacggctac 2220

atccccagca agttccccaa caagaacctg aagaagaatt actgtcggaa ccccgaccgc 2280

gagctgaggc cttggtgttt taccacagat ccaaacaagc gctgggagct gtgcgacatc 2340

cccagatgca caacccctcc acctagcagc ggccctacct accaatgtct gaaaggcacc 2400

ggcgagaatt accggggcaa tgtggctgtg accgtgtccg gccatacctg ccaacattgg 2460

agcgcccaga cacctcacac acacaacaga acccctgaga acttcccctg caagaatctg 2520

gacgaaaact actgtaggaa tcccgatggc aagagggccc catggtgtca caccaccaac 2580

agccaagtcc gctgggagta ctgcaagatc cccagctgtg atagcagccc cgtgtctaca 2640

gaacagctgg cccctacagc tcctcctgag ctgacacctg tggtgcagga ttgctatcac 2700

ggcgacggcc agtcctatag aggcacaagc agcaccacca caaccggcaa gaagtgccag 2760

agctggtcct ccatgacacc ccaccggcac cagaaaaccc cagaaaacta ccccaatgcc 2820

ggcctgacca tgaactattg ccggaatcct gacgccgaca aaggcccctg gtgtttcaca 2880

actgacccca gcgtcagatg ggaatactgt aatctgaaga agtgcagcgg caccgaggcc 2940

tctgttgttg ctcctcctcc ttacccatac gatgttcctg actatgcggg ctatccctat 3000

gacgtcccgg actatgcata aatgcacttc gaattaaacc gctgatcagc ctcgactgtg 3060

ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa 3120

ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt 3180

aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa 3240

gacaatagca ggcatgctgg ggactcgagt agataagtag catggcgggt taatcattaa 3300

ctacaaggaa cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac 3360

tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg cctcagtgag 3420

cgagcgagcg cgcagcctta attaacctaa 3450

<210> 10

<211> 672

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B110蛋白产物氨基酸序列

<400> 10

Met Trp Trp Arg Leu Trp Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Pro Met Val Trp Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys His Ser His

20 25 30

Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu

35 40 45

Ser Gly Gly Met Arg Gly Ile Arg Gly Ala Asp Phe Gln Cys Phe Gln

50 55 60

Gln Ala Arg Ala Val Gly Leu Ala Gly Thr Phe Arg Ala Phe Leu Ser

65 70 75 80

Ser Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser Ile Val Arg Arg Ala Asp Arg Ala

85 90 95

Ala Val Pro Ile Val Asn Leu Lys Asp Glu Leu Leu Phe Pro Ser Trp

100 105 110

Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly Pro Leu Lys Pro Gly Ala Arg

115 120 125

Ile Phe Ser Phe Asp Gly Lys Asp Val Leu Arg His Pro Thr Trp Pro

130 135 140

Gln Lys Ser Val Trp His Gly Ser Asp Pro Asn Gly Arg Arg Leu Thr

145 150 155 160

Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ser Ala Thr Gly

165 170 175

Gln Ala Ser Ser Leu Leu Gly Gly Arg Leu Leu Gly Gln Ser Ala Ala

180 185 190

Ser Cys His His Ala Tyr Ile Val Leu Cys Ile Glu Asn Ser Phe Met

195 200 205

Thr Ala Ser Lys Arg Lys Arg Arg Ser Gly Ser Gly Ala Pro Val Lys

210 215 220

Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser

225 230 235 240

Asn Pro Gly Pro Met Trp Trp Arg Leu Trp Trp Leu Leu Leu Leu Leu

245 250 255

Leu Leu Leu Trp Pro Met Val Trp Ala Asn Arg Lys Ser Ser Ile Ile

260 265 270

Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu Phe Glu Lys Lys Val Tyr Leu Ser

275 280 285

Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met Ser Lys

290 295 300

Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser Pro His

305 310 315 320

Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu Gly Leu Glu Glu

325 330 335

Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp Cys Tyr

340 345 350

Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu Glu Cys

355 360 365

Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn Tyr Asp Gly Lys Ile

370 375 380

Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala Trp Asp Ser Gln Ser

385 390 395 400

Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe Pro Asn Lys Asn Leu

405 410 415

Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu Leu Arg Pro Trp Cys

420 425 430

Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu Cys Asp Ile Pro Arg

435 440 445

Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr Tyr Gln Cys Leu Lys

450 455 460

Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Val Ala Val Thr Val Ser Gly

465 470 475 480

His Thr Cys Gln His Trp Ser Ala Gln Thr Pro His Thr His Asn Arg

485 490 495

Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp Glu Asn Tyr Cys Arg

500 505 510

Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His Thr Thr Asn Ser Gln

515 520 525

Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys Asp Ser Ser Pro Val

530 535 540

Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro Thr Ala Pro Pro Glu Leu Thr Pro Val

545 550 555 560

Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser Tyr Arg Gly Thr Ser

565 570 575

Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser Trp Ser Ser Met Thr

580 585 590

Pro His Arg His Gln Lys Thr Pro Glu Asn Tyr Pro Asn Ala Gly Leu

595 600 605

Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp Lys Gly Pro Trp Cys

610 615 620

Phe Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu Lys Lys

625 630 635 640

Cys Ser Gly Thr Glu Ala Ser Val Val Ala Pro Pro Pro Tyr Pro Tyr

645 650 655

Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

660 665 670

<210> 11

<211> 3255

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B111表达盒的核苷酸序列

<400> 11