一株耐盐异养硝化好氧反硝化菌及其应用
阅读说明：本技术 一株耐盐异养硝化好氧反硝化菌及其应用 (Salt-tolerant heterotrophic nitrification aerobic denitrification bacterium and application thereof ) 是由 雷强 张燕 孙燕 封志飞 刘啟明 于 2021-09-02 设计创作，主要内容包括：本发明提供一株耐盐异养硝化好氧反硝化菌,属于生物技术领域,其保藏编号为GDMCC NO.61505。本发明从养殖废水中分离出产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)YZ-12,该菌株具有耐盐、异养硝化和好氧反硝化能力,在盐度为30g/L时仍能够生长且部分脱氮,对于150mg/L浓度以下氨氮废水、500mg/L浓度以下硝态氮废水,脱氮率均在97%以上。本发明中的菌株在污水处理中具有潜在的应用前景。(The invention provides a salt-tolerant heterotrophic nitrification aerobic denitrification strain, which belongs to the technical field of biology and has a preservation number of GDMCC NO. 61505. The invention separates klebsiella oxytoca (Klebsiella oxytoca) from the culture wastewater Klebsiella oxytoca ) YZ-12, the strain has the salt-tolerant, heterotrophic nitrification and aerobic denitrification capabilities, can still grow and partially denitrify when the salinity is 30g/L, and has the denitrification rate of more than 97 percent for ammonia nitrogen wastewater with the concentration of less than 150mg/L and nitrate nitrogen wastewater with the concentration of less than 500 mg/L. The strain has potential application prospect in sewage treatment.)
技术领域
本发明涉及一株耐盐异养硝化好氧反硝化菌及其应用，属于环境微生物技术领域。
背景技术
随着水体富营养化问题日益突出,氮素污染的防治越来越受到人们的重视。目前污水脱氮处理方法主要有化学法、生化法及生物物理-物化组合工艺,其中生物脱氮以其经济、高效、无残留污染的特性,成为污水脱氮的主要手段。但是,传统的生物脱氮分硝化和反硝化等不同过程，要求在两个反应器中进行,建设成本高,而且各个步骤需要分别添加碳源、调节酸碱等。
近年来, 随着具有异养硝化好氧反硝化特性菌株的发现，利用异养硝化好氧反硝化菌研发污水脱氮技术日益成为研究热点。和传统硝化微生物相比，异养硝化好氧反硝化菌具有更高的细胞生长速率，并且实现了在同一个反应器中同步完成硝化和反硝化反应，同时将氨氮、硝态氮和亚硝态氮转化为含氮气体。而且，在硝化和反硝化过程中分别产生的酸和碱能相互中和，相对维持水体酸碱平衡，减少pH调节成本。一些特殊异养硝化好氧反硝化菌甚至还具备耐受高氨氮、高盐度、低温和低C/N的特性。这些优势使得异养硝化好氧反硝化菌成为污水脱氮处理的研究热点。
发明内容
本发明提供一株耐盐异养硝化好氧反硝化菌，能应用于污水处理领域。
本发明所提供的产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）YZ-12，于2021年7月21日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO.61505。
本发明所筛选的产酸克雷伯菌YZ-12在污水处理中的应用。
本发明还提供一种应用所述产酸克雷伯菌YZ-12进行污水脱氮处理的方法，所述方法包括如下步骤：
（1）活化产酸克雷伯菌YZ-12；具体地，可以取产酸克雷伯菌YZ-12接种于固体培养基中，在28～35℃的条件下，培养24h，制得活化菌株；所述固体培养基是在LB培养基中添加15～20g/L琼脂粉。
（2）制备种子液；具体地，取步骤(1)制得的活化菌株，接种于种子培养基中，在28～35℃，120～200r/min的条件下，培养12～16h，即得种子液；所述种子培养基可以是：胰蛋白胨1g/L，酵母提取物0.5g/L，硝酸钾0.1g/L，pH7.0～7.5。
（3）污水脱氮处理；具体地，取步骤(2)的种子液，按体积比5％的比例接种于待处理污水中，加入蔗糖为碳源，调节C/N为10～20，pH为6～9，在28～35℃，120～200r/min条件下培养24～48h，取水样检测菌株脱氮效果。
所述产酸克雷伯菌YZ-12还具有一定的耐高盐性，在含30g/L氯化钠脱氮培养基中培养48h，菌株数量可达108cell/mL。
本发明的有益效果：
本发明提供的产酸克雷伯菌YZ-12所具有的特性非常适合用于污水脱氮处理。其活菌具有耐盐性，在盐度为10g/L时具有良好的硝化能力，盐度小于等于30g/L时具有良好的反硝化能力；菌株还具有较好的酸碱适应范围，在6～9的pH范围内具有良好的脱氮效果；最适碳源为蔗糖；脱氮最适C/N范围为10～20。
附图说明
图1菌株YZ-12平板菌落形态。
图2菌株YZ-12的PCR凝胶电泳图。
图3菌株YZ-12的系统发育树。
图4不同碳源对菌株YZ-12脱氮效果的影响。
图5不同初始氮溶度对菌株YZ-12脱氮效果的影响。
图6不同碳氮比对菌株YZ-12脱氮效果的影响。
图7不同pH值对菌株YZ-12脱氮效果的影响。
图8不同盐度对菌株YZ-12脱氮效果的影响。
图9菌株YZ-12对养殖废水脱氮处理效果。
具体实施方式
以下实例将对本发明作进一步说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例 1
产酸克雷伯菌YZ-12的筛选、鉴定和保存
（1）产酸克雷伯菌YZ-12的筛选
取养殖场污水处理站好氧池水样，按10%接种量加到无菌初筛培养基中，30℃，120rpm摇床恒温培养24h，连续传代3次。将连续培养3次的培养液用无菌水分别稀释10-5、10-6、10-7倍，涂布于初筛固体培养基中，30℃恒温培养1～2天，待平板上长出单菌落，挑选菌落区域变蓝的单菌落，划线于初筛固体培养基，待平板上长出单菌落，重复挑取单菌落再次划线，最后划线于LB固体培养基试管斜面，于4℃冰箱保存。
所述初筛培养基的配方如下：C4H4Na2O4·6H2O 8.5g/L，KNO3 1g/L，MgSO4·7H2O1g/L，KH2PO41g/L，CaCl2·2H2O 0.2g/L，FeSO4·7H2O 0.05g/L，1%溴百里酚蓝1mL/L，pH值7.0。
所述初筛固体培养基的配方，是在初筛培养基配方基础上增加琼脂20g/L。
（2）产酸克雷伯菌YZ-12的鉴定
如图一所示菌株YZ-12在LB培养基平板上菌落为圆形，白色，表面光滑，粘稠，弹性大，可拉成丝状。显微镜下菌体呈杆状。
对筛选的菌株进行16S rDNA测序。经PCR扩增后，获得的16S rDNA序列，将序列在NCBI上比对后对其进行系统发育树的构建，（见图三），确定菌种为产酸克雷伯菌，即Klebsiella oxytoca YZ-12。
（3）产酸克雷伯菌YZ-12的保存
挑取产酸克雷伯菌YZ-12菌株接种于LB培养基中，30℃，120rpm恒温培养12～24h后，取0.6mL培养液转入装有0.6mL的40％的甘油保藏管中，-20℃冷冻保藏。该菌2021年7月21日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO.61505。
实施例 2
产酸克雷伯菌YZ-12在不同条件下的脱氮效果
（1）碳源对产酸克雷伯菌YZ-12脱氮效果影响检测
种子液制备：取实施例 1中4℃冰箱保存的产酸克雷伯菌YZ-12，接种在装有50mL种子培养基的250mL锥形瓶中，在28～35℃，120～200r/min的条件下，培养12～16h，即得种子液。
脱氮效果检测：用葡萄糖、蔗糖、乙酸钠、甲醇、丁二酸钠为唯一碳源配制氨氮培养基和硝态氮培养基，NH4 +-N浓度为350mg/L，NO3 --N浓度为415mg/L，按5%接种量加入种子液，在28～35℃，120～200r/min的条件下培养72h，每24h取样8000rpm离心，取上清液用纳氏试剂分光光度法检测NH4 +-N浓度，用离子色谱法检测NO3 --N浓度。其中以蔗糖为碳源氨氮培养基中NH4 +-N去除率为42.86%，以蔗糖为碳源硝态氮培养基中NO3 --N去除率为99.84%，氨氮培养基、硝态氮培养基均无NO2 --N积累。
（2）氮源浓度对产酸克雷伯菌YZ-12脱氮效果影响检测
配制NH4 +-N浓度梯度为50、100、150、200、250mg/L，NO3 --N浓度为400、450、500、550、600mg/L，9.8g/L蔗糖的氨氮培养基、硝态氮培养基，按5%接种量加入上述种子液，在28～35℃，120～200r/min的条件下培养72h，每24h取样8000rpm离心，取上清液用纳氏试剂分光光度法检测NH4 +-N浓度，用离子色谱法检测NO3 --N浓度。其中NH4 +-N浓度为50、100mg/L时NH4 +-N去除率为99%以上，NO3 --N浓度400、450mg/L时NO3 --N去除率为99%,且均无NO2 --N积累。
（3）C/N对产酸克雷伯菌YZ-12脱氮效果影响检测
固定NH4 +-N浓度为100mg/L，NO3 --N浓度为415mg/L，调节C/N为2.5、5、10、15、20。按5%接种量加入上述种子液，在28～35℃，120～200r/min的条件下培养72h，每24h取样8000rpm离心，取上清液用纳氏试剂分光光度法检测NH4 +-N浓度，用离子色谱法检测NO3 --N浓度。其中在C/N为10、15、20时，NH4 +-N和NO3 --N去除率均在99%以上，且无NO2 --N积累。
（4）pH对产酸克雷伯菌YZ-12氮效果影响检测
配置NH4 +-N浓度为100mg/L，NO3 --N浓度为415mg/L，C/N为10的氨氮培养基、硝态氮培养基，分别用1mol/L盐酸溶液和1mol/L氢氧化钠溶液调节至pH=5、pH=6、pH=7、pH=8、pH=9。按5%接种量加入上述种子液，在28～35℃，120～200r/min的条件下培养72h，每24h取样8000rpm离心，取上清液用纳氏试剂分光光度法检测NH4 +-N浓度，用离子色谱法检测NO3 --N浓度。其中pH为7、8、9时，NH4 +-N和NO3 --N去除率均在99%以上，且无NO2 --N积累。
（5）盐度对产酸克雷伯菌YZ-12脱氮效果影响检测
配置NH4 +-N浓度为100mg/L，NO3 --N浓度为415mg/L，C/N为10的氨氮培养基、硝态氮培养基，分别加入质量比1%、2%、3%、4%、5%的NaOH。按5%接种量加入上述种子液，在28～35℃，120～200r/min的条件下培养72h，每24h取样8000rpm离心，取上清液用纳氏试剂分光光度法检测NH4 +-N浓度，用离子色谱法检测NO3 --N浓度。其中盐度为1%时NH4 +-N和NO3 --N去除率均在99%以上；盐度为2%时NH4 +-N去除率为66.7%，NO3 --N去除率为99.9%；盐度为3%时NH4 +-N去除率为23.0%，NO3 --N去除率为99.7%，且均无NO2 --N积累。
上述涉及的培养基配方包括：
种子培养基：胰蛋白胨1g/L，酵母提取物0.5g/L，KNO30.1g/L，pH值7.0。
氨氮培养基：C4H4Na2O4·6H2O 11g/L，Na2HPO4·12H2O 6.7g/L，KH2PO4 1g/L，NH4Cl1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，微量元素溶液2mL，pH值7.0～7.3。
硝态氮培养基：蔗糖5g/L，Na2HPO4·12H2O 7.9g/L，KH2PO4 1.5g/L，MgSO4·7H2O0.1g/L，KNO3 3g/L，微量元素溶液2mL，pH值7.0～7.3。
微量元素：EDTA 50g/L，CaCl2·2H2O 7.28g/L，FeSO4·7H2O 5g/L，ZnSO4·7H2O3.92g/L，MnCl2·4H2O 2.06g/L，CoCl2·6H2O 1.61g/L，CuSO4·5H2O 1.57g/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O 1.1g/L，pH值6.0。
实施例 3
产酸克雷伯菌YZ-12对养殖废水脱氮处理效果
用蔗糖调节养殖废水的C/N为10，按5%接种量加入实施例2种子液，在28～35℃，120～200r/min的条件下培养72h，每24h取样8000rpm离心，取上清液用纳氏试剂分光光度法检测NH4 +-N浓度，用离子色谱法检测NO3 --N浓度。结果养殖废水NH4 +-N去除率为95.15%，NO3 --N去除率为99.76%。
所述养殖废水水质情况如下：pH值7.8，COD值2031mg/L，氨氮362mg/L，硝态氮23.8mg/L，亚硝态氮0.167mg/L。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 江西中江环保集团股份有限公司
<120> 一株耐盐异养硝化好氧反硝化菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1406
<212> DNA
<213> 16S rRNA基因的扩增产物()
<400> 1
cagtcgaacg gtagcacaga gagcttgctc tcgggtgacg agtggcggac gggtgagtaa 60
tgtctgggaa actgcctgat ggagggggat aactactgga aacggtagct aataccgcat 120
aacgtcgcaa gaccaaagag ggggaccttc gggcctcttg ccatcagatg tgcccagatg 180
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tcgatgcaac gcgaagaacc ttacctactc ttgacatcca gagaacttag cagagatgct 960
ttggtgcctt cgggaactct gagacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct cgtgttgtga 1020
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cgggaactca aaggagactg ccagtgataa actggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc 1140
atcatggccc ttacgagtag ggctacacac gtgctacaat ggcatataca aagagaagcg 1200
acctcgcgag agcaagcgga cctcataaag tatgtcgtag tccggattgg agtctgcaac 1260
tcgactccat gaagtcggaa tcgctagtaa tcgtggatca gaatgccacg gtgaatacgt 1320
tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt gggttgcaaa agaagtaggt 1380
agcttaacct tcgggagggc gctacc 1406
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