T细胞受体及其应用
阅读说明：本技术 T细胞受体及其应用 (T cell receptor and uses thereof ) 是由 王智鼎 于力 于 2021-10-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了T细胞受体及其应用,本发明还公开了相关多肽和蛋白质,以及相关核酸、载体、细胞、组合物和嵌合分子。(The invention discloses T cell receptors and uses thereof, and related polypeptides and proteins, as well as related nucleic acids, vectors, cells, compositions, and chimeric molecules.)
技术领域
本发明属于细胞免疫学、基因工程领域，涉及T细胞受体及其应用。
背景技术
T淋巴细胞作为人体免疫系统的不可或缺的一大类免疫细胞，对于保护机体免受外来病原微生物的侵染以及维持机体免疫系统平衡具有至关重要的意义。T淋巴细胞经来源于骨髓，且在胸腺激素的诱导下于胸腺微环境中发育成熟形成高度分化的具有免疫活性的免疫细胞。发育成熟的T淋巴细胞随血流进入人体外周免疫器官，并可经淋巴管以及外周血进行再循环，发挥细胞免疫及免疫调节等功能。
目前，肿瘤的治疗方法除了传统的手术、化疗、放疗外，免疫治疗也迅速发展为一种公认的有效方法。免疫治疗当中主要包括抗体疗法以及免疫细胞疗法，其中免疫细胞疗法目前主要包括嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)和T细胞受体-T细胞(TCR-T)，CAR-T与TCR-T的抗原识别端都是针对肿瘤抗原靶点而精准设计的(Barrett J.Expanding the antigenicrepertoire of CAR-T cells with"TCR-like"antibody specificity,[J].Cytotherapy,2016 18(8):929-930.)。目前，针对CAR-T细胞免疫治疗，已有报道表明，其在治疗急性和慢性淋巴细胞白血病的临床试验方面已被证实有显著疗效(Ma Q,Garber HR,Lu S,et al.Anovel TCR-like CAR with specificity for PR1/HLA-A2 effectively targetsmyeloid leukemia in vitro when expressed in human adult peripheral blood andcord blood T cells.[J]Cytotherapy,2016,18(8):985-994)。但是，目前的CAR-T治疗的限制性还是明显存在的，首先CAR-T可选择靶点有限，对实体瘤的治疗还没有很好的效果。而且CAR-T治疗带来的不良反应，如细胞因子风暴等有时不易控制。因此，人们需要一种比CAR-T治疗更好的疗法，能选择更多抗原靶点，并且能够实现对实体瘤治疗达到较好的疗效，且治疗存在的副作用与风险小。随着免疫疗法的迅速发展，针对肿瘤抗原精准设计的TCR-T细胞疗法与CAR-T相比较，具备一些明显的优势。首先，TCR-T可以特异的识别肿瘤抗原，提高T细胞靶向和杀伤肿瘤细胞的能力。另外，TCR-T疗法抗肿瘤靶标更广，它可以靶向大部分肿瘤特异性抗原，尤其是能识别那些肿瘤细胞内部抗原。T细胞通过T细胞受体识别细胞内部肿瘤抗原以及和递呈在表面的经抗原提成细胞胞吞、降解、加工处理的抗原，通过这种识别机制，可以迅速将遭受侵染的靶细胞杀灭(Golubovskaya V,Berahovich R,WuL.Major Highlights of the CAR-TCR Summit,Boston,2016.[J].Anticancer AgentsMed Chem,2017,17(10):1344-1350)。最近的国内外的临床试验表明，TCR-T免疫治疗技术已对一些实体肿瘤有显著疗效，作为细胞免疫治疗的新方法，其机理明确且具备进行临床转化的技术条件，可实现个体化精准治疗，大大提高对晚期肿瘤的治疗效果，特别是对现有治疗方法失败的肿瘤。因此用于治疗恶性肿瘤的相似技术已分别获得美国食品药品管理监督局(FDA)和欧盟的特别政策以推动其尽快在临床应用。这将为治疗恶性肿瘤开辟一条新的道路，有望治愈更多的肿瘤病人，具有重大意义！现有的证据表明TCR-T细胞治疗有希望成为治疗一些晚期癌症的新方法。
自然状态下T细胞受体亲和力比较低下，而且肿瘤细胞存在逃逸机制，比如降低自身MHCI类分子的表达水平，因此寻找有效的肿瘤靶抗原高亲和性的TCR受体和优化TCR-T细胞的转化效率是目前的研究重点。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明鉴定出了新的TCR，并进一步确定了TCR的氨基酸序列，包括其CDR区的氨基酸序列，此外，证明了表达根据本发明的TCR的T细胞具有杀伤肿瘤细胞的效果。
因此，本发明提供了如下技术方案：
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种T细胞受体，所述T细胞受体包含CDR3α和CDR3β，所述CDR3α包含SEQ ID NO：包含SEQ ID NO：3-5任一所示的氨基酸序列；所述CDR3β包含SEQID NO：11-13任一所示的氨基酸序列。
进一步，所述T细胞受体还包含：
SEQ ID NO：1所示的CDR1α，
SEQ ID NO：2所示的CDR2α，
SEQ ID NO：9所示的CDR1β，
SEQ ID NO：10所示的CDR2β，
或其具有一个或多个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
进一步，所述T细胞受体还包含：
α链可变域，其包含SEQ ID NO：6-8任一所示的氨基酸序列或与其具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的变体；
β链可变域，其包含SEQ ID NO：14-16任一所示的氨基酸序列或与其具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的变体。
进一步，所述T细胞受体还包含α链/β链界面处的一个或多个突变，使得当在T细胞中表达所述α链和所述β链时，所述链和内源TCRα和β链之间的错配频率减少。
进一步，所述T细胞受体还包含恒定区。
本发明的第二方面提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含编码本发明第一方面所述的T细胞受体的核苷酸序列。
本发明的第三方面提供了一种载体，所述载体包含本发明第二方面所述的核酸分子。
进一步，所述载体是病毒载体。
进一步，所述病毒载体是慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。
进一步，所述载体还包含编码一个或多个CD3链、CD8、自杀基因和/或选择标志物的多核苷酸。
本发明的第四方面提供了一种细胞，所述细胞包含本发明第一方面所述的T细胞受体，本发明第二方面所述的核酸分子，本发明第三方面所述的载体。
进一步，所述细胞进一步包含编码一个或多个CD3链、CD8、自杀基因和/或选择标志物的载体。
进一步，其中所述细胞是T细胞、淋巴细胞或干细胞；
进一步，其中所述T细胞、所述淋巴细胞或所述干细胞选自下组：CD4细胞、CD8细胞、幼稚T细胞、记忆T细胞、中央记忆T细胞、双阴性T细胞、效应记忆T细胞、效应T细胞、Th0细胞、Tc0细胞、Th1细胞、Tc1细胞、Th2细胞、Tc2细胞、Th17细胞、Th22细胞、γ/δT细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、造血干细胞和多能干细胞。
进一步，所述细胞是T细胞。
进一步，所述T细胞分离自受试者外周血。
本发明的第五方面提供了一种制备细胞的方法，包括以下步骤：
将根据本发明第三方面所述的载体导入细胞中。
进一步，所述导入方法包括转染或转导。
本发明的第六方面提供了一种组合物，包含本发明第一方面所述的T细胞受体，本发明第二方面所述的核酸分子，本发明第三方面所述的载体，本发明第四方面所述的细胞或本发明第五方面的方法制备的细胞。
本发明的第七方面提供了嵌合分子，包含与非细胞底物、毒素和/或抗体缀合的本发明第一方面所述的T细胞受体或其一部分。
进一步，其中所述非细胞底物选自下组：纳米颗粒、外来体(exosome)和其他非细胞底物。
本发明的第八方面提供了如下任一项所述的应用：
(1)本发明第一方面所述的T细胞受体在制备过继细胞转移治疗药物中的应用。
进一步，所述过继细胞转移为过继T细胞转移。
进一步，所述过继T细胞转移是同种异体过继T细胞转移、自体过继T细胞转移或通用的非同种异体反应性过继T细胞转移。
(2)本发明第一方面所述的T细胞受体，本发明第二方面所述的核酸分子，本发明第三方面所述的载体，本发明第四方面所述的细胞、本发明第六方面所述的组合物或本发明第七方面所述的嵌合分子在制备增强免疫力的产品中的应用。
(3)本发明第一方面所述的T细胞受体，本发明第二方面所述的核酸分子，本发明第三方面所述的载体，本发明第四方面所述的细胞、本发明第六方面所述的组合物或本发明第七方面所述的嵌合分子在制备治疗和/或预防疾病的药物中的应用。
进一步，所述疾病为癌症。
进一步，所述癌症为血液肿。
进一步，所述血液肿瘤为白血病。
进一步，所述白血病为急性白血病。
进一步，所述白血病为急性髓系白血病。
进一步，所述血液肿瘤为淋巴瘤。
(4)本发明第一方面所述的T细胞受体，本发明第二方面所述的核酸分子，本发明第三方面所述的载体，本发明第四方面所述的细胞、本发明第六方面所述的组合物或本发明第七方面所述的嵌合分子在制备抗原检测产品中的应用。
附图说明
图1是TCR-T对白血病细胞THP1的杀伤功能检测图。
发明详述
如本文所用，术语“包含”与“包括”或“含有”同义；并且是包括性的或开放式的，并且不排除其他未叙述的成员、要素或步骤。
T细胞受体(TCR)
在抗原加工期间，抗原在细胞内部降解，然后被主要组织相容性复合物(MHC)分子携带到细胞表面。T细胞能够识别抗原呈递细胞的表面处的此肽:MHC复合物。MHC分子有两种不同的类别：MHC I和MHC II，每种类别将肽从不同的细胞区室递送到细胞表面。
T细胞受体(TCR)是一种可以在T细胞表面上发现的分子，其负责识别与MHC分子结合的抗原。天然存在的TCR异二聚体在约95％的T细胞中由α和β链组成，而约5％的T细胞具有由γ和δ链组成的TCR。
TCR与抗原和MHC的结合导致T淋巴细胞活化，在所述T淋巴细胞上通过相关的酶、共受体和专门的辅助分子介导的一系列生化事件来表达TCR。
天然TCR的每条链是免疫球蛋白超家族的成员，并拥有一个N端免疫球蛋白(Ig)可变(V)域、一个Ig恒定(C)域、跨膜/跨细胞膜域和C端的短胞质尾。
TCRα链和β链的可变域具有三个高变或互补决定区(CDR)。TCRα链或β链例如以氨基至羧基末端顺序包含CDR1、CDR2和CDR3。通常，CDR3是负责识别加工抗原的主要CDR，也有证据显示α链的CDR1与抗原性肽的N端部分相互作用，而β链的CDR1与肽的C端部分相互作用，CDR2识别MHC分子。
TCR的恒定域可以由短连接序列组成，其中半胱氨酸残基形成二硫键，从而在两条链之间形成连接。
本发明的TCR可在α和β链的每个中具有一个或多个额外的半胱氨酸残基，使得TCR可以在恒定域中包含两个或更多个二硫键。
结构允许TCR与拥有哺乳动物中的三个独特链(γ、δ和ε)和ζ链的其他分子如CD3缔合。这些辅助分子具有带负电的跨膜区，并且对于将信号从TCR传导到细胞中至关重要。CD3链和δ链与TCR一起形成T细胞受体复合物。
通过特异性共受体同时结合MHC分子增强来自T细胞复合物的信号。对于辅助T细胞，此共受体是CD4(对于II类MHC特异性)；而对于细胞毒性T细胞，此共受体是CD8(对于I类MHC特异性)。共受体允许抗原呈递细胞和T细胞之间的延长的接合，并且募集细胞内参与活化的T淋巴细胞的信号传导的必需分子(例如，LCK)。
因此，如本文所用，术语“T细胞受体”或“TCR”是指能够识别当由MHC分子呈递时的肽的分子。分子可以是两条链α和β(或任选地γ和δ)的异二聚体或者它可以是单链TCR构建体。本发明的TCR可以是可溶性TCR，例如省去或改变一个或多个恒定域。本发明的TCR可以包含恒定域。
本发明的TCR可以是杂合TCR，其包含源自超过一种物种的序列。
互补决定区(CDR)
TCR中建立与同主要组织相容性复合物(MHC)结合的抗原性肽的大多数接触的部分是互补决定区3(CDR3)，其对于每个T细胞克隆是独特的。CDR3区是胸腺中发生并且涉及属于可变(V)、多样性(D，对于β和δ链)和连接(J)基因的非连续基因的体细胞重排事件时产生的。此外，在每个TCR链基因的重排基因座处插入/缺失的随机核苷酸大大增加高度可变CDR3序列的多样性。因此，生物学样品中特定CDR3序列的频率指示特定T细胞群体的丰度。健康的人类中TCR全集的大的多样性针对抗原呈递细胞表面上MHC分子呈递的多种外来抗原提供了广泛的保护。
T细胞受体多样性集中在CDR3上，并且此区域主要负责抗原识别。
本发明的TCR的CDR3区的序列可以选自序列表中列出的那些。TCR可包含CDR，所述CDR包含下文描述的CDR3α和CDR3β对或由下文描述的CDR3α和CDR3β对组成。
CDR可以例如包含给定序列的一个、两个或三个取代、添加或缺失，条件是TCR保留结合由MHC分子呈递时抗原肽的能力。
变体、衍生物、类似物、同源物和片段
除了本文提及的特定蛋白质和多核苷酸之外，本发明还涵盖其变体、衍生物、类似物、同源物和片段的用途。
在本发明的上下文中，任何给定序列的变体是如下的序列，其中残基(无论是氨基酸残基还是核酸残基)的特定序列已经以所讨论的多肽或多核苷酸基本上保留至少一种其内源功能的方式进行了修饰。变体序列可通过天然存在的蛋白质中存在的至少一个残基的添加、缺失、取代、修饰、取代和/或变异获得。
称为具有多达三个氨基酸取代、添加或缺失的本发明的变体氨基酸序列可以具有例如一个、两个或三个氨基酸取代、添加或缺失。
就本发明的蛋白质或多肽而言，如本文所用，术语“衍生物”包括一个(或多个)氨基酸残基从序列或对序列的任何取代、变异、修饰、替换、缺失和/或添加，条件是所得的蛋白质或多肽基本上保留至少一种其内源功能。
就多肽或多核苷酸而言，如本文所用，术语“类似物”包括任何模拟物，即拥有其模拟的多肽或多核苷酸的至少一种内源功能的化合物。
用于本发明的蛋白质还可以具有氨基酸残基的缺失、插入或取代，其产生沉默变化并产生功能上等同的蛋白质。可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进行有意的氨基酸取代，只要保留内源功能即可。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且具有相似亲水性值的具有不带电荷的极性首基的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
取代可以涉及将氨基酸替换为相似的氨基酸(保守取代)。相似的氨基酸是具有分组在一起的具有相关特性的侧链部分的氨基酸，例如，如下所示
(i)碱性侧链：赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)；
(ii)酸性侧链：天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；
(iii)不带电荷的极性侧链：天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和酪氨酸(Y)；或
(iv)非极性侧链：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、色氨酸(W)和半胱氨酸(C)。
任何氨基酸变化应维持TCR结合由MHC分子呈递抗原肽的能力。
变体序列可以包含氨基酸取代、添加、缺失和/或插入。变异可以集中在一个或多个区域中，例如α或β链的恒定区、接头或框架区，或者它们可以分布在整个TCR分子中。
本发明还包括同源取代(例如，取代和替换在本文中均用于指现有氨基酸残基与备选残基的互换)，例如同等取代，例如碱性取代为碱性、酸性取代为酸性、极性取代为极性等。也可以发生非同源取代，例如从一类残基到另一类残基，或备选涉及纳入非天然氨基酸，如鸟氨酸。
如本文所用，术语“变体”可以指与野生型氨基酸序列或野生型核苷酸序列具有一定同源性的实体。术语“同源性”可以等同于“同一性”。
变体序列可以包括与主题序列可以是至少50％，55％，65％，75％，85％或90％相同，优选至少95％，至少97％或至少99％相同的氨基酸序列。通常，变体会包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等。尽管也可以根据相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)考虑同源性，但是在本发明的上下文中，优选根据序列同一性表达同源性。
变体序列可以包括可以与主题序列至少40％，45％，50％，55％，65％，75％，85％或90％相同，优选地至少95％，至少97％或至少99％相同的核苷酸序列。尽管也可以根据相似性考虑同源性，但是在本发明的上下文中，优选根据序列同一性表达同源性。
优选地，提及与本文详述的任何SEQ ID NO具有百分比同一性的序列是指在所提及的SEQ ID NO的整个长度上具有所述同一性百分比的序列。
同一性比较可以通过肉眼进行，或更通常借助容易获得的序列比较程序进行。这些商品化的计算机程序可以计算两个或更多个序列之间的同源性或同一性百分比。
可以在连续序列上计算同源性百分比，即，一个序列与另一序列比对，并且一个序列中的每个氨基酸与另一序列中的对应氨基酸直接比较，一次一个残基。这称为“无缺口”比对。通常，仅在相对少量的残基上进行此类无缺口的比对。
尽管这是一种非常简单且一致的方法，但是它未能考虑到例如在其他方面相同的序列对中，核苷酸序列中的一个插入或缺失可引起后面的密码子退出比对，因此当进行全局比对时，潜在导致同源性百分比的大大降低。因此，大多数序列比较方法设计为产生最佳比对，其考虑到可能的插入和缺失而不过度惩罚整体同源性得分。这是通过在序列比对中插入“缺口”以努力最大化局部同源性来实现的。
但是，这些更复杂的方法将“缺口罚分”分配给比对中出现的每个缺口，以便对于相同数目的相同氨基酸，具有尽可能少的缺口(其反映了两个比较序列之间的更高相关性)的序列比对会比具有许多缺口的比对获得更高的得分。通常使用“仿射缺口成本(Affinegap cost)”，其对于缺口的存在收取相对较高的成本，并对缺口中的每个后续残基收取较小的罚分。这是最常用的缺口评分系统。当然，高缺口罚分将产生具有较少缺口的优化比对。大多数比对程序允许修改缺口罚分。但是，在使用此类软件进行序列比较时，优选使用默认值。例如，当使用GCG Wisconsin Bestfit包时，氨基酸序列的默认缺口罚分是用于缺口的-12和对于每个延伸的-4。
因此，最大同源性百分比的计算首先需要产生最佳比对，考虑到缺口罚分。用于进行此类比对的合适的计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit包。可以进行序列比较的其他软件的实例包括但不限于BLAST包、FASTA和GENEWORKS比较工具套组。BLAST和FASTA都可用于脱机和在线搜索。但是，对于某些应用，优选使用GCG Bestfit程序。另一种称为BLAST2Sequences的工具也可用于比较蛋白质和核苷酸序列。
尽管可以根据同一性来测量最终的同源性百分比，但比对过程本身通常不基于全有或全无对比较。取而代之的是，通常使用缩放的相似性得分矩阵，所述矩阵基于化学相似性或进化距离为每个成对比较分配得分。常用的此类矩阵的一个实例是BLOSUM62矩阵-BLAST程序套件的默认矩阵。
一旦软件产生了最佳比对，就可以计算同源性百分比，优选序列同一性百分比。软件通常将这作为序列比较的部分，并生成数字结果。
“片段”也是变体，并且该术语通常是指功能上或例如在测定法中感兴趣的多肽或多核苷酸的选定区域。因此，“片段”是指作为全长多肽或多核苷酸的一部分的氨基酸或核酸序列。
可以使用标准重组DNA技术，例如定点诱变来制备此类变体。在要进行插入的情况下，可以制备编码插入的合成DNA以及与插入位点任一侧的天然存在序列相对应的5’和3’侧翼区。侧翼区会含有与天然存在的序列中的位点相对应的方便的限制性位点，从而可以用适当的酶切割序列，并将合成的DNA连接到切口中。然后，根据本发明表达DNA以制备编码的蛋白质。这些方法仅例示本领域已知的用于操作DNA序列的众多标准技术，并且也可以使用其他已知技术。
核酸分子
本发明涉及编码本发明的TCR受体或其部分，例如α链和/或β链，可变域或其一部分的分离的多核苷酸或核酸分子。
分离的多核苷酸可以是双链或单链，并且可以是RNA或DNA。
本领域技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸可编码相同的多肽。另外，应当理解，技术人员可以使用常规技术进行不影响本发明多核苷酸编码的多肽序列的核苷酸取代，添加或缺失，以反映任何特定宿主生物的密码子使用。本发明的多肽将被表达。
本文所述的多核苷酸可以通过本领域可用的任何方法进行修饰。为了增强本发明的多核苷酸的体内活性或寿命，可以进行这样的修饰。
诸如DNA多核苷酸的多核苷酸可以重组，合成或通过本领域技术人员可获得的任何方式产生。它们也可以通过标准技术克隆。
通常将使用重组手段，例如使用聚合酶链反应(PCR)克隆技术来产生更长的多核苷酸。这将涉及制备一对期望克隆的靶序列侧翼的引物(例如，约15至30个核苷酸)，使引物与从动物或人类细胞获得的mRNA或cDNA接触，进行聚合酶链反应在引起所需区域扩增的条件下，分离扩增的片段(例如通过用琼脂糖凝胶纯化反应混合物)并回收扩增的DNA。可以设计引物以包含合适的限制酶识别位点，从而可以将扩增的DNA克隆到合适的载体中。
密码子优化
用于本发明的多核苷酸可以是密码子优化的。不同的细胞在其特定密码子的选择上不同。此密码子偏好对应于细胞类型中特定tRNA的相对丰度的偏好。通过改变序列中的密码子，使得它们适合于与相应tRNA的相对丰度匹配，可以增加表达。同样，可以通过有意选择已知在特定细胞类型中罕见的相应tRNA的密码子来减少表达。因此，可获得额外程度的翻译控制。
许多病毒(包括HIV和其他慢病毒)使用大量罕见的密码子，并通过将这些改变为对应于常用的哺乳动物密码子，可以实现哺乳动物生产细胞中包装组分的表达增加。密码子选择表在本领域中对于哺乳动物细胞以及多种其他生物体是已知的。
密码子优化还可涉及除去mRNA不稳定基序和隐蔽剪接位点。
载体
本发明提供了包含本文所述的多核苷酸或核酸分子的载体。
载体是一种允许或促进实体从一种环境转移到另一种环境的工具。根据本发明，并且举例来说，重组核酸技术中使用的一些载体允许将实体，诸如核酸区段(例如异源DNA区段，如异源cDNA区段)转移到靶细胞中。载体可以用于在细胞内维持异源核酸(DNA或RNA)，促进包含核酸区段的载体的复制，或促进核酸区段编码的蛋白质的表达的目的。载体可以是非病毒或病毒的。重组核酸技术中使用的载体的实例包括但不限于质粒、染色体、人工染色体和病毒。载体可以是单链或双链的。它可以是线性的，并且任选地，载体包含一个或多个同源臂。载体也可以是例如裸核酸(例如DNA)。以其最简单的形式，载体本身可以是感兴趣的核苷酸。
本发明中使用的载体可以是例如质粒或病毒载体，并且可以包含用于表达多核苷酸的启动子和任选地启动子的调节物。
可以使用本领域已知的多种技术，例如转化、转染和转导，将包含用于本发明的多核苷酸的载体导入细胞中。几种技术是本领域已知的，例如用重组病毒载体的转导，例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒和单纯疱疹病毒载体、睡美人载体；核酸的直接注射和生物射弹转化。
非病毒递送系统包括但不限于DNA转染方法。在此，转染包括使用非病毒载体将基因递送至靶细胞的过程。典型的转染方法包括电穿孔、DNA生物射弹、脂质介导的转染、紧密DNA介导的转染、脂质体、免疫脂质体、脂质转染、阳离子试剂介导的转染、阳离子面两亲物及其组合。
术语“转染”应理解为包括通过病毒和非病毒递送两者将多核苷酸递送至细胞。
另外，本发明可以采用基因靶向方案，例如DNA修饰剂的递送。
术语“载体”包括表达载体，即能够在体内或体外/离体表达的构建体，表达可以受到载体序列控制，或者例如在插入靶位点的情况下，表达可以受到靶序列控制。载体可以整合或拴系到细胞的DNA。
病毒递送系统包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体和杆状病毒载体。
逆转录病毒是具有与裂解病毒的生命周期不同的生命周期的RNA病毒。在这方面，逆转录病毒是通过DNA中间体复制的感染性实体。当逆转录病毒感染细胞时，其基因组通过逆转录酶转换为DNA形式。DNA拷贝充当模板，用于生产新的RNA基因组和组装感染性病毒颗粒必需的病毒编码蛋白。
存在有许多逆转录病毒，例如鼠白血病病毒(MLV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、藤南(Fujinami)肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠骨肉瘤病毒(FBR MSV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、Abelson鼠白血病病毒(A-MLV)、禽髓细胞瘤病病毒29型(MC29)和禽成红细胞增多病病毒(AEV)和所有其他逆转录病毒，包括慢病毒。
载体可以能够将编码本文所TCR的核苷酸序列转移至细胞，例如T细胞，以使细胞表达TCR。优选地，载体将能够在T细胞中持续高水平表达，从而导入的TCR可以与内源TCR成功竞争有限的CD3分子库。
增加CD3分子的供应可增加TCR的表达，例如，在已经以表达本发明的TCR的方式进行了修饰的细胞中。因此，本发明的载体可以进一步包含一种或多种编码CD3-gamma、CD3-delta、CD3-epsilon和/或CD3-zeta的基因。在一个实施方案中，本发明的载体包含编码CD3-zeta的基因。载体可以包含编码CD8的基因。载体可以编码选择标志物或自杀基因，以增加遗传工程化细胞的安全性概况，例如本发明的细胞或经修饰以表达本发明的TCR的细胞。本发明的载体中包含的基因可以通过自我切割序列，例如2A自我切割序列连接。
或者，可以提供一种或多种编码CD3基因的分开载体，以与本发明的一种或多种本发明载体，例如一种或多种编码本发明TCR的载体同时、顺序或分开共转移至细胞。
细胞
本发明涉及包含根据本发明的多核苷酸或载体的细胞。
细胞可以是T细胞、淋巴细胞或干细胞。T细胞、淋巴细胞或干细胞可以选自下组：CD4细胞、CD8细胞、幼稚T细胞、记忆T细胞、中央记忆T细胞、双阴性T细胞、效应记忆T细胞、效应T细胞、Th0细胞、Tc0细胞、Th1细胞、Tc1细胞、Th2细胞、Tc2细胞、Th17细胞、Th22细胞、gamma/delta T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、造血干细胞和多能干细胞。
可以选择细胞的类型以提供期望的且有利的体内持久性，并为本发明的细胞提供期望的且有利的功能和特性。
细胞可以已经从受试者分离。
可以提供本发明的细胞用于过继细胞转移。如本文所用，术语“过继细胞转移”是指向患者施用细胞群体。通常，细胞是T细胞，其从受试者分离，然后进行遗传修饰和体外培养，以便在施用于患者之前表达本发明的TCR。
过继细胞转移可以是同种异体的或自体的。
通过“自体细胞转移”应理解，起始细胞群体(其然后根据本发明的方法转导，或用根据本发明的载体转导)从与接收经转导的T细胞群体施用的受试者相同的受试者获得。自体转移是有利的，因为它避免了与免疫学不相容性相关的问题，并且无论遗传匹配供体的可用性如何都可用于受试者。
“同种异体细胞转移”应理解为起始细胞群体(其然后根据本发明的方法转导或用根据本发明的载体转导)从与接受经转导的细胞群体施用的受试者不同的受试者获得。优选地，将供体与接受细胞施用的受试者遗传匹配以最小化免疫学不相容的风险。或者，供体可以是与患者错配且无关。
经转导的细胞群体的合适剂量例如在治疗和/或预防上是有效的。待施用的剂量可以取决于受试者和待治疗的状况，并且可以由技术人员容易地确定。
细胞可以源自从受试者分离的T细胞。T细胞可以是从受试者分离的混合细胞群体的部分，例如外周血淋巴细胞(PBL)群体。可以通过本领域已知的方法来活化PBL群体内的T细胞，例如使用抗CD3和/或抗CD28抗体或与抗CD3和/或抗CD28抗体缀合的细胞大小的珠。
T细胞可以是CD4+辅助T细胞或CD8+细胞毒性T细胞。细胞可以在CD4+辅助T细胞/CD8+细胞毒性T细胞的混合群体中。多克隆活化(例如任选与抗CD28抗体组合使用抗CD3抗体)将触发CD4+和CD8+T细胞的增殖。
可以从要接受经遗传修饰的细胞过继转移的受试者分离细胞。在这方面，可以通过从受试者分离T细胞，任选地活化T细胞，离体将TCR基因转移到细胞来制备细胞。然后可以通过过继转移经TCR转导的细胞来进行受试者的后续免疫疗法。如本文所用，此过程指自体T细胞转移，即将经TCR转导的细胞施用到最初衍生T细胞的同一受试者。
或者，可以从不同的受试者分离T细胞，使得它是同种异体的。T细胞可以从供体受试者分离。例如，若受试者正在进行同种异体造血干细胞移植(Allo-HSCT)或实体器官移植或细胞移植或干细胞疗法，则细胞可源自衍生器官、组织或细胞的供体。供体和经历治疗的受试者可以是兄弟姐妹。
或者，细胞可以是或可以源自干细胞，例如造血干细胞(HSC)。由于干细胞不表达CD3分子，因此基因转移到HSC不导致细胞表面的TCR表达。但是，当干细胞分化为迁移到胸腺的淋巴样前体时，CD3表达的启动导致胸腺细胞中导入的TCR的表面表达。
嵌合分子
在另一方面，本发明提供了嵌合分子，其包含与非细胞底物缀合的本发明的TCR、由本发明的多核苷酸编码的TCR或其部分。缀合可以是共价的或非共价的。
非细胞底物可以是纳米颗粒、外来体(exosome)或本领域已知的任何非细胞底物。
本发明的嵌合分子可以是可溶的。
在另一方面，本发明提供了嵌合分子，其包含与毒素或抗体缀合的本发明的TCR、由本发明的多核苷酸编码的TCR或其部分。
毒素或抗体可以是细胞毒性的。毒素可以是细胞毒性分子或化合物，例如放射性分子或化合物。嵌合分子的TCR部分可以赋予识别表达抗原蛋白或肽的细胞的能力。因此，嵌合分子可以特异性识别和/或结合表达抗原的肿瘤细胞。因此，本发明的嵌合分子可以提供细胞毒性毒素、抗体和/或化合物的抗原靶向性递送。
术语“预防”意图指避免、延迟、阻止或阻碍染上疾病。治疗可以例如预防或减少发展或染上与抗原表达有关的疾病的可能性。
如本文所用，“治疗”是指照顾患病的受试者，以改善、治愈或减轻疾病的症状，或以减轻、阻止或延迟疾病的进展。
组合物
本发明的TCR、本发明的核酸分子、本发明的载体、本发明的细胞、通过本发明的方法制备的细胞、本发明的嵌合分子或本发明的组合物可以用药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂配制以对受试者施用。
合适的赋形剂包括水、盐水、右旋糖、甘油等及它们的组合。在实施方案中，包含如本文公开的T细胞受体或宿主细胞的组合物还包含合适的输注培养基。合适的输注培养基可以是任何等渗培养基配制物，通常可以使用生理盐水、Normosol R(Abbott)或Plasma-Lyte A(Baxter)、5％葡萄糖水溶液、林格氏乳酸盐(Ringer's lactate)。输注培养基可以补充有人类血清白蛋白或其他人类血清组分。本文所述的组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器中，诸如密封安瓿或小瓶中。可以冷冻此类容器以保持配制物的稳定性直至输注到患者体内。
组合物的“有效量”是指在必需剂量下并且持续必需的时间足以实现所需治疗结果或有益治疗的量，如本文所述。有效量可以在一次或多次施用中递送。如果向已知或确认患有疾病或疾病状态的受试者施用，则术语“治疗量”可对于治疗使用，而“预防有效量”可用于将向易罹患或处于罹患疾病或疾病状态(例如复发)风险下的受试者施用有效量描述为预防过程。
如医学领域的技术人员所确定，组合物可以以适合于待治疗(或预防)的疾病或病症的方式施用。组合物的合适剂量以及合适的持续时间和频率将通过诸如以下的因素确定：患者的健康状况、患者的体型(即体重、质量或体重)、患者病状的类型和严重程度、活性成分的特定形式和施用方法。通常，适当的剂量和治疗方案以足以提供治疗和/或预防益处(例如本文所述，包括改善的临床结果，诸如更频繁的完全或部分缓解，或更长时间的无疾病和/或总体生存，或症状严重程度的减轻)的量提供组合物。对于预防用途，剂量应足以预防、延迟疾病或病症相关疾病的发作或减轻其严重性。根据本文所述方法施用的组合物的预防益处可通过进行临床前(包括体外和体内研究)和临床研究并通过适当的统计学、生物学以及临床方法和技术分析从中获得的数据来确定。
除非另有说明，否则本发明的实施将采用细胞生物学、分子生物学、组织学、免疫学、肿瘤学的常规技术，它们在本领域普通技术人员的能力范围内。在文献中解释了这些技术。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1高通量测序筛选TCR序列
1、RNA提取及质控
收集急性髓系白血病患者的外周血样本，患者无甲肝，乙肝，丙肝，戊肝，艾滋病，梅毒，淋病和结核感染。
在5mL Ficoll中缓慢加入外周血，离心2000rpm，15min。吸取中间白膜层，加入0.9％生理盐水，计数单个核细胞数量，离心1000rpm，5min，磁珠分选T细胞。采用TRIzol法对处理的细胞样本进行RNA的提取，对提取后的RNA质量使用Qubit RNA HS Assay kits，经2100生物分析仪(安捷伦)检测RNA完整性。
2、反转录及文库制备
用Repertoire Analysis Kit(Human TCR alpha,beta)进行建库。将所有试剂置于冰上解冻，在配置mix之前，混匀和离心这些试剂。在冰上配置杂交引物需用的mix(表1)。充分混匀后离心，加热反转录引物杂交mix，65℃5min，冰上孵育至少2min。在冰上准备配制反转录mix(表2)，混匀后离心mix。
表1反应体系
表2反转录体系
组分
体积
RT buffer A
4μl
RT buffer B
1μl
RT buffer C
3.8μl
RT Universal primer
1μl
RNase inhibitor
1μl
Reverse Transcriptase
1μl
总体积
11.8μl
将11.8μl的杂交buffer加到上一步反应的杂交RNA中混匀，然后离心，在PCR仪(T100，Bio-RAD)上运行以下程序(表3)：
表3反应条件
3、第一步PCR
准备第一步PCR需用的试剂(表4)，并在冰上解冻，混匀后瞬时离心，在冰上配制第一步PCR反应的mix，配置好的mix用移液器混匀，然后离心。
表4第一步PCR反应体系
每管中加入41μl的第一步PCR mix，加入9μl的第一链cDNA产物中混匀，然后离心，在PCR仪(T100，Bio-RAD)上运行以下程序：
表5第一步PCR反应条件
4、第二步PCR
准备第二步PCR需用的试剂(表6)，并在冰上解冻，混匀后瞬时离心，在冰上配制第二步PCR反应的mix，配置好的mix用移液器混匀，然后离心。
表6第二步PCR反应体系
组分
体积
PCR buffer
25μl
PCR dNTP Mixture
10μl
Nuclease-free water
3μl
DNA polymerase
1μl
总体积
39μl
准备一个新的PCR管，每管中加入1μl的第二步PCR引物，hTCRα#1-18(编号：A1-A18)，或者hTCRβ#1-18(编号：B1-B18)。加入39μl第二步反应的mix和10μl的第一步PCR产物混匀，然后离心，在PCR仪(T100，Bio-RAD)上运行以下程序：
表7第二步PCR反应条件
5、第三步PCR
准备第三步PCR需用的试剂在冰上解冻(表9)，混匀后瞬时离心。在冰上配制第二步PCR反应的mix，配置好的mix用移液器混匀，然后离心。
表8第三步PCR反应体系
组分
体积
PCR buffer
25μl
PCR dNTP Mixture
10μl
3rd universal primer
2.5μl
Nuclease-free water
6.5μl
DNA polymerase
1μl
总体积
45μl
准备一个新的PCR管，每管中加入45μl的第三步PCR mix，加入5μl的第二步PCR产物中，用手指肚弹匀，然后离心，在PCR仪(T100，Bio-RAD)上运行以下程序：
表9第三步PCR反应条件
6、琼脂糖凝胶电泳
配置1.5％的琼脂糖胶，用1*TAE buffer和核酸染料(北京金博益)，DNA marker上样量为2μl，加1μl的6*loading buffer到PCR产物中，点样。100V电泳30-45min。使用凝胶到成像系统(1708195，Bio-RAD)，判断产物大小。hTCRɑ/β片段在650bp左右。
7、用AGENCOURT AMPure XP(BEACKMAN)磁珠纯化
准备nuclease-free 0.2mL的8连管，按照表10稀释文库。
表10稀释体系
组分
体积
第三步PCR产物
30μl
Nuclease-free water
20μl
总体积
50μl
配置DNase-free 70％乙醇(sigma)。磁珠使用前室温平衡30min，将22.5μl的磁珠加到稀释后文库中，用移液器混匀至少10次。室温孵育5min，然后简单的离心。将8连管放置在96孔磁力架上磁吸5min，观察液体和磁珠分离。将所有的上清转移到新的8连管中。再次混匀未使用过的磁珠，加17.5μl的磁珠到上清中，用移液器混匀至少10次。室温孵育5min，然后简单离心。将8连管放在96孔磁力架上磁吸5min，观察液体和磁珠分离。弃85μl的上清，保留5μl的上清以免吸到磁珠。不要将磁珠与磁力架分离。加200μl的70％的乙醇漂洗。室温30s，弃酒精，重复酒精洗涤步骤。弃所有上清，加30μl的10mM Tris-HCl到每个PCR管中，用移液器混匀至少10次。室温孵育2min然后简单离心。将离心管放置在磁力架上室温5min，分离液体和磁珠。将上清20μl转移至新的PCR管中。
8、文库浓度定量及质控
测定文库浓度用Qubit dsDNA HS kit(英潍捷基)，使用设备Qubit 2.0(life)，取2μl的样本用于测定。通常文库浓度集中在5-40ng/μl。如果样本浓度≥1.72ng/μl可用于Miseq测序。
9、文库目标片段质控
人的TCRα/β文库目标片段集中在650bp，使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳对文库片段进行质控，用1*TAE buffer和核酸染料(北京金博益)，DNA marker上样量为2μl，加1μl的6*loading buffer到PCR产物中，点样。100V电泳30-45min。使用凝胶到成像系统(1708195，Bio-RAD)，判断产物大小。
10、文库混库及质控
文库混样，是按此批次浓度最低的文库为标准，浓度最低文库乘以10μl为基准纳克数，其他文库按照此纳克数进行取样，确保每个文库的总量是一致的，混样后按照纳克与摩尔数之间的换算，稀释到8.58ng/μl(20nM，650bp)。
11、高通量测序
文库使用Miseq(Illumina)进行2×300bp双端测序，对上述混合完成的文库再次使用设备Qubit 2.0(life)进行文库定量，最终稀释到10pM，与10pM denatured PhiX进行混合(PhiX占比30％)，混合后的600μl进行上机测序。
12、数据分析
采用MiXCR进行初级分析，可以对高度个性化的TCR和免疫球蛋白序列进行分析。MiXCR可以针对不同的数据类型在参数上进行调整，并对分析结果和输出进行优化。进一步高级分析多个多样性指数，如香农指数(Shannon)、辛普森指数(Simpson)、Inverse-Simpson指数和基尼指数(Gini)等。采用VDJtools用于二级TCR profiling分析以及多样性评估。
13、噬菌体展示技术筛选高亲和力的TCR序列。
14、结果
通过噬菌体展示技术筛选出高亲和力的TCR，其α链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO：6-8任一所示，其中CDR1、CDR2的序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示，CDR3的序列如SEQ ID NO：3-5任一所示。
TCR的β链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：14-16任一所示，其中，CDR1-2的序列分别如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10所示，CDR3的序列如SEQ ID NO：11-13任一项所示。
实施例2 TCR-T的构建
1、利用高通量测序和数据分析结果，全合成相关序列，通过XbaI/SalI限制内切酶切点，连接到pCDH载体中。
2、TCR-T细胞制备
采集健康人外周血，在Ficoll中缓慢加入外周血，离心2000rpm，15min。吸取中间白膜层，加入0.9％生理盐水，计数单个核细胞数量，离心1000rpm，5min。磁珠分选T细胞。同时加入CD3/CD28抗体偶联磁珠刺激，24h及48h后加入病毒感染2次，病毒感染时加入IL-2，培养3-20天，获得TCR-T细胞。
实施例3 TCR-T杀伤功能检测
从本研究中所述的序列构建的TCR-T中任选一个进行功能检测。
计数靶细胞THP-1和阴性参照靶细胞(Daudi)，分别标记Celltrace far red和CFSE染色。计数TCR-T(TCR的Vα和Vβ可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：11所示)细胞作为效应细胞。按照计划效靶比(3：1，9：1，18：1)，重悬效应细胞和靶细胞至相应浓度。
圆底96孔板中每个效靶比分别铺入铺入组1效应细胞、组2靶细胞和组3效应细胞+靶细胞，每组4个复孔。培养2-24h，收细胞样本，分别收管A：组1效应细胞+组2靶细胞，管B：组3效应细胞+靶细胞，多聚甲醛液固定，流式上机。作Killing Rate与E:T Ratio曲线图。其中，
结果，如图1所示，相比对照组，本申请的TCR-T具有较好的杀伤效果。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 深圳大学总医院
<120> T细胞受体及其应用
<141> 2021-10-14
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly Leu Ala Phe Trp
1 5 10
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Phe Leu Ser Tyr Asn Val Leu Gly Leu Glu Glu
1 5 10
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Cys Ala Val Met Asp Ser Asn Tyr Gln Leu Ile Trp
1 5 10
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Cys Ala Val Met Asp Ser Ser Tyr Gln Leu Ile Trp
1 5 10
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Cys Ala Val Met Asp Ser Gln Tyr Gln Leu Ile Trp
1 5 10
<210> 6
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gly Gln Asn Ile Asp Gln Pro Thr Glu Met Thr Ala Thr Glu Gly Ala
1 5 10 15
Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly Leu
20 25 30
Phe Trp Tyr Gln Gln His Ala Gly Glu Ala Pro Thr Phe Leu Ser Tyr
35 40 45
Asn Val Leu Asp Gly Leu Glu Glu Lys Gly Arg Phe Ser Ser Phe Leu
50 55 60
Ser Arg Ser Lys Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gln Met
65 70 75 80
Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Leu Cys Ala Val Arg Cys Ala Val Met Asp
85 90 95
Ser Asn Tyr Gln Leu Ile Trp Gly Ala Gly Thr Lys Leu Ile Ile Lys
100 105 110
Pro
<210> 7
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gly Gln Asn Ile Asp Gln Pro Thr Glu Met Thr Ala Thr Glu Gly Ala
1 5 10 15
Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly Leu
20 25 30
Phe Trp Tyr Gln Gln His Ala Gly Glu Ala Pro Thr Phe Leu Ser Tyr
35 40 45
Asn Val Leu Asp Gly Leu Glu Glu Lys Gly Arg Phe Ser Ser Phe Leu
50 55 60
Ser Arg Ser Lys Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gln Met
65 70 75 80
Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Leu Cys Ala Val Arg Cys Ala Val Met Asp
85 90 95
Ser Ser Tyr Gln Leu Ile Trp Gly Ala Gly Thr Lys Leu Ile Ile Lys
100 105 110
Pro
<210> 8
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gly Gln Asn Ile Asp Gln Pro Thr Glu Met Thr Ala Thr Glu Gly Ala
1 5 10 15
Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly Leu
20 25 30
Phe Trp Tyr Gln Gln His Ala Gly Glu Ala Pro Thr Phe Leu Ser Tyr
35 40 45
Asn Val Leu Asp Gly Leu Glu Glu Lys Gly Arg Phe Ser Ser Phe Leu
50 55 60
Ser Arg Ser Lys Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gln Met
65 70 75 80
Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Leu Cys Ala Val Arg Cys Ala Val Met Asp
85 90 95
Ser Gln Tyr Gln Leu Ile Trp Gly Ala Gly Thr Lys Leu Ile Ile Lys
100 105 110
Pro
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gln Asp Met Arg Met Asn Ala Met Tyr
1 5
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
His Tyr Ser Asn Thr Ala Gly Gly Thr Gly Lys
1 5 10
<210> 11
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Asp Gly Ser Thr Asp Thr Gln Tyr Phe
1 5 10 15
<210> 12
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Asp Ser Ser Thr Asp Thr Gln Tyr Phe
1 5 10 15
<210> 13
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Asp Ala Ser Thr Asp Thr Gln Tyr Phe
1 5 10 15
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Ile Ala Gly Ile Thr Gln Ala Pro Thr Ser Gln Ile Leu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Arg Arg Met Thr Leu Arg Cys Thr Gln Asp Met Arg His Asn Ala Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Leu Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr
35 40 45
Ser Asn Thr Ala Gly Thr Thr Gly Lys Gly Glu Val Pro Asp Gly Tyr
50 55 60
Ser Val Ser Arg Ala Asn Thr Asp Asp Phe Pro Leu Thr Leu Ala Ser
65 70 75 80
Ala Val Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Asp Gly
85 90 95
Ser Thr Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 15
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Ile Ala Gly Ile Thr Gln Ala Pro Thr Ser Gln Ile Leu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Arg Arg Met Thr Leu Arg Cys Thr Gln Asp Met Arg His Asn Ala Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Leu Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr
35 40 45
Ser Asn Thr Ala Gly Thr Thr Gly Lys Gly Glu Val Pro Asp Gly Tyr
50 55 60
Ser Val Ser Arg Ala Asn Thr Asp Asp Phe Pro Leu Thr Leu Ala Ser
65 70 75 80
Ala Val Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Asp Ser
85 90 95
Ser Thr Asp Thr Gln Tyr Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 16
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Ile Ala Gly Ile Thr Gln Ala Pro Thr Ser Gln Ile Leu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Arg Arg Met Thr Leu Arg Cys Thr Gln Asp Met Arg His Asn Ala Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Leu Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr
35 40 45
Ser Asn Thr Ala Gly Thr Thr Gly Lys Gly Glu Val Pro Asp Gly Tyr
50 55 60
Ser Val Ser Arg Ala Asn Thr Asp Asp Phe Pro Leu Thr Leu Ala Ser
65 70 75 80
Ala Val Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Asp Ala
85 90 95
Ser Thr Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
100 105 110
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种制备聚乙二醇化类胶原蛋白的方法及其应用