具体实施方式

本发明提供了对MAGE-A3具有抗原特异性的分离或纯化的T细胞受体(TCR)及其功能部分和功能变体，其中所述TCR在HLA-DPβ1＊04的背景下识别MAGE-A3。在本发明的一个实施方案中，分离或纯化的TCR对MAGE-A3_243-258和MAGE-A6具有抗原特异性。

MAGE-A3和MAGE-A6是MAGE-A家族12种同源蛋白质中的成员，该家族还包括MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11和MAGE-A12。MAGE-A蛋白是仅在肿瘤细胞和睾丸和胎盘的非MHC表达性生殖细胞中表达的癌睾丸抗原(cancer testis antigen，CTA)。多种人癌症中都表达MAGE-A蛋白，所述癌症包括但不限于，黑素瘤、乳腺癌、白血病、甲状腺癌、胃癌、胰腺癌、肝癌(例如，肝细胞癌)、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、卵巢癌、多发性骨髓瘤、食管癌、肾癌、头癌(例如，鳞状细胞癌)、颈癌(例如，鳞状细胞癌)、前列腺癌、滑膜细胞肉瘤和尿路上皮癌。

本发明的TCR(包括其功能部分和功能变体)提供了许多优点，包括在用于过继细胞转移时的优点。例如，通过靶向在HLA-DPβ1＊04背景下呈递的MAGE-A3，本发明TCR(包括其功能部分和功能变体)使得治疗不能使用靶向在其他HLA分子(例如，HLA-A＊02、HLA-A＊01或HLA-C＊07)背景下呈递的MAGE抗原的TCR进行治疗的患者成为可能。HLA-DPβ1＊04是由约70％至约80％的癌症患者群体表达的高度普遍的等位基因。因此，有利地，本发明TCR(包括其功能部分和功能变体)大大扩大了可治疗的患者群体。此外，在不受特殊理论束缚的情况下，认为因为多种癌症类型的细胞都表达MAGE-A3和/或MAGE-A6，所以本发明TCR(包括其功能部分和功能变体)有利地提供破坏多种癌症类型之细胞的能力，并因此治疗或预防多种癌症类型。另外，在不受特殊理论束缚的情况下，认为因为MAGE-A蛋白是仅在肿瘤细胞和睾丸和胎盘的非MHC表达性生殖细胞中表达的癌睾丸抗原，所以本发明TCR(包括其功能部分和功能变体)有利地靶向破坏癌细胞，同时最小化或消除对正常非癌细胞的破坏，从而降低(例如，最小化或消除)毒性。

本文使用的短语“抗原特异性”意指TCR可以以高亲和力特异性地结合并免疫识别MAGE-A3和/或MAGE-A6。例如，如果在与经低浓度MAGE-A3和/或MAGE-A6肽(例如，约0.05ng/ml至约5ng/ml、0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml或5ng/ml)脉冲的抗原阴性HLA-DPβ1＊04+靶细胞共培养时，表达TCR的T细胞分泌至少约200pg/ml或更多(例如，200pg/ml或更多、300pg/ml或更多、400pg/ml或更多、500pg/ml或更多、600pg/ml或更多、700pg/ml或更多、1000pg/ml或更多、5,000pg/ml或更多、7,000pg/ml或更多、10,000pg/ml或更多或者20,000pg/ml或更多)的IFN-γ，则可认为TCR对MAGE-A3和/或MAGE-A6具有“抗原特异性”。可替代地或另外地，如果在与经低浓度MAGE-A3和/或MAGE-A6肽脉冲的抗原阴性HLA-DPβ1＊04+靶细胞共培养时，表达TCR的T细胞分泌的IFN-γ为未转导PBL的IFN-γ背景水平的至少两倍，则可认为TCR对MAGE-A3和/或MAGE-A6具有“抗原特异性”。在与经更高浓度的MAGE-A3和/或MAGE-A6肽脉冲的抗原阴性HLA-DPβ1＊04+靶细胞共培养时，本发明TCR(包括其功能部分和功能变体)也可分泌IFN-γ。

本发明的一个实施方案提供了对任意MAGE-A3蛋白、多肽或肽具有抗原特异性的TCR(包括其功能部分和变体)。本发明TCR(包括其功能部分和功能变体)可对MAGE-A3蛋白具有抗原特异性，所述MAGE-A3蛋白包含SEQ ID NO：1、由其组成或基本由其组成。在本发明的一个优选实施方案中，TCR(包括其功能部分和变体)对MAGE-A3_243-258肽具有抗原特异性，所述MAGE-A3_243-258肽包含KKLLTQHFVQENYLEY(SEQ ID NO：2)、由其组成或基本由其组成。

本发明TCR(包括其功能部分和功能变体)能够以人白细胞抗原(HLA)-DPβ1＊04依赖性方式识别MAGE-A3。本文使用的“HLA-DPβ1＊04依赖性方式”意指在HLA-DPβ1＊04分子的背景下，TCR在与MAGE-A3蛋白、多肽或肽结合后引发免疫应答。本发明TCR(包括其功能部分和功能变体)能够识别由HLA-DPβ1＊04分子呈递的MAGE-A3，并且除MAGE-A3之外还可结合HLA-DPβ1＊04分子。示例性HLA-DPβ1＊04分子(在该背景下，本发明TCR(包括其功能部分和功能变体)识别MAGE-A3)包括由HLA-DPβ1＊0401和/或HLA-DPβ1＊0402等位基因编码的那些分子。

本发明的一个实施方案提供了对任意MAGE-6蛋白、多肽或肽具有抗原特异性的TCR(包括其功能部分和变体)。本发明TCR(包括其功能部分和功能变体)可对MAGE-A6蛋白具有抗原特异性，所述MAGE-A6蛋白包含SEQ ID NO：45、由其组成或基本由其组成。在本发明的一个优选实施方案中，TCR(包括其功能部分和功能变体)对MAGE-A6_243-258肽具有抗原特异性，所述MAGE-A6_243-258肽包含KKLLTQYFVQENYLEY(SEQ ID NO：46)、由其组成或基本由其组成。

本发明提供了包含两条多肽(即，多肽链)的TCR，所述多肽例如TCR的α链、TCR的β链、TCR的γ链、TCR的δ链或其组合。本发明TCR的多肽可包含任意氨基酸序列，只要TCR在HLA-DPβ1＊04的背景下对MAGE-A3具有抗原特异性即可。

在本发明的一个实施方案中，TCR包含两条多肽链，所述多肽链各自包含含有TCR之互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3的可变区。在本发明的一个实施方案中，TCR包含第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链包含含有SEQ ID NO：3或13的氨基酸序列的CDR1(α链的CDR1)、含有SEQ ID NO：4或14的氨基酸序列的CDR2(α链的CDR2)和含有SEQ ID NO：5或15的氨基酸序列的CDR3(α链的CDR3)，并且所述第二多肽链包含含有SEQ ID NO：6或16的氨基酸序列的CDR1(β链的CDR1)、含有SEQ ID NO：7或17的氨基酸序列的CDR2(β链的CDR2)和含有SEQ ID NO：8或18的氨基酸序列的CDR3(β链的CDR3)。在这一点上，本发明TCR可包含选自SEQ ID NO：3至5、6至8、13至15和16至18中任意一个或更多个的任意一个或更多个氨基酸序列。优选地，TCR包含SEQ ID NO：3至8或13至18的氨基酸序列。更优选地，TCR包含SEQ IDNO：3至8的氨基酸序列。

可替代地或另外地，TCR可包含含有如上所述CDR之TCR的可变区的氨基酸序列。在这一点上，TCR可包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO：9或19(α链的可变区)或者10或20(β链的可变区)、SEQ ID NO：9和10二者或者SEQ ID NO：19和20二者。优选地，本发明TCR包含SEQID NO：9和10二者的氨基酸序列。

可替代地或另外地，TCR可包含TCR的α链和TCR的β链。本发明TCR的α链和β链各自可独立地包含任意氨基酸序列。优选地，α链包含如上所述α链的可变区。在这一点上，本发明TCR可包含SEQ ID NO：11或21的氨基酸序列。该类型的α链可与TCR的任意β链配对。优选地，本发明TCR的β链包含如上所述β链的可变区。在这一点上，本发明TCR可包含SEQ ID NO：12或22的氨基酸序列。因此，本发明TCR可包含SEQ ID NO：11、12、21或22、SEQ ID NO：11和12二者或者SEQ ID NO：21和22二者的氨基酸序列。优选地，本发明TCR包含SEQ ID NO：11和12二者的氨基酸序列。

本发明的范围中包括本文所述的本发明TCR的功能变体。本文使用的术语“功能变体”是指与亲本TCR、多肽或蛋白质具有很大或显著的序列同一性或相似性的TCR、多肽或蛋白质，其中功能变体保留了变体来源之TCR、多肽或蛋白质的生物活性。例如，功能变体涵盖本文所述的TCR、多肽或蛋白质(亲本TCR、多肽或蛋白质)的那些变体，其以与亲本TCR、多肽或蛋白质相似的程度、相同的程度或更高的程度保留了与MAGE-A3和/或MAGE-A6(亲本TCR对其具有抗原特异性，或者亲本多肽或蛋白质与其特异性结合)特异性结合的能力。参照亲本TCR、多肽或蛋白质，功能变体可例如与亲本TCR、多肽或蛋白质具有至少约30％、50％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的氨基酸序列同一性。

功能变体可例如包含具有至少一个保守氨基酸替换的亲本TCR、多肽或蛋白质的氨基酸序列。保守氨基酸替换在本领域是已知的，包括其中一种具有某些物理和/或化学性质的氨基酸变更为另一种具有相同化学或物理性质的氨基酸的氨基酸替换。例如，保守氨基酸替换可以为酸性氨基酸替换为另一种酸性氨基酸(例如，Asp或Glu)、具有非极性侧链的氨基酸替换为另一种具有非极性侧链的氨基酸(例如，Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Val等)、碱性氨基酸替换为另一种碱性氨基酸(Lys、Arg等)、具有极性侧链的氨基酸替换为另一种具有极性侧链的氨基酸(Asn、Cys、Gln、Ser、Thr、Tyr等)等。

可替代地或另外地，功能变体可包含具有至少一个非保守氨基酸替换的亲本TCR、多肽或蛋白质的氨基酸序列。在这种情况下，优选非保守氨基酸替换不干扰或不抑制功能变体的生物活性。优选地，非保守氨基酸替换使功能变体的生物活性增强，使得与亲本TCR、多肽或蛋白质相比，功能变体的生物活性增加。

在这一点上，本发明的一个实施方案提供了包含(a)SEQ ID NO：3至8、(b)SEQ IDNO：21至22，或者(a)或(b)之功能变体的分离或纯化的TCR，其中所述功能变体包含在(a)的任意一个或更多个或者(b)的任意一个或更多个中具有至少一个氨基酸替换的(a)或(b)，并且所述功能变体在HLA-DPβ1＊04的背景下对MAGE-A3具有抗原特异性。优选地，氨基酸替换位于α或β链的CDR3区中，优选α链的CDR3区中。在一些实施方案中，与亲本TCR氨基酸序列相比，功能变体(或其功能部分)提供了针对MAGE-A3增加的反应性。一般来说，经替换的α链氨基酸序列SEQ ID NO：29、31和33对应于天然未替换SEQ ID NO：11(TCRα链)的全部或一部分，并且当与SEQ ID NO：11相比时，SEQ ID NO：29、31和33具有至少一个替换。优选地，天然Ser116、Ser117、Gly118和Thr119中的一个或更多个被替换。同样地，经替换的β链氨基酸序列SEQ ID NO：30、32和34对应于天然未替换SEQ ID NO：12(TCRβ链)的全部或一部分，并且当与SEQ ID NO：12相比时，SEQ ID NO：30、32和34具有至少一个替换。优选地，天然Arg115、Thr116、Gly117和Pro118中的一个或更多个被替换。

特别地，本发明提供了TCR的功能变体，其包含：(i)SEQ ID NO：29，其中Xaa4是Ser、Ala、Leu、Ile、Val或Met；Xaa5是Ser、Ala、Leu、Ile、Val或Met；Xaa6是Gly、Ala、Leu、Ile、Val或Met；并且Xaa7是Thr、Ala、Leu、Ile、Val或Met；和/或(ii)SEQ ID NO：30，其中Xaa4是Arg、Ala、Leu、Ile、Val或Met；Xaa5是Thr、Ala、Leu、Ile、Val或Met；Xaa6是Gly、Ala、Leu、Ile、Val或Met；并且Xaa7是Pro、Ala、Leu、Ile、Val或Met。SEQ ID NO：29通常对应于天然未替换SEQ ID NO：11的第113至123位，不同之处在于在SEQ ID NO：29中，Ser4、Ser5、Gly6和Thr7中的一个或更多个被替换。优选地，功能变体包含：(a)SEQ ID NO：29，其中Xaa4是Ala，Xaa5是Ser，Xaa6是Gly且Xaa7是Thr；或者(b)SEQ ID NO：29，其中Xaa4是Ser，Xaa5是Ala，Xaa6是Gly且Xaa7是Thr。虽然在一些实施方案中，SEQ ID NO：29可包含野生型CDR3αSEQ ID NO：5，但是优选地，SEQ ID NO：29不包含SEQ ID NO：5。SEQ ID NO：30通常对应于天然未替换SEQ ID NO：12的第112至126位，不同之处在于在SEQ ID NO：30中，Arg4、Thr5、Gly6和Pro7中的一个或更多个被替换。虽然在一些实施方案中，SEQ ID NO：30可包含野生型CDR3β SEQ ID NO：8，但是优选地，SEQ ID NO：30不包含SEQ ID NO：8。

本发明还提供了TCR的功能变体，其包含：(i)SEQ ID NO：31，其中Xaa116是Ser、Ala、Leu、Ile、Val或Met；Xaa117是Ser、Ala、Leu、Ile、Val或Met；Xaa118是Gly、Ala、Leu、Ile、Val或Met；并且Xaa119是Thr、Ala、Leu、Ile、Val或Met；和/或(ii)SEQ ID NO：32，其中Xaa115是Arg、Ala、Leu、Ile、Val或Met；Xaa116是Thr、Ala、Leu、Ile、Val或Met；Xaa117是Gly、Ala、Leu、Ile、Val或Met；并且Xaa118是Pro、Ala、Leu、Ile、Val或Met。SEQ ID NO：31通常对应于天然未替换SEQ ID NO：11的第1至134位，不同之处在于在SEQ ID NO：31中，Ser116、Ser117、Gly118和Thr119中的一个或更多个被替换。优选地，功能变体包含：(a)SEQID NO：31，其中Xaa116是Ala，Xaa117是Ser，Xaa118是Gly且Xaa119是Thr；或者(b)SEQ IDNO：31，其中Xaa116是Ser，Xaa117是Ala，Xaa118是Gly且Xaa119是Thr。虽然在一些实施方案中，SEQ ID NO：31可包含野生型CDR3α SEQ ID NO：5，但是优选地，SEQ ID NO：31不包含SEQID NO：5。SEQ ID NO：32通常对应于天然未替换SEQ ID NO：12的第1至137位，不同之处在于在SEQ ID NO：32中，Arg115、Thr116、Gly117和Pro118中的一个或更多个被替换。虽然在一些实施方案中，SEQ ID NO：32可包含野生型CDR3β SEQ ID NO：8，但是优选地，SEQ ID NO：32不包含SEQ ID NO：8。

本发明还提供了TCR的功能变体，其包含：(i)SEQ ID NO：33，其中Xaa116是Ser、Ala、Leu、Ile、Val或Met；Xaa117是Ser、Ala、Leu、Ile、Val或Met；Xaa118是Gly、Ala、Leu、Ile、Val或Met；并且Xaa119是Thr、Ala、Leu、Ile、Val或Met；和/或(ii)SEQ ID NO：34，其中Xaa115是Arg、Ala、Leu、Ile、Val或Met；Xaa116是Thr、Ala、Leu、Ile、Val或Met；Xaa117是Gly、Ala、Leu、Ile、Val或Met；并且Xaa118是Pro、Ala、Leu、Ile、Val或Met。SEQ ID NO：33通常对应于天然未替换SEQ ID NO：11的第1至275位，不同之处在于在SEQ ID NO：33中，Ser116、Ser117、Gly118和Thr119中的一个或更多个被替换。优选地，功能变体包含：(a)SEQID NO：33，其中Xaa116是Ala，Xaa117是Ser，Xaa118是Gly且Xaa119是Thr；或者(b)SEQ IDNO：33，其中Xaa116是Ser，Xaa117是Ala，Xaa118是Gly并且Xaa119是Thr。虽然在一些实施方案中，SEQ ID NO：33可包含野生型CDR3αSEQ ID NO：5，但是优选地，SEQ ID NO：33不包含SEQ ID NO：5。SEQ ID NO：34通常对应于天然未替换SEQ ID NO：12的第1至313位，不同之处在于在SEQ ID NO：34中，Arg115、Thr116、Gly117和Pro118中的一个或更多个被替换。虽然在一些实施方案中，SEQ ID NO：34可包含野生型CDR3β SEQ ID NO：8，但是优选地，SEQ IDNO：34不包含SEQ ID NO：8。

与本发明的TCR一样，本文所述的功能变体包含两条多肽链，所述两条多肽链各自包含含有TCR之CDR1、CDR2和CDR3的可变区。优选地，第一多肽链包含含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR1(α链的CDR1)、含有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR2(α链的CDR2)和含有SEQ ID NO：29的氨基酸序列的经替换CDR3(α链的经替换CDR3)，并且第二多肽链包含含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR1(β链的CDR1)、含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR2(β链的CDR2)和含有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDR3(β链的CDR3)。在另一个实施方案中，第一多肽链包含含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR1(α链的CDR1)、含有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR2(α链的CDR2)和含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR3(α链的CDR3)，并且第二多肽链包含含有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR1(β链的CDR1)、含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR2(β链的CDR2)和含有SEQ ID NO：30的氨基酸序列的经替换CDR3(β链的经替换CDR3)。在这一点上，本发明的TCR的功能变体可包含选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO：3至5；SEQ ID NO：3至4和29；SEQ ID NO：6至8；以及SEQ ID NO：6至7和30。优选地，TCR的功能变体包含SEQ ID NO：3至4、29和6至8；SEQ ID NO：3至7和30；或者SEQ ID NO：3至4、29、6至7和30的氨基酸序列。更优选地，TCR的功能变体包含SEQ ID NO：3至4、29和6至8的氨基酸序列。

可替代地或另外地，TCR的功能变体可包含含有如上所述CDR之TCR的可变区的经替换氨基酸序列。在这一点上，TCR可包含SEQ ID NO：31的经替换氨基酸序列(α链的经替换可变区)、SEQ ID NO：10(β链的可变区)、SEQ ID NO：31和10二者、SEQ ID NO：32的经替换氨基酸序列(β链的经替换可变区)、SEQ ID NO：9(α链的可变区)、SEQ ID NO：9和32二者，或SEQ ID NO：31和32二者。优选地，本发明的TCR的功能变体包含SEQ ID NO：31和10或者SEQID NO：32和9的氨基酸序列。更优选地，本发明的TCR的功能变体包含SEQ ID NO：31和10的氨基酸序列。

可替代地或另外地，TCR的功能变体可包含TCR的经替换α链和TCR的β链。本发明TCR的α链和β链可各自独立地包含任意氨基酸序列。优选地，经替换α链包含如上所述α链的经替换可变区。在这一点上，本发明的TCR的经替换α链可包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列。本发明该类型的经替换α链可与TCR的任意β链配对。优选地，本发明TCR的β链包含如上所述β链的可变区。在这一点上，本发明TCR可包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列或SEQ ID NO：34的经替换氨基酸序列。本发明该类型的经替换β链可与TCR的任意α链配对。在这一点上，本发明TCR可包含SEQ ID NO：11或33的氨基酸序列。因此，本发明的TCR的功能变体可包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO：11、12、33、34；SEQ ID NO：33和34二者；SEQ ID NO：11和34二者；或者SEQ ID NO：12和33二者。优选地，本发明TCR的功能变体包含SEQ ID NO：11和34或者SEQ ID NO：12和33的氨基酸序列。更优选地，TCR的功能变体包含SEQ ID NO：12和33的氨基酸序列。

在本发明的一个实施方案中，TCR(或其功能变体)可包含人恒定区。在这一点上，TCR(或其功能变体)可包含含有SEQ ID NO：23或35(α链的人恒定区)、SEQ ID NO：24或36(β链的人恒定区)、SEQ ID NO：23和24二者或者SEQ ID NO：35和36二者的人恒定区。优选地，TCR(或其功能变体)包含SEQ ID NO：23和24二者。

在本发明的另一个实施方案中，TCR(或其功能变体)可包含人/小鼠嵌合TCR(或其功能变体)。在这一点上，TCR(或其功能变体)可包含含有SEQ ID NO：25(α链的小鼠恒定区)、SEQ ID NO：26(β链的小鼠恒定区)或者SEQ ID NO：25和26二者的小鼠恒定区。优选地，TCR(或其功能变体)包含SEQ ID NO：25和26二者。

本发明的人/小鼠嵌合TCR(或其功能变体或功能部分)可包含如上所述CDR中的任意一种。在这一点上。本发明的人/小鼠嵌合TCR(或其功能变体或功能部分)可包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：3至5；SEQ ID NO：13至15；SEQ ID NO：16至18；SEQ ID NO：3至4和29；SEQ ID NO：6至8；以及SEQ ID NO：6至7和30。优选地，人/小鼠嵌合TCR(或其功能变体或功能部分)包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO：3至8；SEQ ID NO：13至18；SEQ ID NO：3至4、29和6至8；SEQ ID NO：3至7和30；或者SEQ ID NO：3至4、29、6至7和30。更优选地，人/小鼠嵌合TCR(或其功能变体或功能部分)包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO：3至4、29和6至8或者SEQ ID NO：3至8。

可替代地或另外地，人/小鼠嵌合TCR(或其功能变体或功能部分)可包含如上所述可变区中的任意一种。在这一点上，本发明的人/小鼠嵌合TCR(或其功能变体或功能部分)可包含SEQ ID NO：31的经替换氨基酸序列(α链的经替换可变区)、SEQ ID NO：10或20(β链的可变区)、SEQ ID NO：32的经替换氨基酸序列(β链的经替换可变区)、SEQ ID NO：9或19(α链的可变区)、SEQ ID NO：9和32二者、SEQ ID NO：31和32二者、SEQ ID NO：31和10二者、SEQID NO：9和10二者或者SEQ ID NO：19和20二者。优选地，本发明的人/小鼠嵌合TCR(或其功能变体或功能部分)包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO：31和10、SEQ ID NO：9和10或者SEQID NO：32和9。更优选地，本发明的TCR的功能变体或功能部分包含SEQ ID NO：31和10或者SEQ ID NO：9和10的氨基酸序列。

可替代地或另外地，人/小鼠嵌合TCR(或其功能变体或功能部分)可包含TCR(或其功能变体或功能部分)的α链和TCR(或其功能变体或功能部分)的β链。本发明的人/小鼠嵌合TCR(或其功能变体或功能部分)的α链和β链可各自独立地包含任意氨基酸序列。优选地，α链包含如上所述α链的可变区。在这一点上，本发明人/小鼠嵌合TCR(或其功能变体或功能部分)可包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列。本发明该类型的人/小鼠嵌合TCR(或其功能变体或功能部分)可与TCR(或其功能变体或功能部分)的任意β链配对。优选地，本发明人/小鼠嵌合TCR(或其功能变体或功能部分)的β链包含如上所述β链的可变区。在这一点上，本发明的人/小鼠嵌合TCR(或其功能变体或功能部分)可包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列。因此，本发明的人/小鼠嵌合TCR(或其功能变体或功能部分)可包含SEQ ID NO：27或28或者SEQID NO：27和28二者的氨基酸序列。优选地，本发明TCR包含SEQ ID NO：27和28的氨基酸序列。

本发明还提供了包含本文所述TCR或功能变体中任意一种之功能部分的多肽。本文使用的术语“多肽”包括寡肽并且是指通过一个或更多个肽键连接的氨基酸单链。

关于本发明多肽，所述功能部分可以是含有其所来源之TCR(或其功能变体)的连续氨基酸的任意部分，只要所述功能部分与MAGE-A3和/或MAGE-A6特异性结合即可。在提及TCR(或其功能变体)时使用的术语“功能部分”是指本发明TCR(或其功能变体)的任意部分或片段，所述部分或片段保留了其所来源(亲本TCR或其亲本功能变体)之TCR(或其功能变体)的生物活性。例如，功能部分涵盖TCR(或其功能变体)的这些部分，其以与亲本TCR(或其功能变体)相似的程度、相同的程度或更高的程度保留了与MAGE-A3(例如，以HLA-DPβ1＊04依赖性方式)或MAGE-A6特异性结合的能力或者检测、治疗或预防癌症的能力。参照亲本TCR(或其功能变体)，功能部分可包含例如亲本TCR(或其功能变体)的约10％、25％、30％、50％、68％、80％、90％、95％或更多。

功能部分可在所述部分的氨基或羧基端或者在两端包含另外的氨基酸，所述另外的氨基酸不存在于亲本TCR或其功能变体的氨基酸序列中。期望地，另外的氨基酸不干扰功能部分的生物功能，例如，与MAGE-A3和/或MAGE-A6特异性结合和/或具有检测癌症、治疗或预防癌症的能力等。更期望地，与亲本TCR或其功能变体的生物活性相比，另外的氨基酸使生物活性增强。

所述多肽可包含本发明TCR或其功能变体的α链和β链中任一条或两条的功能部分，例如包含本发明TCR或其功能变体的α链和/或β链可变区的CDR1、CDR2和CDR3中一种或更多种的功能部分。在这一点上，所述多肽可包含含有以下氨基酸序列的功能部分：SEQ IDNO：3或13(α链的CDR1)，4或14(α链的CDR2)，5、15或29(α链的CDR3)，6或16(β链的CDR1)，7或17(β链的CDR2)，8、18或30(β链的CDR3)或者其组合。优选地，本发明多肽包含含有以下的功能部分：SEQ ID NO：3至5；3至4和29；6至8；6至7和30；13至15；16至18；SEQ ID NO：3至8全部；SEQ ID NO：13至18全部；SEQ ID NO：3至4、29和6至8的全部；SEQ ID NO：3至7和30全部；或者SEQ ID NO：3至4、29、6至7和30全部。更优选地，所述多肽包含含有以下氨基酸序列的功能部分：SEQ ID NO：3至8全部或者SEQ ID NO：3至4、29和6至8全部。

可替代地或另外地，本发明多肽可包含例如含有如上所述CDR区之组合的本发明TCR或其功能变体的可变区。在这一点上，所述多肽可包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO：9、19或31(α链的可变区)，SEQ ID NO：10、20或32(β链的可变区)；SEQ ID NO：9和10二者；SEQID NO：19和20二者；SEQ ID NO：31和32二者；SEQ ID NO：9和32二者或者SEQ ID NO：10和31二者。优选地，所述多肽包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO：9和10二者或者SEQ ID NO：10和31二者。

可替代地或另外地，本发明多肽可包含本文所述TCR或其功能变体之一的全长α链或β链。在这一点上，本发明多肽可包含SEQ ID NO：11、12、21、22、27、28、33或34的氨基酸序列。可替代地，本发明多肽可包含本文所述TCR或其功能变体的α链和β链。例如，本发明多肽可包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO：11和12二者、SEQ ID NO：21和22二者、SEQ ID NO：33和34二者、SEQ ID NO：11和34二者、SEQ ID NO：12和33二者或者SEQ ID NO：27和28二者。优选地，所述多肽包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO：11和12二者、SEQ ID NO：33和12二者或者SEQ ID NO：27和28二者。

本发明还提供了包含本文所述多肽中至少一种的蛋白质。“蛋白质”意指包含一条或更多条多肽链的分子。

在一个实施方案中，本发明蛋白质可包含第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链包含SEQ ID NO：3至5、SEQ ID NO：13至15或SEQ ID NO：3至4和29的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：6至8、SEQ ID NO：16至18或SEQ ID NO：6至7和30的氨基酸序列。可替代地或另外地，本发明蛋白质可包含第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链包含SEQ ID NO：9、19或31的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：10、20或32的氨基酸序列。例如，本发明蛋白质可包含第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链包含SEQ IDNO：11、21、27或33的氨基酸序列；所述第二多肽链包含SEQ ID NO：12、22、28或34的氨基酸序列。在这种情况下，本发明蛋白质可以是TCR。可替代地，例如，如果蛋白质包含含有SEQID NO：11、21、27或33和SEQ ID NO：12、22、28或34的单一多肽链，或者如果蛋白质的第一多肽链和/或第二多肽链还包含其他氨基酸序列，例如编码免疫球蛋白或其部分的氨基酸序列，则本发明蛋白质可以是融合蛋白。在这一点上，本发明还提供了包含本文所述的本发明多肽中至少一种以及至少一种其他多肽的融合蛋白。所述其他多肽可作为融合蛋白的单独多肽存在，或可作为与本文描述的本发明多肽之一一起(以串联方式)在框(frame)中表达的多肽而存在。其他多肽可编码任意的肽分子或蛋白质分子或其部分，包括但不限于免疫球蛋白、CD3、CD4、CD8、MHC分子、CD1分子(如，CD1a、CD1b、CD1c、CD1d)等。

融合蛋白可包含本发明多肽的一个或更多个拷贝和/或其他多肽的一个或更多个拷贝。例如，融合蛋白可包含本发明多肽和/或其他多肽的1、2、3、4、5或更多个拷贝。制备融合蛋白的合适方法在本领域是已知的，包括例如重组方法。参见例如，Choi等、Mol.Biotechnol.31：193-202(2005)。

在本发明的一些实施方案中，本发明的TCR(及其功能部分和功能变体)、多肽和蛋白质可表达为包含连接α链和β链的接头肽的单一蛋白。在这一点上，包含SEQ ID NO：11、21、27或33和SEQ ID NO：12、22、28或34的本发明TCR(及其功能变体和功能部分)、多肽和蛋白质还可包含接头肽。接头肽可有利地帮助重组TCR(包括其功能部分和功能变体)、多肽和/或蛋白质在宿主细胞中表达。在宿主细胞表达包含接头肽的构建体后，接头肽可被切割，产生分离的α链和β链。

本发明蛋白质可以是包含本文所述的本发明多肽中至少一种的重组抗体。本文使用的“重组抗体”是指这样的重组(例如，遗传改造的)蛋白：其包含本发明多肽中的至少一种和抗体的多肽链或其部分。抗体的多肽或其部分可以是重链、轻链、重链或轻链的可变区或恒定区，单链可变片段(scFv)或者抗体的Fc、Fab或F(ab)₂′等。抗体的多肽链或其部分可作为重组抗体的单独多肽存在。可替代地，抗体的多肽链或其部分可作为与本发明多肽一起在框中(以串联方式)表达的多肽存在。抗体的多肽或其部分可以是任意抗体的多肽或任意抗体片段，包括本文所述抗体和抗体片段中的任意一种。

TCR(或其功能变体)、多肽或蛋白质可基本由本文所述的一条或多条指定氨基酸序列组成，使得TCR(或其功能变体)、多肽或蛋白质的其他组分(例如其他氨基酸)不实质上改变TCR(或其功能变体)、多肽或蛋白质的生物活性。在这一点上，本发明TCR(或其功能变体)、多肽或蛋白质可例如基本由以下氨基酸序列组成：SEQ ID NO：11、12、21、22、27、28、33和34、SEQ ID NO：11和12二者、SEQ ID NO：21和22二者、SEQ ID NO：27和28二者、SEQ IDNO：33和34二者、SEQ ID NO：11和34二者或者SEQ ID NO：12和33二者。另外，例如，本发明TCR(包括其功能变体)、多肽或蛋白质可基本由以下氨基酸序列组成：SEQ ID NO：9、10、19、20、31、32、SEQ ID NO：9和10二者、SEQ ID NO：19和20二者、SEQ ID NO：31和32二者、SEQ IDNO：9和32二者、SEQ ID NO：10和31二者。此外，本发明TCR(包括其功能变体)、多肽或蛋白质可基本由以下氨基酸序列组成：SEQ ID NO：3或13(α链的CDR1)，SEQ ID NO：4或14(α链的CDR2)、SEQ ID NO：5、15或29(α链的CDR3)，SEQ ID NO：6或16(β链的CDR1)、SEQ ID NO：7或17(β链的CDR2)，SEQ ID NO：8、18或30(β链的CDR3)或者其任意组合，例如，SEQ ID NO：3至5；6至8；3至8；13至15；16至18；13至18；3至4和29；6至7和30；3至4、29和6至8；3至7和30；或者3至4、29、6至7和30。

本发明的TCR、多肽和蛋白质(包括其功能变体)可以为任意长度，即，其可包含任意数目的氨基酸，只要TCR、多肽或蛋白质(或其功能变体)保留其生物活性即可，所述生物活性例如，能够与MAGE-A3和/或MAGE-A6特异性结合；在哺乳动物中检测癌症；或者在哺乳动物中预防或治疗癌症的能力等。例如，多肽的长度可在约50至约5000个氨基酸长的范围中，例如50、70、75、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多个氨基酸。在这一点上，本发明多肽还包括寡肽。

本发明的TCR、多肽和蛋白质(包括其功能变体)可包含代替一个或更多个天然氨基酸的合成氨基酸。这样的合成氨基酸在本领域是已知的，并且例如包括，氨基环己烷羧酸、正亮氨酸、α-氨基正癸酸、高丝氨酸、S-乙酰基氨甲基-半胱氨酸、反式3-羟脯氨酸和反式-4-羟脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸、β-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、二氢吲哚-2-羧酸、1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、N’-苄基-N’甲基-赖氨酸、N’，N’-二苄基-赖氨酸、6-羟基赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环己烷羧酸、α-氨基环庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降冰片烷)-羧酸、α，γ-二氨基丁酸、α，β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸和α-叔丁基甘氨酸。

可使本发明的TCR、多肽和蛋白质(包括其功能变体)糖基化、酰胺化、羧化、磷酸化、酯化、N-酰化、通过例如二硫键环化或者转化为酸加成盐和/或任选地二聚化或多聚化，或者缀合。

可通过本领域已知的方法获得本发明的TCR、多肽和/或蛋白质(包括其功能变体)。在参考文献，例如，Chan等，Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis，OxfordUniversity Press，Oxford，United Kingdom，2005；Peptide and Protein Drug Analysis，Reid，R.编辑，Marcel Dekker，Inc.，2000；Epitope Mapping，Westwood等编辑，Oxford University Press，Oxford，United Kingdom，2000以及美国专利No.5,449,752中描述了从头合成多肽和蛋白质的合适方法。此外，可使用标准重组方法用本文所述的核酸来重组地产生多肽和蛋白质。参见，例如Sambrook等，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY 2001；和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates以及JohnWiley&Sons，NY，1994。此外，可从例如，植物、细菌、昆虫、哺乳动物(例如，大鼠、人等)来源分离和/或纯化一些本发明的TCR、多肽和蛋白质(包括其功能变体)。分离和纯化的方法是本领域公知的。或者，可通过公司，例如Synpep(Dublin，CA)、Peptide Technologies Corp.(Gaithersburg，MD)和Multiple Peptide Systems(San Diego，CA)来商业化合成本文所述的TCR、多肽和/或蛋白质(包括其功能变体)。在这一方面，本发明的TCR(包括其功能变体)、多肽和蛋白质可以是合成的、重组体、分离的和/或纯化的。

包括在本发明范围内的是缀合物，例如，生物缀合物，其包含本发明的TCR、多肽或蛋白质(包括其功能变体的任意一种)、核酸、重组表达载体、宿主细胞、宿主细胞群或者抗体或其抗原结合部分的任意一种。缀合物以及通常合成缀合物的方法是本领域已知的(参见，例如，Hudecz，E，Methods Mol.Biol.298：209-223(2005)和Kirin等，Inorg Chem.44(15)：5405-5415(2005))。

如本文所用的“核酸”包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”并且通常意指DNA或RNA的聚合物，其可以是单链或双链的、合成的或者从天然来源获得的(例如，分离和/或纯化的)，所述核酸可包含天然的、非天然的或改变的核苷酸，并且其可含有天然的、非天然的或改变的核苷酸间键(例如，磷酰胺键(phosphoroamidate linkage)或硫代磷酸酯键(phosphorothioate linkage)，替代了包含在未修饰的寡核苷酸的核苷酸之间发现的磷酸二酯)。通常优选的是，所述核酸不包含任意一种插入、缺失、倒位和/或替代。然而，如本文所讨论的，在一些情况下，可能合适的是，核酸包含一个或更多个插入、缺失、倒位和/或替代。

优选地，本发明的核酸是重组体。如本文所使用，术语“重组体”是指(i)通过将天然的或合成的核酸区段与可在活细胞中复制的核酸分子连接而在活细胞外构建的分子，或者(ii)通过上面(i)中所述的那些分子的复制而得到的分子。就本文的目的而言，所述复制可以是体外复制或体内复制。

可使用本领域已知的方法基于化学合成和/或酶促连接反应来构建核酸。参见，例如，Sambrook等(同上)和Ausubel等(同上)。例如，可使用天然核苷酸或多种经修饰的核苷酸来化学地合成核酸，所述多种经修饰核苷酸被设计成增加分子的生物稳定性或增加杂交时所形成的双链体的物理稳定性(例如，硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)。可用于产生核酸的经修饰核苷酸的实例包括但不限于，5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基核苷(galactosylqueosine)、肌苷、N⁶-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N⁶-取代的腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫脲嘧啶、β-D-吡喃甘露糖基核苷(mannosylqueosine)、5′-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N⁶-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、核苷(queosine)、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。或者，可从公司，例如，Macromolecular Resources(Fort Collins，CO)和Synthegen(Houston，TX)，购得本发明的一种或更多种核酸。

所述核酸可包含编码本文所述的TCR、多肽、蛋白质或其功能变体的任一种之任何核苷酸序列。例如，所述核酸可包含核苷酸序列SEQ ID NO：37至44的任意一种或更多种，可由核苷酸序列SEQ ID NO：37至44的任意一种或更多种组成或者基本上由核苷酸序列SEQID NO：37至44的任意一种或更多种组成。

本发明还提供了包含与本文所述的任一种核酸的核苷酸序列互补之核苷酸序列或者在严格条件下与本文所述的任一种核酸的核苷酸序列杂交之核苷酸序列的核酸。

在严格条件下杂交的核苷酸序列优选地在高严格度条件下杂交。“高严格度条件”意指核苷酸序列以可检测到高于非特异性杂交的量与靶序列(本文所述的任一种核酸的的核苷酸序列)特异性杂交。高严格度条件包括将具有精确互补序列的多核苷酸或者仅包含少数分散错配的多核苷酸与具有几个与核苷酸序列配对的小区域(例如，3至10个碱基)的随机序列区分开来的条件。这样的互补性小区域比14个至17个或更多个碱基的全长补体更易熔，并且高度严格的杂交使得其易于区分。相对的高严格度条件可包括，例如，低盐和/或高温条件，例如，在约50℃至70℃的温度下，由约0.02M至0.1M NaCl或等同物所提供的条件。这样的高严格度条件耐受核苷酸序列与模板或靶链的极少(如果有的话)错配，并且特别适于检测任意一种本发明的TCR(包括其功能部分和功能变体)的表达。通常认为，通过增加甲酰胺的添加量可使条件更严格。

本发明还提供了包含这样的核苷酸序列的核酸，其与任意一种本文所述的核酸具有至少约70％或更多，例如，约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的同一性。

可将本发明的核酸并入重组表达载体中。在这一点上，本发明提供了包含任意一种本发明核酸的重组表达载体。就本文的目的而言，术语“重组表达载体”意指基因修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体，所述构建体允许mRNA、蛋白质、多肽或肽通过宿主细胞表达，当所述构建体包含编码mRNA、蛋白质、多肽或肽的核苷酸序列时，在足以使mRNA、蛋白质、多肽或肽在细胞内表达的条件下，使载体与细胞接触。就整体而言，本发明的载体不是天然的。然而，载体的部分可以是天然的。本发明的重组表达载体可包含任意一种类型的核苷酸，包括但不限于DNA和RNA，所述核苷酸可以是单链或双链的、合成的或部分从天然来源获得的，并且所述重组表达载体可包含天然的、非天然的或改变的核苷酸。重组表达载体可包含天然的、非天然的核苷酸间键，或者两种类型的键。优选地，非天然的或改变的核苷酸或核苷酸间键不妨碍载体的转录或复制。

本发明的重组表达载体可以是任意合适的重组表达载体，并且可将其用于转化或转染任意合适的宿主细胞。合适的载体包括设计为用于增殖和扩增或用于表达或者两者皆可的那些，例如质粒或病毒。载体可选自pUC系列(Fermentas Life Sciences)、pBluescript系列(Stratagene，LaJolla，CA)、pET系列(Novagen，Madison，WI)、pGEX系列(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)以及pEX系列(Clontech，Palo Alto，CA)。还可使用噬菌体载体，例如λGT10、λGT11、λZapH(Stratagene)、λEMBL4和λNM1149。植物表达载体的实例包括pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(Clontech)。动物表达载体的实例包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。优选地，重组表达载体是病毒载体，例如，逆转录病毒载体。

可使用在例如Sambrook等(同上)和Ausubel等(同上)中描述的标准重组DNA技术来制备本发明的重组表达载体。可制备环状或线性表达载体的构建体以包含在原核或真核宿主细胞中发挥作用的复制系统。复制系统可来源于，例如，ColEl、2μ质粒、λ、SV40、牛乳头瘤病毒等。

理想地，所述重组表达载体包含调控序列，例如转录和翻译起始密码子和终止密码子，所述调控序列对载体待被引入其中的宿主细胞类型(例如，细菌、真菌、植物或动物)是特异性的，这要视情况而定并考虑所述载体是基于DNA还是基于RNA的。

所述重组表达载体可包括一个或更多个标记基因，其使得能够选择经转化或转染的宿主细胞。标记基因包括杀生物剂抗性，例如，对抗生素、重金属等的抗性，在营养缺陷型宿主细胞中提供原养型的互补等。用于本发明的表达载体的合适的标记基因包括，例如，新霉素/G418抗性基因、潮霉素抗性基因、组氨醇抗性基因、四环素抗性基因和氨苄西林抗性基因。

重组表达载体可包含本源或非本源启动子，所述启动子有效地连接到编码TCR、多肽或蛋白质(包括其功能变体)的核苷酸序列，或者连接到与编码TCR、多肽或蛋白质(包括其功能变体)的核苷酸序列互补或杂交的核苷酸序列。启动子的选择(例如，强、弱、可诱导、组织特异性和发育特异性)在普通技术人员的能力之内。类似地，核苷酸序列与启动子的组合也在普通技术人员的能力之内。启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子以及在鼠干细胞病毒的长末端重复中发现的启动子。

可设计本发明的重组表达载体以用于瞬时表达、稳定表达或两者。此外，可制造重组表达载体以用于组成型表达或诱导型表达。此外，可制造重组表达载体以包括自杀基因。

如本文所使用的，术语“自杀基因”是指引起表达所述自杀基因的细胞死亡的基因。自杀基因可以是向基因在其中表达之细胞赋予试剂(例如，药物)敏感性并且当细胞与试剂接触或暴露于试剂时，引起细胞死亡的基因。自杀基因是本领域已知的(参见，例如，Suicide Gene Therapy：Methods and Reviews，Springer，Caroline J.(Cancer ResearchUK Centre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research，Sutton，Surrey，UK)，Humana Press，2004)并且包括，例如，单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶脱氨酶(cytosine daminase)、嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleosidephosphorylase)和硝基还原酶。

本发明的另一个实施方案还提供了包含本文所述的任意一种重组表达载体的宿主细胞。如本文所使用的，术语“宿主细胞”是指可包含本发明的重组表达载体的任意类型的细胞。宿主细胞可以是真核细胞，例如，植物、动物、真菌或藻类，或者可以是原核细胞，例如，细菌或原生动物。宿主细胞可以是培养的细胞或原代细胞，即，直接从生物体(例如，人)分离的细胞。宿主细胞可以是贴壁细胞或悬浮细胞，即，悬浮生长的细胞。合适的宿主细胞是本领域已知的并且包括，例如，DH5α大肠杆菌细胞、中国仓鼠卵巢细胞、猴VERO细胞、COS细胞、HEK293细胞等。为了扩增或复制重组表达载体的目的，宿主细胞优选地为原核细胞，例如，DH5α细胞。为了生产重组TCR、多肽或蛋白质的目的，宿主细胞优选地为哺乳动物细胞。最优选地，宿主细胞为人细胞。同时，宿主细胞可以是任意一种细胞类型，可来源于任意一种类型的组织并且可处于任意发育阶段，宿主细胞优选地为外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)。更优选地，宿主细胞是T细胞。

就本文的目的而言，T细胞可以是任意一种T细胞，例如，培养的T细胞，例如，原代T细胞，或者来自培养的T细胞系的T细胞，例如，Jurkat、SupT1等，或者从哺乳动物获得的T细胞。如果是从哺乳动物获得的，则T细胞可从多种来源获得，包括但不限于血液、骨髓、淋巴结、胸腺或者其他组织或体液。T细胞还可以是富集的或纯化的。优选地，T细胞是人T细胞。更优选地，T细胞是从人分离的T细胞。T细胞可以是任意一种类型的T细胞并且可处于任意发育阶段，包括但不限于CD4⁺/CD8⁺双阳性T细胞、CD4⁺辅助T细胞，例如Th₁细胞和Th₂细胞、CD4+T细胞、CD8⁺T细胞(例如，细胞毒T细胞)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、记忆T细胞(例如，中央记忆T细胞(central memory T cell)和效应记忆T细胞)、幼稚T细胞等。

本发明还提供的是包含至少一种本文所述的宿主细胞的细胞群。细胞群可以是包含宿主细胞以及至少一种其他细胞的异质群，所述宿主细胞包含任意一种所述的重组表达载体，所述至少一种其他细胞为，例如不包含任意一种重组表达载体的宿主细胞(例如，T细胞)，或者除了T细胞之外的细胞，例如，B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、红细胞、肝细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌肉细胞、脑细胞等。或者，细胞群可以为基本上同质的群，其中所述群主要包含宿主细胞(例如，基本上由宿主细胞组成)，所述宿主细胞包含重组表达载体。所述群还可以是细胞的克隆群，其中所述群的所有细胞是包含重组表达载体的单个宿主细胞的克隆，以使得所述群的所有细胞包含重组表达载体。在本发明的一个实施方案中，细胞群是包含宿主细胞的克隆群，所述宿主细胞包含如本文所述的重组表达载体。

本发明还提供了抗体或其抗原结合部分，其与本文所述的任意一种TCR(或其功能变体)的功能部分特异性结合。优选地，功能部分与癌抗原特异性结合，例如，功能部分包含氨基酸序列SEQ ID NO：3或13(α链的CDR1)、4或14(α链的CDR2)、5、15或29(α链的CDR3)、6或16(β链的CDR1)、7或17(β链的CDR2)、8、18或30(β链的CDR3)，SEQ ID NO：9、19或31(α链的可变区)，SEQ ID NO：10、20或32(β链的可变区)，或者其组合，例如，3至5；6至8；3至8；13至15；16至18；13至18；3至4以及29；6至7以及30；3至4、29以及6至8；或者3至7以及30；3至4、29、6至7以及30。更优选地，功能部分包含氨基酸序列SEQ ID NO：3至8或SEQ ID NO：3至4、29以及6至8。在一个优选的实施方案中，抗体或其抗原结合部分与由全部6个CDR(α链的CDR1至3和β链的CDR1-3)形成的表位相结合。抗体可以是本领域已知的任意一种类型的免疫球蛋白。例如，抗体可以是任意一种同种型，例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM等。抗体可以是单克隆的或多克隆的。抗体可以是天然抗体，例如，从哺乳动物(例如，小鼠、兔子、山羊、马、鸡、仓鼠、人等)中分离和/或纯化的抗体。或者，抗体可以是遗传改造抗体，例如，人源化抗体或嵌合抗体。抗体可以以单体形式或聚合形式。此外，抗体对本发明的TCR(或其功能变体)的功能部分可具有任意水平的亲和性或亲和力。理想地，抗体对于本发明TCR(或其功能变体)的功能部分是特异的，以使得其与其他表位或蛋白质的交叉反应最小化。

测试抗体与本发明TCR的任意功能部分或功能变体相结合之能力的方法是本领域已知的并且包括任意一种抗体-抗原结合测定，例如，放射性免疫测定(RIA)、ELISA、Western印迹、免疫沉淀法和竞争性抑制测定(参见，例如，Janeway等(见下文)和美国专利申请公开No.2002/0197266 A1)。

制造抗体的合适方法是本领域已知的。例如，在如和Milstein，Eur.J.Immunol.，5，511-519(1976)，Harlow和Lane(编辑)，Antibodies：A LaboratoryManual，CSH Press(1988)和C.A.Janeway等.(编辑)，Immunobiology，第五版，GarlandPublishing，New York，NY(2001))中描述的标准杂交瘤方法。或者，其他方法例如EBV-杂交瘤方法(Haskard和Archer，J.Immunol.Methods，74(2)，361-67(1984)和Roder等，MethodsEnzymol.，121，140-67(1986))和噬菌体载体表达系统(参见，例如，Huse等，Science，246，1275-81(1989))是本领域已知的。此外，在例如美国专利5,545,806、5,569,825和5,714,352以及美国专利申请公开No.2002/0197266 A1中描述了在非人类动物中生产抗体的方法。

还可将噬菌体展示用于生产本发明的抗体。在这一方面，可使用标准的分子生物学和重组DNA技术(参见，例如，Sambrook等.(编辑)，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(2001))来生产编码抗体的抗原结合可变(V)结构域的噬菌体文库。选择编码具有期望特异性之可变区的噬菌体以与期望抗原特异性结合，并且重建完全或部分抗体，其包含所选择的可变结构域。将编码重建抗体的核酸序列引入合适的细胞系(例如用于杂交瘤生产的骨髓瘤细胞)以便通过细胞分泌具有单克隆抗体特征的抗体(参见，例如，Janeway等(同上)，Huse等(同上)和美国专利6,265,150)。

可通过转基因小鼠生产抗体，所述转基因小鼠是对于特异性重链和轻链免疫球蛋白基因转基因的。这样的方法是本领域已知的并且描述于例如美国专利5,545,806和5,569,825以及Janeway等(同上)。

用于生产人源化抗体的方法是本领域公知的并且在例如Janeway等(同上)，美国专利5,225,539、5,585,089和5,693,761，欧洲专利No.0239400 B1以及英国专利No.2188638中详细描述。还可使用在例如美国专利5,639,641和Pedersen等，J.Mol.Biol.，235，959-973(1994)中描述的抗体表面重塑技术(antibody resurfacing technology)来生产人源化抗体。

本发明还提供了本文所述的任意抗体的抗原结合部分。抗原结合部分可以是具有至少一个抗原结合位点(例如，Fab、F(ab’)₂、dsFv、sFv、双抗体和三抗体)的任意部分。

可使用常规重组DNA技术(参见，例如，Janeway等(同上))来生产单链可变区片段(sFv)抗体片段，其由包含通过合成肽与抗体轻链的可变(V)结构域连接之抗体重链的V结构域的截短Fab片段组成。类似地，可通过重组DNA技术(参见，例如，Reiter等，ProteinEngineering，7，697-704(1994))来制备二硫键稳定的可变区片段(dsFv)。然而，本发明的抗体片段并不限于这些示例性类型的抗体片段。

此外，可修饰抗体或其抗原结合部分以使其包含可检测标记，例如，放射性同位素、荧光基团(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE))、酶(例如，碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)和元素颗粒(例如，金颗粒)。

本发明的TCR、多肽、蛋白质(包括其功能变体)、核酸、重组表达载体、宿主细胞(包括其群)和抗体(包括其抗原结合部分)可以是分离的和/或纯化的。如本文所使用的术语“分离的”意指已经从其天然环境中移出。如本文所使用的术语“纯化的”意指已经增加了纯度，其中“纯度”是相对性术语，没有必要解释为绝对纯度。例如，纯度可以为至少约50％，可以为大于60％、70％、80％、90％、95％，或者可以为100％。

可将本发明的TCR、多肽、蛋白质(包括其功能变体)、核酸、重组表达载体、宿主细胞(包括其群)和抗体(包括其抗原结合部分)(以下将其全部统称为“本发明的TCR材料”)配制成组合物，例如药物组合物。在这一方面，本发明提供了药物组合物，其包含TCR、多肽、蛋白质、功能部分、功能变体、核酸、表达载体、宿主细胞(包括其群)和抗体(包括其抗原结合部分)的任意一种，以及可药用载体。包含任一种本发明TCR材料的本发明的药物组合物可包含多于一种的本发明的TCR材料，例如，多肽和核酸，或者两种或更多种不同的TCR(包括其功能部分和功能变体)。或者，所述药物组合物可包含与另一种药物活性剂或药物(例如，化疗剂，例如，天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、道诺霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春花碱、长春新碱等)相组合的本发明的TCR材料。

优选地，载体是可药用载体。相对于药物组合物，所述载体可以是常规地用于所考虑的具体的本发明的TCR材料的那些之任一种。这样的可药用载体是本领域技术人员公知的并且公众可容易获得。优选的是，可药用载体是在使用条件下无有害副作用或毒性的载体。

载体的选择可部分地由具体的本发明TCR材料以及用于施用本发明TCR材料的具体方法来确定。因此，存在本发明药物组合物的多种合适制剂。合适的制剂可包括任意用于经口、气雾剂、肠胃外、皮下、静脉内、肌内、动脉内、鞘内或腹膜内施用的那些。可用多于一种的途径来施用本发明的TCR材料，而在某些情况下，特定途径可提供比另外的途径更及时并且更有效的应答。

优选地，通过注射(例如，静脉内)施用本发明的TCR材料。当本发明的TCR材料是表达本发明的TCR(或其功能变体)的宿主细胞时，用于注射之细胞的可药用载体可包括任意等渗载体，例如，生理盐水(在水中约0.90％w/v的NaCl、在水中约300mOsm/L NaCl或每升水约9.0g NaCl)、NORMOSOL R电解质溶液(Abbott，Chicago，IL)、PLASMA-LYTE A(Baxter，Deerfield，IL)、在水中约5％的葡萄糖或者Ringer乳酸。在一个实施方案中，可药用载体是补充有入血清白蛋白的。

在本发明的一个实施方案中，药物组合物还可包含MHC I类限制性TCR或多肽、蛋白质、编码MHC I类限制性TCR的核酸或者重组表达载体，或者表达MHC I类限制性TCR的宿主细胞或细胞群。不受限于特定理论，认为MHC I类限制性CD8⁺T细胞增加MHC II类限制性CD4+T细胞的反应性并且增强MHC II类限制性CD4+T细胞治疗或预防癌症的能力。

就本发明的目的而言，经过合理的时间范围，在对象或动物中所施用的本发明的TCR材料的量或剂量(例如，当本发明的TCR材料是一个或更多个细胞时，为细胞的数量)应足以产生效应，例如，治疗性应答或预防性应答。例如，在施用时间之后约2小时或更长时间(例如12小时至24小时或更多小时)的时间段内，本发明的TCR材料的剂量应足以与癌抗原结合，或检测、治疗或预防癌症。在某些实施方案中，所述时间段甚至可以更长。可通过具体的本发明的TCR材料的效力和动物(例如，人)的状况，以及待治疗动物(例如，人)的体重来确定剂量。

用于确定施用剂量的许多测定是本领域已知的。就本发明的目的而言，可将这样的测定用于确定施用于哺乳动物的起始剂量，所述测定包括比较通过向哺乳动物施用给定剂量的这种T细胞而通过T细胞的靶细胞裂解或者IFN-γ分泌的程度，所述T细胞表达本发明的TCR(或其功能变体或功能部分)、多肽或蛋白质，所述哺乳动物在一组各自给予不同剂量的T细胞的哺乳动物之中。可通过本领域已知的方法测定施用一定剂量后靶细胞裂解或IFN-γ分泌的程度。

还可通过施用具体的本发明的TCR材料可能伴随的任何不良副作用的存在、性质和程度来确定本发明TCR材料的剂量。通常，主治医师将考虑多种因素，例如，年龄、体重、一般健康、饮食、性别、待施用的本发明TCR材料、施用途径以及待治疗病症的严重程度，来决定用来治疗各个患者的本发明的TCR材料的剂量。在一个其中本发明的TCR材料是细胞群的实施方案中，每次输注所施用的细胞数量可为例如约1×10⁶个至约1×10¹¹个细胞或更多不等。

本领域普通技术人员将容易地理解，可以以任意数量的方式修饰本发明的TCR材料，以便经过修饰来提高本发明的TCR材料的治疗效力或预防效力。例如，可使本发明的TCR材料直接或间接地经过桥与靶向部分缀合。将化合物(例如，本发明的TCR材料)与靶向部分缀合的实践是本领域已知的。参见，例如，Wadwa等，J.Drug Targeting 3：111(1995)和美国专利5,087,616。如本文所使用的术语“靶向部分”是指特异性识别并结合细胞表面受体以使得靶向部分将本发明的TCR材料定向递送到在其表面上表达受体的细胞群的任意分子或试剂。靶向部分包括但不限于抗体或其片段、肽、激素、生长因子、细胞因子和任意其他的天然或非天然的配体，所述靶向部分与细胞表面受体(例如，表皮生长因子受体(EGFR)、T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)、CD28、血小板衍生生长因子受体(PDGF)、烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)等)结合。如本文所使用的术语“桥”是指将本发明的TCR材料与靶向部分连接的任意试剂或分子。本领域普通技术人员认识到，在本发明的TCR材料上的位点是连接桥和/或靶向部分的理想位点，所述位点对于本发明的TCR材料的功能不是必需的，只要桥和/或靶向部分一经连接到本发明的TCR材料上，并不干扰本发明的TCR材料的功能(即，与MAGE-A3或MAGE-A6结合的能力；或者检测、治疗或预防癌症的能力)即可。

可以构想的是，可将本发明的药物组合物、TCR(包括其功能变体)、多肽、蛋白质、核酸、重组表达载体、宿主细胞或细胞群用于治疗或预防癌症的方法中。不受限于特定理论，认为本发明的TCR(及其功能变体)与MAGE-A3和/或MAGE-A6特异性结合以使得当通过细胞表达时TCR(或相关的本发明的多肽或蛋白质及其功能变体)能够介导针对表达MAGE-A3或MAGE-A6的靶细胞的免疫应答。在这一方面，本发明提供了在哺乳动物中治疗或预防癌症的方法，其包括以有效治疗或预防哺乳动物中癌症的量向哺乳动物施用本文所述的药物组合物、TCR(及其功能变体)、多肽或蛋白质的任一种；包含编码本文所述的TCR(及其功能变体)、多肽、蛋白质的任一种之核苷酸序列的任何核酸或重组表达载体；或者包含编码本文所述的TCR(及其功能变体)、多肽或蛋白质之任一种的重组载体的任何宿主细胞或细胞群。

在本发明的一个实施方案中，本发明的治疗或预防癌症的方法还可包括向哺乳动物共施用MHC I类限制性TCR或多肽、蛋白质、编码MHC I类限制性TCR的核酸或重组表达载体，或者表达MHC I类限制性TCR的宿主细胞或细胞群。

如本文所使用的术语“治疗”和“预防”以及从其而来的词语不需要意味100％的或完全治疗或预防。相反，存在其中本领域普通技术人员认为具有潜在益处或治疗效果的不同程度的治疗或预防。在这一方面，本发明的方法可在哺乳动物中提供任意量的任何水平的癌症治疗或预防。此外，由本发明的方法所提供的治疗或预防可包括疾病(例如，待治疗或预防的癌症)的一种或更多种病症或症状的治疗或预防。此外，就本文的目的而言，“预防”可涵盖延迟疾病或者其症状或病症的发作。

还提供的是在哺乳动物中检测癌症的存在的方法。所述方法包括(i)使包含癌症的细胞样品与本文所述的本发明的TCR(及其功能变体)、多肽、蛋白质、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群，或者抗体或其抗原结合部分的任意一种接触，由此形成复合物，以及检测所述复合物，其中检测到所述复合物指示在所述哺乳动物中存在癌症。

对于本发明的在哺乳动物中检测癌症的方法而言，癌症的细胞样品可以是包含全细胞、其裂解物或全细胞裂解物之级分(例如细胞核或细胞质级分、全部蛋白质级分或核酸级分)的样品。

为了本发明的检测方法的目的，对于哺乳动物而言，所述接触可发生在体外或体内。优选地，所述接触是在体外。

此外，复合物的检测可通过本领域已知的任意数量的方式发生。例如，可用可检测的标记来标记本文所述的本发明的TCR(及其功能变体)、多肽、蛋白质、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群或者抗体或其抗原结合部分，所述标记例如，放射性同位素、荧光基团(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE))、酶(例如，碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)和元素颗粒(例如，金颗粒)。

就本发明方法其中施用宿主细胞或细胞群的目的而言，所述细胞可以是对哺乳动物而言同种异体或自体的细胞。优选地，所述细胞是对哺乳动物而言自体的。

对于本发明的方法而言，癌症可以是任何癌症，包括肉瘤(例如，滑膜肉瘤、成骨性肉瘤、子宫平滑肌肉瘤和肺泡状横纹肌肉瘤)、淋巴瘤(例如，霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、肝细胞癌、神经胶质瘤、头癌(例如，鳞状细胞癌)、颈癌(例如，鳞状细胞癌)、急性淋巴细胞癌、白血病(例如，急性髓性白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、骨癌、脑癌、乳腺癌、肛门癌、肛管癌或肛肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、外阴癌、慢性骨髓癌(chronic myeloid cancer)、结肠癌(例如，结肠癌(colon carcinoma))、食管癌、宫颈癌、胃癌、胃肠道类癌肿瘤、下咽部癌、喉癌、肝癌(例如，肝细胞癌)、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、恶性间皮瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、卵巢癌、胰腺癌、腹膜癌、网膜癌和肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌(例如，肾细胞癌)、小肠癌、软组织癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌和泌尿道上皮癌(例如，输尿管癌和膀胱癌)的任意一种。优选地，癌症是黑素瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、滑膜细胞肉瘤、头颈癌、食管癌或卵巢癌。

本发明的方法中所提及的哺乳动物可以是任何哺乳动物。如本文所使用的，术语“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包括但不限于啮齿目的哺乳动物，例如，小鼠和仓鼠，以及兔形(Logomorpha)目的哺乳动物，例如，兔子。优选的是，所述哺乳动物来自食肉目，包括猫科动物(猫)和犬科动物(狗)。更优选的是，所述哺乳动物来自偶蹄(Artiodactyla)目，包括牛科动物(牛)和猪科动物(猪)或者奇蹄(Perssodactyla)目，包括马科动物(马)。最优选的是，所述哺乳动物是灵长(Primates)目、Ceboids或猿(猴)目的或者类人猿(Anthropoids)目(人和类人猿)的。特别优选的哺乳动物是人。

以下实施例进一步说明了本发明，但是当然不应认为是以任意一种方式限制其范围。

实施例1A

该实施例阐释了从T细胞克隆中分离TCR。

将抗MAGE-A3_243-258 CD4+效应克隆R12C9和抗MAGE-A3_243-258 Treg克隆6F9与经肽(MAGE-A3_243-288)脉冲的EBV B细胞一起培养。测量细胞因子分泌、受抑制的指示性细胞的百分比、FOXP3+Treg细胞的百分比和未甲基化的FOXP3序列的百分比。认为未甲基化的FOXP3内含子1序列是稳定的Treg表型的标志物。6F9克隆和R12C9克隆的结果在表1A和1B中示出。

表1A

表1B

在通过适当的肽刺激之后，Treg克隆可抑制指示性细胞的增殖。如表1A所示，克隆6F9是Treg克隆。

包含SEQ ID NO：21和22的TCR是从抗MAGE-A3_243-258 CD4⁺效应克隆R12C9(“R12C9TCR”)中克隆的。包含SEQ ID NO：11和12的TCR是从抗MAGE-A3_243-258 Treg克隆6F9(“6F9TCR”)中克隆的。

实施例1B

该实施例阐释了用编码实施例1的6F9 TCR或R12C9 TCR的核苷酸序列转导的PBMC的转导效率。

将编码R12C9和6F9的TCRα和β链的转录物与编码P2A自身切割肽的序列相连接并克隆到MSGV1逆转录病毒载体中。将来自三个患者的PBMC用OKT3刺激，在第二天用瞬时逆转录病毒上清液转导，并且在第七天富集CD4+T细胞。通过染色用抗Vβ22或Vβ6.7(其分别检测6F9或R12C9 TCR)转导的细胞来评估TCR表达水平。来自患者1的PBMC分析表明25％至35％的T细胞被各个TCR转导，并且来自患者2和患者3的PBMC获得了类似的转导水平。

实施例2

该实施例证明了用编码实施例1之抗MAGE-A3_243-258 TCR的核苷酸序列转导的T细胞识别MAGE-A3和经肽脉冲之靶标的293-II类主要组织相容性复合物反式激活因子(CIITA)转染子。该实施例还证明了6F9 TCR识别MAGE-A3和MAGE-A6的293-CIITA转染子。

来自两个人供体的CD4+富集的外周血淋巴细胞(PBL)是未转导的(UT)或者用F5(抗MART-1)TCR、R12C9 TCR或6F9 TCR转导的。将所述细胞与由MAGE-A3_243-258(SEQ ID NO：2)肽脉冲的经293-CIITA-转染的靶细胞一起培养。293-CIITA细胞是用CIITA转导的293细胞，所述CIITA是编码II类主要组织相容性复合物反式激活蛋白的人基因。用6F9 TCR和R12C9 TCR转导的细胞所获得的结果在表2和图10A中示出。通过R12C9 TCR或6F9 TCR转导的PBL识别经MAGE-A3_243-258肽脉冲的HLA-DP＊0401+靶细胞。MAGE-A3_243-258肽的滴定表明，用6F9 TCR或R12C9 TCR转导的CD4⁺T细胞释放了与响应于用至少0.001mg/ml至0.01mg/ml的MAGE-A3：_243-258肽脉冲的靶标水平相当的IFN-γ。使用来自第三个人供体的PBL重复实验并获得了类似的结果。

表2

用编码全长MAGE-A3蛋白或MAGE-A6蛋白(其仅在单个位置(249)上不同)或者编码全长MAGE-A1蛋白质或MAGE-A12蛋白质的DNA构建体(pCDNA3载体)来转染293-CIITA靶细胞。将未转导的和转导的PBL与经转染的293-CIITA细胞共培养并测量干扰素(IFN)γ分泌。结果在图1A、1B和10A中示出。

如图1A、1B和10A中所示，尽管用R12C9 TCR或6F9 TCR转导的T细胞识别经肽脉冲的靶标，但是用6F9 TCR转染的PBL与各MAGE-A3和MAGE-A6 293-CIITA转染子具有最高反应性。用6F9 TCR(而非R12C9 TCR)转导的CD4⁺T细胞识别用编码MAGE-A3或MAGE-A6的基因转染的HLA DP＊0401⁺293-CIITA细胞，而不识别用编码MAGE-A1或MAGE-A12的基因转染的HLADP＊0401⁺293-CIITA细胞。MAGE家族成员的相应区域的氨基酸序列之比较表明MAGE-A3和MAGE-A6仅在一个位置(残基249)上不同，而其他MAGE家族成员与MAGE-A3在两个(MAGE-A12_243-258(SEQ ID NO：70))或三个(MAGE-A1_243-258(SEQ ID NO：71))位置上不同。此外，用6F9TCR(而非R12C9 TCR)转导的CD4⁺T细胞识别MAGE-A3⁺/HLA-DP＊0401⁺黑素瘤细胞系1359mel-CIITA而无法识别MAGE-A3⁺/HLA-DP＊0401^-黑素瘤细胞系624 mel-CIITA。用R12C9 TCR转导的CD4⁺T细胞无法识别任意一个所测试的黑素瘤细胞系。用MART-1反应性TCR DMF5转导的细胞无法识别转染的293-CIITA细胞或经MAGE-A3：_243-258脉冲的靶细胞，但是识别HLA-A＊0201+和MART-1+细胞系624mel-CIITA。使用来自第三个人供体的PBL重复实验并获得了类似的结果。因为6F9 TCR是从Treg克隆中获得的，所述Treg克隆参与免疫活性的抑制，所以6F9 TCR的反应性是令人惊讶且出乎意料的。这些结果表明当用6F9或R12C9转导的CD4⁺T细胞识别经肽脉冲的靶细胞时，只有用6F9 TCR转导的细胞识别经转染的靶细胞以及MAGE-A3⁺和HLA-DP＊04⁺肿瘤细胞。

实施例3

该实施例证明经6F9转导的PBL示出对由HLA-DP4+B细胞加工和呈递的MAGE-A3全长蛋白质的高反应性。

来自两个人供体的PBL是未转导的或者用编码6F9 TCR的核苷酸序列转导的。将所述细胞与已经加工并呈递全长MAGE-A3蛋白质(SEQ ID NO：1)的HLA-DP4+B细胞共培养。结果在表3和图10A中示出。如在表3和图10A中所示，经6F9转导的PBL与由HLA-DP4+B细胞加工并呈递的MAGE-A3全长蛋白质高度反应。

表3

实施例4

该实施例证明了经6F9 TCR转导的PBL与具有MAGE-A3蛋白之内源性II类呈递的肿瘤细胞系(tumor line)有反应性。

来自两个人供体的PBL是未转导的或用编码6F9 TCR或F5 TCR的核苷酸序列转导的。将所述细胞单独培养(仅T细胞)或与624-CHTA细胞、526-CIITA细胞或H1299-CIITA细胞(用CHTA转染的肿瘤细胞系)共培养。结果在表4中示出。如表4中所示，经6F9 TCR转导的PBL与具有MAGE-A3蛋白之内源性II类呈递的肿瘤细胞系(tumor line)有反应性。

表4

实施例5

该实施例证明了6F9 TCR是MAGE-A3特异性的。

来自人供体的PBL是CD4+富集的并且在第27天细胞的数量快速扩增。细胞是未转导的或用F5 TCR或6F9 TCR转导的并且与526-CIITA细胞或H1299-CIITA细胞单独共培养或者与抗MAGE-A3 siRNA或抗MART-1 siRNA共培养。测量IFN-γ分泌。结果在图2A和2B中示出。

如图2A和2B所示，抗MAGE-A3 siRNA降低了经6F9-TCR转导的细胞的反应性。相应地，siRNA敲除测定证实了6F9 TCR是MAGE-A3特异性的。

实施例6

该实施例证明了6F9 TCR以HLA-DP限制性方式识别MAGE-A3。

用CIITA(624-CIITA、526-CIITA、1359-CIITA、H1299-CIITA、1300-CIITA、1764-CIITA、3071-CIITA、397-CIITA、2630-CIITA和2984-CIITA)来转导624、526、1359、H1299、1300、1764、3071、397、2630和2984肿瘤细胞系并且通过流式细胞术来测量HLA-DP表达。DP4和MAGE-A3表达在表5A中示出。

表5A

将经6F9转导的PBL单独培养(仅T细胞)或与3071细胞、3071-CIITA细胞、397细胞、397-CIITA细胞、2630细胞、2630-CIITA细胞、2984细胞和2984-CIITA细胞共培养。测量IFN-γ分泌。结果在图3中示出。如图3所示，经6F9转导的PBL与表达CIITA的肿瘤细胞系有反应性。

通过确定从两个患者PBMC分离的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞针对一系列肿瘤细胞系的反应性来进一步评价6F9 TCR，所述肿瘤细胞系包括624-CIITA、526-CIITA、1359-CIITA、H1299-CIITA、SK37-CIITA、1764-CIITA、3071-CIITA、397-CIITA、2630-CIITA和2984-CIITA。尽管CD4⁺T细胞响应于肿瘤靶标分泌的细胞因子的量比转导的CD8⁺T细胞更高，但是经转导的CD4⁺和CD8⁺T细胞识别表达MAGE-A3和HLA-DP＊0401的5个黑素瘤细胞系(2630-CIITA、397-CIITA、2984-CIITA、526-CIITA和1359-CIITA)以及非小细胞肺癌细胞系H1299NSCLC-CIITA。

用抗HLA-DP或抗HLA-DR siRNA转染H1299-CIITA和526-CIITA细胞以敲低HLA-DP或HLA-DR表达。用抗HLA-DQ siRNA转染3071-CIITA和526-CIITA细胞以敲低HLA-DQ表达。通过流式细胞术来证实HLA-DP、HLA-DR或HLA-DQ敲除。

对来自人供体的PBL进行CD4⁺富集并且在第30天细胞的数量快速扩增。细胞是用6F9 TCR转导的或未转导的。将细胞单独培养(仅T细胞)或与未处理的H1299-CIITA细胞、用抗HLA-DP或抗HLA-DR siRNA转染的H1299-CIITA、未处理的526-CIITA细胞或者用抗HLA-DP或抗HLA-DR siRNA转染的526-CIITA共培养。测量IFN-γ分泌。结果在图4中示出。如图4所示，抗HLA-DP siRNA降低经6F9-TCR转导的细胞的反应性。

利用抗体的进一步研究证实6F9 TCR以HLA-II类限制性方式识别MAGE-A3。将用6F9 TCR转导的PBL与在表5B中所列的细胞共培养并且用表5B所列的抗体阻断。测量IFN-γ，并且将结果列在表5B中。

表5B

如表5B中所示，抗体阻断研究示出6F9 TCR以HLA-II类限制性方式识别MAGE-A3，而非以HLA-DR限制性方式或者以HLA I类限制性方式识别MAGE-A3。

实施例7

该实施例证明了在6F9 TCR的α链第116位或117位处的丙氨酸替换提高了6F9 TCR的反应性。

如表6所列制备了8个不同的经替换的TCR，每一个在6F9 TCR的CDR3区域中不同位置处具有一个丙氨酸替换。

表6

来自人供体的PBL是未转导的或用野生型(wt)6F9 TCR或者表6中的8个经替换的TCR的每一个转导的。将细胞单独培养(仅T细胞)或者与624-CIITA、526-CIITA、1359-CIITA、H1299-CIITA或1764-CIITA共培养。测量IFN-γ分泌。结果在图5中列出。如图5所示，与wt 6F9 TCR相比，a1和a2经替换的TCR证明提高了反应性。

用转导的CD4+富集PBL的单独实验也证实了a1和a2经替换的TCR的优异反应性(图6)。如图6所示，与wt 6F9 TCR相比，a1和a2经替换的TCR示出约2倍的抗肿瘤活性提高。如通过流式细胞术所测量的，与wt 6F9 TCR相比，a1和a2经替换的TCR还示出更好的四聚体(SEQID NO：2)结合。

实施例8

该实施例阐释了经替换的6F9 TCR的反应性。

如表7所列制备了8个不同的经替换的TCR，每一个在6F9 TCR的α链的CDR3区域中不同位置处具有一个氨基酸替换。

表7

来自人供体的PBL是未转导的或用野生型(wt)6F9 TCR或者8个经替换TCR的每一个转导的。将细胞单独培养(仅T细胞)或者与624-CIITA、526-CIITA、1359-CIITA、H1299-CIITA或1764-CIITA共培养。测量IFN-γ分泌。结果在图7中列出。如图7所示，a1、a2和a1-3经替换的TCR证明了针对CIITA-肿瘤细胞系的反应性。

实施例9

该实施例证明用鼠恒定区替代6F9 TCR的天然恒定区提高了6F9 TCR的反应性。

制备了TCR，其包含wt 6F9 TCR的α链和β链的可变区以及鼠恒定区(6F9mC TCR)(SEQ ID NO：27和28)。

如通过流式细胞术所测量的，与wt 6F9 TCR相比，6F9mC TCR证明了更好的MAGE-A3四聚体和Vβ染色。不受限于特定理论，认为6F9mC TCR提供了TCRα链和β链的改进的配对。

来自人供体的PBL是未转导的或者用wt 6F9 TCR或6F9mC TCR转导的并且将其单独培养(仅T细胞)或者与624-CIITA、1300-CIITA、526-CIITA、1359-CIITA、H1299-CIITA、397-CIITA、2630-CIITA、2984-CIITA、3071-CIITA或1764-CIITA细胞共培养。测量IFN-γ分泌。结果在图8中示出。如图8中所示，与wt 6F9 TCR转导的细胞相比，6F9mC转导的细胞示出2倍至5倍的抗肿瘤活性提高。

对未转导的细胞、6F9TCR转导的细胞或6F9mC TCR转导的细胞进行CD8或CD4富集并且将其单独培养(仅T细胞)或者与624-CIITA、SK37-CIITA、526-CIITA、1359-CIITA、H1299-CIITA、397-CIITA、2630-CIITA、2984-CIITA、3071-CIITA或1764-CIITA细胞共培养。测量干扰素-γ分泌。结果在图9A和9B中示出。如图9A和9B所示，针对若干个细胞系，与6F9TCR转导的细胞相比，CD8和CD4富集的6F9mC转导的细胞保持更高的抗肿瘤活性，表明6F9mCTCR的高亲和力不依赖于协同受体。使用来自第二个人供体的PBL重复实验并获得了类似的结果。用野生型(Wt)6F9 TCR转导的CD4⁺T细胞的响应与用6F9mc TCR转导的细胞的响应之比较表明鼠恒定区导致转导的T细胞针对所评估的7个MAGE-A3⁺和HLA-DP＊0401⁺靶标的响应增强2倍至5倍。此外，用6F9mc转导的CD8⁺T细胞的响应比用wt 6F9 TCR转导的细胞中所见的响应增强了2倍至10倍。尽管观察到响应于一些肿瘤靶标的相当的细胞因子响应，但是用6F9mc转导的CD8⁺T细胞的响应通常比用该TCR转导的CD4⁺T细胞的响应要低。

实施例10

该实施例证明当肿瘤刺激时，6F9mC TCR转导的细胞产生高水平的IFN-γ和TNF-α并且示出高度活化的表型(如通过增加的4-1BB、CD25和CD69表达所测量的)。

细胞是CD4或CD8富集的并且用6F9mC TCR转导的。将转导的细胞与肿瘤细胞系624-CIITA、2630-CIITA、2984-CIITA或Whitington-CIITA共培养6个小时，然后针对细胞内的IFN-γ、白介素(IL)-2或肿瘤坏死因子(TNF)-α进行染色。当肿瘤刺激时，6F9mC TCR转导的细胞示出特异性细胞内IFN-γ产生。当肿瘤刺激时，在CD4富集的级分中，6F9mC TCR转导的细胞示出可检测的IL-2产生以及特异性的高TNF-α产生。

细胞是CD4富集的并且用6F9mC TCR转导的。将转导的细胞与肿瘤细胞系624-CIITA、2630-CIITA、2984-CIITA或Whitington-CIITA共培养过夜，然后针对4-1BB、CD25和CD69进行染色。在过夜肿瘤刺激之后，大多数6F9mC TCR转导的细胞表达了高水平的4-1BB(指示抗原特异性活化)、CD25和CD69。

实施例11

该实施例证明了6F9 TCR介导肿瘤细胞识别。

PBL是未转导的或用野生型6F9 TCR转导的并且将其单独培养或者与非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系H11299或黑素瘤细胞系526mel、624mel或1359mel共培养。MAGE-A3和DP＊04表达在表8中示出。

表8

测量IFN-γ表达。结果在图10B中示出。如图10B中所示，6F9 TCR介导肿瘤细胞识别。

实施例12

该实施例证明6F9 TCR和6F9mc TCR对于MAGE-A3：_248-258肽具有高度特异性。

为了评估通过用6F9 TCR和6F9mc TCR转导的细胞介导的抗原识别之优良的特异性，用截短的MAGE-A3：_243-258肽或来自MAGE家族成员的相关肽来脉冲HLA-DP＊0401⁺靶细胞。通过阴性选择从两个患者的PBMC(PBMC-1或PBMC-2)中分离的CD4+T细胞是用6F9 TCR或6F9mc TCR转导的或者是未转导的并且在OKT3刺激之后第10天测定其对293-CHTA细胞的响应，所述293-CIITA细胞用10mg/ml表9中所示的肽脉冲。

对来自经转导CD4⁺PBMC的两个培养物的截短的MAGE-A3肽之响应的分析表明对应于MAGE-A3蛋白质的第248位至第258位氨基酸的11聚体(mer)肽QHFVQENYLEY(SEQ ID NO：54)代表了引出与由MAGE-A3：_243-258肽所引出之响应相当的响应的最小肽(表9)。使用表位预测算法预测MAGE-A3：_243-258肽对于HLA-DP＊0401具有高亲和力，并且此外，截短的MAGE-A3肽的识别表现出与T细胞识别相关(表9)。观察到对于在249位上含酪氨酸单替换组氨酸之MAGE-A6：_248-258肽的显著识别，但是观察到针对与MAGE-A3：_248-258肽具有2个至5个差别之基因产物的MAGE家族另外成员的最低反应性。NCBI数据库的BLAST搜索发现最密切相关的肽来源于蛋白质神经细胞生长抑制因子(necdin)。该肽也无法被用6F9 TCR或6F9mc TCR转导的T细胞识别，所述肽与MAGE-A3：_248-258肽具有5个差别。这些发现表明6F9 TCR对于MAGE-A3：_248-258肽具有高度特异性，并且表明用该TCR转导的T细胞可与来源于另外的人蛋白质的肽具有很少交叉反应性或没有交叉反应性。

所有参考文件，包括本文中引用的出版物、专利申请以及专利均通过引用并入本文，这等同于单独且明确地表明每份参考文件均通过引用并入并且在本文中以其整体进行阐述的那样。

除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(特别在后面权利要求上下文中)所使用的无数量词修饰名词以及术语“所述(the)”和“至少一个”以及类似的指代词应解释为涵盖单数和复数两者。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则在一个或更多个项目的列表之前所使用的术语“至少一个”(例如，“A和B的至少一个”)应解释为意指选自所列项目的一个项目(A或B)或者两个或更多个所列项目的任意组合(A和B)。除非另外指出，否则术语“包含(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”和“含有(containing)”应解释为开放式术语(即，意指“包括，但不限于”)。除非本文另外指出，否则本文对数值范围的叙述仅仅旨在用作单独指代落入范围内的各独立数值的一种速记方法，并且各独立数值包含在说明书内，如同其在本文中单独叙述一样。除非本文另有说明或另与上下文明显矛盾，否则可以任意合适的顺序进行本文所述的所有方法。除非另外要求保护，否则本文所提供的任意或所有实施例或者示例性语言(例如，“例如”)的使用仅仅旨在更好地说明本发明而不提出对本发明范围的限制。说明书中任何语言均不应解释为将任何未要求保护的要素表示对实施本发明是必要的。

本文描述了本发明的优选实施方案，包括本发明人已知的进行本发明的最佳方式。通过阅读前述说明书，那些优选的实施方案的变体对于本领域技术人员来说会变得明显。本发明人预期本领域技术人员适当使用这些变体，并且本发明人意图使本发明以并不限于本文具体描述的另外方式实施。因此，本发明包括本文所附权利要求中所述的主题的所有修改和等同方案，如适用的法律所允许的。此外，除非本文另有说明或另与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述要素以其所有可能的变体的任意组合。

本申请母案的原始权利要求在此并入，作为本说明书的一部分。具体如下。

1.分离或纯化的T细胞受体(TCR)，其对MAGE-A3_243-258和MAGE-A6具有抗原特异性。

2.包含(a)SEQ ID NO：3至8、(b)SEQ ID NO：21至22或者(a)或(b)的功能变体的分离或纯化的TCR，其中所述功能变体包含在(a)的任意一个或更多个或者(b)的任意一个或更多个中具有至少一个氨基酸替换的(a)或(b)，并且所述功能变体在HLA-DPβ1＊04的背景下对MAGE-A3具有抗原特异性。

3.根据权利要求2所述的分离或纯化的TCR或者功能变体，其包含：

(i)SEQ ID NO：29，其中

Xaa4是Ser、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa5是Ser、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa6是Gly、Ala、Leu、Ile、Val或Met；并且

Xaa7是Thr、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

和/或(ii)SEQ ID NO：30，其中

Xaa4是Arg、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa5是Thr、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa6是Gly、Ala、Leu、Ile、Val或Met；并且

Xaa7是Pro、Ala、Leu、Ile、Val或Met。

4.根据权利要求3所述的功能变体，其包含(a)SEQ ID NO：29，其中Xaa4是Ala，Xaa5是Ser，Xaa6是Gly且Xaa7是Thr；或者(b)SEQ ID NO：29，其中Xaa4是Ser，Xaa5是Ala，Xaa6是Gly且Xaa7是Thr。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的分离或纯化的TCR或者功能变体，其包含鼠恒定区。

6.根据权利要求5所述的分离或纯化的TCR或者功能变体，其包含含有SEQ ID NO：25和/或SEQ ID NO：26的鼠恒定区。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的分离或纯化的TCR或者功能变体，其包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列，

所述第一氨基酸序列选自：

(i)SEQ ID NO：31，其中

Xaa116是Ser、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa117是Ser、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa118是Gly、Ala、Leu、Ile、Val或Met；并且

Xaa119是Thr、Ala、Leu、Ile、Val或Met；和

(ii)SEQ ID NO：9；

所述第二氨基酸序列选自：

(i)SEQ ID NO：32，其中

Xaa115是Arg、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa116是Thr、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa117是Gly、Ala、Leu、Ile、Val或Met；并且

Xaa118是Pro、Ala、Leu、Ile、Val或Met；和

(ii)SEQ ID NO：10。

8.根据权利要求7所述的功能变体，其包含

(a)SEQ ID NO：31，其中Xaa116是Ala，Xaa117是Ser，Xaa118是Gly且Xaa119是Thr；或者

(b)SEQ ID NO：31，其中Xaa116是Ser，Xaa117是Ala，Xaa118是Gly且Xaa119是Thr。

9.根据权利要求2至8中任一项所述的分离或纯化的TCR或者功能变体，其包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列，

所述第一氨基酸序列选自：

(i)SEQ ID NO：33，其中

Xaa116是Ser、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa117是Ser、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa118是Gly、Ala、Leu、Ile、Val或Met；并且

Xaa119是Thr、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

(ii)SEQ ID NO：11；

(iii)SEQ ID NO：21；和

(iV)SEQ ID NO：27；

所述第二氨基酸序列选自：

(i)SEQ ID NO：34，其中

Xaa115是Arg、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa116是Thr、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa117是Gly、Ala、Leu、Ile、Val或Met；并且

Xaa118是Pro、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

(ii)SEQ ID NO：12；

(iii)SEQ ID NO：22；和

(iv)SEQ ID NO：28。

10.根据权利要求9所述的功能变体，其包含：

(a)SEQ ID NO：33，其中Xaa116是Ala，Xaa117是Ser，Xaa118是Gly且Xaa119是Thr；或者

(b)SEQ ID NO：33，其中Xaa116是Ser，Xaa117是Ala，Xaa118是Gly且Xaa119是Thr。

11.分离或纯化的多肽，其包含权利要求1至10中任一项所述的TCR或功能变体的功能部分，其中所述功能部分包含：

(a)SEQ ID NO：3、4、6、7，

(i)SEQ ID NO：29，其中，

Xaa4是Ser、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa5是Ser、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa6是Gly、Ala、Leu、Ile、Val或Met；并且

Xaa7是Thr、Ala、Leu、Ile、Val或Met；以及

(ii)SEQ ID NO：30，其中

Xaa4是Arg、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa5是Thr、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa6是Gly、Ala、Leu、Ile、Val或Met；并且

Xaa7是Pro、Ala、Leu、IIe、Val或Met；或者

(b)SEQ ID NO：3至8。

12.权利要求11所述的分离或纯化的多肽，其中所述功能部分包含：

(a)SEQ ID NO：29，其中Xaa4是Ala，Xaa5是Ser，Xaa6是Gly且Xaa7是Thr；或者

(b)SEQ ID NO：29，其中Xaa4是Ser，Xaa5是Ala，Xaa6是Gly且Xaa7是Thr。

13.权利要求11或12所述的分离或纯化的多肽，其中所述部分包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列，

所述第一氨基酸序列选自：

(i)SEQ ID NO：31，其中

Xaa116是Ser、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa117是Ser、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa118是Gly、Ala、Leu、Ile、Val或Met；并且

Xaa119是Thr、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

(ii)SEQ ID NO：9；

所述第二氨基酸序列选自：

(i)SEQ ID NO：32，其中

Xaa115是Arg、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa116是Thr、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa117是Gly、Ala、Leu、Ile、Val或Met；并且

Xaa118是Pro、Ala、Leu、Ile、Val或Met；和

(ii)SEQ ID NO：10。

14.权利要求13所述的分离或纯化的多肽，其中所述部分包含：

(a)SEQ ID NO：31，其中Xaa116是Ala，Xaa117是Ser，Xaa118是Gly且Xaa119是Thr；或者

(b)SEQ ID NO：31，其中Xaa116是Ser，Xaa117是Ala，Xaa118是Gly且Xaa119是Thr。

15.分离或纯化的多肽，其包含权利要求2至10中任一项所述的TCR或功能变体的功能部分，其中所述部分包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列：

所述第一氨基酸序列选自：

(i)SEQ ID NO：33，其中，

Xaa116是Ser、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa117是Ser、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa118是Gly、Ala、Leu、Ile、Val或Met；并且

Xaa119是Thr、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

(ii)SEQ ID NO：11；

(iii)SEQ ID NO：21；和

(iv)SEQ ID NO：27；

所述第二氨基酸序列选自：

(i)SEQ ID NO：34，其中，

Xaa115是Arg、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa116是Thr、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa117是Gly、Ala、Leu、Ile、Val或Met；并且

Xaa118是Pro、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

(ii)SEQ ID NO：12；

(iii)SEQ ID NO：22；和

(iv)SEQ ID NO：28。

16.权利要求15所述的分离或纯化的多肽，其中所述部分包含：

(a)SEQ ID NO：33，其中Xaa116是Ala，Xaa117是Ser，Xaa118是Gly且Xaa119是Thr；或者

(b)SEQ ID NO：33，其中Xaa116是Ser，Xaa117是Ala，Xaa118是Gly且Xaa119是Thr。

17.分离或纯化的蛋白质，其包含至少一种权利要求11至16中任一项所述的多肽。

18.根据权利要求17所述的分离或纯化的蛋白质，其包含第一多肽链和第二多肽链，

所述第一多肽链包含：

(a)SEQ ID NO：3至5；或者

(b)SEQ ID NO：3、4和SEQ ID NO：29，其中

Xaa4是Ser、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa5是Ser、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa6是Gly、Ala、Leu、Ile、Val或Met；并且

Xaa7是Thr、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

所述第二多肽链包含：

(a)SEQ ID NO：6至8；或者

(b)SEQ ID NO：6、7和SEQ ID NO：30，其中

Xaa4是Arg、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa5是Thr、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa6是Gly、Ala、Leu、Ile、Val或Met；并且

Xaa7是Pro、Ala、Leu、Ile、Val或Met。

19.权利要求18所述的蛋白质，其中所述第一多肽链包含：

(a)SEQ ID NO：29，其中Xaa4是Ala，Xaa5是Ser，Xaa6是Gly且Xaa7是Thr；或者

(b)SEQ ID NO：29，其中Xaa4是Ser，Xaa5是Ala，Xaa6是Gly且Xaa7是Thr。

20.根据权利要求17至19中任一项所述的分离或纯化的蛋白质，其包含第一多肽链和第二多肽链，

所述第一多肽链包含选自以下的氨基酸序列：

(i)SEQ ID NO：31，其中

Xaa116是Ser、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa117是Ser、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa118是Gly、Ala、Leu、Ile、Val或Met；并且

Xaa119是Thr、Ala、Leu、Ile、Val或Met；和

(ii)SEQ ID NO：9；

所述第二多肽链包含选自以下的氨基酸序列：

(i)SEQ ID No：32，其中

Xaa115是Arg、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa116是Thr、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa117是Gly、Ala、Leu、Ile、Val或Met；并且

Xaa118是Pro、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

和(ii)SEQ ID No：10。

21.权利要求20所述的蛋白质，其中所述第一多肽链包含：

(a)SEQ ID NO：31，其中Xaa116是Ala，Xaa117是Ser，Xaa118是Gly且Xaa119是Thr；或者

(b)SEQ ID NO：31，其中Xaa116是Ser、Xaa117是Ala、Xaa118是Gly且Xaa119是Thr。

22.分离或纯化的蛋白质，其包含第一多肽链和第二多肽链，

所述第一多肽链包含选自以下的氨基酸序列：

(i)SEQ ID NO：33，其中，

Xaa116是Ser、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa117是Ser、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa118是Gly、Ala、Leu、Ile、Val或Met；并且

Xaa119是Thr、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

(ii)SEQ ID NO：11；

(iii)SEQ ID No：21；和

(iv)SEQ ID NO：27；

所述第二多肽链包含选自以下的氨基酸序列：

(i)SEQ ID No：34，其中，

Xaa115是Arg、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa116是Thr、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa117是Gly、Ala、Leu、Ile、Val或Met；并且

Xaa118是Pro、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

(ii)SEQ ID NO：12；

(iii)SEQ ID NO：22；和

(iv)SEQ ID NO：28。

23.权利要求22所述的蛋白质，其中所述第一多肽链包含：

(a)SEQ ID NO：33，其中Xaa116是Ala，Xaa117是Ser，Xaa118是Gly且Xaa119是Thr；或者

(b)SEQ ID NO：33，其中Xaa116是Ser、Xaa117是Ala、Xaa118是Gly且Xaa119是Thr。

24.权利要求17至23中任一项所述的分离或纯化的蛋白质，其中所述蛋白质是融合蛋白。

25.权利要求17至24中任一项所述的分离或纯化的蛋白质，其中所述蛋白质是重组抗体。

26.分离或纯化的核酸，其包含编码根据权利要求1至10中任一项所述的TCR或功能变体、根据权利要求11至16中任一项所述的多肽或根据权利要求17至25中任一项所述的蛋白质的核苷酸序列。

27.根据权利要求26所述的分离或纯化的核酸，其中所述核苷酸序列包含选自以下的核苷酸序列：a)SEQ ID NO：37和38、b)SEQ ID NO：39和40、c)SEQ ID NO：41和42以及d)SEQ ID NO：43和44。

28.重组表达载体，其包含根据权利要求26或27所述的核酸。

29.分离的宿主细胞，其包含权利要求28所述的重组表达载体。

30.根据权利要求29所述的宿主细胞，其中所述细胞是人的。

31.细胞群，其包含至少一种权利要求29或30所述的宿主细胞。

32.抗体或其抗原结合部分，其与根据权利要求1至10中任一项所述的TCR或功能变体的功能部分特异性结合，其中所述功能部分包含：

(a)SEQ ID NO：3、4、6、7，

(i)SEQ ID NO：29，其中

Xaa4是Ser、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa5是Ser、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa6是Gly、Ala、Leu、Ile、Val或Met；并且

Xaa7是Thr、Ala、Leu、Ile、Val或Met；以及

(ii)SEQ ID NO：30，其中

Xaa4是Arg、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa5是Thr、Ala、Leu、Ile、Val或Met；

Xaa6是Gly、Ala、Leu、Ile、Val或Met；并且

Xaa7是Pro、Ala、Leu、Ile、Val或Met；或者

(b)SEQ ID NO：3至8。

33.药物组合物，其包含可药用载体以及根据权利要求1中10中任一项所述的TCR或功能变体、根据权利要求11至16中任一项所述的多肽、根据权利要求17至25中任一项所述的蛋白质、权利要求26至27所述的核酸、权利要求28所述的重组表达载体、权利要求29或30所述的宿主细胞、权利要求31所述的细胞群或者权利要求32所述的抗体或其抗原结合部分。

34.一种在哺乳动物中检测癌症存在的方法，其包括：

(a)使包含来自所述哺乳动物的一种或更多种细胞的样品与以下物质相接触，从而形成复合物：根据权利要求1至10中任一项所述的TCR或功能变体、根据权利要求11至16中任一项所述的多肽、根据权利要求17至25中任一项所述的蛋白质、权利要求26至27所述的核酸、权利要求28所述的重组表达载体、权利要求29或30所述的宿主细胞、权利要求31所述的细胞群或者权利要求32所述的抗体或其抗原结合部分或者权利要求33所述的药物组合物；以及

(b)检测所述复合物，其中检测到所述复合物指示在所述哺乳动物中存在癌症。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述癌症是黑素瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、滑膜细胞肉瘤、头颈癌、食管癌或卵巢癌。

36.根据权利要求1至10中任一项所述的TCR或功能变体、根据权利要求11至16中任一项所述的多肽、根据权利要求17至25中任一项所述的蛋白质、权利要求26至27所述的核酸、权利要求28所述的重组表达载体、权利要求29或30所述的宿主细胞、权利要求31所述的细胞群、权利要求32所述的抗体或其抗原结合部分或者权利要求33所述的药物组合物，其用于在哺乳动物中治疗或预防癌症。

37.用于权利要求36所述用途的TCR或功能变体、多肽、蛋白质、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群、抗体或其抗原结合部分或者药物组合物，其中所述癌症是黑素瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、滑膜细胞肉瘤、头颈癌、食管癌或卵巢癌。