一种草鱼C5aR蛋白合成肽及其多克隆抗体
阅读说明：本技术 一种草鱼C5aR蛋白合成肽及其多克隆抗体 (Synthetic peptide of grass carp C5aR protein and polyclonal antibody thereof ) 是由 苏杭 许宝红 刘巧林 肖调义 江石峰 蒋海鹏 严海亮 于 2021-04-28 设计创作，主要内容包括：一种草鱼C5aR蛋白合成肽及其多克隆抗体,是利用DNA star软件综合分析C5aR序列的特点,确定以N端起包含第2-20位氨基酸运用Fmoc法化学合成SEQ ID NO.2所示的多肽,经纯化后,将多肽疏基偶联到载体蛋白KLH上,形成C5aR-KLH偶联物以作为多肽抗原,多次免疫实验级日本大耳白兔得到浓缩的草鱼C5aR蛋白合成肽多克隆抗体。通过本方法能得到满足后续实验需求的浓缩草鱼C5aR多克隆抗体,能用于草鱼C5aR蛋白表达检测,为C5aR蛋白功能及作用机制的研究奠定重要的材料基础。(A synthetic peptide of grass carp C5aR protein and its polyclonal antibody are characterized by that it utilizes DNA star software to comprehensively analyze C5aR sequence, and utilizes Fmoc method to chemically synthesize the polypeptide shown by SEQ ID No.2 containing 2-20 th amino acids from N end, and after the polypeptide is purified, the polypeptide sulfhydryl is coupled on carrier protein KLH to form C5aR-KLH conjugate as polypeptide antigen, and can make several times of immunity of experimental-grade Japanese white rabbit to obtain concentrated synthetic peptide polyclonal antibody of grass carp C5aR protein. The concentrated grass carp C5aR polyclonal antibody meeting the requirements of subsequent experiments can be obtained by the method, can be used for grass carp C5aR protein expression detection, and lays an important material foundation for the research of C5aR protein functions and action mechanisms.)
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及草鱼C5aR蛋白合成肽，同时涉及将该合成肽与载体蛋白KLH偶联所得的偶联物为抗原制备的多克隆抗体。
背景技术
C5aR是一个G蛋白偶联的受体，又称CD88，是具有7个跨膜结构域的G蛋白偶联受体家族成员之一，天然表达于多种细胞的膜上，主要表达在中性粒细胞，肥大细胞及巨噬细胞上。它的天然表达形式与它所介导的生物学功能有着密切的关系。C5aR在组织炎症反应中扮演着重要角色，C5aR与其配体结合介导后会导致细胞内钙离子增加和细胞内信号级联反应，从而发挥多种生物学作用，如：刺激中性粒细胞和单核巨噬细胞等髓系来源细胞释放组胺和溶酶体酶，诱导平滑肌收缩，增强血管通透性，介导中性粒细胞和单核细胞等炎性细胞向炎症部位聚集，促进内皮细胞表达黏附分子等，另外还有通过诱导或抑制单核细胞细胞因子的释放起免疫调节作用。
草鱼（Ctenopharyngodonidella）是我国产量最大的淡水鱼养殖品种，草鱼呼长孤病毒（Grass carp reovirus, GCRV）所引起的草鱼出血病严重制约了草鱼的健康养殖。草鱼出血病中炎症因子大量表达，但草鱼体内C5aR与其配体所调控的炎症机制尚未清楚且C5aR在草鱼体内发挥的生物学功能尚未明晰。鉴于C5aR在草鱼出血病中的研究缺陷，获得草鱼C5aR蛋白合成肽及其多克隆抗体，为以后继续探讨C5aR的生物学功能以及开发应用具有很大的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，针对上述现有技术中实验材料的欠缺，提供一种草鱼C5aR蛋白合成肽及其多克隆抗体，利用本方法从草鱼C5aR蛋白序列开始分析，构建能够得到符合后续检测要求的草鱼C5aR蛋白合成肽多克隆抗体，为C5aR蛋白功能及作用机制的研究奠定重要的材料基础。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种草鱼C5aR蛋白合成肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明同时提供一种抗原，其是由上述的草鱼C5aR蛋白合成肽与载体蛋白KLH偶联得到。
本发明还提供一种多克隆抗体，是以上述的抗原免疫动物后得到。
上述提及的多克隆抗体的具体制备步骤如下：
（1）根据SEQ ID NO.1所示的草鱼C5aR蛋白全序列，利用DNA star软件综合分析C5aR序列的特点，确定如SEQ ID NO.2所示的草鱼C5aR蛋白合成肽序列；
（2）将草鱼C5aR蛋白合成肽与载体蛋白KLH偶联得到抗原；
（3）利用抗原免疫动物。
上述步骤（1）中草鱼C5aR蛋白合成肽序列是位于SEQ ID NO.1所示的草鱼C5aR蛋白全序列outside区第2-20位氨基酸。
上述步骤（3）中的动物为实验级日本大耳白兔。
本发明的有益效果在于：得到满足后续实验需求的浓缩草鱼C5aR多克隆抗体，能用于草鱼C5aR蛋白表达检测，并为C5aR蛋白功能及作用机制的研究奠定重要的材料基础。
附图说明
图1是本发明草鱼C5aR蛋白的抗原表位预测分析结果图；
表明：目的蛋白是七跨膜蛋白，表达难度极大，不适宜表达路线制备抗原，选择合成多肽制备抗原为最佳方式。
图2是本发明草鱼C5aR蛋白的跨膜结构域分析结果图；
表明：2-20aa区段为蛋白N端且位于outside区，暴露性较好，特异性、免疫原性和亲水性均较好，适合C5aR蛋白合成肽抗体的制备。
图3是抗血清ELISA检测数据；
其中：多肽包被量为100ng，抗体稀释比例为1：1000，1：5000，1：10000，1：50000，1：100000，1：200000。
图4是本发明抗原WB检测结果；
其中：多肽包被量为100ng，抗体稀释比例为1：1000，1：5000，1：10000，1：50000，1：100000，1：200000。
图5是使用本发明的草鱼C5aR多克隆抗体对健康草鱼不同器官或组织进行Western Blot杂交结果图。
图6是使用本发明得到的草鱼C5aR多克隆抗体对患有出血病的草鱼肝脏中C5aR表达情况的Western Blot检测结果；
其中：β-actin为内参蛋白；A、B、C、D、E、F分别表示草鱼感染出血病病毒开始、12个小时、第1阶段、第3阶段、第7阶段和第10阶段；第1阶段表示开始发病，第3阶段表示发病进入严重阶段，第7阶段表示发病进入恢复阶段，第10阶段表示已痊愈。
具体实施方式
以下实施是对本发明的进一步说明和解释，而不是对本发明的限制。
实施例1 C5aR蛋白合成肽的设计
从NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）GenBank数据库中检索到SEQ IDNO.1所示的草鱼C5aR蛋白序列，利用DNA star软件根据抗原指数、亲水性结构、柔韧区及表面概率结构4个参数及特异性、合成难易程度等方面综合分析C5aR序列的特点，确定合成的肽序列为从N端起包含第2-20位氨基酸，其序列为SEQ ID NO.2所示，请结合参见图1及图2。
实施例2 C5aR蛋白N端多肽的合成及抗原
C5aR蛋白N端多肽由美国CME公司的Liberty全自动多肽合成仪合成。化学合成采用Fmoc方法，从C端向N端合成，合成纯度为98%。将合成完成的多肽（C5aR蛋白合成肽）溶解于8M尿素-PBS缓冲溶液中，疏基偶联到载体蛋白KLH上，形成C5aR-KLH偶联物，以作为制备多克隆抗体的抗原。
实施例3 C5aR蛋白合成肽多克隆抗体的制备
第一次免疫取350μgC5aR-KLH偶联物与等量的完全福氏佐剂充分乳化后，于实验级日本大耳白兔颈部和背部皮下多点注射，每点约100 μg；12天后进行第二次免疫，使用不完全弗氏佐剂与C5aR-KLH偶联物混合，剂量为0.35 mg；第一次免疫26天后进行第三次免疫，使用不完全弗氏佐剂与C5aR-KLH偶联物混合，剂量为0.35 mg；第一次免疫40天后进行第四次免疫，使用不完全弗氏佐剂与C5aR-KLH偶联物混合，剂量为0.35 mg；第一次免疫54天后进行第五次免疫，使用不完全弗氏佐剂与C5aR-KLH偶联物混合，剂量为0.35 mg。免疫日本大耳白兔的采血时间为第一次免疫后66天，对日本大耳白兔颈动脉采血，分离血清后，在超低温冰箱（Thermo Fisher Scientific，美国）中保存备用。对分离得到的血清进行抗血清ELISA检测，结果显示抗血清在1:1000、1:5000以及1:10000稀释后仍能通过ELISA检测到，结合参见图3。
实施例4 抗体血清的亲和纯化
称取10mg前述合成的多肽，用2ml偶联Buffer（50mM tris, 5Mm EDTA-NA）溶解，取2ml Sulfolinkcouping gel（Thermo，美国）于层析柱中，将抗原加入层析柱于旋转培养器上旋转3小时，静置在层析架上30分钟，连接恒流泵。40ml 1×PBS流速2.0，30ml 1×Gly，30ml 1×PBS将柱子内环境平衡到中性；样品中加入1/20的4M氯化钠，流速1.5，过柱两遍；加入40ml Wash buffer（1×PBS 320mM氯化钠），加入1×Gly流速0.6，收集样品。收集完之后，加入过量的酸将抗体洗脱干净，再用1×PBS平衡到中性将收集的抗体放入透析袋中，混匀之后取30微升左右用于抗体浓度测定其余放入1×PBS50%甘油中透析浓缩过夜。分别得到浓度为1.29 mg/ml和1.83 mg/ml的浓缩草鱼C5aR多克隆抗体，抗原westernblot结果显示抗体在稀释1:1000、1:5000以及1:10000的情况下能够被检测得到，结合参见图4。
实施例5多克隆抗体的Western blot分析
为了验证得到的草鱼C5aR蛋白合成肽多克隆抗体是否能够用于后续WesternBlot实验，我们利用得到的草鱼C5aR蛋白合成肽多克隆抗体检测草鱼C5aR在健康草鱼肝、脾、肾、头肾、肠、鳃和肌肉中的表达情况，以及在患有出血病的草鱼肝脏中不同发病时间点的表达情况，每组实验采集了三条草鱼样本。首先从各检测器官或组织分别剪取0.1 g组织，加入到装有1 ml RIPA裂解液、10μl蛋白酶抑制剂和2颗无菌钢珠的匀浆管中，使用冷冻混合球磨仪进行研磨，均质速度55 Hz，1650r/s，研磨结束后置于裂解10分钟，然后4℃、12000 rpm离心15分钟，将离心后的上清分装转移至1.5 ml离心管中用于后续实验。根据每个样品总蛋白量，按照上样量20 μg点样至分离胶浓度为15%的PAGE胶中100V电泳至溴酚蓝到胶底部止。然后将草鱼过敏性毒素C5a蛋白（8 kD）进行转膜。用1×PBST缓冲液清洗3次，每次脱色摇床摇10 min。加适量封闭液，在脱色摇床上封闭15 min。将膜加到多槽盒内，加入草鱼过敏性毒素C5a多克隆抗体稀释液（用封闭液按1：1000的比例稀释），将膜与抗体一起孵育，4℃过夜。孵育结束后，用1×PBST缓冲液洗涤3次，每次洗涤10 min。将HRP标记的二抗稀释液（用封闭液按1：2000的比例稀释），将稀释后的二抗与膜共同孵育60 min，然后用1×PBST缓冲液洗涤3次，每次洗涤10 min。最后将显色A液与B液（Thermo）等体积混合，避光，每张膜加200μL，放置1-2 min。将膜放置到荧光成像仪中，观察并拍照。结果显示，健康草鱼不同组织草鱼C5aR表达结果如图5所示，表明不同组织中C5aR的蛋白表达存在明显差异，其中C5aR蛋白主要在肝脏中表达，且与其他六个组织存在显著性差异（P＜0.05）。草鱼C5aR在患有出血病的草鱼肝脏中不同发病时间点的表达结果如图6所示，GCRV感染后，C5aR的蛋白表达在草鱼肝脏中呈现出阶梯式的持续性上升。感染初期和潜伏期处于同一水平，病发期和死亡期处于同一水平，恢复期和痊愈期处于同一水平。以上结果验证了通过本发明描述的方法能够得到用于草鱼C5aR表达检测的浓缩草鱼C5aR蛋白合成肽多克隆抗体。
序列表
<110> 湖南农业大学
<120> 一种草鱼C5aR蛋白合成肽及其多克隆抗体
<130> 0003
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 358
<212> PRT
<213> 合成()
<400> 1
Met Glu Gly Asp Tyr Leu Asp Tyr Gly Pro Phe Asp Phe Ser Asn Glu
1 5 10 15
Ser Tyr Ser Cys Glu Asp Pro Glu Asn Cys Thr Asp Ile Glu Phe Pro
20 25 30
Asn Glu Ile Leu Met Ser Glu Ile Gly Leu Arg His Trp Ile Ala Leu
35 40 45
Val Cys Tyr Ser Ile Val Phe Leu Leu Gly Val Pro Gly Asn Gly Leu
50 55 60
Val Val Trp Val Thr Ala Phe Arg Met Pro Asn Ser Val Asn Ala Gln
65 70 75 80
Trp Phe Leu Asn Leu Ala Ile Ala Asp Leu Leu Cys Cys Leu Ser Leu
85 90 95
Pro Phe Leu Met Val Ser Leu Ala Gln Asp Lys His Trp Pro Phe Gly
100 105 110
Asp Leu Ala Cys Lys Leu Leu Ser Gly Leu Phe Tyr Met Met Met Tyr
115 120 125
Cys Ser Val Leu Leu Leu Val Val Ile Ser Leu Asp Arg Phe Leu Leu
130 135 140
Val Thr Lys Pro Val Trp Cys Gln Asn His Arg His Pro Arg Gln Ala
145 150 155 160
Arg Cys Val Cys Phe Phe Val Trp Ile Leu Ala Leu Leu Gly Gly Ser
165 170 175
Pro Gln Phe Ala His Met Glu Thr Arg Arg Asp Glu Thr Lys Thr Leu
180 185 190
Cys Asn Ser Ala Tyr Asn Ser Phe Gly His Ala Trp Ala Val Thr Leu
195 200 205
Thr Arg Ser Phe Leu Ser Phe Leu Leu Pro Phe Leu Ile Ile Cys Gly
210 215 220
Ser His Trp Met Val Tyr Arg Thr Met Ser Ser Gly Arg Gly Gln Arg
225 230 235 240
Arg Ser Asp Lys Ser Ala Arg Thr Leu Arg Val Ile Leu Ala Leu Val
245 250 255
Leu Ser Phe Phe Leu Cys Trp Ser Pro Leu Gln Ile Val Asp Leu Leu
260 265 270
Glu Leu Ile Leu Tyr Glu Gln Ser Glu Ser Leu Arg Ala Asn Val Arg
275 280 285
Leu Ala His Val Leu Thr Leu Cys Leu Ala Tyr Ile Asn Ser Cys Leu
290 295 300
Asn Pro Leu Leu Tyr Val Cys Leu Gly Arg Gly Phe Lys Lys Asn Leu
305 310 315 320
Val Ser Ser Leu Arg Ser Val Leu His Phe Ala Ser Glu Ala Pro Thr
325 330 335
Asn Arg Thr Ser Met Thr Ala Asn Ser Lys Ser Thr Thr Asp Gly Met
340 345 350
Phe Arg Glu Lys Pro Val
355
<210> 2
<211> 19
<212> PRT
<213> 合成()
<400> 2
Glu Gly Asp Tyr Leu Asp Tyr Gly Pro Phe Asp Phe Ser Asn Glu Ser
1 5 10 15
Tyr Ser Cys
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