卵泡抑素的抑制
阅读说明：本技术 卵泡抑素的抑制 (Inhibition of follistatin ) 是由 G·M·豪斯 M·E·巴拉什 于 2019-05-17 设计创作，主要内容包括：本文提供了用于调节卵泡抑素的方法,如抑制卵泡抑素、抑制卵泡抑素的产生、降低卵泡抑素的水平、抑制卵泡抑素的功能或其组合。所述方法可以包含施用用于调节卵泡抑素的化合物。在一个实施例中,将所述化合物施用于患有或有风险患有选自以下的疾病或病状的患者：糖尿病、前期糖尿病、代谢综合征、胰岛素抵抗、痴呆和肥胖症,并且任选地,对所述疾病或病状进行预防、治疗、改善或其组合。(Provided herein are methods for modulating follistatin, such as inhibiting follistatin, inhibiting production of follistatin, reducing the level of follistatin, inhibiting the function of follistatin, or a combination thereof. The methods can comprise administering a compound for modulating follistatin. In one embodiment, the compound is administered to a patient suffering from or at risk of a disease or condition selected from: diabetes, pre-diabetes, metabolic syndrome, insulin resistance, dementia, and obesity, and optionally, preventing, treating, ameliorating, or a combination thereof the disease or condition.)
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年5月17日提交的美国临时申请号62/673,082的权益，所述美国临时申请的公开内容以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本公开包括一种用于通过降低在身体中产生并在血液中循环的卵泡抑素的水平来预防、诱导长期缓解或治愈人和动物的各种代谢疾病和病症的通用方法，所述代谢疾病和病症包含肥胖症、2型糖尿病、代谢综合征、葡萄糖耐受不良、胰岛素抵抗和其它病症。
背景技术
糖尿病、前期糖尿病、代谢综合征和肥胖症是全世界主要国家的流行病。糖尿病表现为丧失控制存在于血液中的糖(葡萄糖)的量以及其它危及生命的并发症(包含血脂异常、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、心血管疾病、肾脏疾病、神经病和视网膜病)的能力。据估计，在2000年以后出生的人中，每五人中有一人将在其生命周期中患有糖尿病。已有超过1600万美国人患有这种疾病。在2015年9月，美国疾病控制中心(U.S.Center for DiseaseControl，CDC)发布了其发现，揭示出从1988年到2012年，糖尿病和前期糖尿病在美国平稳增长，这是富含精制糖甜味饮料(“SSB”)和高脂食品(尤其是快餐食品)的饮食的直接结果。根据CDC，美国人口中有12-14％现在是糖尿病患者，并且人口中有34-38％是前期糖尿病患者。在其它“西方化”国家(包含加拿大、墨西哥、西欧)以及甚至中国发现了类似的发病率和患病率。2017年，在美国，已诊断糖尿病的总费用为3270亿美元(http://www.diabetes.org/diabetes-basics/statistics/)。
正常控制血糖对于良好健康和幸福至关重要。人体中的血糖水平由于胰岛素对各种组织和器官的影响而维持在仔细控制的界限内。当人吃饭时，血糖(糖)会随着食物和饮料的消化和吸收而上升。胰腺通过以下进行应答：通过刺激胰岛素应答组织(如脂肪、肝脏和肌肉)而产生胰岛素来控制血糖的上升，以将多余的葡萄糖从血流中去除并抑制肝脏产生葡萄糖。胰岛素对心血管系统和中枢神经系统的功能也有重要影响。通过这种激素介导的机制，个体可以将血糖水平维持在正常范围内，并避免进行性代谢疾病和危及生命的心血管事件。如果血糖浓度超出正常界限(如在前期糖尿病、代谢综合征和未经治疗的糖尿病患者中那样)，则可能会发生严重的并且有时致命的后果。
糖尿病是已经知道超过2000年的复杂且危及生命的疾病。其发生于猴、猫、狗、大鼠、小鼠和人等各种哺乳动物中。胰岛素的发现和其在1921年纯化用于人提供了至今仍在广泛使用的针对糖尿病的部分治疗。通常，身体会在逐时刻的基础上调节胰岛素水平，以将血糖水平保持在窄的生理学范围内。然而，因为对胰岛素的细胞应答在许多情况下也会降低，所以定期胰岛素注射仅可能接近正常状态。因此，出于下面将详细讨论的这些和其它原因，在经过治疗的糖尿病患者的生命期间仍然会发生危及生命的并发症，尤其是在2型(成人发病)糖尿病的情况下。
糖尿病是由各种原因引起的，包含葡萄糖感应失调或胰岛素分泌失调(青年的成年发病型糖尿病；MODY)、自身免疫性介导的β细胞破坏(1型糖尿病)或外周胰岛素抵抗补偿不足(2型糖尿病)，(Zimmet,P.等人,2001)。2015年，大约125万美国儿童和成人患有1型糖尿病。然而，2型糖尿病(或“T2D”)是疾病的最普遍形式，其与肥胖症密切相关，通常发生在中年期，并且如上文所讨论的CDC研究所示出的，现在使超过3000万美国人遭受折磨。越来越多的人认识到，肥胖症、前期糖尿病、代谢综合征和最终糖尿病一起构成一连串逐渐恶化的患病率状态，所述逐渐恶化的患病率状态最终会导致一系列后遗症，从而增加多种另外的疾病可能在遭受折磨的个体中出现的可能性。例如，遭受肥胖症、糖尿病、前期糖尿病或代谢综合征折磨的个体患有动脉粥样硬化、多种形式的癌症、痴呆、心脏病、非酒精性脂肪肝炎(NASH)和中风以及其它较不常见的疾病和病症的风险显著增加。用于鉴定有风险患有这些病症的个体的关键分子和生理学标志物包含较高的循环胰岛素水平、升高的葡萄糖水平、血脂异常和高血压。
在分子水平下，糖尿病是由各种原因引起的：自身免疫性介导的β细胞破坏(1型糖尿病或“T1D”)；葡萄糖感应受损或胰岛素分泌受损、外周胰岛素抵抗和β细胞胰岛素分泌能力补偿不足(2型糖尿病，“T2D”)和青年的成年发病型糖尿病(MODY)(Chen,L.等人,2012；Lipman,T.H.等人,2013；Tuomilehto,J.等人,2013；Yisahak,S.F.等人,2014；Kendall,D.L.等人,2014；George,M.M.等人,2013；Samaan,M.C.等人,2013；Savoye,M.等人,2014；Monzavi,R.等人,2006)。T2D是最普遍形式，其通常在中年表现出来(Menke,A.等人,2015；http://www.diabetes.org/diabetes-basics/statistics)。然而，T2D在发达国家的儿童和青少年中变得更加常见(Menke,A.等人,2015；http://www.diabetes.org/diabetes-basics/statistics)。
生理学应激、对创伤、炎症的应答或营养过剩会通过活化损害各种组织(包含肝脏、脂肪、肌肉、脉管系统以及其它组织)中对胰岛素的受体后应答的通路来促进T2D(Hotamisligil,G.S.等人,2006；Petersen,K.F.等人,2007；Semple,R.K等人,2009)。在一些信息病例中，胰岛素受体或AKT2中的突变解释了胰岛素抵抗的严重形式(Semple,R.K.等人,2009)。T2D的更常见形式与对葡萄糖稳态具有适度影响的多种基因变体相关——包含IRS1(Rung,J.等人,2009；T.O.等人,2011)、PPARγ、PPARγC1A、Kir6.2(KCNJ11)、CAPN10、TCF7L2、脂联素(ADIPOQ)、ADIPOR2、HNF4α、UCP2、SREBF1或高血浆IL-6浓度(Nandi,A.等人,2004；Vaxillaire,M.等人,2008)。由慢性高血糖和补偿性高胰岛素血症加剧的胰岛素信号传导失调促进一系列急性和慢性后遗症(DeFronzo,R.A.等人,2004；Reaven,G.M.等人,1995)。未经治疗的糖尿病会进展成酮症酸中毒(在T1D中最常见)或高血糖渗透压(在T2D中最常见)，所述酮症酸中毒或高血糖渗透压是患病率和死亡率的直接原因(Kitabchi,A.E.等人,2006)。糖尿病还与许多慢性的危及生命的并发症(包含增加的脑血管疾病)相关。类似地，作为高血糖、血脂异常、高胰岛素血症和其它心血管风险因素的协同作用的结果，糖尿病患者的心血管疾病(如周围性血管疾病、冠状动脉疾病、高血压、充血性心力衰竭和心肌梗塞)一致地增加(Brownlee,M.等人,2005；Stentz,F.B.等人，2004)。在糖尿病患者中也观察到肝脏并发症，包含非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)和肝癌发病率增加(Herzig,S.等人,2012；Schattenberg,J.M.等人,2011；D'Adamo,E.等人,2013)。糖尿病也与中枢神经系统的变性相关(Cole,G.M.等人,2007；Barbieri,M.等人,2003)。前期糖尿病日益成为健康关注问题，其中预防疾病进展成完全成熟的糖尿病是有益的(Savoye,M.等人,2014；Monzavi,R.等人,2006)。由于可以较早检测到胰岛素抵抗和血糖升高，因此提供可以逆转前期糖尿病患者并使其正常化的安全治疗可以提供潜在的糖尿病治愈(Savoye,M.等人,2014；Monzavi,R.等人,2006)。治疗患前期糖尿病的青少年和年轻人以阻止其进展成糖尿病将会显著提高其生活质量并对其医疗保健的生命周期成本具有显著影响。增强的IRS2信号传导有可能改善肝脏中的葡萄糖代谢，增强外周胰岛素敏感性，增加胰岛素分泌，使β细胞恢复活力并促进中枢神经系统对外周代谢的控制(White,M.F.等人,2006；Norquay,L.D.等人,2009；Terauchi,Y.等人,2007；Housey和White,2003；Housey和Balash,2014)。
胰岛素信号传导的近端效应：胰岛素受体底物
对转基因小鼠的研究表明，引起许多胰岛素应答(尤其是与体细胞生长和营养稳态相关的胰岛素应答)的胰岛素信号传导的近端效应是通过IRS1或IRS2介导的(White,M.F.等人,2003)。IRS蛋白是将胰岛素样受体连接到常见下游信号传导级联的衔接子分子(图1)。在啮齿动物中已经鉴定出四个IRS基因，其中三个IRS基因在人中是保守性的(IRS1、IRS2和IRS-4)(Bjornholm,M.等人,2002)。IRS1和IRS2蛋白在哺乳动物组织中广泛表达，而IRS-4在很大程度上局限于下丘脑并且在一些其它组织中水平较低(Numan,S.等人,1999)。这些IRS蛋白中的每个IRS蛋白均通过NH2末端的普列克底物蛋白同源性(PH)结构域和磷酸酪氨酸结合(PTB)结构域域靶向经活化的胰岛素样受体。
IRS蛋白通过其PTB结构域在pY972处与胰岛素受体中的近膜自身磷酸化位点结合。pY972驻留在典型的PTB结构域结合基序(NPEpY972)中(White,M.F.等人,1988；Eck,M.J.等人,1996)。近膜区长约35个残基并且将IRβ亚基的跨膜螺旋连接到激酶结构域。与其它受体酪氨酸激酶不同，胰岛素受体激酶不受近膜区中的自身磷酸化调控——尽管NPEY-基序可以调节受体运输(Backer,J.M.等人,1990；Hubbard,S.R.等人,2004)。然而，Tyr972的磷酸化产生用于IRS蛋白和SHC中的磷酸酪氨酸结合(PTB)结构域的对接位点(White,M.F.等人,1988；Pelicci,G.L.等人,1992)。NPEpY972-基序填充PTB结构域上的L形裂缝，而经结合的肽的N末端残基形成β夹心中的另外的链(Eck,M.J.等人,1996)。NPEpY972-基序是用于IRS1的PTB结构域的低亲和力结合位点(Kd为约87μM)，因为E971的去稳定效应促进胰岛素受体对Y972的自身磷酸化(Farooq,A.等人,1999；Hubbard,S.R等人,2013)。通过比较，SHC的PTB结构域以高得多的亲和力与NPEpY972结合(Kd为约4μM)。
紧邻PTB结构域上游的普列克底物蛋白同源性(PH)结构域有助于将IRS蛋白募集到胰岛素受体(Yenush,L.等人,1996)。PH结构域在结构上类似于PTB结构域，但在功能上与其有所不同(Dhe-Paganon,S.等人,1999)。尽管PH结构域促进IRS与胰岛素受体之间的相互作用，但是由于其不会结合磷酸酪氨酸，因此其作用机制仍知之甚少。PH结构域通常被认为结合磷脂，但是IRS中的PH结构域是这种结合特异性的较差实例(Lemmon,M.A.等人,1996；Lemmon,M.A.等人,2002)。相比之下，IRS1/IRS2 PH结构域与各种蛋白质中带负电荷的序列基序结合，这可能对胰岛素受体募集很重要(Burks,D.J.等人,1997)。无论如何，因为IRS蛋白中的PH结构域可以在IRS蛋白之间互换而不会明显丧失生物活性，所以其起着重要且特异性的作用。相比之下，IRS1 PH结构域被来自无关蛋白质的异源性PH结构域取代会降低IRS1功能，这证实了IRS1 PH结构域的特异性功能作用(Burks,D.J.等人,1998)。
IRS2利用另外的机制与IRS1中不存在的胰岛素受体相互作用。IRS2中的氨基酸残基591和786(尤其是Tyr624和Tyr628)介导与经活化的IR催化位点的强相互作用(Sawka-Verhelle,D.等人,1996；Sawka-Verhelle,D.等人,1997)。因为需要A环的三磷酸化来观察相互作用，所以IRS2中的这种结合区最初称为激酶调控环结合(KRLB)结构域(Sawka-Verhelle,D.等人,1996)。结构分析揭示了KRLB结构域的重要功能部分——鼠类IRS2中的残基620-634——其适合胰岛素受体的“开放”催化位点(Wu,J.等人,2008)。通过自身磷酸化或其它方式进行的A环脱离催化位点，IRS2的Tyr621插入受体ATP结合袋，而Tyr628比对以进行磷酸化。这种相互作用可能会通过阻断ATP进入催化位点来减弱信号传导，或其可能会在三自身磷酸化之前通过开放催化位点来促进信号传导。有趣的是，KRLB基序不与IGF1R结合，这可能解释了IR与IGF1R以及受体杂交体之间的信号传导差异(Wu,J.等人,2008)。
胰岛素信号传导的远端效应：下游级联
胰岛素活化其受体酪氨酸激酶，所述受体酪氨酸激酶进而使胰岛素受体底物IRS1和IRS2磷酸化，这会启动和调控胰岛素信号。下游胰岛素信号传导由协调多个组织特异性信号的高度集成的网络构成，所述多个组织特异性信号控制细胞的生长、存活和代谢并通过各种各样的反馈级联来调节信号的强度和持续时间(Taniguchi,C.M.等人,2006)。级联在胰岛素刺激IRS1和/或IRS2中的YXXM-基序的酪氨酰磷酸化时开始，所述YXXM-基序直接募集并活化1A类磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)(参见图1)。PI3K是对许多信号传导通路主要的脂质激酶，其可以被组织成三类——I类、II类和III类。生长因子调控的IA类PI3K由两个亚基构成。催化亚基——p110α(PIK3CA)、p110β(PIK3CB)或p110γ(PIK3CD)——在与由PIK3R1(p85α)或PIK3R2(p85β)编码的若干个同源性85kDa调控性亚基之一相关时被抑制和稳定。
由经活化的PI3K产生的PI(3,4,5)P3发挥关键作用以募集到质膜并活化各种蛋白质。关键级联涉及由PI(3,4,5)P3将若干种Ser/Thr激酶(包含PDK1(3'-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1)和AKT(v-akt鼠类胸腺瘤病毒癌基因))募集到质膜中。IRS蛋白在PI3K→AKT信号传导级联中的作用已经在各种基于细胞和基于小鼠的实验(包含啮齿动物肝细胞、肌肉和脂肪组织)中得到验证(Taniguchi,C.M.等人,2005；Dong,X.等人,2006；Dong,X.C.等人,2008；Kubota,N.等人,2008)。
通过并列膜结合的PDK1在其活化环中对Thr308进行磷酸化来活化AKT。因为AKT同种型通过磷酸化来调控控制细胞存活、生长、增殖、血管生成、血压、葡萄糖流入、肝脏和肌肉代谢以及细胞迁移的许多蛋白质，所以所述AKT同种型在细胞生物学中起着核心作用(图1)(Manning,B.D.等人,2007；Vanhaesebroeck,B.等人,2012；Humphrey,S.J.等人,2013)。已知超过100种AKT底物并且其中若干种与胰岛素信号传导尤其相关——包含GSK3α/β(阻断糖原合成的抑制)；AS160(促进GLUT4易位)；BAD·BCL2异质二聚体(抑制细胞凋亡)；FOXO转录因子(调控肝脏、β-细胞、下丘脑和其它组织中的基因表达)；p21CIP1和p27KIP1(阻断细胞周期抑制)；eNOS(刺激NO合成和血管舒张)；PDE3b(使cAMP水解)；以及抑制mTORC1(雷帕霉素复合物1的机械靶标)的TSC2(结节性硬化症2肿瘤抑制剂)(图1)。无偏差MS/MS方法在胰岛素作用中涉及更多AKT底物，这表明大多数PI3K介导的生长因子(胰岛素)信号传导是通过AKT依赖性机制来协调的(图1)(Humphrey,S.J.等人,2013)。
转录因子的叉头盒O(FOXO)亚家族(FOXO1、FOXO3a、FOXO4和FOXO6)调控DNA损伤修复应答、细胞凋亡、代谢、细胞增殖、应激耐受性和寿命所涉及的靶基因的表达(Calnan,D.R.等人,2008；van der Horst,A.等人,2007)。FOXO含有若干个AKT磷酸化位点、高度保守的叉头DNA结合结构域(DBD)、正好定位于DBD下游的核定位信号(NLS)、核输出序列(NES)和C末端反式活化结构域(Obsil,T.等人,2008)。AKT介导的FOXO1、FOXO3a和FOXO4的磷酸化引起其核排斥，从而导致泛素化和细胞质的降解。因此，IRS1和/或IRS2的胰岛素刺激的酪氨酸磷酸化通过活化PI3K→AKT级联来直接控制基因表达。
最后，IRS1/2→PI3K→AKT1/2级联使许多其它蛋白质磷酸化，从而活化被称为mTORC1的丝氨酸激酶复合物(Yecies,J.L.等人,2011；Wan,M.等人,2011；White,M.F.等人,2010；Hagiwara,A.等人,2012；Tsunekawa,S.等人,2011)。mTORC1通过刺激固醇调控元件结合因子-1(SREBPF1)裂解和活化来促进肝脂肪生成，这增强生脂基因的表达；然而，SREBPF1可以抑制IRS2表达/功能(图1)(Yecies,J.L.等人,2011；Wan,M.等人,2011；Hagiwara,A.等人,2012；Tsunekawa,S.等人,2011；Laplante,M.等人,2009；Astrinidis,A.等人,2005；Hu,C.等人,1994；Menon,S.等人,2012)。
胰岛素信号传导级联的异源性调控/失调
胰岛素抵抗——组织对正常胰岛素浓度的降低的应答性——是导致补偿性高胰岛素血症的2型糖尿病的主要特征(Reaven,G.等人,2004)。其还是伴有心血管疾病、非酒精性脂肪肝病和相关疾病(代谢综合征)的2型糖尿病的聚类的风险因素(包含高血糖、血脂异常和高血压)的基础(Biddinger,S.B.等人,2006)。尽管许多遗传和生理学因素相互作用以产生并加重胰岛素抵抗，但是啮齿动物和人研究涉及作为常见的潜在机制的胰岛素受体底物蛋白IRS1和IRS2的信号传导失调(DeFronzo,R.A.等人,2009；Karlsson,H.K.等人,2007)。已经提出了若干个机制来发挥作用——包含转录调控、翻译控制、翻译后修饰和IRS降解——这些机制可以合起来造成胰岛素信号传导级联的近端步骤的失调并导致代谢疾病。
在小鼠中进行的经过十多年的遗传实验建立了各种各样的胰岛素信号传导组分、营养传感器和其下游代谢效应子的相关功能的变化会对胰岛素敏感性和营养稳态产生深远影响(Biddinger,S.B.等人,2006)。虽然这项工作非常有意义，但是异源性调控的复杂性使用于治疗胰岛素抵抗和其病理后遗症的新策略的鉴定和设计复杂化。尽管通过功能和遗传方法使胰岛素信号传导组分和其相互作用的列表增长，但是IRS作为协调所有组织和细胞中的胰岛素应答的整合节点而保留了特殊位置。实际上，通过遗传方法实现的IR、IRS1和IRS2的浓度降低50％会引起小鼠的生长缺陷和糖尿病(Kido,Y.等人,2000)。因此，降低的IR→IRS信号传导会终生引起代谢疾病。现在知道调控这些近端胰岛素信号传导组分的浓度和功能的许多异源性通路，但是对这些机制的失调如何导致人类的胰岛素抵抗、代谢疾病和2型糖尿病的进展尚不了解。
在过去的15年中，基于小鼠的实验已经揭示了介导胰岛素信号的基因的突变如何导致胰岛素抵抗和糖尿病(White,M.F.等人,2003)。最近的研究揭示了从脂肪组织分泌的抑制胰岛素信号传导的多种因子(FFA、肿瘤坏死因子-α(TNFα)和抵抗素)或促进胰岛素信号传导的因子(30kDa的脂肪细胞补体相关蛋白(脂联素)和瘦蛋白)(Shimomura,I.等人,2000；Zick,Y.等人,2005；Ozcan,U.等人,2004)。IRS蛋白功能的失调将炎性细胞因子连接到胰岛素抵抗并且提供合理的框架来理解外周胰岛素抵抗出现时补偿性β细胞功能的丧失(Shimomura,I.等人,2000；Zick,Y.等人,2005；Ozcan,U.等人,2004；Wellen,K.E.等人,2005；Aguirre,V.等人,2000；Giraud,J.等人,2007)。异源性信号传导级联可以至少部分地通过IRS-1和/或IRS-2的Ser/Thr磷酸化来抑制胰岛素信号(图1)。(Copps,K.D.等人,2012)
缺乏IRS1或IRS2基因的小鼠具有胰岛素抵抗性，其肝代谢功能和外周葡萄糖利用受损(Kubota,N.等人,2000；Guo,S.等人,2009；Withers,D.J.等人,1998；Previs,S.F.等人,2000)。两种类型的敲除小鼠均展现出代谢失调，但是由于胰腺β细胞几乎完全丧失，因此仅IRS2-/-小鼠在8-15周龄之间患有糖尿病(Withers,D.J.等人,1998)。在肥胖小鼠的模型中，肝脏中的IRS2表达也降低(Kubota,N.等人,2000)。对肝IRS2的这种破坏导致胰岛素抵抗，从而表明肝IRS2和IRS1对于全身性胰岛素抵抗的发病机制至关重要(Withers,D.J.等人,1998)。
IRS1和IRS2的肝脏特异性双基因敲除上调FOXO1并增加肝脏的卵泡抑素产生
White和其同事已经通过创建携带IRS1和IRS2两者的肝脏特异性敲除的小鼠进一步研究了外周胰岛素抵抗和其受肝功能的调节的分子机制(Dong,X.C.等人,2008；Cheng,Z.等人,2009；Tao,R.等人,2018)。向普通野生型小鼠腹膜内注射胰岛素会迅速刺激Akt磷酸化和Akt底物(包含FOXO1和GSK3β)的磷酸化(Dong,X.C.等人,2008)。然而，如果IRS1和IRS2两者均在肝脏中被敲除，则所产生的肝脏双敲除小鼠(LDKO)会表现出突出的肝胰岛素抵抗，其包含组成型FOXO1活化。必须删除IRS1和IRS2两者才能使胰岛素受体与肝PI3K→AKT级联解偶，因为两种IRS蛋白均在肝脏中介导胰岛素信号(图1)(Kubota,N.等人,2008)。这些结果证实了肝脏胰岛素信号传导对IRS1或IRS2的共享需求和绝对需求，并且证明肝脏中IRS1和IRS2两者的丧失均会引起组成型FoxO1活性(图2、3)。
值得注意的是，肝IRS1和IRS2的缺失还通过迄今为止尚未识别出的分子机制在外周组织(如白色脂肪组织(WAT))中引起胰岛素抵抗。参见图3A和3B。(Tao,R.等人,2018)。为了了解肝胰岛素抵抗如何导致外周胰岛素抵抗，已经研究了肝脏因子分泌失调的功能，并且最近的证据已经涉及作为外周胰岛素抵抗中(尤其是WAT中)的关键介质的结合蛋白卵泡抑素(Fst)(Tao,R.等人,2018)。如通过qPCR测定的，卵泡抑素在LDKO-肝脏中增加超过10倍，但是其水平在LTKO-肝脏(其中FoxO1也已经被敲除)和血浆中正常化(Tao,R.等人,2018)。Fst的5'启动子区含有FoxO1结合位点，这表明Fst表达可以由核FoxO1诱导。许多细胞和组织会产生Fst，但是大多数循环Fst来自肝脏(Hansen,J.S.等人,2016)，参见图3A和3B。在小鼠中，通过替代性mRNA剪接产生两个Fst同种型，包含含有功能肝素结合位点的膜结合(自分泌)Fst288和表现出降低的肝素结合的较长循环(内分泌)Fst315(Lerch等人,2007)。
Fst可以中和TGFβ超家族配体——包含活化素、肌生长抑制素、BMP2、4、6、7、11和BMP15。当配体与其同源异聚受体丝氨酸激酶结合并活化其同源异聚受体丝氨酸激酶时，TGFβ-超家族信号传导开始，所述同源异聚受体丝氨酸激酶由两个“II型”受体和两个“I型”受体构成，其使Smads磷酸化以调控基因表达(参见图2)。Fst可以正向或负向调控受体处的配体相互作用，因此迄今为止，Fst的确切生理学作用尚不确定(Hansen,J.S.等人,2016；Han,H.Q.等人,2013)。由于Fst是在饥饿期间由运动、炎症或胰高血糖素诱导的，因此其可能将全身性营养和能量稳态与TGFβ-调控的基因表达、生长和分化连接(Hansen,J.S.等人,2016)。在胰岛素抵抗和高血糖T2DM患者的血浆中，Fst适度升高(Hansen,J.等人,2013)。有趣的是，Fst的过表达会促进胰岛素抵抗——但仍会通过促进β细胞增殖来保持糖尿病胰腺中的β细胞功能(Zhao,C.等人,2015；Ungerleider,N.A.等人,2013)。LDKO-小鼠中的经过长期上调的FoxO1→Fst通过加剧外周胰岛素抵抗、高胰岛素血症和肝衰竭来促进代谢疾病。因此，如本公开所教导的，无论Fst的最终作用机制如何，针对如上文所公开的多种代谢病症的治疗功效将通过卵泡抑素活性或水平或两者的受控降低实现。这是与本领域的当前想法形成对比的概念(Zhang,L.等人,2018；Pervin,S.等人,2017；Singh,R.等人,2014)。
发明内容
自从Banting和Best在1921年发现胰岛素以来，对外周胰岛素抵抗(尤其是在2型糖尿病中)的分子机制仍然知之甚少。发明人已经鉴定出LDKO小鼠(缺乏肝脏IRS1和IRS2两者)中的负责诱导外周胰岛素抵抗的分子机制。发明人和其同事已经对胰岛素介导的信号转导靶标进行研究超过15年，并且知道当胰岛素受体底物家族的两个关键相关成员(IRS1和IRS2)在小鼠的肝脏中经历器官特异性缺失时，所产生的分子应答引起FOXO1转录因子的组成型活化(Dong,X.C.等人,2008；Cheng,Z.等人,2009)。除了在胰岛素抵抗性肝细胞中提高FOXO1活性的效应之外，这些小鼠还患有外周胰岛素抵抗，尤其是在白色脂肪组织(WAT)中。由于FOXO1活化许多基因(并抑制其它基因)，所以最近的工作研究了在FOXO1表达升高时被活化或被抑制的基因的谱(Dong,X.C.等人,2008)。现已知道，LDKO小鼠中的增加的肝脏FOXO1活性会导致肝脏产生的被称为卵泡抑素(Fst)的蛋白质增加(Tao,R.等人,2018)。
在胰岛素抵抗的发展中，发明人已经设想并认识到涉及卵泡抑素(Fst)(循环结合蛋白)的这些最近发现的治疗潜力。本领域的当前想法已经支持选择性施用Fst(从而增加人的Fst水平)可以提供治疗益处的概念(Zhang,L.等人,2018；Pervin,S.等人,2017；Singh,R.等人,2014)。然而，从上文所提到的代谢病症(包含糖尿病和肥胖症)的角度来看，发明人已经认识到治疗上有效降低Fst的水平和/或生物活性将会有益于患有某些代谢病症的人和其它哺乳动物。能够降低人或其它哺乳动物的Fst水平或生物活性(或两者)的本公开的组合物包含抗体(多克隆抗体和单克隆抗体两者)、抗体片段(如Fab')、纳米体、其它类别的多肽(如结合拮抗剂(抑制剂))、核酸以及破坏Fst与其靶结合配偶体中的一个或多个靶结合配偶体结合的化合物(如小分子)。如果根据本公开的教导产生和选择上文提到的物质中的任何物质，则所述物质将通过以下作用机制中的一种或多种作用机制表现出抗Fst治疗功效：抑制Fst蛋白的生物功能；降低其信号传导潜力；阻断产生Fst蛋白的通路，包含干扰Fst mRNA功能；活化促进Fst蛋白降解或Fst mRNA降解的通路。
肥胖的个体以及已经表现出前期糖尿病、代谢综合征或2型糖尿病的症状的个体的Fst循环水平相对较高。然而，如果此类患者经历导致包含体重减轻和术前出现的胰岛素抵抗或糖尿病的对应消退在内的成功结果的胃旁路手术，则此类患者也会示出Fst水平的对应降低(Tao等人,2018；Perakakis等人,2019)。因此，发明人已经认识到，在有需要的哺乳动物中选择性降低Fst(与其施用相反)在治疗各种代谢病症(包含肥胖症和糖尿病)时将会是治疗有效的。
证据进一步表明，胰岛素受体底物(IRS)蛋白家族对于介导胰岛素对应答性细胞的效应以及保持Fst水平在哺乳动物的正常生理学情况期间处于控制之下至关重要。
本文公开了一种治疗Fst介导的疾病或病状的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本文所描述的药物组合物。在某些实施例中，Fst介导的疾病或病状是糖尿病、前期糖尿病、代谢综合征、胰岛素抵抗、痴呆或肥胖症。在某些实施例中，所述方法进一步包括施用抗糖尿病剂、胰岛素、二甲双胍(metformin)、艾塞那肽(exenatide)、维达列汀(vildagliptin)、西他列汀(sitagliptin)、DPP4抑制剂、美格列奈(meglitinide)、毒蜥外泌肽-4(exendin-4)、利拉鲁肽(liraglutide)、杜拉鲁肽(dulaglutide)或GLP1激动剂。本文所公开的药物组合物可以在与抗糖尿病剂、胰岛素、二甲双胍、艾塞那肽、维达列汀、西他列汀、DPP4抑制剂、美格列奈、毒蜥外泌肽-4、利拉鲁肽或GLP1激动剂分开的药物调配物中施用。可替代地，本文所公开的药物组合物可以在与抗糖尿病剂、胰岛素、二甲双胍、艾塞那肽、维达列汀、西他列汀、DPP4抑制剂、美格列奈、毒蜥外泌肽-4、利拉鲁肽、杜拉鲁肽、2型钠-葡萄糖转运蛋白(SGLT-2)抑制剂(如依帕列净(empagliflozin)、卡格列净(canagliflozin)或达格列净(dapagliflozin))或GLP1激动剂相同的药物调配物中施用。在某些实施例中，所述药物组合物每天在饭前30-60分钟口服施用两次。
本文公开了一种抑制有需要的受试者中的Fst的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所描述的药物组合物。术语“抑制Fst”包含但不限于降低患者中的Fst的表达、降低患者中的Fst的量(例如，患者的血液或细胞中的量)和/或降低患者中的Fst的活性(例如，患者的血液或细胞中的活性)。
本文公开了一种抑制Fst的方法，所述方法包括使细胞与本文所描述的药物组合物接触。
本公开提供了提供营养支持、预防糖尿病、代谢病症、中枢神经系统疾病、肥胖症、生育力和如本文所讨论的其它人疾病、诱导持久的长期缓解或治愈患有所述疾病的患者的化合物和方法。本公开具体地涉及卵泡抑素以及作为治疗人疾病和/或提供有益的营养支持的机制的对Fst介导的细胞信号传导通路的抑制。
本公开还提供了预防、治疗或改善Fst介导的疾病或病状的方法，所述方法包括鉴定有需要的患者，并单独施用治疗有效量的化合物或与其药学上可接受的盐、酯、酰胺或前药一起施用。需要预防、治疗或改善的患者是患有或有风险患有本文所描述的疾病或病状的患者。Fst介导的疾病或病状包含但不限于糖尿病(1型和2型)、胰岛素抵抗、代谢综合征、痴呆、阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)、高胰岛素血症、血脂异常和高胆固醇血症、肥胖症、高血压、视网膜变性、视网膜脱离、帕金森氏病(Parkinson's disease)、受试者的心血管疾病(包含血管疾病、动脉粥样硬化、冠心病、脑血管疾病、心力衰竭和外周血管疾病)。
本公开还提供了将化合物单独或与药学上可接受的盐、酯、酰胺、前药或溶剂化物一起与第二治疗剂或其它治疗组合共同施用于受试者。
用于治疗糖尿病和相关病状的第二治疗剂包含：双胍类药物(包含但不限于二甲双胍)，其降低肝葡萄糖输出并增加外周对葡萄糖的摄取；胰岛素促分泌剂(包含但不限于磺酰脲类药物和美格列脲类药物，如瑞格列奈(repaglinide))，其触发或增强胰腺β细胞释放胰岛素；以及PPARγ、PPARα和PPARα/γ调节剂(例如，噻唑烷二酮类药物，如吡格列酮(pioglitazone)和罗格列酮(rosiglitazone))。
另外的第二治疗剂包含GLP1受体激动剂，包含但不限于GLP1类似物，如毒蜥外泌肽-4、利拉鲁肽、杜拉鲁肽以及抑制二肽基肽酶-4(DPP-4)降解GLP1的药剂。维达列汀和西他列汀是DPP-4抑制剂的非限制性实例。
仍其它第二治疗剂包含2型钠葡萄糖转运蛋白(SGLT-2)抑制剂，其在肾脏穿过肾小球并进入肾单位之后会降低肾脏再吸收葡萄糖的能力。SLGT-2抑制剂包含但不限于依帕列净、卡格列净或达格列净，其抑制肾单位对葡萄糖的再吸收，从而导致尿液中剩余大量葡萄糖。这种类别的化合物具有显著的降血糖效应，但是由于所产生的糖尿，膀胱感染和肾盂肾炎的可能性也显著增加。
在本公开的某些实施例中，化合物与胰岛素替代疗法共同施用。
根据本公开，化合物与以下共同施用：他汀类药物和/或其它降脂药物(如MTP抑制剂和LDLR上调剂)、抗高血压剂(如血管紧张素拮抗剂，例如氯沙坦(losartan)、厄贝沙坦(irbesartan)、奥美沙坦(olmesartan)、坎地沙坦(candesartan)和替米沙坦(telmisartan))、钙通道拮抗剂(例如，拉西地平(lacidipine))、ACE抑制剂(例如，依那普利(enalapril))和β-肾上腺素能阻断剂(β-阻断剂)(例如，阿替洛尔(atenolol)、拉贝洛尔(labetalol)和奈比洛尔(nebivolol))。
在另一个实施例中，给受试者开出本公开的化合物与食用血糖指数低的食物的说明的组合。
在组合疗法中，化合物是在另一种疗法以及其任何组合之前、期间或之后，即，在施用第二治疗剂之前和期间、之前和之后、期间和之后或之前、期间和之后施用的。例如，可以每天施用本公开的化合物，同时每天施用延迟释放的二甲双胍(糖尿病预防研究组(Diabetes Prevention Program Research Group),2002；Campbell 2007)。在另一个实例中，每天施用一次本公开的化合物，并且同时每周施用一次艾塞那肽。而且，用本公开的化合物的疗法可以在开始用另一种药剂的疗法之前、期间或之后开始。例如，可以将用本公开的化合物的疗法引入已经接受用胰岛素促分泌剂的疗法的患者中。另外，本公开的化合物可以与其它营养补剂、维生素、保健品或膳食补剂结合每天施用一次或两次。实例包含GCE、绿原酸、菊苣酸、肉桂和各种其它羟基肉桂酸、铬、吡啶甲酸铬、多种维生素等。
在另一方面，本公开提供了药学上可接受的组合物，所述药学上可接受的组合物包括治疗有效量的与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂一起调配的本公开的化合物中的一种或多种化合物。如下面详细描述的，本公开的药物组合物可以被专门调配成用于以固体或液体形式施用，包含适于以下的药物组合物：(1)口服施用，例如，浸液(水性或非水性溶液或悬浮液)、片剂(例如，旨在经颊、舌下和全身性吸收的片剂)、团注、粉末、颗粒剂、应用于舌头的糊剂；(2)肠胃外施用，例如，作为例如无菌溶液或悬浮液或持续释放的调配物通过皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射；(3)局部应用，例如，作为乳膏、软膏或控制释放的贴剂或喷雾应用于皮肤；(4)阴道内或子宫内，例如作为子宫托、乳膏或泡沫；(5)舌下；(6)眼部；(7)经皮；或(8)经鼻。
在另一方面，本公开提供了在营养上有益或支持性的组合物，所述在营养上有益或支持性的组合物包括在营养上有益或支持性的量的与一种或多种活性或失活成分、载体(添加剂)和/或稀释剂一起调配的本公开的化合物中的一种或多种化合物。如下面详细描述的本公开的营养补剂调配物可以被专门调配成用于以固体或液体形式施用，包含适于以下的营养补剂调配物：(1)口服施用，例如，饮料、食物、可咀嚼糊剂或胶、浸液(水性或非水性溶液或悬浮液)、胶囊、片剂(例如，旨在经颊、舌下和全身性吸收的片剂)、团注、粉末、颗粒剂、应用于舌头的糊剂；(2)肠胃外施用，例如，作为例如无菌溶液或悬浮液或持续释放的调配物通过皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射；(3)局部应用，例如，作为乳膏、软膏或控制释放的贴剂或喷雾应用于皮肤；(4)阴道内或子宫内，例如作为子宫托、乳膏或泡沫；(5)舌下；(6)眼部；(7)经皮；或(8)经鼻。
如本文所使用的，短语“有效量”意指在动物中的至少细胞亚群(例如，肝脏细胞)中有效产生一些期望效应(如降低Fst的表达、降低Fst的量和/或降低Fst的活性)的化合物、材料或包括本公开的化合物的组合物的量。如本文所使用的，短语“治疗有效量”意指以适用于任何医学治疗的合理益处/风险比率(例如，适用于任何医学治疗的合理副作用)在动物中的至少细胞亚群(例如，肝脏细胞)中有效产生一些期望治疗效应的化合物、材料或包括本公开的化合物的组合物的量。
短语“药物组合物”在适当时必须包含本公开的化合物等。
短语“药学上可接受的”在本文中用于指在正确医学判断的范围内适合于与人和动物的组织接触使用并会产生毒性、刺激、过敏应答或其它问题或并发症的、与合理的益处/风险比率相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
如本文所使用的，短语“药学上可接受的载体”意指如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造辅助(例如，润滑剂、滑石镁、硬脂酸钙或锌或硬脂酸)或溶剂包囊材料等涉及将主题化合物从一个器官或身体的一部分承载或运输到另一个器官或身体的另一部分的药学上可接受的材料、组合物或媒剂。在与调配物的其它成分相容并且对患者无害的意义上来讲，每种载体必须是“可接受的”。可以充当药学上可接受的载剂的材料的一些实例包含：(1)糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)维素和其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、乙酸纤维素和羟丙基甲基纤维素；(4)粉状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；(9)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油以及大豆油；(10)二醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇、以及聚乙二醇；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液(Ringer'ssolution)；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；以及(22)药物调配物中采用的其它无毒的相容物质。
如本文所述，本公开化合物的某些实施例可以含有如胺或烷基胺等碱性官能团，并且因此能够与药学上可接受的酸形成药学上可接受的盐。在这方面，术语“药学上可接受的盐”是指本公开的化合物的相对无毒的无机和有机酸加成盐。这些盐可以在施用媒剂或剂型制造过程中原位制备，或通过使以其游离碱形式的本公开的经纯化的化合物单独与合适的有机或无机酸反应并在随后的纯化期间分离因此形成的盐来制备。代表性的盐包含氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、醋酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月硅酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘甲酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖醛酸盐、和月桂基磺酸盐等(Berge等人,1977)。
主题化合物的药学上可接受的盐包含例如来自无毒的有机或无机酸的化合物的常规无毒盐或季铵盐。例如，此类常规无毒盐包含衍生自以下无机酸的常规无毒盐，如盐酸、氢溴酸、硫酸、胺基磺酸、磷酸、硝酸等；以及由以下有机酸制备的盐，如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、软脂酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷磺酸、草酸、羟乙基磺酸等。
在其它情况下，本公开的化合物可以含有一个或多个酸性官能团，并且因此能够与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐。在这些情况下，术语“药学上可接受的盐”是指本公开的化合物的相对无毒的无机和有机碱加成盐。这些盐同样可以在施用媒剂或剂型制造过程中原位制备，或者通过使以其游离酸形式的经纯化的化合物单独与合适的碱，如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐、与氨或与药学上可接受的有机伯胺、仲胺或叔胺反应来制备。代表性碱或碱土金属盐包含锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和铝盐等。可用于形成碱加成盐的代表性有机胺包含乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等。(参见例如，Berge等人,1977)。
润湿剂、乳化剂和润滑剂(如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁)以及着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和香味剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于组合物中。
药学上可接受的抗氧化剂的实例包含：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
本公开的调配物包含适合于口服、鼻腔、局部(包含颊和舌下)、直肠、阴道和/或肠胃外施用的调配物。所述调配物可以方便地以单位剂型呈现并且可以通过制药业领域中熟知的任何方法来制备。
在某些实施例中，本公开的调配物包括选自由环糊精、纤维素、脂质体、胶束形成剂(例如，胆汁酸)和聚合物载体(例如，聚酯和聚酐)组成的组的赋形剂；以及本公开的化合物。在某些实施例中，上文所提到的调配物使本公开的化合物具有口服生物利用性。
制备这些调配物或组合物的方法包含使本公开的化合物与载体和任选地一种或多种辅助成分缔合的步骤。通常，调配物通过使本公开的化合物与液体载体或精细分散的固体载体或两者均匀且紧密地缔合以及然后在必要时使产品成形来制备。
适于口服施用的本公开的调配物可以以胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用调味基质，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)、粉末、颗粒剂的形式；或作为水性或非水性液体中的溶液或悬浮液；或作为水包油或油包水液体乳剂；或作为酏剂或糖浆；或作为软锭剂(使用惰性基质，如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶)；和/或作为漱口剂等，各自含有预定量的本公开的化合物作为活性成分。本公开的化合物活性还可以以团注、药糖剂或糊剂形式施用。
在本公开的用于口服施用的固体剂型(胶囊、片剂、丸剂、糖衣丸、粉末、颗粒剂、小丸剂等)中，活性成分可以与一种或多种药学上可接受的载体混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或以下中的任何一个：(1)填充剂或增量剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，例如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)保湿剂，如甘油；(4)崩解剂，如琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，如石蜡；(6)吸收促进剂，如季铵化合物和表面活性剂，如泊洛沙姆(poloxamer)和月桂基硫酸钠；(7)润湿剂，例如鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯和非离子表面活性剂；(8)吸收剂，如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠、硬脂酸锌、硬脂酸钠、硬脂酸和其混合物；(10)着色剂；以及(11)控释剂，如交聚维酮或乙基纤维素。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，药物组合物还可以包括缓冲剂。类似类型的固体组合物也可以使用如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂用作软壳明胶胶囊和硬壳明胶胶囊中的填充剂。
片剂可以通过任选地与一种或多种辅助成分压制或模制来制备。压制的片剂可以使用粘合剂(例如，明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，乙醇酸淀粉钠或交联的羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂来制备。模制的片剂可以通过在适合的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物来制造。
本公开的药物组合物和营养组合物的片剂和其它固体剂型(如糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒剂)可以任选地用包衣和衣壳(如肠溶衣和药物调配领域中众所周知的其它包衣)来刻截或制备。所述剂型还可以被调配成使用例如不同比例的羟丙基甲基纤维素使活性成分在其中缓释或控释以提供期望的释放曲线、其它聚合物基质、脂质体和/或微球。所述剂型可以被调配用于快速释放，例如，冷冻干燥的。所述剂型可以例如通过细菌截留过滤器进行过滤或者通过掺入可以溶于无菌水或一些其它无菌可注射介质中的无菌固体组合物的形式的灭菌剂来灭菌，然后立即使用。这些组合物还可以任选地含有乳浊剂并且其组成可以使得其仅或优选地在胃肠道的某一部分中任选地以延迟的方式释放一种或多种活性成分。可以使用的包埋组合物的实例包含聚合物质和蜡。活性成分还可以以微包囊形式，在适当情况下具有本文所描述的赋形剂中的一种或多种赋形剂。
用于口服施用本公开的化合物的液体剂型包含药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除了活性成分以外，液体剂型可以含有本领域中常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(具体地，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和山梨醇酐的脂肪酸酯和其混合物。
除了惰性稀释剂，所述口服组合物还可以包含佐剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。
除活性化合物之外，悬浮液可以含有悬浮剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂-琼脂和黄蓍胶和其混合物等。
用于直肠或阴道施用的本公开的药物组合物的调配物可以作为栓剂存在，所述栓剂可以通过将一种或多种本公开的化合物与一种或多种合适的无刺激性赋形剂或载体(包括例如可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸盐)混合来制备并且其在室温下为固体但在体温下为液体并且因此会在直肠或阴道腔内融化并释放出活性化合物的。
适于阴道施用的本公开的调配物还包含子宫托、棉塞、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾调配物，其含有本领域已知是适当的载体。
用于局部或经皮施用本公开的化合物的剂型包含粉末、喷雾、软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、溶液、贴剂和吸入剂。活性化合物可以在无菌条件下与药学上可接受的载体和可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。
除本公开的活性化合物之外，所述软膏剂、糊剂、乳膏剂和凝胶剂还可以含有赋形剂，如动物和植物脂肪、油类、蜡类、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌或其混合物。
除本公开的化合物之外，粉剂和喷雾剂还可以含有赋形剂，如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末或这些物质的混合物。喷雾可以另外含有常规推进剂，如氯氟烃和挥发性未经取代的烃，如丁烷和丙烷。
经皮贴剂具有额外的优点，即提供本公开的化合物到身体的受控递送。此类剂型可以通过将化合物溶解或分散于适当介质中来制备。还可以使用吸收促进剂来增加所述化合物穿过皮肤的流量。此类通量的速率可以通过提供速率控制膜或将所述化合物分散于聚合物基质或凝胶中来控制。
眼科调配物、眼药膏、粉末、溶液等也被设想为处于本公开的范围内。
适于肠胃外施用的本公开的药物组合物包括本公开的一种或多种化合物组合一种或多种药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳剂、或仅在使用之前可重构成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末，其可以含有糖、醇、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使调配物与预期接受者的血液等渗的溶质、或悬浮剂或增稠剂。
本公开的药物组合物中可以采用的适合的水性和非水性载体的实例包含水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、以及其适合的混合物、植物油，如橄榄油和可注射的有机酯，如油酸乙酯。可以例如通过使用如卵磷脂等包衣材料，通过在分散液的情况下维持所需粒径以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。
这些组合物还可以含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂以及分散剂。可以通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来确保防止微生物对主题化合物的作用。可能还期望将等渗剂，如糖、氯化钠等，包含在这些组合物中。另外，通过包含延迟吸收的药剂(如单硬脂酸铝以及明胶)可以实现可注射药物形式的延长的吸收。
在一些情况下，为了延长药物的效应，可能期望减缓皮下注射或肌肉内注射的药物的吸收。这可以通过使用水溶性差的结晶或无定形材料的液体悬浮液来实现。然后，药物的吸收速率取决于其溶解速率，所述溶解速率进而可以取决于晶体大小和结晶形式。可替代地，肠胃外施用的药物形式的延迟吸收通过将药物溶解或悬浮在油性媒剂中来实现。
通过在可生物降解的聚合物(如聚丙交酯-聚乙交酯)中形成主题化合物的微囊基质来制备可注射储库型(depot)形式。取决于药物与聚合物的比率以及所采用的特定聚合物的性质，可以对药物释放速率进行控制。其它可生物降解的聚合物的实例包含聚(原酸酯)和聚(酸酐)。储库型可注射调配物还通过将药物截留在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备。
当本公开的化合物作为针对人和动物的药物、保健品或营养补剂施用时，所述化合物可以本身或作为含有例如0.1到99％(更优选地，10到30％)的活性成分的组合物与药学上可接受载体的组合给予。
本公开的制剂可以口服、肠胃外、局部或直肠给予。当然，所述制剂以适于每种施用途径的形式给予。例如，所述制剂以片剂或胶囊形式通过注射、吸入、眼用洗剂、软膏、栓剂等施用；通过注射、输注或吸入施用；通过洗剂或软膏局部施用；并且通过栓剂直肠施用。口服施用是优选的。
如本文所使用的，短语“肠胃外施用(parenteral administration)”和“肠胃外施用(administered parenterally)”意指除肠内和局部施用以外的通常通过注射进行的施用方式，并且包含但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注。
如本文所使用的，短语“全身施用(systemic administration或administeredsystemically)”和“外周施用(peripheral administration或administeredperipherally)”意指除直接到中枢神经系统中的施用之外的化合物、药物或其它材料的施用，使得所述化合物、药物或其它材料进入患者的系统，并且因此经历代谢和其它类似过程，例如皮下施用。
这些化合物可以通过任何合适的施用途径施用于人和其它动物以进行疗法，所述施用途径包含口服、鼻腔(如通过例如喷雾)、直肠、阴道内、肠胃外、脑池内和局部(如通过粉末、软膏或滴剂)，包含经颊和舌下。
无论选择哪种施用途径，可以将以合适的水合形式使用的本公开的化合物和/或本公开的药物组合物通过本领域的技术人员已知的常规方法都调配成药学上可接受的剂型。
可以改变本公开的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平以获得对于特定患者、组合物和施用模式有效实现期望治疗应答而对患者无毒性的活性成分的量。
所选剂量水平将取决于各种因素，包含所采用的本公开的具体化合物或其酯、盐或酰胺的活性；施用途径；施用时间；所采用的具体化合物的排泄或代谢速率；吸收速率和程度；治疗持续时间；与所采用的具体化合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料；所治疗的患者的年龄、性别、体重、病状、总体健康状况和先前病史；以及医学领域中众所周知的类似因素。
具有所属领域普通技能的医生或兽医可以容易地确定并且开出有效量的所需药物或营养组合物。例如，医师或兽医可以比实现期望治疗效果所需的水平低的水平来开始在药物组合物中采用的本公开的化合物的剂量，并且逐渐增加剂量直到实现期望的效果。
通常，本公开的化合物的合适日剂量将是化合物的所述量，所述量是有效产生治疗效果或营养上支持性效果的最低剂量。此种有效剂量将通常取决于本文所描述的因素。通常，当用于所指示的止痛效应时，针对患者的本公开的化合物的口服、静脉内、脑室内和皮下剂量的范围将为约0.0001到约100mg每千克体重每天。
如果需要的话，活性化合物的有效日剂量可以作为在一天中以适当的间隔以两个、三个、四个、五个、六个或更多个亚剂量单独施用，任选地以单位剂型施用。优选的剂量是每天施用一次。
虽然本公开的化合物可以单独施用，但是优选的是以药物调配物的形式施用化合物，两者在本文中均被称为“组合物”。
类比于其它药物，根据本公开的化合物可以被调配成以任何方便的方式施用以用于人或兽医学中。
附图说明
图1描绘了IRS信号传导级联的组分。胰岛素调控的PI 3-激酶→PDK1→Akt和Grb2/Sos→ras激酶级联。胰岛素(INS)刺激IRS蛋白(pY)的酪氨酸磷酸化，所述酪氨酸磷酸化促进PI3K[p85·p110]和Grb2/SOS结合。Grb2/SOS刺激ras→MAPK(ERK1/2)级联，从而刺激转录因子。PI3K产生PI3、4P2和PI3、4、5P3(通过PTEN或SHIP2的作用被拮抗)，从而将PDK1和AKT募集到质膜，在所述质膜处，AKT1通过在T308处被PDK1磷酸化并在S473处被mTORC2磷酸化而被活化。AKT使包含抑制Rheb特异性GTPase的TSC2的许多细胞蛋白磷酸化，所述Rheb特异性GTPase活化mTORC1依赖性蛋白并活化SREBP1c，从而刺激生脂基因表达。AKT介导的FOXO1的磷酸化导致细胞质汇集。Akt、mTORC1和S6K1通过IRS1/2的Ser/Thr磷酸化介导IRS依赖性信号传导的“同源性”反馈抑制，而循环因子(TNFα)活化在S/T位点上使IRS磷酸化的“异源性”通路(Jnk等人)。
图2描绘了导致肝脏中的卵泡抑素失调的IRS信号传导级联的破坏的方面。由Fst和Fgf21引起胰岛素信号传导和异源性失调的机制。胰岛素(Ins)刺激IRS→PI3K以产生将AKT募集到膜的PI3、4，在所述膜处，所述AKT在T308处被PDK1磷酸化并在S473处被mTORC2磷酸化。pAKT使TSC2、FoxO1、GSK3β磷酸化并抑制它们——并活化PDE3β等。胰岛素抵抗期间的核FoxO1增加Fst(卵泡抑素)，从而抑制TGFβ超家族配体；并降低Fgf21。由于AKT对FoxO1的负调控效应，IRS1和IRS2的缺失会导致PDK1丧失AKT活化，从而导致AKT释放FoxO1的抑制性磷酸化。所产生的FoxO1活性上升导致肝脏中的Fst的表达明显增加，从而导致血液中的循环Fst水平增加并且因此在白色脂肪组织(WAT)中产生外周胰岛素抵抗。深灰色圆圈/箭头：抑制；浅灰色圆圈/箭头：活化。
图3描绘了FoxO1活性的相对效应和其与肝脏的卵泡抑素产生和分泌的关系，然后其通过血流循环并诱导外周组织如白色脂肪组织(WAT)中的胰岛素抵抗。肝脏中的正常Fst调控生理学以及肝脏中的由于胰岛素信号传导在IRS1和IRS2被破坏时丧失而发生的有害效应的简化示意图版本(B)。在正常情况下，通过胰岛素介导的IRS1/2的活化来活化AKT会导致FoxO1通过磷酸化而失活并降低肝脏的FST产生。IRS1和IRS2的肝脏特异性缺失导致PDK1丧失AKT活化。这导致AKT丧失FoxO1的抑制性磷酸化。所产生的FoxO1活性上升导致肝脏中的Fst的表达的明显增加，从而导致血液中的循环Fst水平增加并且因此在白色脂肪组织(WAT)中产生外周胰岛素抵抗，如图A中所示出的。图B中示出了用于进行治疗干预以降低WAT中的Fst介导的胰岛素抵抗的各种方式。深灰色圆圈/箭头：抑制；浅灰色圆圈/箭头：活化。
具体实施方式
本公开涉及预防糖尿病、代谢病症、中枢神经系统疾病、肥胖症、生育力和其它人病症、治愈患有所述疾病的患者或诱导持久的长期缓解的通用方法，其中一种或多种卵泡抑素变体的不适当水平或功能活性导致疾病状态。本公开具体涉及卵泡抑素以及由于其在体内过量产生并在某些条件下分泌到循环中而作为治疗人疾病的机制的对卵泡抑素介导的细胞信号传导通路的活性的调节。
本公开基于以下认识：胰岛素/IGF信号传导系统的卵泡抑素分支协调重要的生物化学反应和外周胰岛素敏感性组织和细胞(特别是在肌肉和脂肪中)的适当功能所需的信号传导通路。
在缺乏卵泡抑素或过表达Fst的基因改变小鼠中进行的实验揭示了Fst在外周胰岛素作用中的基本作用以及Fst在生物体的功能、生长和存活中的作用。Fst信号传导的失调，特别是外周胰岛素敏感组织(包含WAT和肝脏)处的过度Fst表达或功能会引起胰岛素抵抗、过量的肝葡萄糖产生和全身性葡萄糖耐受不良。相反，抑制Fst的生物功能或降低其信号传导潜力或阻断产生蛋白质的通路或活化促进其降解的通路会纠正这些问题。
因此，本公开涉及通过降低有需要的哺乳动物中的卵泡抑素的水平或功能活性来治疗、治愈或预防各种代谢和相关病症(包含糖尿病)的通用方法。
在一个实施例中，本公开涉及通过降低卵泡抑素水平或活性来恢复或增强细胞中的胰岛素敏感性。根据本公开，通过卵泡抑素水平升高表征的疾病或病症可以通过降低卵泡抑素水平或活性(或两者)来治疗。此类疾病包含但不限于代谢疾病、糖尿病、血脂异常、肥胖症、女性不育症、中枢神经系统病症、阿尔茨海默氏病和血管生成的病症。
在本公开的另一个实施例中，IRS2功能的上调(Housey和White；2003；Housey和Balash；2014)可以降低Fst并改善WAT和外周胰岛素敏感性。这将会包含活化IRS2或包含IRS2的复合物。IRS2功能的上调还通过抑制IRS2的羧基末端丝氨酸残基的磷酸化来完成。IRS2功能的上调可以通过增强IRS2的表达或抑制IRS2的降解来实现。增加IRS2的表达和/或功能将导致肝Fst水平降低，并伴随分泌到循环中的肝Fst的量减少，这将因此改善WAT和外周胰岛素敏感性以及代谢调控。
在另一个实施例中，本公开涉及一种测定化合物是否为Fst的抑制剂的方法。在基于细胞的测定中，提供了测试细胞(Test Cell)，相对于产生较低水平的Fst或根本不会产生Fst并且表现出较少量的Fst结合蛋白与Fst的结合的对照细胞，所述测试细胞过度产生Fst并且表现出所述蛋白质与Fst的结合(包含特异性抗体与Fst结合)增加。通过测量与Fst结合的Fst结合蛋白的量来鉴定抑制Fst的小分子。
在另一个实施例中，本公开内容涉及一种鉴定能够降低哺乳动物细胞中的来自Fst启动子的表达水平的化合物的方法。在一个此实施例中，构建了测试细胞，所述测试细胞含有包括可操作地连接到报告基因的Fst启动子的构建体，使得使用已知能够上调内源性Fst基因的物质使Fst启动子序列的表达增加导致由于报告基因的表达增加而引起的测试细胞的可测量特性增加(以及报告蛋白的产生的对应增加)。抑制Fst表达的小分子通过检测报告基因活性(报告蛋白产生)的降低来鉴定。
在另一个实施例中，本公开涉及一种鉴定能够干扰Fst蛋白的功能以促进WAT胰岛素抵抗的化合物的方法。在一个此实施例中，使用测试细胞(例如，分化的3T3L1脂肪细胞)来筛选逆转来自含有Fst的胰岛素抵抗小鼠的血清的影响以促进胰岛素抵抗的化合物。含有Fst的血清的理想来源是特异性地缺乏肝Irs1和Irs2的胰岛素抵抗性LDKO小鼠。可替代地，可以使用来自在肝脏中过表达Fst的胰岛素抵抗性小鼠的血清。在一个实施例中，在暴露于来自LDKO小鼠的小鼠血清的3T3-L1脂肪细胞中测量IRS1与PI3K的p110催化亚基的相互作用。添加到用来自LDKO小鼠的血清温育的经过胰岛素刺激的3T3-L1脂肪细胞的增加IRS1与p110之间的缔合的化合物——其在胰岛素刺激期间形成更多的IRS1·p110复合物——将被鉴定为抑制Fst功能的化合物。
在另一个实施例中，AKT的经过胰岛素刺激的磷酸化的增加用于鉴定抑制暴露于来自胰岛素抵抗性LDKO小鼠的血清的3T3-L1脂肪细胞中的Fst的功能并通过IRS1/IRS2→PI3K→AKT级联导致较好的胰岛素敏感性的分子。在另一个实施例中，使用激素敏感性脂肪酶(HSL)的经过胰岛素刺激的去磷酸化来鉴定在用来自胰岛素抵抗性LDKO小鼠或专门设计用于表达和分泌肝Fst的其它小鼠的血清温育的3T3-L1脂肪细胞中抑制Fst的功能并通过IRS1/IRS2→PI3K→AKT→PDE级联导致较好的胰岛素敏感性的分子。因此，促进用来自循环Fst升高的胰岛素抵抗性LDKO小鼠的血清温育的3T3-L1脂肪细胞或其它细胞中的IRS1·p110复合物形成、AKT磷酸化和/或HSL去磷酸化的化合物揭示了Fst功能的抑制剂。通过本公开的这些实施例鉴定的化合物是用于治疗代谢疾病、糖尿病和其相关病症的胰岛素敏化分子。
出于本公开的目的，以下术语定义如下。
“卵泡抑素(follistatin)”、“卵泡抑素(follistatin)”、“Fst”、“Fst多肽”和“Fst蛋白”是指卵泡抑素蛋白的任何同种型。在本文中描述了Fst蛋白。如本文所使用的，术语“卵泡抑素”或“fst”：是指与活化素或其它TGFβ超家族配体结合的分泌或膜保留蛋白。卵泡抑素包含Fst、Fst288、Fst303、Fst315、Fst317、Fst344或从对哺乳动物中的保留功能的Fst基因进行的替代性剪接产生的任何其它形式。
“Fst”或“Fst基因”或“Fst mRNA”是指编码卵泡抑素(Fst)蛋白的核苷酸序列。
如本文所使用的，术语Fst的“抑制剂”和“拮抗剂”可互换使用，其中“Fst”和“Fst蛋白”是相同的。
与“Fst的抑制剂”相同的“卵泡抑素的抑制剂”是指包含仅与Fst结合并降低Fst的水平或抑制Fst的功能的化合物，或与包括Fst和一个或多个其它Fst结合配偶体(Fst“结合配偶体”包含蛋白质(如肌生长抑制素、活化素)和与Fst结合的其它非蛋白质分子)的复合物结合的化合物，并且其中所述化合物不能在不存在Fst的情况下与一个或多个非Fst结合配偶体结合。
与“Fst表达的抑制剂”相同的“卵泡抑素表达的抑制剂”意指包含通过任何机制(包含干扰功能Fst mRNA的产生或增强Fst mRNA的降解)抑制Fst基因的表达的化合物。
对于本公开，陈述物质“抑制”卵泡抑素意指：所述物质可以与卵泡抑素结合并降低卵泡抑素在细胞、组织、血液或存在于体内的活性；所述物质可以减少或消除卵泡抑素的功能；所述物质可以降低卵泡抑素的量或水平；和/或所述物质可以减少卵泡抑素的表达或产生。为了使化合物“抑制卵泡抑素”或“抑制Fst”，所述化合物必须是Fst的抑制剂或Fst表达的抑制剂。
除非另有明确说明，否则“抑制剂”、“拮抗剂”和“卵泡抑素的抑制剂”也是同义的。通过抑制剂的抑制可以是部分或完全的。就描述两种物质(例如，酶-底物、蛋白质-DNA、受体-配体等)之间的相互作用而言，术语“结合(bind)”、“结合(binding)”和“与……结合”具有其在生物化学领域的普通含义。如本文所使用的，在讨论物质与其对应的靶蛋白或核酸之间的关系的上下文中，术语“与……结合”与“与……相互作用”同义。
如本文所使用的，术语“化合物”和“物质”可互换使用，并且两个术语均指化学剂和生物剂。
如本文所使用的，术语“化学剂”是指具有多达但不包含2000原子质量单位(道尔顿)的分子量的物质。此类物质有时被称为“小分子”。
如本文所使用的，“生物剂”是包含蛋白质、多肽和核酸并且具有等于或大于2000原子质量单位(“amu”或“道尔顿”)但不超过990,000amu的分子量的分子。
如本文所使用的，术语“抗体”是指响应于抗原而产生的蛋白质或免疫球蛋白，并且可以“特异性结合”抗原。“特异性结合”抗原的抗体是仅与诱导抗体的合成的抗原的表位相互作用或与在结构上相关的表位相互作用的抗体。即使在存在多种潜在结合靶标的情况下，与表位“特异性结合”的抗体也将在适当的条件下与表位相互作用。
如本文所使用的，术语“抗原”是指具有抗体与其特异性结合的表位的蛋白质或肽靶标。
如本文所使用的，术语“片段”是指多肽或多核苷酸的一部分。在一个实施例中，片段保留多肽或多核苷酸的活性。
术语“和/或”意指所列出要素中的一个或全部要素，或所列出要素中的任何两个或更多个要素的组合。
在某些情况下，词语“优选的”和“优选地”是指可以提供某些益处的本公开的实施例。然而，在相同或其它情况下，其它实施例也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施例的叙述并不意味着其它实施例是无用的，也不旨在将其它实施例排除在本公开的范围之外。
在术语出现在说明书和权利要求书中的情况下，这些术语“包括”和其变体都不具有限制性意义。
应当理解，当在本文中无论何处用语言“包含(include)”、“包含(includes)”、“包含(including)”等来描述实施例时，还提供了根据“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的在其它方面类似实施例。
除非另有说明，否则“一个/一种(a/an)”、“所述(the)”和“至少一个”可互换使用并且意指一个或多于一个。
“适”于事件发生的条件或“合适的”条件是不会阻止此类事件发生的条件。因此，这些条件允许、增强、促进和/或有利于事件。
如本文所使用的，在组合物、抗体、核酸或小分子的上下文中，“提供”意指：制备所述组合物、抗体、核酸或小分子；购买所述组合物、抗体、核酸或小分子；或以其它方式获得所述组合物、抗体、核酸或小分子。
贯穿本说明书，对“一个实施例”、“实施例”、“某些实施例”或“一些实施例”等的引用意指结合所述实施例描述的特定特征、配置、组合物或材料或特性被包含在本公开的至少一个实施例中。因此，此类短语在贯穿本说明书的各个地方的出现不一定是指本公开的同一个实施例。此外，在一个或多个实施例中，可以以任何合适的方式组合特定特征、配置、组合物或特性。
对于本文所公开的包含离散步骤的任何方法，可以以任何可行的顺序进行所述步骤。并且，在适当的情况下，可以同时进行两个或更多个步骤的任何组合。
根据本公开，治疗有效量的抑制例如卵泡抑素蛋白(Fst)的功能或表达水平的一种或多种化合物/物质被施用于有需要的哺乳动物。如本文所使用的，术语“哺乳动物”旨在包含但不限于人、实验室动物、家养宠物和农场动物。
Fst蛋白
人FST基因在染色体5q11.2上包含六个跨越5329bp的外显子并产生两个主要转录物，分别为1122bp(转录物变体FST344)和1386bp(转录物变体FST317)(Grusch,M.,2010)。第一个外显子编码信号肽，第二个外显子编码N末端结构域，并且第3-5个外显子各自编码卵泡抑素模块。替代性剪接导致使用编码FST344中的酸性区的外显子6A或含有FST317的终止密码子的两个碱基的外显子6B(Shimasaki,S.等人,1988)。
成熟分泌的卵泡抑素蛋白以由288个、303个和315个氨基酸组成的三种主要形式存在(Sugino,K.等人,1993)。FST344转录物产生344个氨基酸的蛋白质前体，这在去除信号肽后产生成熟的315个氨基酸形式(Fst315)。Fst315的级分通过C末端的蛋白水解切割被进一步转化成303个氨基酸的形式(Fst303)。FST317的信号肽去除导致288个氨基酸的卵泡抑素的成熟形式(Fst288)。所有形式的卵泡抑素都含有三个通过10个半胱氨酸残基的保守性排列表征的卵泡抑素结构域(FSD)。FSD的N末端亚结构域与EGF样模块类似，而C末端区类似于在多种丝氨酸蛋白酶抑制剂中发现的Kazal结构域。
在一个实施例中，被调节的FST是Fst315。成熟的人Fst315蛋白的实例如下：
GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCI
PCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKAR
CKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGN
DGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSL
CDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEEEED
EDQDYSFPISSILEW(基因库登录号P19883.2的第30-344个氨基酸)(SEQ ID NO:1)。
卵泡抑素前体的实例可在基因库登录号AAA35851处获得。
编码成熟的人Fst315蛋白的多核苷酸序列的实例可在基因库登录号AH001463处获得。
Fst抑制剂的产生
使用本领域中标准的并且是熟练的从业者已知的多种方法来制备本公开的抑制剂。在产生此类抑制剂之后，可以使用下面描述的详细方法和见解或通过对于本领域普通技术人员来说显而易见的变化测试抑制剂的潜在治疗功效对。用于测试此类抑制剂的一种方法是下面描述的基于细胞的测定系统。可以利用其它方法。并不旨在限制如何测试Fst抑制剂的治疗功效。
多克隆抗体(Ab)。通过用Fst的特异性多肽或肽片段使动物(如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、山羊、绵羊、鸡或马)产生免疫来制备多克隆抗体。用于免疫的施用途径可以包含但不限于静脉内、腹膜内、真皮内、肌肉内、皮内、足垫、结内或脾内。为了增加抗原性，肽片段可以连接到载体蛋白，如白蛋白或钥孔戚血蓝素。在优选实施例中，30ug的抗原肽片段用于免疫。在对接受者动物进行一次或多次免疫之后，获得血清，并使用酶联免疫吸附测定(ELISA)针对对人卵泡抑素的抗体的存在对其进行测试。可以直接使用与卵泡抑素结合的抗体，或更优选地，使用固定在基于琼脂糖的树脂上的同源肽对所述抗体进行纯化以增强实用性。参见例如，Milstein《自然(Nature)》266(1977)550；Kohler和Milstein《自然》256(1975)495；《抗体：实验室手册(Antibodies A Lab Manual)》1989；Rasmussen《生物科技快报(Biotechnol Lett)》29(2007)845；《Delahaut方法(Delahaut Methods)》116(2017)4-11；Hanly ILAR 27(1995)93；Newcombe C,Newcombe AR J Chromatogr B《生物医学生命科学分析(Analyt Technol Biomed Life Sci)》848(2007)2；Murphy《抗体技术杂志(Antibody Tech J)》6(2016)。
然后，如下面所描述的，测试多克隆Ab的潜在治疗功效。收集动物的血液，并且可以使用多种技术(如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫组织化学染色等)来测量抗血清中的多克隆抗体的效价。可以使用色谱或非色谱技术将多克隆抗体从血清中的复杂混合物中纯化。使用基于色谱法的方法，可以通过使抗体穿过固相(例如，硅树脂或微珠、整体柱或纤维素膜)并取决于利用哪些色谱方法而允许抗体结合或穿过来分离抗体。这些方法包含不同的分离技术，如亲和标签结合、离子交换、尺寸排阻色谱法或免疫亲和色谱法。使用基于非色谱法的方法，可以采用沉淀、絮凝、结晶、过滤、水两相分区技术和其任意组合。
抗Fst单克隆Ab。使用标准方法制备单克隆抗体(mAb)。简而言之，如上所述的使动物产生免疫以制备多克隆Ab。在根据上文所描述的测定验证经过免疫的动物正在产生相关抗体之后，根据Kohler和Milstein(1975)的方法从产生Ab的动物(如小鼠)中收集淋巴细胞，并将其与骨髓瘤细胞融合。还参见，Kunert《应用微生物学与生物技术(Appl MicrobiolBiotechnol)》100(2016)3451；Roque《生物技术进展(Biotechnol Prog)》20(2004)639；Maynard《生物工程年度评论(Annu Rev Bio Eng)》2(2000)339。
然后，使用下面所描述的测定方法测试产生单独的mAb的克隆的治疗功效。
可以制备靶向Fst和Fst结合蛋白(如肌生长抑制素(mstatin)、活化素或骨形态发生蛋白(bmp))的双特异性抗体。Roque《生物技术进展》20(2004)639的方法具有指导性。
人源化抗体。可能优选的是通过用人抗体的Fc结构域替代其恒定区使通过上文所提及的方法中的任何方法(或通过另一种适当的方法)制备的mAb人源化。已经示出此种替代产生更多的临床上有用的Ab，其诱导副作用(如接受者体内患有可能使治疗性mAb不太有效或无效的中和Ab)的可能性较低。详细描述了mAb的人源化。参见例如，Roque《生物技术进展》20(2004)639、Kipriyanov《分子生物技术(Mol Biotech)》26(2004)39和Maynard《生物工程年度评论》2(2000)339。
通常从来自啮齿动物源的单克隆抗体开始，将对靶抗原具有特异性的编码啮齿动物的可变区的DNA区段与编码人恒定区的DNA的区段连接。通过将人抗体重链和轻链基因的可变区交换为源自于啮齿类动物单克隆的可变区，所产生的嵌合(人源化)抗体为60-70％人。对于鼠类单克隆抗体，仅在互补决定区中含有表位或抗原决定簇区。重链和轻链的每个结构域具有被框架区包围的这些区中的三个区。为了构建90-95％被识别为人的单克隆抗体，可以将针对期望的抗原所选择的鼠类单克隆的互补决定区与人框架区邻接。
可以通过使用标准程序对动物(通常是小鼠)的免疫系统进行基因工程化来获得基本上为100％人的单克隆抗体。
合成Ab。合成抗体是产生抗体的另一种方法。此类抗体是从合成文库产生的，并且也可用于产生用于治疗用途的完全人源化、高亲和力、高特异性的抗体。所述方法类似于上文关于Ab功能活性所描述的方法。参见Shim《BMB报告(BMB Reports)》48(2015)489、Bradbury《自然生物科技(Nat Biotech)》29(2011)245。
根据标准方法，由抗Fst mAb制备抗Fst的FAb'片段。另外，抗原结合片段/F(ab)片段、可变片段(Fv片段)、单链可变片段(scFv片段)等也可以根据以下的方法来制备：Hust《BMC生物技术(BMC Biotech)》7(2007)；Skerra《当前免疫学观点(Curr Opin Immunol)》5(1993)256；Roque《生物技术进展》20(2004)639；Skerra-Pluckthun《科学(Science)》240(1988)1038；Kipriyanov《分子生物技术》26(2004)39。
因为抗体片段的大小较小并且可以在维持功能的同时大量产生，所以它们通常在细菌系统中产生。抗原结合片段/F(ab)片段也可以在重组系统中制备。可变片段包含含有抗原结合位点的抗体片段上的可变区的重链和轻链两者。抗体或片段通常在同一细菌细胞(例如，大肠杆菌)中表达，并一起分泌到细菌的周质中。使用链中的大约等量的每条链以及基本上同时分泌它们允许功能抗体片段的适当折叠和组装。真核系统(如酵母、昆虫和哺乳动物细胞)也是用于产生可变抗体(Fv)片段的有活性的系统。
对于单链可变片段，抗体片段的含有通过肽接头连接的整个抗体的抗原结合位点的重链的可变部分和轻链的可变部分在同一细菌细胞中表达(如大肠杆菌)，并一起分泌到细菌的周质中。
纳米体。根据如先前所描述的方法制备抗Fst的纳米体。参见例如，Liu《免疫分子学(Mol Immunol)》96(2018)37；Steeland《今日药物开发(Drug Discov Today)》21(2016年7月)1076；《应用化学国际英文版(Angew Chem Int Ed Engl)》,57(2018年2月)2314；Fridy《自然方法(Nat Methods)》11(2014)1253；和Goldman《免疫学前沿(Front Immunol)》2017年7月。
纳米体通常从以下所创建的文库中的任何文库获得：免疫文库、原初文库或半合成/合成文库。对于免疫文库，抗原特异性重链抗体在最常见来自骆驼科家族的动物的免疫后会经历亲和力成熟。从外周血淋巴细胞获得mRNA，并通过逆转录合成cDNA。通过使用建立的技术(如噬菌体展示、细胞表面展示、mRNA/cDNA展示、HTS DNA测序和质谱鉴定、生物素化的纳米体筛选或细菌双杂交系统)筛选文库来选择纳米体。
对于原初文库，噬菌体展示和核糖体展示是用于选择从所获得的mRNA和所合成的cDNA产生的纳米体的常用技术，所述mRNA和所述cDNA是从未经过免疫的动物收集的外周血淋巴细胞获得和合成的。
对于半合成/合成文库，纳米体的互补决定区在长度和序列上随机变化，而框架区是保守的。这允许文库的扩展以及库内的多样性的产生。
Fst的小分子抑制剂。可以使用标准的体外细胞游离放射性配体或荧光配体结合测定或其等同物来鉴定(i)抑制Fst与其结合蛋白(包含MST、BMP或活化素)中的一种或多种结合蛋白结合、(ii)抑制Fst基因的表达或(iii)增强Fst的降解的化合物。小分子抑制剂的来源包含但不限于例如：化学化合物文库；链霉菌、其它细菌和真菌的发酵培养基；以及植物和其它植被的细胞提取物。小分子文库是可用的，并包含AMRI文库、AnalytiCon、BioFocus DPI库、Chem-XInfinity、ChemBridge文库、ChemDiv文库、Enamine文库、Greenpharma天然化合物文库(Greenpharma Natural Compound Library)、生命化学品文库(Life Chemicals Library)、LOPAC1280TM、MicroSource频谱采集(MicroSourceSpectrum Collection)、Pharmakon、PrestwickSPECS、NIH临床收集(NIH Clinical Collection)、手性中心多样性文库(Chiral Centers DiversityLibrary)。
使用短干扰RNA(siRNA)的基因沉默和使用RNA干扰(RNAi)的相关方法。众所周知，RNAi在通过分子(如siRNA)沉默的转录后基因中起着重要作用。siRNA是能够以序列特异性方式使信使RNA(mRNA)的翻译减少或沉默的约19-22个核苷酸(nt)双链体RNA(dsRNA)分子。参见Walton等人,2010；Sibley等人,2010。
多核苷酸可以用于减少特异性基因的表达。此类抑制性多核苷酸包含由使具有高度特异性的基因沉默的双链小干扰RNA(siRNA)介导的RNA干扰(RNAi)。siRNA包含与编码信使RNA(mRNA)的蛋白质互补并引起mRNA降解的序列。如Gao等人(2010)给出的实例中所示出的，本领域普通技术人员可以设计和合成能够抑制卵泡抑素的siRNA分子。用于抑制卵泡抑素的siRNA分子也是可商购获得的(例如，科罗拉多州拉斐特Dharmacon公司)。核酸的自动合成是众所周知的，并且包含核苷和核糖/脱氧核糖环系统上的许多位置处的修饰(Sibley等人,2010；Walton等人,2010)。
另一种类型的抑制性核苷酸包含反义RNA，即与编码mRNA的蛋白质互补的单链RNA，所述反义RNA与所述蛋白质杂交并由此阻断其翻译成蛋白质。本文中的方法中使用的siRNA具有减少Fst315的表达的能力。RNA干扰方法表示用于分子靶向疗法的有用方法。因此，在另一个实施例中，使用siRNA或另一种RNAi方法。将siRNA合成，并在哺乳动物中测试其以治疗有效方式降低循环Fst的能力。制造siRNA的寡核苷酸合成方法是众所周知的。并不旨在限制可以用于降低哺乳动物中的Fst水平的RNAi的类型，包含RNA-DNA嵌合体、串联发夹RNA、串联siRNA、tRNA-shRNA等(Sibley《分子疗法(Mol Ther)》18(2010)466)。
在一个实施例中，本文中可用的多核苷酸包含双链RNA(dsRNA)多核苷酸。多核苷酸的序列包含16到30个核苷酸(例如，16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸)的一条链，在本文中被称为有义链。有义链与靶mRNA(例如，编码Fst315的mRNA)基本上相同，优选地相同。如本文所使用的，术语“相同”意指有义链的核苷酸序列具有与靶mRNA的一部分相同的核苷酸序列。如本文所使用的，术语“基本上相同”意指有义链的序列与靶mRNA的序列在1个、2个或3个核苷酸处(优选地，在1个核苷酸处)不同，并且其余核苷酸与mRNA的序列相同。有义链的这些1个、2个或3个核苷酸被称为非互补核苷酸。当多核苷酸包含与靶mRNA基本上相同的有义链时，1个、2个或3个非互补核苷酸优选地定位于有义链的中间。例如，如果有义链的长度为21个核苷酸，则非互补核苷酸通常在第9个、第10个、第11个或第12个核苷酸处，优选地在第10个或第11个核苷酸处。dsRNA多核苷酸的另一条链(在本文中被称为反义链)与有义链互补。
dsRNA多核苷酸的有义链和反义链通常也可以通过由核苷酸构成的间隔子共价连接。此种多核苷酸在本领域中通常被称为短发夹RNA(shRNA)。在有义链和反义链碱基配对时，间隔区形成环。构成环的核苷酸的数量可以变化，并且已经报道了介于3个核苷酸与23个核苷酸之间的环(Sui等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA)》,99,5515-5520(2002)和Jacque等人,《自然》,418,435-438(2002))。
在一个实施例中，本文中可用的多核苷酸包含单链RNA(ssRNA)多核苷酸。多核苷酸的序列包含至少16个核苷酸的一条链，在本文中被称为反义链。反义链与靶mRNA(例如，编码Fst315的mRNA)基本上互补，优选地互补。在一个实施例中，用于减少细胞中的编码区的表达的多核苷酸包含基本上所有编码区，或在一些情况下，整个编码区。反义链与靶编码区或靶mRNA基本上互补，优选地互补。如本文所使用的，术语“基本上互补”意指反义链的核苷酸中的至少1个、2个或3个核苷酸不与靶mRNA的核苷酸序列互补。
优选地，本公开的多核苷酸具有生物活性。具有生物活性的多核苷酸引起靶编码区的表达的转录后抑制，也被称为沉默。在不旨在受理论限制的情况下，在引入细胞中之后，本发明的多核苷酸将与靶mRNA杂交并向细胞核酸内切酶发出信号以切割靶mRNA。结果是抑制由mRNA编码的多肽的表达。靶编码区的表达是否被抑制可以通过例如以下来测定：测量细胞中的靶mRNA的量的降低；测量由mRNA编码的多肽的量的降低；或通过测量由mRNA编码的多肽的活性的降低。
本公开的多核苷酸可以包含另外的核苷酸。例如，关于有义链，5'端、3'端或两端可以包含另外的核苷酸，条件是另外的核苷酸与适当的靶mRNA相同并且有义链的总长度不大于30个核苷酸。
多核苷酸可以被修饰。在某些环境中，此类修饰可以用于增加多核苷酸的稳定性。修饰可以包含核酸糖、碱基或主链或其任何组合。修饰可以是合成的、天然存在的或非天然存在的。多核苷酸可以包含存在于多核苷酸中的核酸中的一个或多个核酸处的修饰。主链修饰的实例包含但不限于膦酰基乙酸酯、硫代膦酰基乙酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸和肽-核酸。核酸碱基修饰的实例包含但不限于肌苷、嘌呤、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2,4,6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氢尿苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如，5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(例如，核糖胸苷)、5-卤代尿苷(例如，5-溴尿苷)或6-氮杂嘧啶或6-烷基嘧啶(例如，6-甲基尿苷)或丙炔修饰。核酸糖修饰的实例包含但不限于2'-糖修饰，例如2'-O-甲基核苷酸、2'-脱氧-2'-氟核苷酸、2'-脱氧-2'-氟阿拉伯糖、2'-O-甲氧基乙基核苷酸、2'-O-三氟甲基核苷酸、2'-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸、2'-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸或2'-脱氧核苷酸。可以商业合成获得包含此类修饰的多核苷酸(例如，科罗拉多州拉斐特的Dharmacon公司)。
在一个实施例中，可能优选的是将本发明的化合物靶向需要用Fst抑制剂治疗的人或其它生物的肝脏。如本文所使用的，“靶”意指出于增加进入肝脏而不是体内其它器官的化合物的量的目的而化学修饰化合物。这是因为Fst在哺乳动物的肝脏中产生。因此，将治疗性化合物靶向肝脏将提高化合物抑制卵泡抑素的功效。
将化合物靶向肝细胞(特定类型的肝脏细胞)的方法在文献中是众所周知的，并且包含将靶向剂添加到本文所描述的化合物，如多核苷酸，包含siRNA。一种方法是将靶向剂化学缀合到化合物到化合物。靶向剂的实例是N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)部分(Nair等人,2014；Rajeev等人,2015；Matsuda等人,2015)。在一个实施例中，GalNAc部分缀合到核酸序列，如反义寡核苷酸或siRNA(Lee和Sinko,2006；Willoughby等人2018)。由于脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)在肝细胞上特异性表达，并且因为GalNAc是ASGPR的已知配体，所以将GalNAc部分添加到化合物(如siRNA)会导致通过与ASGPR结合、随后将复合物内化到网格蛋白涂覆的核内体中而从血液中迅速清除的GalNAc-siRNA缀合分子(Springer和Dowdy,2018)。在一个实施例中，一个或多个GalNAc部分缀合到siRNA的有义链的5'端(Kumar等人,2019；Willoughby等人2018；Wang等人,2017)。
已知其它靶向剂能够将化合物靶向以组织特异性方式在如肝细胞(在肝脏中)、胶质细胞(神经)、脂肪细胞(脂肪)、肌细胞(肌肉)等上表达的受体(Lee等人，2012)。并不旨在限制可以利用的靶向方法的性质。出于涉及抑制卵泡抑素的本发明的目的，可能优选的是靶向肝脏中的细胞，并且具体地，肝细胞。
本文中可用所描述的方法的多核苷酸可以直接施用于患者。在多核苷酸包含RNA的那些实施例中，RNA可以通过引入编码RNA的载体来间接提供。例如，当siRNA是期望的多核苷酸时，siRNA可以通过施用编码dsRNA的两条单链的一种或多种载体来间接提供。
基因疗法。在另一个实施例中，可以使用基于病毒载体的基因疗法方法来降低哺乳动物中的Fst表达或产生。并不旨在限制可以利用的基因疗法方法的类型。在已经示出与其它靶的临床功效的一个优选实施例中，可以使用病毒载体系统将反义核酸引入产生Fst的器官(如肝脏)中。此类方法在本领域中是众所周知的。在一个优选实施例中，使用腺相关病毒(AAV)。在AAV载体系统中使用编码Fst蛋白的一个或多个编码或非编码反义区段以将其引入患病哺乳动物的肝脏中。参见例如，Naso《生物制药(BioDrugs)》31(2017)317；Ojala《神经科学家(Neuroscientist)》21(2015)84；Hanna《卫生政策(Health Policy)》122(2018)217；Mendell NEJM 377(2017)1713。
基因组编辑。Crispr/cas9系统以及其它基因组编辑技术可以用于内源性修饰肝脏或其它组织中的细胞以降低Fst的表达。Fst表达降低将导致Fst蛋白水平降低，并伴随外周中的胰岛素敏感性的改善。参见例如，Franco-Tormo等人,2018；Li等人,2018；以及其中所公开的标准方法。
Fst结合多肽。使用标准方法，可以使用选自Fst或可替代地选自卵泡抑素的已知结合配偶体(如肌生长抑制素、骨形态发生蛋白、活化素等(参见上文))之一的肽片段以生成能够阻断Fst与已知结合配偶体之间的相互作用的肽。使用放射性配体、ELISA技术或带有荧光标签的配体或抗体的可溶性结合测定在本领域中是众所周知的。参见例如(Horowitz,A.D.等人,1981；Knudsen,L.等人,2012)
并不旨在限制通过其鉴定或富集特定Fst结合化合物的方法。
潜在治疗功效的测试：用于鉴定有效的Fst结合化合物的基于细胞的测定
由上文所描述的方法中的一种或多种方法制备一种或多种潜在的Fst抑制剂化合物，并且然后测试其恢复分离的动物或人脂肪细胞或3T3L1脂肪细胞或分离的人或动物肝细胞中的胰岛素信号传导的能力。通过测定在胰岛素刺激下PI3K与IRS1结合的相对增加，将动物或细胞用来自LDKO小鼠或另一种相当的Fst来源的血清温育。3T3-L1脂肪细胞优选用于如先前所示出的这种基于细胞的测定(Tao,R.等人,2018)。使用LuminexTM平台上的结合测定对IRS1·p110复合物的形成和浓度进行定量。
将从无支原体原液获得的3T3-L1前脂肪细胞用含10％BCS的5％CO2在DMEM/F12中培养。汇合后两天，将细胞暴露于具有异丁甲基黄嘌呤(0.5mM)、地塞米松(dexamethasone，1μM)和胰岛素(5μg/ml)的DMEM/10％FBS。2天后，将细胞维持在DMEM/10％FBS中，直到在第7天准备进行处理为止。在第9天，在来自胰岛素抵抗小鼠的DMEM/5％小鼠血清中维持24小时后，将细胞用胰岛素(10nM)处理3分钟。因为来自胰岛素抵抗性小鼠的小鼠血清提供了有助于WAT胰岛素抵抗的Fst来源和Fst靶，所以其是有用的(Tao,R.等人,2018)。
如先前所描述的(Hancer等人,2014；Copps等人,2016)，将IRS1捕获抗体(兔单克隆抗体58-10C-31，密理博(Millipore)目录号05-784R)与磁性羧基微球偶联。用来自细胞信号传导技术公司(Cell Signaling Technology)(CST#4249)的抗体检测与捕获到的IRS1相关的PI3K的p110亚基。对于LuminexTM测定，将细胞裂解物(10μg)或小鼠组织裂解物(80μg)用Irs1捕获珠粒(4000个珠粒/孔)在总体积为50μl的磷蛋白检测洗涤缓冲液(伯乐公司(Bio-rad))中稀释，并将其在96孔圆形底板中温育过夜。用相同的缓冲液洗涤两次后，将珠粒用50μl的检测抗体在旋转平板振荡器(80rpm)上温育1小时。去除生物素化的检测抗体后，可以将珠粒在25μl的1μg/ml链霉亲和素-藻红蛋白(Prozyme)中振摇温育15分钟。然后去除所有溶液，并将珠粒悬浮于PBS-BN中以在LuminexTM FlexMap 3D仪器中进行分析。
可替代地，用于鉴定潜在治疗mAb的另一种测定是使用暴露于来自胰岛素抵抗性LDKO小鼠的血清的细胞在存在或不存在所选择的抗Fst Ab的情况下在胰岛素刺激后测量AKT磷酸化的程度。将用来自胰岛素抵抗性LDKO小鼠的血清温育的组织或3T3-L1脂肪细胞在裂解缓冲液(50mm Hepes、pH 7.5、150mm NaCl、10％甘油、1％Triton X-100、1.5mmMgCl2、1mm EGTA、10mm焦磷酸钠、100mm氟化钠以及新添加的蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物)中均质化。将蛋白质提取物在SDS-PAGE凝胶上溶解并转移到硝酸纤维素膜(Bio-)。蛋白质的检测是通过以下进行的：用靶向AKT中的调控性磷酸化位点(包含T308或S473)的HRP缀合的次级抗体、然后用ECL检测试剂进行温育。
技术人员可以设计在上文所给出的条件下测量抗卵泡抑素Ab或其它Fst抑制剂化合物的胰岛素信号传导的增加的其它测定系统——包含使用测定来定量AKT磷酸化。此外，可以选择其它下游靶——包含降低的HSL磷酸化；降低的FOXO1磷酸化；增加的S6K磷酸化；或增加的RPS6磷酸化。并不旨在限制如何表征本公开的化合物在测量胰岛素信号传导和其由于Fst而从抑制性抵抗中释放的测定中增强这些和其它胰岛素信号传导应答的能力。
例如，胰岛素通常促进3T3-L1脂肪细胞中的HSL的去磷酸化。在这个测定中，将用来自胰岛素抗性LDKO小鼠的5％血清温育的3T3-L1脂肪细胞用胰岛素刺激几分钟。将细胞在裂解缓冲液(50mm Hepes、pH 7.5、150mm NaCl、10％甘油、1％Triton X-100、1.5mmMgCl2、1mm EGTA、10mm焦磷酸钠、100mm氟化钠以及新添加的蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物)中均质化。将蛋白质提取物在SDS-PAGE凝胶上溶解并转移到硝酸纤维素膜(伯乐公司)。使用磷酸-HSL(Ser660)(抗体#4126，细胞信号传导技术公司)对pS660Hsl处的磷酸化HSL进行的检测通过是通过以下进行的：用靶向与HSL中的调控性磷酸化位点结合的抗体的HRP缀合的次级抗体、然后用ECL检测试剂进行温育。
一旦在上文提到的细胞测定中鉴定出本公开的有效mAb或其它有效化合物，则可以针对体内功效对在上文所给出的测定中的一种测定中得分阳性的化合物或Ab进行进一步测试。如先前所描述的，优选地繁殖肝脏特异性Irs1和Irs2双敲除小鼠(LDKO)(27、28)。可替代地，可以从杰克森实验室(Jackson lab，缅因州巴尔港)购买C57BL6小鼠(库存编号：000664)、ob/ob小鼠(库存编号：000632)、B6.129S2-Il6tm1Kopf/J小鼠(库存编号：002650)。将周龄介于4-16之间的这些小鼠放置于高脂饮食以诱导胰岛素抵抗和糖尿病。优选地，将所有小鼠按12:12小时明暗周期圈养在塑料笼中，在适当的设施中自由获取水和食物。
使用有意识和不受约束的小鼠中的高胰岛素正葡萄糖钳夹来评估用于抑制Fst诱导胰岛素抵抗的能力的Fst抑制剂的功效。在钳夹实验之前，将一根导管插入右颈静脉进行输注。恢复5-7天后，体重减轻小于其术前体重的10％的小鼠将经受高胰岛素正葡萄糖钳夹。
在实验的前一天，用Fst结合蛋白或抗体以在先前部分的基于细胞的测定中测定的浓度对小鼠进行处理。在实验当天，在上午8:00剥夺小鼠食物3.5小时，然后以1微升/分钟的速率连续输注D-[3-3H]-葡萄糖(0.05微居里/分钟)持续1.5小时。从尾静脉进行基础采样后，用以下来进行140分钟的高胰岛素正葡萄糖钳夹：以2微升/分钟的速率进行人常规胰岛素(4鼠单位/千克/分钟，优泌林(Humulin)，Eli )的灌注连续输注，并在整个钳夹实验中，以2微升/分钟的速率连续输注D-[3-3H]-葡萄糖(0.1微居里/分钟)。用3％BSA在0.9％生理盐水中制备胰岛素溶液。根据需要以可变速率输注20％葡萄糖以将血浆葡萄糖维持在约130mg/dl(图1D、1F中除外(Cntr±SEM：138±9mg/dl；LDKO±SEM：204±21mg/dl；P＜0.05))。优选地，所有输注均用微输注泵(KD科学公司(KD Scientific)或等效物)来进行。根据固定方案定期监测来自尾静脉的血糖浓度。为了估计WAT、BAT和骨骼肌中的经过胰岛素刺激的葡萄糖摄取，在钳夹开始后95分钟，将2-脱氧-D-[1-14C]葡萄糖(10μCi/小鼠；珀金埃尔默公司(PerkinElmer))以团注形式施用。在钳夹的-5分钟、100分钟、110分钟、120分钟、130分钟和140分钟时采集血液样品(20ul)以测量血浆D-[3-3H]-葡萄糖和2-脱氧-D-[1-14C]葡萄糖浓度。当固定的葡萄糖输注速率使血液中的葡萄糖浓度持续维持40分钟时，则认为在100-140分钟期间实现稳态。在实验结束时，用氯胺酮/甲苯噻嗪处死小鼠，并将WAT、BAT、骨骼肌和肝脏解剖并储存在-80℃以根据需要进行进一步分析。
根据来自范德比尔特-NIDDK小鼠代谢表型中心(Vanderbilt-NIDDK MouseMetabolic Phenotyping Center)的具有一些修改的“葡萄糖钳夹有意识小鼠(GLUCOSECLAMPING THE CONSCIOUS MOUSE)”的程序对血浆中的D-[3-3H]-葡萄糖和2-脱氧-D-[1-14C]葡萄糖浓度进行测量。简而言之，将与14μl生理盐水混合的6μl的血浆样品用100ul 3NBa(OH)2和ZnSO4(在ZnSO4之前添加Ba(OH)2)进行处理，并将100μl的上清液移液到闪烁小瓶中并在烘箱中干燥过夜；将8ml闪烁流体添加到经过干燥的小瓶中或到50μl非干型上清液以在流体闪烁计数器中测量放射性。为了测量2-脱氧-D-[1-14C]葡萄糖，使用高氯酸Ba(OH)2/ZnSO4沉淀对脂肪组织和骨骼肌的裂解物进行处理(Ferre,P.等人,1985)。可以基于血清中的2-脱氧-D-[1-14C]-葡萄糖6-磷酸积聚和2-脱氧-D-[1-14C]-葡萄糖的特异性活性来计算体内到WAT、BAT和骨骼肌的葡萄糖摄取。
通过使Fst促进胰岛素抵抗的效应神经化，选择促进胰岛素抑制肝葡萄糖产生的Fst结合蛋白或特异性抗体作为生物活性候选物以增强胰岛素作用。
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