用于治疗癌症的方法和组合物

文档序号：245760 发布日期：2021-11-12 浏览：2601次 >En<

阅读说明：本技术 用于治疗癌症的方法和组合物 (Methods and compositions for treating cancer ) 是由詹尼弗·A·沃戈万切斯瓦兰·戈帕拉克里希南迈尔斯·C·安德鲁斯劳伦斯·齐特福格尔瓦莱于 2019-11-21 设计创作，主要内容包括：本文描述了用于治疗癌症和用于预测对象对检查点抑制剂联合疗法的应答的方法和组合物。本公开的方面涉及在对象中治疗癌症和/或降低针对疗法的毒性的方法,其包括向对象施用包含至少一种属于以下的属中的一者或多于一者的经分离或经纯化的细菌群体的组合物：解黄酮菌属、Dielma、阿克曼氏菌属、别样杆菌属、拟杆菌属、丁酸单胞菌属、吸血弧菌属、泰泽氏菌属、狄氏副拟杆菌、Fournierella、Fournierella massiliensis、Eisenbergiella tayi、蒂西耶氏菌目、Hungateiclostridium thermocellum、长链多尔氏菌、柯氏喜热菌、Muricomes、地生孢杆菌、沼泽普雷沃氏菌、嗜黑麦乳杆菌、芬氏拟杆菌、约氏乳杆菌、堆肥副土地杆菌和Anaerotignum lactatifermentans,并且其中所述方法还包括用(i)PD-1、PDL1或PDL2抑制剂和(ii)CTLA-4、B7-1或B7-2抑制剂的组合治疗对象。(Described herein are methods and compositions for treating cancer and for predicting a subject's response to checkpoint inhibitor combination therapy. Aspects of the present disclosure relate to methods of treating cancer and/or reducing toxicity to therapy in a subject comprising administering to the subject a composition comprising at least one isolated or purified bacterial population belonging to one or more than one of the genera: flavonolactobacillus, Dielma, akkermansia, xenorhabdus, bacteroides, butanomonas, haemophilus, terezuelis, parabacteroides dieselii, Fournierella maliensis, Eisenbergiella tayi, dicelia, hungatricelliforme themacellum, dolichopus longus, coxiella carolinae, Muricomes, geobacillus cereus, prevotella marylaniculata, lactobacillus secalophilus, bacteroides finnii, lactobacillus johnsonii, agrobacterium composted paramenia, and antiaerotica gntab transfer, and wherein the method further comprises treating the subject with a combination of (i) a PD-1, PDL1, or 2 inhibitor and (ii) a CTLA-4, B7-1, or B7-2 inhibitor.)

用于治疗癌症的方法和组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年11月21日提交的美国临时专利申请第62/770603号和2019年3月29日提交的美国临时专利申请第62/826631号的优先权权益，其通过引用整体并入本文。

发明背景

技术领域

本发明涉及分子生物学和医学领域。

背景技术

过去十年，通过靶向疗法和免疫疗法的使用，癌症治疗已取得了巨大的进步。通过阻断涉及CTLA-4和PD-1的免疫抑制性配体-受体相互作用，检查点阻断免疫疗法可减轻T淋巴细胞的主要抑制信号，从而增强潜在的T细胞介导的抗肿瘤免疫活性。然而，全身性抑制信号的普遍减轻也会激活对自体抗原反应性的T淋巴细胞，从而导致自体耐受性的丧失和免疫相关的不良事件。发生高度毒性的患者通常需要暂时或永久的停止治疗，并且可能需要长时间的重度免疫抑制以应对其毒性。在免疫疗法的各种治疗方案中，相比于以单一疗法给予相同药剂，抗CTLA-4和抗PD-1联合疗法提供了优异的应答率，然而，这被发生严重毒性的更高风险所抵消。抗CTLA-4和抗PD-1联合疗法高频率地发生严重到危及生命的毒性已成为临床医师开出这种治疗形式的限制因素。

虽然已发现了与患者对免疫检查点抑制剂疗法的应答相关的一些因素，但本领域仍需要因免疫检查点阻断疗法引起的毒性的预测和针对免疫检查点阻断联合疗法的应答者的预测。基于一种或多于一种生物标志物将患者分为可能和不可能对检查点阻断疗法经历毒性和/或有应答的患者，将为患者提供更有效且治疗性的治疗方法，因为可在疾病的进一步蔓延之前为患者提供最有效的治疗。

发明内容

本文描述了用于治疗癌症和用于预测对象对检查点抑制剂联合疗法的应答的方法和组合物。在一个方面，本公开涉及在对象中治疗癌症和/或降低疗法的毒性的方法，其包括向对象施用包含至少一种属于以下的属或种中的一者或多于一者的经分离或经纯化的细菌群体的组合物：解黄酮菌属(Flavonifractor)、Dielma、阿克曼氏菌属(Akkermansia)、别样杆菌属(Alistipes)、拟杆菌属(Bacteroides)、丁酸单胞菌属(Butyricimonas)、吸血弧菌属(Vampirovibrio)、泰泽氏菌属(Tyzzerella)、狄氏副拟杆菌(Parabacteroides distasonis)、Fournierella、Fournierella massiliensis、Eisenbergiella tayi、蒂西耶氏菌目(Tissierellales)、Hungateiclostridiumthermocellum、长链多尔氏菌(Dorea formicigenerans)、柯氏喜热菌(Caloramatorcoolhaasi)、Muricomes、地生孢杆菌(Geosporobacter)、沼泽普雷沃氏菌(Prevotellapaludivivens)、嗜黑麦乳杆菌(Lactobacillus secaliphilus)、芬氏拟杆菌(Bacteroidesfinegoldii)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、堆肥副土地杆菌(Parapedobactercomposti)和Anaerotignum lactatifermentans或图28C中公开的细菌种，并且其中所述方法还包括用(i)PD-1、PDL1或PDL2抑制剂和(ii)CTLA-4、B7-1或B7-2抑制剂的组合治疗对象。在一些实施方案中，组合物包含至少一种属于以下的属或种中的一者或多于一者的经分离或经纯化的细菌群体：解黄酮菌属、拟杆菌属、丁酸单胞菌属、Dielma、阿克曼氏菌属、别样杆菌属、粪便拟杆菌(Bacteroides stercoris)、狄氏副拟杆菌、Fournierella、Fournierella massiliensis、嗜粪拟杆菌(Bacteroides coprophilus)、Eisenbergiellatayi、蒂西耶氏菌目、Hungateiclostridium thermocellum。

在另一个方面，本公开涉及在对象中治疗癌症和/或降低疗法的毒性的方法，其包括向对象施用包含来自健康患者、来自确定对免疫检查点阻断单一疗法或联合疗法有应答的患者或来自确定对免疫检查点阻断单一疗法或联合疗法具有无毒性应答的患者的粪便的组合物，其中所述方法还包括用(i)PD-1、PDL1或PDL2抑制剂和(ii)CTLA-4、B7-1或B7-2抑制剂的组合治疗对象。在一些实施方案中，将粪便转移到对象的结肠或直肠中。

在另一个方面，本公开涉及减少或预防与联合检查点阻断疗法相关的不良事件的方法，其包括向对象施用组合物的步骤，所述组合物包含至少一种属于以下的属或种中的一者或多于一者的经分离或经纯化的细菌群体：解黄酮菌属、Dielma、阿克曼氏菌属、别样杆菌属、拟杆菌属、丁酸单胞菌属、吸血弧菌属、泰泽氏菌属、狄氏副拟杆菌、Fournierella、Fournierella massiliensis、Eisenbergiella tayi、蒂西耶氏菌目、Hungateiclostridium thermocellum、长链多尔氏菌、柯氏喜热菌、Muricomes、地生孢杆菌、沼泽普雷沃氏菌、嗜黑麦乳杆菌、芬氏拟杆菌、约氏乳杆菌、堆肥副土地杆菌和Anaerotignum lactatifermentans或图28C中公开的细菌种。

在另一个方面，本公开涉及在对象中治疗癌症和/或降低疗法的毒性的方法，其包括向确定在肠道微生物组中具有有利的微生物分布型的对象施用(i)PD-1、PDL1或PDL2抑制剂和(ii)CTLA-4、B7-1或B7-2抑制剂的组合。

在另一个方面，本公开涉及在患有癌症的对象中预测对免疫检查点抑制剂联合疗法的应答的方法，所述方法包括：检测由对象获得的样本中的微生物分布型；当在来自对象的样本中检测到拟杆菌属、戴阿利斯特菌属(Dialister)、Coprobacter、Intestinibacter属和副萨特氏菌属(Parasutterella)中的一者或多于一者的细菌时预测对疗法的毒性应答；或当在来自对象的样本中检测到脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、吸血弧菌属、泰泽氏菌属、长链多尔氏菌、柯氏喜热菌、Muricomes、Muricomes intestini、地生孢杆菌、地下地生孢杆菌(Geosporobacter subterraneus)、Anaerotignum lactatifermentans的属或种中的一者或多于一者的细菌时预测对疗法的无毒性应答。

在另一个方面，本公开涉及在患有癌症的对象中预测对免疫检查点抑制剂联合疗法的应答的方法，所述方法包括：检测由对象获得的样本中的微生物分布型；当在来自对象的样本中检测到有利的微生物分布型时预测对疗法的毒性应答；或当在来自对象的样本中检测到不利的微生物分布型时预测对疗法的无毒性应答。

在一些实施方案中，毒性应答包括一种或多于一种irAE。在一些实施方案中，毒性应答包括3级或高于3级的不良事件。在一些实施方案中，毒性应答包括间质性肺炎、结肠炎、甲状腺机能减退、肝功能障碍、皮疹、白癜风、下垂体炎、1型糖尿病、肾功能障碍、重症肌无力、神经病、肌炎和葡萄膜炎中的一种或多于一种。在一些实施方案中，毒性应答不包括间质性肺炎、结肠炎、甲状腺机能减退、肝功能障碍、皮疹、白癜风、下垂体炎、1型糖尿病、肾功能障碍、重症肌无力、神经病、肌炎中的一种或多于一种，并不包括葡萄膜炎。在一些实施方案中，irAE包括间质性肺炎、结肠炎、甲状腺机能减退、肝功能障碍、皮疹、白癜风、下垂体炎、1型糖尿病、肾功能障碍、重症肌无力、神经病、肌炎和葡萄膜炎中的一种或多于一种。在一些实施方案中，不包括间质性肺炎、结肠炎、甲状腺机能减退、肝功能障碍、皮疹、白癜风、下垂体炎、1型糖尿病、肾功能障碍、重症肌无力、神经病、肌炎和葡萄膜炎中的一种或多于一种。在一些实施方案中，方法不包括结肠炎的治疗和/或不包括诊断患有或具有结肠炎的患者。

在一些方面，当在来自对象的生物样本中检测到Robertkochia marina、产雌马酚阿德勒氏菌(Adlerrcreutizia equolifaciens)、胞内劳森氏菌(Lawsoniaintracellularis)或红条乳杆菌(Lactobacillus satsumensis)中的一者或多于一者时，预测对象是对CICB的无应答者。

在另一个方面，本公开涉及在对象中治疗癌症的方法，其包括(1)首先向对象施用包含经分离或经纯化的细菌群体的组合物，所述细菌群体包含至少一种属于选自以下的属或种的细菌：解黄酮菌属、Dielma、阿克曼氏菌属、别样杆菌属、拟杆菌属、丁酸单胞菌属、吸血弧菌属、泰泽氏菌属、狄氏副拟杆菌、Fournierella、Fournierella massiliensis、Eisenbergiella tayi、蒂西耶氏菌目、Hungateiclostridium thermocellum、长链多尔氏菌、柯氏喜热菌、Muricomes、地生孢杆菌、沼泽普雷沃氏菌、嗜黑麦乳杆菌、芬氏拟杆菌、约氏乳杆菌、堆肥副土地杆菌和Anaerotignum lactatifermentans，和(2)随后向对象施用基本上由(a)PD-1、PDL1或PDL2抑制剂和(2)CTLA-4、B7-1或B7-2抑制剂组成的联合免疫疗法。在一些实施方案中，所述经分离或经纯化的细菌群体包含至少一种属于以下的属或种的细菌：解黄酮菌属、拟杆菌属、丁酸单胞菌属、Dielma、阿克曼氏菌属、别样杆菌属、粪便拟杆菌、狄氏副拟杆菌、Fournierella、Fournierella massiliensis、嗜粪拟杆菌、Eisenbergiella tayi、蒂西耶氏菌目、Hungateiclostridium thermocellum。

在另一个方面，本公开涉及在患有癌症的对象中预测对免疫检查点抑制剂联合疗法的应答的方法，所述方法包括：检测由对象获得的样本中的微生物分布型；当在来自对象的样本中检测到粪便拟杆菌、丁酸单胞菌属、解黄酮菌属、Dielma、别样杆菌属和嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)的属或种中的一者或多于一者细菌时预测对疗法的有效应答；或当在来自对象的样本中检测到乳杆菌属(Lactobacillus)、脆弱拟杆菌和普雷沃氏菌(Prevotella)的属或种中的一者或多于一者的细菌时预测对疗法的无效应答。

在另一个方面，本公开涉及在患有癌症的对象中预测对免疫检查点抑制剂联合疗法的应答的方法，所述方法包括：检测由对象获得的样本中的微生物分布型；当在来自对象的样本中检测到有利的分布型时预测对疗法的有效应答；或当在来自对象的样本中检测到不利的分布型时预测对疗法的无效应答。

在另一个方面，本公开涉及的方法包括在对象中检测以下中的一者或多于一者：粪便拟杆菌、粪拟杆菌(Bacteroides caccae)、肠道拟杆菌(Bacteroides intestinalis)、戴阿利斯特菌属、脆弱拟杆菌、吸血弧菌属、泰泽氏菌属、粪便拟杆菌、珀氏解黄酮菌(Flavonifractor plautii)、Butyricimonas faecihominis、Alistipes indistinctus、Dielma fastidiosa、嗜黏蛋白阿克曼氏菌、罗氏乳杆菌(Lactobacillus rogosae)、脆弱拟杆菌、粪源普雷沃氏菌(Prevotella copri)和沙氏普雷沃氏菌(Prevotella shahii)。

在另一个方面，本公开涉及的方法包括在对象中检测以下中的一者或多于一者：粪便拟杆菌、粪拟杆菌、肠道拟杆菌、戴阿利斯特菌属、脆弱拟杆菌、吸血弧菌属、泰泽氏菌属、珀氏解黄酮菌、Dielma fastidiosa、Butyricimonas faecihominis、别样杆菌属、嗜黏蛋白阿克曼氏菌、罗氏乳杆菌(Clostridium hylemonae)、粪源普雷沃氏菌、沙氏普雷沃氏菌、柠檬酸杆菌属、海氏梭菌、Hungateiclostridium aldrichii、鼠柠檬酸杆菌(Citrobacter rodentium)、沟迹真杆菌(Eubacterium sulci)、哈夫尼菌科(Hafniaceae)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、霍氏真杆菌(Eubacterium halii)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、哈夫尼菌属(Hafnia)、人罗斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)、类肠膜魏斯氏菌(Weissella paramesenteroides)、肠杆菌属(Enterobacter)、芽孢杆菌属(Bacilli)、乳酸杆菌属(Lactobacillales)、产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、Coprobacter、Intestinibacterbartletti、Intestinibacter、Parasutterella secunda、产丙酸戴阿利斯特菌(Dialisterpropionicifaciens)、狄氏副拟杆菌、Fournierella、Fournierella massiliensis、嗜粪拟杆菌、Eisenbergiella tayi、蒂西耶氏菌目、Hungateiclostridium thermocellum、长链多尔氏菌、柯氏喜热菌、Muricomes、Muricomes intestini、地生孢杆菌、地下地生孢杆菌和Anaerotignum lactatifermentans或图28C中公开的细菌种。

在另一个方面，本公开涉及的方法包括在对象中检测以下中的一者或多于一者：粪便拟杆菌、粪拟杆菌、肠道拟杆菌、戴阿利斯特菌属、脆弱拟杆菌、吸血弧菌属、泰泽氏菌属、粪便拟杆菌、珀氏解黄酮菌、Dielma fastidiosa、嗜黏蛋白阿克曼氏菌、罗氏乳杆菌、脆弱拟杆菌、粪源普雷沃氏菌、沙氏普雷沃氏菌、厚壁菌门、梭菌目、瘤胃球菌科、Alistipesindistinctus、Bacteroides stercorirosoris、Clostridium lactatifermentans orus、Abyssivirga alkaniphila、Acetatifactor muris、解纤维素醋弧菌、产乙醇醋弧菌、牛无胆甾原体、德雷氏无色小杆菌、Acidovorax radices、产雌马酚阿德勒氏菌、嗜黏蛋白阿克曼氏菌、Alistipes indistinctus、Alistipes obesi、腐烂别样杆菌、塞内加尔别样杆菌、提蒙别样杆菌、糖发酵碱杆状菌、Alkalibaculum bacchi、狗粪别样棒菌(Allobaculumstercoricanis)、Anaerobacterium chartisolvens、Anaerocolumna cellulosilytica、运动厌氧生孢菌、Anaerotaenia torta、人结肠厌氧棍状菌、Anaerotruncus rubiinfantis、解嗅厌氧贪食菌、产酸拟杆菌Bacteroides caecimuris、多氏拟杆菌、Bacteroidesfaecichinchillae、腐蚀拟杆菌、Bacteroides stercorirosoris、解木聚糖拟杆菌、肠道巴恩斯氏菌、Beduini massiliensis、假长双歧杆菌、淤泥布劳特氏菌、Breznakiablatticola、Breznakia pachnodae、鸡盲肠丁酸球菌、穗状丁酸弧菌、Catabacterhongkongensis、Christensenella massiliensis、Christensenella minuta、Christensenella timonensis、耐氧梭菌、阿尔顿梭菌、碱纤维梭菌、芦笋状梭菌、速生梭菌、产纤维二糖梭菌、解纤维梭菌、鲜黄梭菌、耳蜗形梭菌、鹌鹑梭菌、海氏梭菌、吲哚梭菌、济州岛梭菌、发酵乳酸梭菌、拉华尔梭菌、甲基戊糖梭菌、乳清酸梭菌、水稻梭菌、溶纸莎草梭菌、解多糖梭菌、波氏梭菌、解糖梭菌、Clostridium saudiense、裂解梭菌、Clostridiumstraminisolvens、绿色梭菌、解木素梭菌、Coprobacter secundus、尖锐粪球菌、Culturomica massiliensis、Defluviitalea saccharophila、哥本哈根脱亚硫酸菌、还原金属脱亚硫酸杆菌、东方脱硫芽孢弯曲菌、脱硫脱硫弧菌、简单脱硫弧菌、产甲酸多尔氏菌、Eisenbergiella massiliensis、Emergencia timonensis、小肠肠球菌、居肠黏膜肠杆状菌、Enterorhabdus muris、Erysipelatoclostridium ramosum、幼虫丹毒丝菌、弗格森埃希氏菌、产粪甾醇真杆菌、长真杆菌、啮齿真杆菌、惰性真杆菌、多曲真杆菌、凸腹真杆菌、腐蚀栖粪杆菌、Flavimarina pacifica、珀氏解黄酮菌、Flintibacter butyricus、Gordonibacter faecihominis、耐盐纤细杆菌、Harryflintia acetispora、马赛霍兰德氏菌、解糖氢厌氧杆菌、Ihubacter massiliensis、Intestinimonas butyriciproducens、Irregularibacter muris、Lachnoclostridium pacaense、动物乳杆菌、粪乳杆菌、加氏乳杆菌、人乳杆菌、肠乳杆菌、约氏乳杆菌、路氏乳杆菌、罗氏乳杆菌、台湾乳杆菌、胞内劳森氏菌、Longibaculum muris、Marvinbryantia formatexigens、Millionella massiliensis、舍氏小螺菌、Muribaculum intestinale、Murimonas intestini、Natranaerovirgapectinivora、Neglecta timonensis、内脏臭气杆菌、Olsenella profusa、啮齿震颤杆菌、产戊酸震颤杆菌、食桂皮酸乳头杆菌、古氏副拟杆菌、香港副爱格氏菌、人类副萨特氏菌、Parvibacter caecicola、黑色消化球菌、Phocea massiliensis、托氏卟啉单胞菌(Porphyromonas catoniae)、口普雷沃氏菌、粪普雷沃氏菌、提蒙医院雷沃氏菌(Prevotellamassilia timonensis)、瘤胃假丁酸弧菌、多毛假解黄酮菌、Pseudoflavonifractor phocaeensis、Raoultibacter timonensis、Rhizobiumstraminoryzae、粪便罗斯拜瑞氏菌、人罗斯拜瑞氏菌、肠道罗斯拜瑞氏菌、Ruminiclostridium thermocellum、Ruminococcus champanellensis、粪瘤胃球菌、生黄瘤胃球菌、活泼瘤胃球菌、Ruthenibacterium lactatiformans、Sphingomonaskyeonggiensis、速生螺原体、白蚁孢杆菌、Stomatobaculum longum、少酸链球菌、Streptococcus danieliae、沃氏共养单胞菌、台湾栖温境单胞菌、加利福尼亚丁达尔氏菌、特斯科科湖丁达尔氏菌、血尿杆菌(Turicibacter sanguinis)、Turicimonas muris、Tyzzerella nexilis、Vallitalea pronyensis和嗜小球藻吸血弧菌。

在另一个方面，本公开涉及的组合物包含至少一种属于以下的属或种中的一者或多于一者的经分离或经纯化的细菌群体：解黄酮菌属、Dielma、阿克曼氏菌属、别样杆菌属、拟杆菌属、丁酸单胞菌属、吸血弧菌属、泰泽氏菌属、狄氏副拟杆菌、Fournierella、Fournierella massiliensis、Eisenbergiella tayi、蒂西耶氏菌目、Hungateiclostridium thermocellum、长链多尔氏菌、柯氏喜热菌、Muricomes、地生孢杆菌、沼泽普雷沃氏菌、嗜黑麦乳杆菌、芬氏拟杆菌、约氏乳杆菌、堆肥副土地杆菌和Anaerotignum lactatifermentans。

在一些实施方案中，所述组合物包含至少一种属于以下的属或种中的一者或多于一者的经分离或经纯化的细菌群体：解黄酮菌属、拟杆菌属、丁酸单胞菌属、Dielma、阿克曼氏菌属、别样杆菌属、粪便拟杆菌、狄氏副拟杆菌、Fournierella、Fournierellamassiliensis、嗜粪拟杆菌、Eisenbergiella tayi、蒂西耶氏菌目、Hungateiclostridiumthermocellum。

在另一个方面，本公开涉及的组合物包含至少两种属于以下的属或种中的一者或多于一者的经分离或经纯化的细菌群体：解黄酮菌属、Dielma、阿克曼氏菌属、别样杆菌属、拟杆菌属、丁酸单胞菌属、吸血弧菌属、泰泽氏菌属、狄氏副拟杆菌、Fournierella、Fournierella massiliensis、Eisenbergiella tayi、蒂西耶氏菌目、Hungateiclostridium thermocellum、长链多尔氏菌、柯氏喜热菌、Muricomes、地生孢杆菌、沼泽普雷沃氏菌、嗜黑麦乳杆菌、芬氏拟杆菌、约氏乳杆菌、堆肥副土地杆菌和Anaerotignum lactatifermentans。在一些实施方案中，组合物包含至少两种属于以下的属或种中的一者或多于一者的经分离或经纯化的细菌群体：解黄酮菌属、拟杆菌属、丁酸单胞菌属、Dielma、阿克曼氏菌属、别样杆菌属、粪便拟杆菌、狄氏副拟杆菌、Fournierella、Fournierella massiliensis、嗜粪拟杆菌、Eisenbergiella tayi、蒂西耶氏菌目、Hungateiclostridium thermocellum。

在另一个方面，本公开涉及的组合物包含以下的至少一种、至少两种、或3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、15种或20种(或其中任何可派生范围)的经分离或经纯化的菌群：狄氏副拟杆菌、Fournierella、Fournierella massiliensis、Eisenbergiella tayi、蒂西耶氏菌目、Hungateiclostridium thermocellum、长链多尔氏菌、柯氏喜热菌、Muricomes、地生孢杆菌、沼泽普雷沃氏菌、嗜黑麦乳杆菌、芬氏拟杆菌、约氏乳杆菌、堆肥副土地杆菌、解黄酮菌属、拟杆菌属、丁酸单胞菌属、Dielma、阿克曼氏菌属、别样杆菌属、Anaerotignum lactatifermentans、嗜粪拟杆菌、粪便拟杆菌、粪拟杆菌、肠道拟杆菌、戴阿利斯特菌属、脆弱拟杆菌、吸血弧菌属、泰泽氏菌属、粪便拟杆菌、珀氏解黄酮菌、Dielmafastidiosa、嗜黏蛋白阿克曼氏菌、罗氏乳杆菌、脆弱拟杆菌、粪源普雷沃氏菌、沙氏普雷沃氏菌、厚壁菌门、梭菌目、瘤胃球菌科、Alistipes indistinctus、Bacteroidesstercorirosoris、Clostridium lactatifermentans orus、Abyssivirga alkaniphila、Acetatifactor muris、解纤维素醋酸弧菌、产乙醇醋酸弧菌、牛无胆甾原体、德雷氏无色小杆菌、Acidovorax radices、产雌马酚阿德勒氏菌、嗜黏蛋白阿克曼氏菌、Alistipesindistinctus、Alistipes obesi、腐烂别样杆菌、塞内加尔别样杆菌、提蒙别样杆菌、糖发酵碱杆状菌、Alkalibaculum bacchi、狗粪别样棒菌、Anaerobacterium chartisolvens、Anaerocolumna cellulosilytica、运动厌氧生孢菌、Anaerotaenia torta、人结肠厌氧棍状菌、Anaerotruncus rubiinfantis、解嗅厌氧贪食菌、产酸拟杆菌、Bacteroidescaecimuris、多氏拟杆菌、Bacteroides faecichinchillae、腐蚀拟杆菌、Bacteroidesstercorirosoris、解木聚糖拟杆菌、肠道巴恩斯氏菌、Beduini massiliensis、假长双歧杆菌、淤泥布劳特氏菌、Breznakia blatticola、Breznakia pachnodae、鸡盲肠丁酸球菌、穗状丁酸弧菌、Catabacter hongkongensis、Christensenella massiliensis、Christensenella minuta、Christensenella timonensis、耐氧梭菌、阿尔顿梭菌、碱纤维梭菌、芦笋状梭菌、快生梭菌、产纤维二糖梭菌、解纤维素梭菌、鲜黄梭菌、螺蜗形梭菌、鹌鹑梭菌、海氏梭菌、吲哚梭菌、济州岛梭菌、发酵乳酸梭菌、拉华尔梭菌、甲基戊糖梭菌、乳清酸梭菌、水稻梭菌、解溶纸梭菌、解多糖梭菌、杨木梭菌、解糖梭菌、Clostridium saudiense、裂解梭菌、Clostridium straminisolvens、绿色梭菌、解木聚糖梭菌、Coprobactersecundus、规则粪球菌、Culturomica massiliensis、Defluviitalea saccharophila、哥本哈根脱亚硫酸杆菌、还原金属脱亚硫酸杆菌、东方脱硫弯曲孢菌、脱硫脱硫弧菌、简单脱硫弧菌、产甲酸多尔氏菌、Eisenbergiella massiliensis、Emergencia timonensis、海氏肠球菌、居肠黏膜肠杆状菌、Enterorhabdus muris、Erysipelatoclostridium ramosum、幼虫丹毒丝菌、弗氏埃希氏菌、产粪甾醇真杆菌、长真杆菌、啮齿真杆菌、惰性真杆菌、多曲真杆菌、凸腹真杆菌、腐蚀栖粪杆菌、Flavimarina pacifica、珀氏解黄酮菌、Flintibacterbutyricus、Gordonibacter faecihominis、耐盐纤细杆菌、Harryflintia acetispora、马赛霍兰德氏菌、解糖氢厌氧杆菌、Ihubacter massiliensis、Intestinimonasbutyriciproducens、Irregularibacter muris、Lachnoclostridium pacaense、动物乳杆菌、粪乳杆菌、加氏乳杆菌、人乳杆菌、肠乳杆菌、约氏乳杆菌、路氏乳杆菌、罗氏乳杆菌、台湾乳杆菌、胞内劳森氏菌、Longibaculum muris、Marvinbryantia formatexigens、Millionella massiliensis、舍氏小螺菌、Muribaculum intestinale、Murimonasintestini、Natranaerovirga pectinivora、Neglecta timonensis、内脏臭气杆菌、Olsenella profusa、啮齿震颤杆菌、产戊酸震颤杆菌、食桂皮酸乳头杆菌、古氏副拟杆菌、香港副爱格氏菌、人类副萨特氏菌、Parvibacter caecicola、黑色消化球菌、Phoceamassiliensis、卡托氏卟啉单胞菌、口普雷沃氏菌、粪普雷沃氏菌、提蒙医院普雷沃氏菌、瘤胃假丁酸弧菌、多毛假解黄酮菌、Pseudflavonifractor phocaeensis、Raoultibactertimonensis、Rhizobium straminoryzae、粪便罗斯拜瑞氏菌、人罗斯拜瑞氏菌、肠道罗斯拜瑞氏菌、Ruminiclostridium thermocellum、Ruminococcus champanellensis、粪瘤胃球菌、生黄瘤胃球菌、活泼瘤胃球菌、Ruthenibacterium lactatiformans、Sphingomonaskyeonggiensis、速生螺原体、白蚁孢杆菌、Stomatobaculum longum、少酸链球菌、Streptococcus danieliae、沃氏共养单胞菌、台湾栖温境单胞菌、加利福尼亚丁达尔氏菌、特斯科科湖丁达尔氏菌、血尿杆菌、Turicimonas muris、Tyzzerella nexilis、Vallitaleapronyensis和/或嗜小球藻吸血弧菌。

在一些实施方案中，组合物包含或还包含至少一种属于以下种中的一者或多于一者经分离或经纯化的细菌群体：解黄酮菌属、粪便拟杆菌、Butyricimonas faecihominis、Dielma、阿克曼氏菌属和Alistipes indistinctus。在一些实施方案中，组合物不包括粪便拟杆菌。在一些实施方案中，组合物包含或还包含至少一种属于Dielma和阿克曼氏菌属中的一者或多于一者的经分离或经纯化的细菌群体。在一些实施方案中，组合物包含或还包含至少一种属于别样杆菌属、Dielma和阿克曼氏菌属中的一者或多于一者的经分离或经纯化的细菌群体。在一些实施方案中，组合物包含或还包含至少一种属于阿克曼氏菌属的经分离或经纯化的细菌群体。在一些实施方案中，组合物包含或还包含至少一种经分离或经纯化的嗜黏蛋白阿克曼氏菌菌群。在一些实施方案中，组合物包含或还包含包含嗜黏蛋白阿克曼氏菌和Dielma fastidiosa以及Alistipes indistinctus中的一者或多于一者的细菌群体。在一些实施方案中，解黄酮菌属的细菌包括珀氏解黄酮菌。在一些实施方案中，组合物包含或还包含至少一种属于以下的属或种中的一者或多于一者的经分离或经纯化的细菌群体：脆弱拟杆菌、吸血弧菌属、泰泽氏菌属、长链多尔氏菌、柯氏喜热菌、Muricomes、Muricomes intestini、地生孢杆菌、地下地生孢杆菌、Anaerotignum lactatifermentans。在一些实施方案中，组合物包含或还包含至少一种经分离或经纯化的肠道拟杆菌菌群。在一些实施方案中，组合物包含或还包含至少一种属于厚壁菌门、梭菌目和瘤胃球菌科的经分离或经纯化的细菌群体。在一些实施方案中，组合物包含或还包含珀氏解黄酮菌和/或Dielma fastidiosa。在一些实施方案中，组合物包含或还包含粪便拟杆菌、Butyricimonasfaecihominis、珀氏解黄酮菌、Dielma fastidiosa、Alistipes indistinctus和嗜黏蛋白阿克曼氏菌。

在一些实施方案中，组合物包含少于1×10⁵、1×10⁴、1×10³或1×10²个的归类为厚壁菌门、梭菌目和瘤胃球菌科的细菌的CFU或细胞(或其中任何可推导出的范围)。在一些实施方案中，组合物包含少于1×10⁵、1×10⁴、1×10³或1×10²个的属于瘤胃球菌科、梭菌科、毛螺旋菌科、微球菌科和/或韦荣氏球菌科的细菌的CFU或细胞(或其中任何可派生范围)。

在一些实施方案中，癌症为皮肤癌。在一些实施方案中，癌症为基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、黑色素瘤、隆凸性皮肤纤维肉瘤、默克尔细胞癌、卡波西肉瘤、角化棘皮瘤、梭形细胞肿瘤、皮脂腺癌、微囊性附属器癌、乳腺佩吉特病、非典型纤维黄瘤、平滑肌肉瘤或血管肉瘤。在一些实施方案中，癌症为黑色素瘤。在一些实施方案中，黑色素瘤为转移性黑色素瘤、恶性雀斑样痣、恶性雀斑样痣黑色素瘤、浅表扩散性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、肢端雀斑样痣黑色素瘤、皮肤黑色素瘤或促结缔组织增生性黑色素瘤。在一些实施方案中，癌症包括皮肤黑色素瘤。

在一些实施方案中，癌症包括复发性癌症。在一些实施方案中，癌症包括复发性转移性癌症。在一些实施方案中，癌症包括原发肿瘤区域中癌症的复发。在一些实施方案中，癌症包括转移性癌症。在一些实施方案中，癌症包括III期或IV期癌症。在一些实施方案中，癌症包括I期或II期癌症。在一些实施方案中，癌症不包括I期或II期癌症。

在一些实施方案中，所述方法还包括施用至少一种附加的抗癌治疗。在一些实施方案中，所述至少一种附加的抗癌治疗为手术疗法、化学疗法、放射疗法、激素疗法、免疫疗法、小分子疗法、受体激酶抑制剂疗法、抗血管生成疗法、细胞因子疗法、冷冻疗法或生物疗法。在一些实施方案中，所述附加的抗癌治疗包括本文所述的癌症治疗。

在一些实施方案中，(i)PD-1、PDL1或PDL2抑制剂、(ii)CTLA-4、B7-1或B7-2抑制剂和/或至少一种附加的抗癌治疗通过瘤内、动脉内、静脉内、血管内、胸膜内、腹膜内、气管内、鞘内、肌肉内、内镜下、病灶内、经皮、皮下、区域性地、定向地、经口或通过直接注射或灌注施用。在一些实施方案中，施用途径为本文描述的途径。

在一些实施方案中，方法被定义为在诊断患有癌症的对象中治疗癌症的方法。在一些实施方案中，方法包括或还包括减少或预防一种或多于一种不良事件。在一些实施方案中，方法包括或还包括减少或预防一种或多于一种严重的不良事件。在一些实施方案中，治疗癌症包括减少或预防一种或多于一种严重的不良事件。在一些实施方案中，方法用于降低免疫疗法如免疫检查点阻断联合疗法的毒性。在一些实施方案中，降低毒性包括减少不良事件。在一些实施方案中，不良事件或严重的不良事件还归类为免疫相关的不良事件。在一些实施方案中，方法包括预防或减少免疫相关的不良事件。在一些实施方案中，不良事件归类为严重的不良事件。在一些实施方案中，预防3级或高于3级的不良事件。不良事件的级别通过本领域已知的方法评定，例如，根据不良事件的NCI通用术语标准(CTCAE)评定。

在一些实施方案中，已确定对象在肠道微生物组中具有不利的微生物分布型。在一些实施方案中，不利的分布型包括包含属于拟杆菌属、戴阿利斯特菌属、Coprobacter、肠杆菌属和副萨特氏菌属中的一者或多于一者的细菌的细菌群体。在一些实施方案中，不利的分布型包括包含粪便拟杆菌、粪拟杆菌、肠道拟杆菌、Coprobacter、Intestinibacterbartletti、Parasutterella secunda和产丙酸戴阿利斯特菌中的一者或多于一者的细菌群体。在一些实施方案中，不利的分布型包括Erysipelatoclostridium ramosum。在一些实施方案中，不利的分布型包括包含属于以下的属中的一者或多于一者的细菌的细菌群体：乳杆菌属、拟杆菌属、普雷沃氏菌属、柠檬酸杆菌属、梭菌属、Hungateiclostridium、真杆菌属、哈夫尼菌科、肠杆菌属、哈夫尼菌属、罗斯拜瑞氏菌属、魏斯氏菌属、芽孢杆菌属、乳酸杆菌属和克雷伯氏菌属。在一些实施方案中，不利的分布型包括包含以下的一者或多于一者的细菌群体：罗氏乳杆菌、脆弱拟杆菌、粪源普雷沃氏菌和沙氏普雷沃氏菌。在一些实施方案中，不利的分布型包括以下的一者或多于一者：粪源普雷沃氏菌、沙氏普雷沃氏菌、丁酸弧菌属、氢养布劳特氏菌、脆弱拟杆菌、穗状丁酸弧菌、乳酸杆菌属、乳杆菌属、乳杆菌科、罗氏乳杆菌、嗜糖梭菌和马赛巨球形菌。在一些实施方案中，不利的分布型包括以下的至少、至多或恰好1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种或13种(或其任何可派生范围)：柠檬酸杆菌属、海氏梭菌、Hungateiclostridium aldrichii、鼠柠檬酸杆菌、沟迹真杆菌、哈夫尼菌科、弗氏柠檬酸杆菌、霍氏真杆菌、阴沟肠杆菌、蜂房哈夫尼菌、哈夫尼菌属、人罗斯拜瑞氏菌、类肠膜魏斯氏菌、肠杆菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌目、产气克雷伯氏菌、克雷伯氏菌属、肠道拟杆菌、Coprobacter、Intestinibacter bartletti、Intestinibacter、Parasutterella secunda、产丙酸戴阿利斯特菌、粪源普雷沃氏菌、沙氏普雷沃氏菌、丁酸弧菌属、氢养布劳特氏菌、脆弱拟杆菌、穗状丁酸弧菌、乳杆菌目、乳杆菌属、乳杆菌科、罗氏乳杆菌、嗜糖梭菌和马赛巨球形菌。在一些实施方案中，不利的分布型还归类为无应答分布型或无效分布型。无应答分布型是指对象中，特别是对象的肠道中的微生物分布型，其存在于对免疫检查点阻断联合疗法无应答的对象中。在一些实施方案中，无应答分布型包括以下中至少、至多或恰好1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种或25种(或其任何可派生范围)：柠檬酸杆菌属、海氏梭菌、Hungateiclostridium aldrichii、鼠柠檬酸杆菌、沟迹真杆菌、哈夫尼菌科、弗氏柠檬酸杆菌、霍氏真杆菌、阴沟肠杆菌、蜂房哈夫尼菌、哈夫尼菌属、人罗斯拜瑞氏菌、类肠膜魏斯氏菌、肠杆菌属、罗氏乳杆菌、芽孢杆菌属、乳酸杆菌属、产气克雷伯氏菌、克雷伯氏菌属、粪源普雷沃氏菌、沙氏普雷沃氏菌、丁酸弧菌属、氢养布劳特氏菌、脆弱拟杆菌、穗状丁酸弧菌、乳酸杆菌属、乳杆菌属、乳杆菌科、罗氏乳杆菌、嗜糖梭菌和马赛巨球形菌。在一些实施方案中，不利的分布型包括以下的一者或多于一者：粪便拟杆菌、粪拟杆菌、Negativicutes、肠道拟杆菌、梭菌种、梭状梭菌和戴阿利斯特菌属。在一些实施方案中，不利的分布型包括以下的至少、至多或恰好1种、2种、3种、4种、5种、6种或7种(或其任何可派生范围)：Coprobacter、Intestinibacter bartletti、Intestinibacter、Parasutterella secunda、产丙酸戴阿利斯特菌、粪便拟杆菌、粪拟杆菌、Negativicutes、肠道拟杆菌、梭菌种、梭状梭菌和戴阿利斯特菌属。在一些实施方案中，不利的分布型还归类为毒性相关的分布型。毒性相关的分布型是指对象中，特别是对象的肠道中的微生物分布型，其存在于因免疫检查点阻断联合疗法而经历毒性的对象中。在一些实施方案中，无应答分布型包括以下的至少、至多或恰好1种、2种、3种、4种、5种、6种或7种(或其任何可派生范围)：粪便拟杆菌、粪拟杆菌、Negativicutes、肠道拟杆菌、梭菌种、梭状梭菌和戴阿利斯特菌属。

在一些实施方案中，属于以下的属或种的细菌的相对丰度被确定为至少10％：柠檬酸杆菌属、海氏梭菌、Hungateiclostridium aldrichii、鼠柠檬酸杆菌、沟迹真杆菌、哈夫尼菌科、弗氏柠檬酸杆菌、霍氏真杆菌、阴沟肠杆菌、蜂房哈夫尼菌、哈夫尼菌属、人罗斯拜瑞氏菌、类肠膜魏斯氏菌、肠杆菌属、罗氏乳杆菌、芽孢杆菌属、乳杆菌目、产气克雷伯氏菌、克雷伯氏菌属、肠道拟杆菌、Coprobacter、Intestinibacter bartletti、Intestinibacter、Parasutterella secunda、产丙酸戴阿利斯特菌、拟杆菌属、戴阿利斯特菌属、乳杆菌属和/或普雷沃氏菌属。术语相对丰度为在一定区域如来自对象的样本中相对于生物总数的特定种类生物的百分数组成。在一些实施方案中，属于以下的属或种的细菌被确定以至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)的相对丰度存在：柠檬酸杆菌属、海氏梭菌、Hungateiclostridium aldrichii、鼠柠檬酸杆菌、沟迹真杆菌、哈夫尼菌科、弗氏柠檬酸杆菌、霍氏真杆菌、阴沟肠杆菌、蜂房哈夫尼菌、哈夫尼菌属、人罗斯拜瑞氏菌、类肠膜魏斯氏菌、肠杆菌属、罗氏乳杆菌、芽孢杆菌属、乳杆菌目、产气克雷伯氏菌、克雷伯氏菌属、肠道拟杆菌、Coprobacter、Intestinibacter bartletti、Intestinibacter、Parasutterella secunda、产丙酸戴阿利斯特菌、戴阿利斯特菌属、乳杆菌属、拟杆菌属和/或普雷沃氏菌属。在一些实施方案中，归类为以下的一者或多于一者的细菌的合并相对丰度被确定为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)：柠檬酸杆菌属、海氏梭菌、Hungateiclostridium aldrichii、鼠柠檬酸杆菌、沟迹真杆菌、哈夫尼菌科、弗氏柠檬酸杆菌、霍氏真杆菌、阴沟肠杆菌、蜂房哈夫尼菌、哈夫尼菌属、人罗斯拜瑞氏菌、类肠膜魏斯氏菌、肠杆菌属、罗氏乳杆菌、芽孢杆菌属、乳杆菌目、产气克雷伯氏菌、克雷伯氏菌属、肠道拟杆菌、Coprobacter、Intestinibacter bartletti、Intestinibacter、Parasutterella secunda、产丙酸戴阿利斯特菌、戴阿利斯特菌属、乳杆菌属、拟杆菌属和/或普雷沃氏菌属。在一些实施方案中，属于拟杆菌属的细菌的相对丰度被确定为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)。在一些实施方案中，属于戴阿利斯特菌属的细菌的相对丰度被确定为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)。在一些实施方案中，属于乳杆菌属的细菌的相对丰度被确定为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)。在一些实施方案中，属于普雷沃氏菌属的细菌的相对丰度被确定为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)。

在一些实施方案中，方法还包括将在来自患者的样本中测得的微生物分布型与对照样品相比较。对照可以是衍生自从针对免疫检查点阻断联合疗法为无应答者、应答者、经历毒性或不经历毒性的患者中所取的样本的微生物分布型。

在一些实施方案中，通过分析来自对象的样本中的微生物组确定对象包含不利的微生物分布型。在一些实施方案中，样本为粪便样本或口腔样本。在一些实施方案中，分析包括进行16S核糖体测序和/或宏基因组学全基因组测序。

在一些实施方案中，对象已在先前治疗过癌症。在一些实施方案中，已确定对象是对先前的治疗的无应答者。在一些实施方案中，已确定患者对先前的治疗具有毒性应答。在一些实施方案中，先前的治疗包括免疫检查点阻断单一疗法或免疫检查点阻断联合疗法。在一些实施方案中，先前的治疗包括仅包含PD-1、PDL1、PDL2、CTLA-4、B7-1或B7-2抑制剂中一种的免疫检查点阻断单一疗法。在一些实施方案中，免疫检查点阻断联合疗法包括(i)PD-1、PDL1或PDL2抑制剂和(ii)CTLA-4、B7-1或B7-2抑制剂的组合。在一些实施方案中，(i)为PD-1抗体和/抑制剂，(ii)为CTLA-4抑制剂。在一些实施方案中，(i)为抗PD-1单克隆抗体和/或(ii)为抗CTLA-4单克隆抗体。在一些实施方案中，(i)包括纳武单抗、帕博利珠单抗或匹地利珠单抗。在一些实施方案中，(ii)包括伊匹单抗或曲美木单抗。在一些实施方案中，对象先前已接受过免疫检查点阻断单一疗法或免疫检查点阻断联合疗法的治疗。

在一些实施方案中，在(i)和(ii)中的治疗之前或同时用经分离的细菌群体治疗对象。在一些实施方案中，在(i)和(ii)中的治疗之后用经分离的细菌群体治疗对象。在一些实施方案中，用微生物组合物的治疗在用(i)和(ii)的抑制剂的治疗之前或之后至少或至多1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时或24小时或者1天、2天、3天、4天、5天或6天或者1周、2周、3周、4周、5周或6周(或其中任何可派生范围)时进行。在一些实施方案中，用微生物组合物的治疗在用(i)和(ii)的抑制剂的治疗的至少或至多1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时或24小时或者1天、2天、3天、4天、5天或6天或者1周、2周、3周、4周、5周或6周(或其中任何可派生范围)内进行。

在一些实施方案中，经纯化的细菌群体包含来自至少两个属或种的细菌，并且其中两种细菌的比为1:1。在一些实施方案中，经纯化的细菌群体包含来自至少、至多或恰好1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、14种、16种、20种、30种、40种或50种(或其中任何可派生范围)不同的细菌科、属或种的细菌。在一些实施方案中，组合物中存在的一个科、属或种的细菌与另一个科、属或种的细菌的比为至少、至多或恰好1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100、1:150、1:200、1:250、1:300、1:350、1:400、1:450、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1000、1:1500、1:2000、1:2500、1:3000、1:3500、1:4000、1:4500、1:5000、1:1550、1:6000、1:6500、1:7000、1:7500、1:8000、1:8500、1:9000、1:9500、1:10000、1:1200、1:14000、1:16000、1:18000、1:20000、1:30000、1:40000、1:50000、1:60000、1:70000、1:80000、1:90000或1:100000(或其中任何可派生范围)。

在一些实施方案中，组合物提供至少、至多或恰好为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20的α多样性。计算α多样性的方法是本领域已知的。例如，可使用逆辛普森指数来估计样本的分类学α多样性，其在实施例1中描述。在一些实施方案中，组合物以有效量施用。在一些实施方案中，有效量包括在对象中提供至少、至多或恰好为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20(或其中任何可派生范围)的α多样性的量。

在一些实施方案中，属于以下的属或种的细菌：解黄酮菌属、Dielma、阿克曼氏菌属、别样杆菌属、拟杆菌属、丁酸单胞菌属、吸血弧菌属、泰泽氏菌属、狄氏副拟杆菌、Fournierella、Fournierella massiliensis、Eisenbergiella tayi、蒂西耶氏菌目、Hungateiclostridium thermocellum、长链多尔氏菌、柯氏喜热菌、Muricomes、地生孢杆菌、沼泽普雷沃氏菌、嗜黑麦乳杆菌、芬氏拟杆菌、约氏乳杆菌、堆肥副土地杆菌和Anaerotignum lactatifermentans以至少、至多或恰好1×10³个、1×10⁴个、1×10⁵个、1×10⁶个、1×10⁷个、1×10⁸个、1×10⁹个、1×10¹⁰个、1×10¹¹个、1×10¹²个、1×10¹³个、1×10¹⁴个、1×10¹⁵个或1×10¹⁶个细胞或CFU(或其中任何可派生范围)的量施用。在一些实施方案中，属于以下的属或种的细菌：解黄酮菌属、拟杆菌属、丁酸单胞菌属、Dielma、阿克曼氏菌属、别样杆菌属、粪便拟杆菌、狄氏副拟杆菌、Fournierella、Fournierella massiliensis、嗜粪拟杆菌、Eisenbergiella tayi、蒂西耶氏菌目、Hungateiclostridium thermocellum以至少、至多或恰好1×10³个、1×10⁴个、1×10⁵个、1×10⁶个、1×10⁷个、1×10⁸个、1×10⁹个、1×10¹⁰个、1×10¹¹个、1×10¹²个、1×10¹³个、1×10¹⁴个、1×10¹⁵个或1×10¹⁶个细胞或CFU(或其中任何可派生范围)的量施用。在一些实施方案中，施用的细菌的总量为至少、至多或恰好1×10³个、1×10⁴个、1×10⁵个、1×10⁶个、1×10⁷个、1×10⁸个、1×10⁹个、1×10¹⁰个、1×10¹¹个、1×10¹²个、1×10¹³个、1×10¹⁴个、1×10¹⁵个或1×10¹⁶个细胞或CFU(或其中任何可派生范围)。在一些实施方案中，细菌如特定种类的细菌的具体量可为至少、至多或恰好1×10³个、1×10⁴个、1×10⁵个、1×10⁶个、1×10⁷个、1×10⁸个、1×10⁹个、1×10¹⁰个、1×10¹¹个、1×10¹²个、1×10¹³个、1×10¹⁴个、1×10¹⁵个或1×10¹⁶个细胞或CFU(或其中任何可派生范围)。在一些实施方案中，组合物可含有至少、至多或恰好至少、至多或恰好1×10³个、1×10⁴个、1×10⁵个、1×10⁶个、1×10⁷个、1×10⁸个、1×10⁹个、1×10¹⁰个、1×10¹¹个、1×10¹²个、1×10¹³个、1×10¹⁴个、1×10¹⁵个或1×10¹⁶个的来自本文描述的细菌的门、科、属或种的细胞或CFU(或其中任何可派生范围)。在一些实施方案中，组合物可含有少于至少、至多或恰好1×10⁶个、1×10⁵个、1×10⁴个、1×10³个或1×10²个的来自本文描述的细菌的门、科、属或种的细胞或CFU(或其中任何可派生范围)。

在一些实施方案中，所述方法还包括施用抗生素。在一些实施方案中，抗生素可为广谱抗生素。在一些实施方案中，施用至少1种、2种、3种、4种或5种抗生素的混合物。在一些实施方案中，抗生素包括氨苄西林、链霉素和黏菌素及其组合。在一些实施方案中，在包含至少一种经分离或经纯化的细菌群体的组合物之前施用抗生素。在一些实施方案中，与包含至少一种经分离或经纯化的细菌群体的组合物同时施用抗生素。在一些实施方案中，在微生物组合物之前或之后至少或至多1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时或24小时或者1天、2天、3天、4天、5天或6天或者1周、2周、3周、4周、5周或6周(或其中任何可派生范围)时施用抗生素。

在一些实施方案中，有利的分布型包括包含属于拟杆菌属、吸血弧菌属和泰泽氏菌属中的一者或多于一者的细菌的细菌群体。在一些实施方案中，有利的分布型包括包含以下中的一者或多于一者的细菌群体：脆弱拟杆菌、吸血弧菌属、泰泽氏菌属、长链多尔氏菌、柯氏喜热菌、Muricomes、Muricomes intestini、地生孢杆菌、地下地生孢杆菌、Anaerotignum lactatifermentans。在一些实施方案中，有利的分布型包含相对丰度小于30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的厚壁菌门、梭菌目和瘤胃球菌科中的一者或多于一者的细菌。在一些实施方案中，有利的分布型包括包含以下中的一者或多于一者的细菌群体：狄氏副拟杆菌、Fournierella、Fournierellamassiliensis、嗜粪拟杆菌、Eisenbergiella tayi、蒂西耶氏菌目、Hungateiclostridiumthermocellum、长链多尔氏菌、柯氏喜热菌、Muricomes、Muricomes intestini、地生孢杆菌、地下地生孢杆菌、Anaerotignum lactatifermentans、脆弱拟杆菌、吸血弧菌属、泰泽氏菌属、嗜黏蛋白阿克曼氏菌、粪便拟杆菌、Dielma fastidiosa、厚壁菌门、梭菌目、瘤胃球菌科、珀氏解黄酮菌、Alistipes indistinctus、嗜黏蛋白阿克曼氏菌、Bacteroidesstercorirosoris、Clostridium lactatifermentans orus、Abyssivirga alkaniphila、Acetatifactor muris、解纤维素醋酸弧菌、产乙醇醋酸弧菌、牛无胆甾原体、德雷氏无色小杆菌、Acidovorax radices、产雌马酚阿德勒氏菌、嗜黏蛋白阿克曼氏菌、Alistipesindistinctus、Alistipes obesi、腐烂别样杆菌、塞内加尔别样杆菌、提蒙别样杆菌、糖发酵碱杆状菌、Alkalibaculum bacchi、狗粪别样棒菌、Anaerobacterium chartisolvens、Anaerocolumna cellulosilytica、运动厌氧生孢菌、Anaerotaenia torta、人结肠厌氧棍状菌、Anaerotruncus rubiinfantis、解嗅厌氧贪食菌、产酸拟杆菌、Bacteroidescaecimuris、多氏拟杆菌、Bacteroides faecichinchillae、腐蚀拟杆菌、Bacteroidesstercorirosoris、解木聚糖拟杆菌、肠道巴恩斯氏菌、Beduini massiliensis、假长双歧杆菌、淤泥布劳特氏菌、Breznakia blatticola、Breznakia pachnodae、鸡盲肠丁酸球菌、穗状丁酸弧菌、Catabacter hongkongensis、Christensenella massiliensis、Christensenella minuta、Christensenella timonensis,耐氧梭菌、阿尔顿梭菌、碱纤维梭菌、芦笋状梭菌、快生梭菌、产纤维二糖梭菌、解纤维素梭菌、鲜黄梭菌、螺蜗形梭菌、鹌鹑梭菌、海氏梭菌、吲哚梭菌、济州岛梭菌、发酵乳酸梭菌、拉华尔梭菌、甲基戊糖梭菌、乳清酸梭菌、水稻梭菌、解溶纸梭菌、解多糖梭菌、杨木梭菌、解糖梭菌、Clostridium saudiense、裂解梭菌、Clostridium straminisolvens、绿色梭菌、解木聚糖梭菌、Coprobactersecundus、规则粪球菌、Culturomica massiliensis、Defluviitalea saccharophila、哥本哈根脱亚硫酸杆菌、还原金属脱亚硫酸杆菌、东方脱硫弯曲孢菌、脱硫脱硫弧菌、简单脱硫弧菌、产甲酸多尔氏菌、Eisenbergiella massiliensis、Emergencia timonensis、海氏肠球菌、居肠黏膜肠杆状菌、Enterorhabdus muris、Erysipelatoclostridium ramosum、幼虫丹毒丝菌、弗氏埃希氏菌、产粪甾醇真杆菌、长真杆菌、啮齿真杆菌、惰性真杆菌、多曲真杆菌、凸腹真杆菌、腐蚀栖粪杆菌、Flavimarina pacifica、珀氏解黄酮菌、Flintibacterbutyricus、Gordonibacter faecihominis、耐盐纤细杆菌、Harryflintia acetispora、马赛霍兰德氏菌、解糖氢厌氧杆菌、Ihubacter massiliensis、Intestinimonasbutyriciproducens、Irregularibacter muris、Lachnoclostridium pacaense、动物乳杆菌、粪乳杆菌、加氏乳杆菌、人乳杆菌、肠乳杆菌、约氏乳杆菌、路氏乳杆菌、罗氏乳杆菌、台湾乳杆菌、胞内劳森氏菌、Longibaculum muris、Marvinbryantia formatexigens、Millionella massiliensis、舍氏小螺菌、Muribaculum intestinale、Murimonasintestini、Natranaerovirga pectinivora、Neglecta timonensis、内脏臭气杆菌、Olsenella profusa、啮齿震颤杆菌、产戊酸震颤杆菌、食桂皮酸乳头杆菌、古氏副拟杆菌、香港副爱格氏菌、人类副萨特氏菌、Parvibacter caecicola、黑色消化球菌、Phoceamassiliensis、卡托氏卟啉单胞菌、口普雷沃氏菌、粪普雷沃氏菌、提蒙医院普雷沃氏菌、瘤胃假丁酸弧菌、多毛假解黄酮菌、Pseudoflavonifractor phocaeensis、Raoultibactertimonensis、Rhizobium straminoryzae、粪便罗斯拜瑞氏菌、人罗斯拜瑞氏菌、肠道罗斯拜瑞氏菌、Ruminiclostridium thermocellum、Ruminococcus champanellensis、粪瘤胃球菌、生黄瘤胃球菌、活泼瘤胃球菌、Ruthenibacterium lactatiformans、Sphingomonaskyeonggiensis、速生螺原体、白蚁孢杆菌、Stomatobaculum longum、少酸链球菌、Streptococcus danieliae、沃氏共养单胞菌、台湾栖温境单胞菌、加利福尼亚丁达尔氏菌、特斯科科湖丁达尔氏菌、血尿杆菌、Turicimonas muris、Tyzzerella nexilis、Vallitaleapronyensis和嗜小球藻吸血弧菌。

在一些实施方案中，有利的分布型包括排除以下中的一者或多于一者的细菌群体：狄氏副拟杆菌、Fournierella、Fournierella massiliensis、嗜粪拟杆菌、Eisenbergiella tayi、蒂西耶氏菌目、Hungateiclostridium thermocellum、长链多尔氏菌、柯氏喜热菌、Muricomes、Muricomes intestini、地生孢杆菌、地下地生孢杆菌、Anaerotignum lactatifermentans、脆弱拟杆菌、吸血弧菌属、泰泽氏菌属、嗜黏蛋白阿克曼氏菌、粪便拟杆菌、Dielma fastidiosa、厚壁菌门、梭菌目、瘤胃球菌科、珀氏解黄酮菌、Alistipes indistinctus、嗜黏蛋白阿克曼氏菌、Bacteroides stercorirosoris、Clostridium lactatifermentans orus、Abyssivirga alkaniphila、Acetatifactormuris、解纤维素醋酸弧菌、产乙醇醋酸弧菌、牛无胆甾原体、德雷氏无色小杆菌、Acidovorax radices、产雌马酚阿德勒氏菌、嗜黏蛋白阿克曼氏菌、Alistipesindistinctus、Alistipes obesi、腐烂别样杆菌、塞内加尔别样杆菌、提蒙别样杆菌、糖发酵碱杆状菌、Alkalibaculum bacchi、狗粪别样棒菌、Anaerobacterium chartisolvens、Anaerocolumna cellulosilytica、运动厌氧生孢菌、Anaerotaenia torta、人结肠厌氧棍状菌、Anaerotruncus rubiinfantis、解嗅厌氧贪食菌、产酸拟杆菌、Bacteroidescaecimuris、多氏拟杆菌、Bacteroides faecichinchillae、腐蚀拟杆菌、Bacteroidesstercorirosoris、解木聚糖拟杆菌、肠道巴恩斯氏菌、Beduini massiliensis、假长双歧杆菌、淤泥布劳特氏菌、Breznakia blatticola、Breznakia pachnodae、鸡盲肠丁酸球菌、穗状丁酸弧菌、Catabacter hongkongensis、Christensenella massiliensis、Christensenella minuta、Christensenella timonensis、耐氧梭菌、阿尔顿梭菌、碱纤维梭菌、芦笋状梭菌、快生梭菌、产纤维二糖梭菌、解纤维素梭菌、鲜黄梭菌、螺蜗形梭菌、鹌鹑梭菌、海氏梭菌、吲哚梭菌、济州岛梭菌、发酵乳酸梭菌、拉华尔梭菌、甲基戊糖梭菌、乳清酸梭菌、水稻梭菌、解溶纸梭菌、解多糖梭菌、杨木梭菌、解糖梭菌、Clostridium saudiense、裂解梭菌、Clostridium straminisolvens、绿色梭菌、解木聚糖梭菌、Coprobactersecundus、规则粪球菌、Culturomica massiliensis、Defluviitalea saccharophila、哥本哈根脱亚硫酸杆菌、还原金属脱亚硫酸杆菌、东方脱硫弯曲孢菌、脱硫脱硫弧菌、简单脱硫弧菌、产甲酸多尔氏菌、Eisenbergiella massiliensis、Emergencia timonensis、海氏肠球菌、居肠黏膜肠杆状菌、Enterorhabdus muris、Erysipelatoclostridium ramosum、幼虫丹毒丝菌、弗氏埃希氏菌、产粪甾醇真杆菌、长真杆菌、啮齿真杆菌、惰性真杆菌、多曲真杆菌、凸腹真杆菌、腐蚀栖粪杆菌、Flavimarina pacifica、珀氏解黄酮菌、Flintibacterbutyricus、Gordonibacter faecihominis、耐盐纤细杆菌、Harryflintia acetispora、马赛霍兰德氏菌、解糖氢厌氧杆菌、Ihubacter massiliensis、Intestinimonasbutyriciproducens、Irregularibacter muris、Lachnoclostridium pacaense、动物乳杆菌、粪乳杆菌、加氏乳杆菌、人乳杆菌、肠乳杆菌、约氏乳杆菌、路氏乳杆菌、罗氏乳杆菌、台湾乳杆菌、胞内劳森氏菌,Longibaculum muris、Marvinbryantia formatexigens、Millionella massiliensis、舍氏小螺菌、Muribaculum intestinale、Murimonasintestini、Natranaerovirga pectinivora、Neglecta timonensis、内脏臭气杆菌、Olsenella profusa、啮齿震颤杆菌、产戊酸震颤杆菌、食桂皮酸乳头杆菌、古氏副拟杆菌、香港副爱格氏菌、人类副萨特氏菌、Parvibacter caecicola、黑色消化球菌、Phoceamassiliensis、卡托氏卟啉单胞菌、口普雷沃氏菌、粪普雷沃氏菌、提蒙医院普雷沃氏菌、瘤胃假丁酸弧菌、多毛假解黄酮菌、Pseudoflavonifractor phocaeensis、Raoultibactertimonensis、Rhizobium straminoryzae、粪便罗斯拜瑞氏菌、人罗斯拜瑞氏菌、肠道罗斯拜瑞氏菌、Ruminiclostridium thermocellum、Ruminococcus champanellensis、粪瘤胃球菌、生黄瘤胃球菌、活泼瘤胃球菌、Ruthenibacterium lactatiformans、Sphingomonaskyeonggiensis、速生螺原体、白蚁孢杆菌、Stomatobaculum longum、少酸链球菌、Streptococcus danieliae、沃氏共养单胞菌、台湾栖温境单胞菌、加利福尼亚丁达尔氏菌、特斯科科湖丁达尔氏菌、血尿杆菌、Turicimonas muris、Tyzzerella nexilis、Vallitaleapronyensis和嗜小球藻吸血弧菌。

在一些实施方案中，有利的分布型包括包含以下中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100者(或其中任何可派生范围)的细菌群体：狄氏副拟杆菌、Fournierella、Fournierellamassiliensis、嗜粪拟杆菌、Eisenbergiella tayi、Tissierellales、Hungateiclostridium thermocellum、产甲酸多尔氏菌、柯氏喜热菌、Muricome、Muricomesintestini、地生孢杆菌、地下地生孢杆菌、Anaerotignum lactatifermentans、脆弱拟杆菌、吸血弧菌属、泰泽氏菌属、嗜黏蛋白阿克曼氏菌、粪便拟杆菌、Dielma fastidiosa、厚壁菌门、梭菌目、瘤胃球菌科、珀氏解黄酮菌、Alistipes indistinctus、嗜黏蛋白阿克曼氏菌、Bacteroides stercorirosoris、Clostridium lactatifermentans orus、Abyssivirgaalkaniphila、Acetatifactor muri、解纤维素醋酸弧菌、产乙醇醋酸弧菌、牛无胆甾原体、德雷氏无色小杆菌、Acidovorax radices、产雌马酚阿德勒氏菌、嗜黏蛋白阿克曼氏菌、Alistipes indistinctus、Alistipes obesi、腐烂别样杆菌、塞内加尔别样杆菌、提蒙别样杆菌、糖发酵碱杆状菌、Alkalibaculum bacchi、狗粪别样棒菌、Anaerobacteriumchartisolvens、Anaerocolumna cellulosilytica、运动厌氧生孢菌、Anaerotaeniatorta、人结肠厌氧棍状菌、Anaerotruncus rubiinfantis、解嗅厌氧贪食菌、产酸拟杆菌、Bacteroides caecimuris、多氏拟杆菌、Bacteroides faecichinchillae、腐蚀拟杆菌、Bacteroides stercorirosoris、解木聚糖拟杆菌、肠道巴恩斯氏菌、Beduinimassiliensis、假长双歧杆菌、淤泥布劳特氏菌、Breznakia blatticola、Breznakiapachnodae、鸡盲肠丁酸球菌、穗状丁酸弧菌、Catabacter hongkongensis、Christensenella massiliensis、Christensenella minuta、Christensenellatimonensis、耐氧梭菌、阿尔顿梭菌、碱纤维梭菌、芦笋状梭菌、快生梭菌、产纤维二糖梭菌、解纤维素梭菌、鲜黄梭菌、螺蜗形梭菌、鹌鹑梭菌、海氏梭菌、吲哚梭菌、济州岛梭菌、发酵乳酸梭菌、拉华尔梭菌、甲基戊糖梭菌、乳清酸梭菌、水稻梭菌、解溶纸梭菌、解多糖梭菌、杨木梭菌、解糖梭菌、Clostridium saudiense、裂解梭菌、Clostridium straminisolvens、绿色梭菌、解木聚糖梭菌、Coprobacter secundus、规则粪球菌、Culturomica massiliensis、Defluviitalea saccharophila、哥本哈根脱亚硫酸杆菌、还原金属脱亚硫酸杆菌、东方脱硫弯曲孢菌、脱硫脱硫弧菌、简单脱硫弧菌、产甲酸多尔氏菌、Eisenbergiellamassiliensis、Emergencia timonensis、海氏肠球菌、居肠黏膜肠杆状菌、Enterorhabdusmuris、Erysipelatoclostridium ramosum、幼虫丹毒丝菌、弗氏埃希氏菌、产粪甾醇真杆菌、长真杆菌、啮齿真杆菌、惰性真杆菌、多曲真杆菌、凸腹真杆菌、腐蚀栖粪杆菌、Flavimarina pacifica、珀氏解黄酮菌、Flintibacter butyricus、Gordonibacterfaecihominis、耐盐纤细杆菌、Harryflintia acetispora、马赛霍兰德氏菌、解糖氢厌氧杆菌、Ihubacter massiliensis、Intestinimonas butyriciproducens、Irregularibactermuris、Lachnoclostridium pacaense、动物乳杆菌、粪乳杆菌、加氏乳杆菌、人乳杆菌、肠乳杆菌、约氏乳杆菌、路氏乳杆菌、罗氏乳杆菌、台湾乳杆菌、胞内劳森氏菌、Longibaculummuris、Marvinbryantia formatexigens、Millionella massiliensis、舍氏小螺菌、Muribaculum intestinale、Murimonas intestini、Natranaerovirgapectinivora、Neglecta timonensis、内脏臭气杆菌、Olsenella profusa、啮齿震颤杆菌、产戊酸震颤杆菌、食桂皮酸乳头杆菌、古氏副拟杆菌、香港副爱格氏菌、人类副萨特氏菌、Parvibacter caecicola、黑色消化球菌、Phocea massiliensis、卡托氏卟啉单胞菌、口普雷沃氏菌、粪普雷沃氏菌、提蒙医院普雷沃氏菌、瘤胃假丁酸弧菌、多毛假解黄酮菌、Pseudoflavonifractor phocaeensis、Raoultibacter timonensis、Rhizobiumstraminoryzae、粪便罗斯拜瑞氏菌、人罗斯拜瑞氏菌、肠道罗斯拜瑞氏菌、Ruminiclostridium thermocellum、Ruminococcus champanellensis、粪瘤胃球菌、生黄瘤胃球菌、活泼瘤胃球菌、Ruthenibacterium lactatiformans、Sphingomonaskyeonggiensis、速生螺原体、白蚁生孢菌、Stomatobaculum longum、少酸链球菌、Streptococcus danieliae、沃氏共养单胞菌、台湾栖温境单胞菌、加利福尼亚丁达尔氏菌、特斯科科湖丁达尔氏菌、血尿杆菌、Turicimonas muris、Tyzzerella nexilis、Vallitaleapronyensis和嗜小球藻吸血弧菌。

在一些实施方案中，有利的分布型包括以至少、至多或恰好2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)的相对丰度的量包含以下中的一者或多于一者的细菌群体：狄氏副拟杆菌、Fournierella、Fournierella massiliensis、嗜粪拟杆菌、Eisenbergiellatayi、Tissierellales、Hungateiclostridium thermocellum、产甲酸多尔氏菌、柯氏喜热菌、Muricomes、Muricomes intestini、地生孢杆菌、地下地生孢杆菌、Anaerotignumlactatifermentans、脆弱拟杆菌、吸血弧菌属、泰泽氏菌属、嗜黏蛋白阿克曼氏菌、粪便拟杆菌、Dielma fastidiosa、厚壁菌门、梭菌目、瘤胃球菌科、珀氏解黄酮菌、Alistipesindistinctus、嗜黏蛋白阿克曼氏菌、Bacteroides stercorirosoris、Clostridiumlactatifermentans orus、Abyssivirga alkaniphila、Acetatifactor muris、解纤维素醋酸弧菌、产乙醇醋酸弧菌、牛无胆甾原体、德雷氏无色小杆菌、Acidovorax radices、产雌马酚阿德勒氏菌、嗜黏蛋白阿克曼氏菌、Alistipes indistinctus、Alistipes obesi、腐烂别样杆菌、塞内加尔别样杆菌、提蒙别样杆菌、糖发酵碱杆状菌、Alkalibaculum bacchi、狗粪别样棒菌、Anaerobacterium chartisolvens、Anaerocolumna cellulosilytica、运动厌氧生孢菌、Anaerotaenia torta、人结肠厌氧棍状菌、Anaerotruncus rubiinfantis、解嗅厌氧贪食菌、产酸拟杆菌、Bacteroides caecimuris、多氏拟杆菌、Bacteroidesfaecichinchillae、腐蚀拟杆菌、Bacteroides stercorirosoris、解木聚糖拟杆菌、肠道巴恩斯氏菌、Beduini massiliensis、假长双歧杆菌、淤泥布劳特氏菌、Breznakiablatticola、Breznakia pachnodae、鸡盲肠丁酸球菌、穗状丁酸弧菌、Catabacterhongkongensis、Christensenella massiliensis、Christensenella minuta、Christensenella timonensis、耐氧梭菌、阿尔顿梭菌、碱纤维梭菌、芦笋状梭菌、快生梭菌、产纤维二糖梭菌、解纤维素梭菌、鲜黄梭菌、螺蜗形梭菌、鹌鹑梭菌、海氏梭菌、吲哚梭菌、济州岛梭菌、发酵乳酸梭菌、拉华尔梭菌、甲基戊糖梭菌、乳清酸梭菌、水稻梭菌、解溶纸梭菌、解多糖梭菌、杨木梭菌、解糖梭菌、Clostridium saudiense、裂解梭菌、Clostridiumstraminisolvens、绿色梭菌、解木聚糖梭菌、Coprobacter secundus、规则粪球菌、Culturomica massiliensis、Defluviitalea saccharophila、哥本哈根脱亚硫酸杆菌、还原金属脱亚硫酸杆菌、东方脱硫弯曲孢菌、脱硫脱硫弧菌、简单脱硫弧菌、产甲酸多尔氏菌、Eisenbergiella massiliensis、Emergencia timonensis、海氏肠球菌、居肠黏膜肠杆状菌、Enterorhabdus muris、Erysipelatoclostridium ramosum、幼虫丹毒丝菌、弗氏埃希氏菌、产粪甾醇真杆菌、长真杆菌、啮齿真杆菌、惰性真杆菌、多曲真杆菌、凸腹真杆菌、腐蚀栖粪杆菌、Flavimarina pacifica、珀氏解黄酮菌、Flintibacter butyricus、Gordonibacterfaecihominis、耐盐纤细杆菌、Harryflintia acetispora、马赛霍兰德氏菌、解糖氢厌氧杆菌、Ihubacter massiliensis、Intestinimonas butyriciproducens、Irregularibactermuris、Lachnoclostridium pacaense、动物乳杆菌、粪乳杆菌、加氏乳杆菌、人乳杆菌、肠乳杆菌、约氏乳杆菌、路氏乳杆菌、罗氏乳杆菌、台湾乳杆菌、胞内劳森氏菌、Longibaculummuris、Marvinbryantia formatexigens、Millionella massiliensis、舍氏小螺菌、Muribaculum intestinale、Murimonas intestini、Natranaerovirga pectinivora、Neglecta timonensis、内脏臭气杆菌、Olsenella profusa、啮齿震颤杆菌、产戊酸震颤杆菌、食桂皮酸乳头杆菌、古氏副拟杆菌、香港副爱格氏菌、人类副萨特氏菌、Parvibactercaecicola、黑色消化球菌、Phocea massiliensis、卡托氏卟啉单胞菌、口普雷沃氏菌、粪普雷沃氏菌、提蒙医院普雷沃氏菌、瘤胃假丁酸弧菌、多毛假解黄酮菌、Pseudoflavonifractor phocaeensis、Raoultibacter timonensis、Rhizobiumstraminoryzae、粪便罗斯拜瑞氏菌、人罗斯拜瑞氏菌、肠道罗斯拜瑞氏菌、Ruminiclostridium thermocellum、Ruminococcus champanellensis、粪瘤胃球菌、生黄瘤胃球菌、活泼瘤胃球菌、Ruthenibacterium lactatiformans、Sphingomonaskyeonggiensis、速生螺原体、白蚁孢杆菌、Stomatobaculum longum、少酸链球菌、Streptococcus danieliae、沃氏共养单胞菌、台湾栖温境单胞菌、加利福尼亚丁达尔氏菌、特斯科科湖丁达尔氏菌、血尿杆菌、Turicimonas muris、Tyzzerella nexilis、Vallitaleapronyensis和嗜小球藻吸血弧菌。

在一些实施方案中，有利的分布型还归类为无毒性关联分布型。无毒性关联分布型是指对象中，特别是对象的肠道中的微生物分布型，其存在于不因免疫检查点阻断联合疗法而经历毒性、经历低水平毒性或经历低于3级免疫相关的副作用的对象中。在一些实施方案中，有利的分布型包括包含属于以下的属中的一者或多于一者的细菌的细菌群体：Dorea、喜热菌属、Muricomes、地生孢杆菌、地生孢杆菌、Anaerotignum、拟杆菌属、丁酸单胞菌属、解黄酮菌属、Dielma、别样杆菌属和阿克曼氏菌属。在一些实施方案中，有利的分布型包括包含以下的一者或多于一者的细菌群体：长链多尔氏菌、柯氏喜热菌、Muricomes、Muricomes intestini、地生孢杆菌、地下地生孢杆菌、Anaerotignum lactatifermentans、粪便拟杆菌、Butyricimonas faecihominis、珀氏解黄酮菌、Dielma fastidiosa、Alistipes indistinctus和嗜黏蛋白阿克曼氏菌。在一些实施方案中，有利的分布型还定义为有效的分布型。有效的分布型是指对象中、特别是对象的肠道中的微生物分布型，其存在于对免疫检查点阻断联合疗法有应答的对象中。在一些实施方案中，有效应答包括肿瘤样本或浸润物中CD8+细胞的增加。在一些实施方案中，有效应答包括T细胞的数量和/或密度的增加或者肿瘤T细胞浸润物的熵的增加。熵可通过本领域已知和本文描述的方法测定。例如，可使用香农熵(Shannon entropy)和瑞丽熵(Renyi entropy)来比较不同的人之间或不同的T-细胞表型之间的TCR多样性。

在一些实施方案中，确定属于以下的属或种的细菌：别样杆菌属、拟杆菌属、丁酸单胞菌属、狄氏副拟杆菌、Fournierella、Fournierella massiliensis、Eisenbergiellatayi、蒂西耶氏菌目、Hungateiclostridium thermocellum、长链多尔氏菌、柯氏喜热菌、Muricomes、地生孢杆菌、沼泽普雷沃氏菌、嗜黑麦乳杆菌、芬氏拟杆菌、约氏乳杆菌、堆肥副土地杆菌、Anaerotignum lactatifermentans、脆弱拟杆菌、吸血弧菌属、泰泽氏菌属、解黄酮菌属、Dielma或阿克曼氏菌属的相对丰度为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)。在一些实施方案中，确定属于以下的细菌：别样杆菌属、拟杆菌属、丁酸单胞菌属、狄氏副拟杆菌、Fournierella、Fournierella massiliensis、Eisenbergiella tayi、蒂西耶氏菌目、Hungateiclostridium thermocellum、长链多尔氏菌、柯氏喜热菌、Muricomes、地生孢杆菌、沼泽普雷沃氏菌、嗜黑麦乳杆菌、芬氏拟杆菌、约氏乳杆菌、堆肥副土地杆菌、Anaerotignum lactatifermentans、脆弱拟杆菌、吸血弧菌属、泰泽氏菌属、解黄酮菌属、Dielma或阿克曼氏菌属以至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)的相对丰度存在。在一些实施方案中，确定别样杆菌属、拟杆菌属、丁酸单胞菌属、狄氏副拟杆菌、Fournierella、Fournierella massiliensis、Eisenbergiella tayi、蒂西耶氏菌目、Hungateiclostridium thermocellum、长链多尔氏菌、柯氏喜热菌、Muricomes、地生孢杆菌、沼泽普雷沃氏菌、嗜黑麦乳杆菌、芬氏拟杆菌、约氏乳杆菌、ParapedobAnaerotignumlactatifermentans、脆弱拟杆菌、吸血弧菌属、泰泽氏菌属、解黄酮菌属、Dielma或阿克曼氏菌属组合的相对丰度为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)。在一些实施方案中，确定属于脆弱拟杆菌的细菌的相对丰度为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)。在一些实施方案中，确定属于吸血弧菌属的细菌的相对丰度为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)。在一些实施方案中，确定属于泰泽氏菌属的细菌的相对丰度为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)。在一些实施方案中，确定属于解黄酮菌属的细菌的相对丰度为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)。在一些实施方案中，确定属于Dielma的细菌的相对丰度为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)。在一些实施方案中，确定属于阿克曼氏菌属的细菌的相对丰度为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)。在一些实施方案中，当在来自对象的样本中检测到粪便拟杆菌、粪拟杆菌、肠道拟杆菌、Coprobacter、Intestinibacter bartletti、Parasutterella secunda和产丙酸戴阿利斯特菌中的一者或多于一者时预测毒性应答。在一些实施方案中，当确定粪便拟杆菌、粪拟杆菌、肠道拟杆菌、Coprobacter、Intestinibacter bartletti、Parasutterella secunda和产丙酸戴阿利斯特菌中的一者或多于一者的相对丰度为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)时预测毒性应答。在一些实施方案中，确定属于粪便拟杆菌、粪拟杆菌、肠道拟杆菌、Coprobacter、Intestinibacter bartletti、Parasutterella secunda和产丙酸戴阿利斯特菌的细菌以至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)的相对丰度存在。在一些实施方案中，确定粪便拟杆菌、粪拟杆菌、肠道拟杆菌、Coprobacter、Intestinibacter bartletti、Parasutterella secunda和产丙酸戴阿利斯特菌组合的相对丰度为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)。在一些实施方案中，确定属于粪便拟杆菌的细菌的相对丰度为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)。在一些实施方案中，确定属于粪拟杆菌的细菌的相对丰度为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)。在一些实施方案中，确定属于肠道拟杆菌的细菌的相对丰度为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)。在一些实施方案中，确定属于戴阿利斯特菌属的细菌的相对丰度为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)。

在一些实施方案中，当检测到脆弱拟杆菌、吸血弧菌属、泰泽氏菌属、长链多尔氏菌、柯氏喜热菌、Muricomes、Muricomes intestini、地生孢杆菌、地下地生孢杆菌、Anaerotignum lactatifermentans中的一者或多于一者时预测无毒性应答。在一些实施方案中，当确定脆弱拟杆菌、吸血弧菌属、泰泽氏菌属、长链多尔氏菌、柯氏喜热菌、Muricomes、Muricomes intestini、地生孢杆菌、地下地生孢杆菌、Anaerotignumlactatifermentans中的一者或多于一者的相对丰度为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)时预测无毒性应答。在一些实施方案中，确定属于脆弱拟杆菌、吸血弧菌属、泰泽氏菌属、长链多尔氏菌、柯氏喜热菌、Muricomes、Muricomes intestini、地生孢杆菌、地下地生孢杆菌、Anaerotignum lactatifermentans的细菌以至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)的相对丰度存在。在一些实施方案中，确定脆弱拟杆菌、吸血弧菌属、泰泽氏菌属、长链多尔氏菌、柯氏喜热菌、Muricomes、Muricomesintestini、地生孢杆菌、地下地生孢杆菌、Anaerotignum lactatifermentans组合的相对丰度为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)。在一些实施方案中，确定属于脆弱拟杆菌的细菌的相对丰度为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)。在一些实施方案中，确定属于吸血弧菌属的细菌的相对丰度为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)。在一些实施方案中，确定属于泰泽氏菌属的细菌的相对丰度为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)。

在一些实施方案中，当在来自对象的样本中检测到狄氏副拟杆菌、Fournierella、Fournierella massiliensis、嗜粪拟杆菌、Eisenbergiella tayi、蒂西耶氏菌目、Hungateiclostridium thermocellum、粪便拟杆菌、珀氏解黄酮菌、Dielma fastidiosa和嗜黏蛋白阿克曼氏菌中的一者或多于一者时预测有效应答。在一些实施方案中，当在来自对象的样本中检测到Parabacteroides、Fournierella、Eisenbergiella、蒂西耶氏菌目、Hungateiclostridium、拟杆菌属、丁酸单胞菌属、解黄酮菌属、Dielma、别样杆菌属和阿克曼氏菌属中的一者或多于一者时预测有效应答。在一些实施方案中，当在来自对象的样品中检测到粪便拟杆菌、Butyricimonas faecihominis、珀氏解黄酮菌、Dielma fastidiosa、Alistipes indistinctus和嗜黏蛋白阿克曼氏菌中的一者或多于一者时预测有效应答。在一些实施方案中，当确定狄氏副拟杆菌、Fournierella、Fournierella massiliensis、嗜粪拟杆菌、Eisenbergiella tayi、蒂西耶氏菌目、Hungateiclostridium thermocellum、粪便拟杆菌、Butyricimonas faecihominis、珀氏解黄酮菌、Dielma fastidiosa、Alistipesindistinctus和嗜黏蛋白阿克曼氏菌中的一者或多于一者的相对丰度为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)时预测有效应答。在一些实施方案中，确定属于狄氏副拟杆菌、Fournierella、Fournierella massiliensis、嗜粪拟杆菌、Eisenbergiellatayi、蒂西耶氏菌目、Hungateiclostridium thermocellum、粪便拟杆菌、Butyricimonasfaecihominis、珀氏解黄酮菌、Dielma fastidiosa、Alistipes indistinctus和嗜黏蛋白阿克曼氏菌的细菌以至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)的相对丰度存在。在一些实施方案中，确定狄氏副拟杆菌、Fournierella、Fournierellamassiliensis、嗜粪拟杆菌、Eisenbergiella tayi、蒂西耶氏菌目、Hungateiclostridiumthermocellum、粪便拟杆菌、Butyricimonas faecihominis、珀氏解黄酮菌、Dielmafastidiosa、Alistipes indistinctus和嗜黏蛋白阿克曼氏菌组合的相对丰度为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)。在一些实施方案中，确定属于粪便拟杆菌的细菌的相对丰度为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)。在一些实施方案中，确定属于珀氏解黄酮菌的细菌的相对丰度为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)。在一些实施方案中，确定属于Dielma fastidiosa的细菌的相对丰度为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)。在一些实施方案中，确定属于嗜黏蛋白阿克曼氏菌的细菌的相对丰度为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)。在一些实施方案中，确定属于Butyricimonas faecihominis的细菌的相对丰度为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)。在一些实施方案中，确定属于Alistipes indistinctus的细菌的相对丰度为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)。

在一些实施方案中，当检测到罗氏乳杆菌、脆弱拟杆菌、粪源普雷沃氏菌、沙氏普雷沃氏菌、海氏梭菌、Hungateiclostridium aldrichii、鼠柠檬酸杆菌、沟迹真杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、霍氏真杆菌、阴沟肠杆菌、蜂房哈夫尼菌、人罗斯拜瑞氏菌、类肠膜魏斯氏菌和产气克雷伯氏菌中的一者或多于一者时预测无效应答。在一些实施方案中，当确定罗氏乳杆菌、脆弱拟杆菌、粪源普雷沃氏菌、沙氏普雷沃氏菌、海氏梭菌、Hungateiclostridiumaldrichii、鼠柠檬酸杆菌、沟迹真杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、霍氏真杆菌、阴沟肠杆菌、蜂房哈夫尼菌、人罗斯拜瑞氏菌、类肠膜魏斯氏菌和产气克雷伯氏菌中的一者或多于一者的相对丰度为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)时预测无效应答。在一些实施方案中，确定属于罗氏乳杆菌、脆弱拟杆菌、粪源普雷沃氏菌、沙氏普雷沃氏菌、海氏梭菌、Hungateiclostridium aldrichii、鼠柠檬酸杆菌、沟迹真杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、霍氏真杆菌、阴沟肠杆菌、蜂房哈夫尼菌、人罗斯拜瑞氏菌、类肠膜魏斯氏菌和产气克雷伯氏菌的细菌以至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)的相对丰度存在。在一些实施方案中，确定罗氏乳杆菌、脆弱拟杆菌、粪源普雷沃氏菌、沙氏普雷沃氏菌、海氏梭菌、Hungateiclostridium aldrichii、鼠柠檬酸杆菌、沟迹真杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、霍氏真杆菌、阴沟肠杆菌、蜂房哈夫尼菌、人罗斯拜瑞氏菌、类肠膜魏斯氏菌和产气克雷伯氏菌组合的相对丰度为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)。在一些实施方案中，确定属于罗氏乳杆菌的细菌的相对丰度为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)。在一些实施方案中，确定属于脆弱拟杆菌的细菌的相对丰度为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)。在一些实施方案中，确定属于粪源普雷沃氏菌的细菌的相对丰度为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)。在一些实施方案中，确定属于沙氏普雷沃氏菌的细菌的相对丰度为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)。

在一些实施方案中，有利的分布型、无毒性关联分布型和/或有效分布型不包括来自瘤胃球菌科、梭菌科、毛螺旋菌科、微球菌科和/或韦荣氏球菌科中的一者或多于一者的细菌或者包括相对丰度小于30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％(或其中任何可派生范围)的来自瘤胃球菌科、梭菌科、毛螺旋菌科、微球菌科和/或韦荣氏球菌科中的一者或多于一者的细菌。

在一些实施方案中，有利的分布型、无毒性关联分布型和/或有效分布型不包括来自以下中的一者或多于一者的细菌或包括相对丰度小于30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％(或其中任何可派生范围)的来自以下中的一者或多于一者细菌：粪便拟杆菌、狄氏副拟杆菌、Fournierella、Fournierella massiliensis、嗜粪拟杆菌、Eisenbergiella tayi、Tissierellales、Hungateiclostridium thermocellum、产甲酸多尔氏菌、柯氏喜热菌、Muricomes、Muricomes intestini、地生孢杆菌、地下地生孢杆菌、Anaerotignum lactatifermentans、凝固拟杆菌、阿尔顿梭菌、阿氏梭菌、碱纤维梭菌、杏仁香梭菌、芦笋状梭菌、纤维素梭菌、奇特龙梭菌、鲜黄梭菌DSM 19732、梭状梭菌、鹌鹑梭菌、居粪肥梭菌、平野氏梭菌、亨氏梭菌、海氏梭菌DSM 15053、吲哚梭菌、发酵乳酸梭菌、柔嫩梭菌、甲基戊糖梭菌、乳清酸梭菌、解溶纸梭菌DSM 2782、杨木梭菌、丙酸梭菌、解糖梭菌、裂解梭菌、球孢梭菌、粪堆梭菌、Clostridium straminisolvens、亮黄梭菌、白蚁梭菌、热产琥珀酸梭菌、绿色梭菌、解木聚糖梭菌、滴状脱硫肠状菌、直肠真杆菌ATCC 33656、长真杆菌、挑剔真杆菌ATCC 27750、霍氏真杆菌、娇弱真杆菌、惰性真杆菌、纤细真杆菌、扭链瘤胃球菌、延长厌氧醋菌、Acetatifactor muris、解纤维素醋酸弧菌、产乙醇醋酸弧菌、甘蓝无胆甾原体0502、细小无胆甾原体、牛无胆甾原体、琼氏不动杆菌、猪放线杆菌、鲍氏放线菌、齿放线菌、龋齿放线菌、Acutalibacter muris、浅绿气球菌、苛求气微菌、芬氏别样杆菌、Alistipes obesi、昂氏别样杆菌、腐烂别样杆菌、沙氏别样杆菌、沙氏别样杆菌WAL8301、提蒙别样杆菌JC136、糖发酵碱杆状菌、Alkaliphilus metalliredigens QYMF、产组胺阿里松氏菌、狗粪别样棒菌DSM 13633、Alloprevotella rava、Alloprevotellatannerae、Anaerobacterium chartisolvens、汤氏厌氧生活螺菌、Anaerobiumacetethylicum、八叠厌氧球菌NCTC 9810、Anaerococcus provenciensis、阴道厌氧球菌ATCC 51170、Anaerocolumna jejuensis、敏捷厌氧细线菌、人粪厌氧棒形菌、成双厌氧球形菌(Anaeroglobus geminatus)、Anaeromassilibacillus senegalensis、不容菌厌氧支原体、叉形厌氧杆形菌、运动厌氧生孢菌、Anaerostipes butyraticus、粪厌氧棒状菌、Anaerostipes hadrus、人结肠厌氧棍状菌、解嗅厌氧贪食菌、努比卤地无氧芽孢杆菌、Aquabacterium limnoticum、Arcobacter butzleri、Arthrospira platensis、隐藏不解糖杆菌、极小阿托波氏菌、粪拟杆菌、Bacteroides caecimuris、解纤维素拟杆菌、Bacteroides clarus YIT12056、多氏拟杆菌、埃氏拟杆菌、芬氏拟杆菌、脆弱拟杆菌、鸡拟杆菌、马赛拟杆菌、Bacteroides oleiciplenus YIT 12058、平常拟杆菌DSM 17135、腐蚀拟杆菌JCM 16496、多形拟杆菌、单形拟杆菌、溶木聚糖拟杆菌XB1A、解木聚糖拟杆菌、肠道巴恩斯氏菌、Beduini massiliensis、双歧双歧杆菌、齿双歧杆菌、长双歧杆菌婴儿亚种、Blautia caecimuris、粪球布劳特氏菌、粪布劳特氏菌、Blautia glucerasea、汉氏布劳特氏菌DSM 20583、氢养布劳特氏菌、淤泥布劳特氏菌、淤泥布劳特氏菌DSM 14534、韦氏布劳特氏菌DSM 19850、水生布戴约维采菌、鸡盲肠丁酸球菌、Butyricimonas paravirosa、穗状丁酸弧菌、大岛氏热粪杆菌、柯氏喜热菌、解蛋白喜热菌、Caloramator quimbayensis、纤细弯曲杆菌、直肠弯曲杆菌、Campylobacter ureolyticus DSM 20703、牙龈二氧化碳嗜纤维菌、利氏二氧化碳嗜纤维菌、生痰二氧化碳嗜纤维菌、Casaltella massiliensis、Catabacter hongkongensis、三冈链形杆菌、Christensenella minuta、Christensenellatimonensis、Chryseobacterium taklimakanense、弗氏柠檬酸杆菌、Cloacibacillusporcorum、Clostridioides difficile ATCC 9689＝DSM 1296、解淀粉梭菌、鲍氏梭菌、Clostridium butyricum、尸毒梭菌、狗肠梭菌、产气梭菌、缓纤维梭菌DSM 5427、海梭菌、水稻梭菌、类腐败梭菌、牧场梭菌、产气荚膜梭菌、奎氏梭菌、糖丁醇梭菌、生孢梭菌、Clostridium ventriculi、产气柯林斯氏菌、睾丸酮丛毛单胞菌、Coprobacterfastidiosus NSB1、规则粪球菌、Corynebacterium diphtheriae、坚硬棒杆菌、蕈状棒杆菌、Corynebacterium pyruviciproducens ATCC BAA-1742、解结核硬脂酸棒杆菌、Culturomica massiliensis、Cuneatibacter caecimuris、Defluviitaleasaccharophila、食酸戴尔福特菌、氧呼吸脱亚硫酸杆菌、还原金属脱亚硫酸杆菌、Desulfosporosinus acididurans、喜盐脱硫肠状菌、Desulfotomaculum intricatum、Desulfotomaculum tongense、脱硫脱硫弧菌脱硫亚种、爱达荷脱硫弧菌、海滨脱硫弧菌、懒惰脱硫弧菌、简单脱硫弧菌、大叶藻脱硫弧菌、乙酸氧化脱硫单胞菌、嗜碱还原硫素杆菌AHT1、食氨基酸脱硫代硫酸菌、浑浊戴阿利斯特菌、产丙酸戴阿利斯特菌、Dielma fastidiosa、Dietzia alimentaria 72、长链多尔氏菌、嘉德营发酵单胞菌ATCC BAA-286、莫氏营发酵单胞菌、缓慢爱格士氏菌、啮噬艾肯氏菌、Eisenbergiella tayi、Emergencia timonensis、Enorma massiliensis phI、粪肠球菌、Enterorhabdus muris、哈尔滨产乙酸菌YUAN-3、产粪甾醇真杆菌、黏液真杆菌、氧化还原真杆菌、沟迹真杆菌ATCC 35585、单形真杆菌、凸腹真杆菌、嗜木聚糖真杆菌、Extibacter muris、Ezakiella peruensis、普氏栖粪杆菌、Faecalicoccus acidiformans、Faecalitalea cylindroides、绒毛产线菌、珀氏解黄酮菌、Flintibacter butyricus、Frisingicoccus caecimuris、Fucophilus fucoidanolyticus、Fusicatenibacter saccharivorans、死亡梭杆菌、具核梭杆菌文氏亚种、猴梭杆菌、可变梭杆菌、脱氮加西亚氏菌、溶血孪生球菌、甲酸芽殖菌、Gordonibacter urolithinfaciens、耐盐纤细杆菌JW/YJL-S1、挑食短链小球菌、牛古根海姆氏菌、溶血嗜血杆菌、盲肠螺杆菌、猪粪赫斯佩尔氏菌(Hespellia stercorisuis)、Holdemanella biformis、马赛霍兰德氏菌AP2、解脲霍华德氏菌、Hungatella effluvii、Hungatella hathewayi、解糖氢厌氧杆菌、Ihubacter massiliensis、Intestinibacter bartletti、Intestinimonasbutyriciproducens、Irregularibacter muris、昆布基尔市螺菌DSM 19542、Kroppenstedtia guangzhouensis、Lachnoanaerobaculum orale、Lachnoanaerobaculumumeaense、Lachnoclostridium phytofermentans、嗜酸乳杆菌、低温乳杆菌、动物乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌、近茎轴乳杆菌、懒惰乳杆菌、戊糖乳杆菌、罗氏乳杆菌、格氏乳球菌、长卵形产内酯菌、口腔纤毛菌、霍氏纤毛菌、香港纤毛菌、瓦氏纤毛菌、仁荷明串珠菌、Levyella massiliensis、Loriellopsis cavernicola、嗜热烂泥孢菌、鲑肉色嗜纤维菌JCM21150、Marvinbryantia formatexigens、光尾荧中间原体、史氏甲烷短杆菌ATCC 35061、Methanomassiliicoccus luminyensis B10、扭托甲基杆菌、贾氏光岗氏菌、Mobilitaleasibirica、柯氏动弯杆菌、细小难养杆菌、慢生难养杆菌、甘油穆尔氏菌、Moorellahumiferrea、Moraxella nonliquefaciens、奥斯陆莫拉氏菌、摩氏摩根氏菌、产吲哚摩里氏菌、Muribaculum intestinale、Murimonas intestini、Natranaerovirga pectinivora、Neglecta timonensis、灰色奈瑟氏球菌、口奈瑟氏球菌、Nocardioides mesophilus、Novibacillus thermophilus、人苍白杆菌、内脏臭气杆菌、Olsenella profusa、龈乳杆菌、Oribacterium asaccharolyticum ACB7、瘘管口腔杆菌、啮齿震颤杆菌GH1、产戊酸震颤杆菌、普氏产醋杆菌、成团泛菌、食桂皮酸乳头杆菌、粪副拟杆菌(Parabacteroides faecis)、古氏副拟杆菌、戈登氏副拟杆菌、粪副拟杆菌(Parabacteroides merdae)、寡食副生孢杆菌、人类副萨特氏菌、Parasutterella secunda、微小小单胞菌、黑色消化球菌、Peptoniphilus duerdenii ATCC BAA-1640、Peptoniphilus grossensis ph5、Peptoniphilus koenoeneniae、Peptoniphilus senegalensis JC140、口炎消化链球菌、Phascolarctobacterium succinatutens、Phocea massiliensis、Pontibacter indicus、本氏卟啉单胞菌、牙髓卟啉单胞菌、Porphyromonas pasteri、伯根普雷沃氏菌、口颊普雷沃氏菌ATCC 33574、栖牙普雷沃氏菌、抑制普雷沃氏菌,Prevotella fusca JCM 17724、洛氏普雷沃氏菌、变黑普雷沃氏菌、口普雷沃氏菌、苍白雷沃氏菌ATCC 700821、粪普雷沃氏菌DSM 18206、提蒙医院普雷沃氏菌、Propionispira arcuata、奇异变形菌、雷氏普罗威登斯菌、seudobacteroides cellulosolvens ATCC 35603＝DSM 2933、瘤胃假丁酸弧菌、多毛假解黄酮菌ATCC 29799、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、Pseudomonas mandelii、硝基还原假单胞菌、恶臭假单胞菌、Raoultella ornithinolytica、Raoultella planticola、Raoultibacter massiliensis、Robinsoniella peoriensis、Romboutsia timonensis、粪便罗斯拜瑞氏菌、人罗斯拜瑞氏菌A2-183、肠道罗斯拜瑞氏菌、食葡糖罗斯拜瑞氏菌DSM16841、龋齿罗斯氏菌ATCC 17931、Ruminiclostridium thermocellum、白色瘤胃球菌、布氏瘤胃球菌、伶俐瘤胃球菌、Ruminococcus champanellensis 18P13＝JCM 17042、粪瘤胃球菌JCM 15917、生黄瘤胃球菌、Ruminococcus gauvreauii、酸奶瘤胃球菌ATCC 29176、Rummeliibacillus pycnus、Saccharofermentans acetigenes、Scardovia wiggsiae、热脱聚合物赛托氏菌、香港沉积物棒菌、生痰月单胞菌ATCC 35185、弱生斯奈克氏菌ATCC700122、Slackia piriformis YIT 12062、加拿大土壤杆形菌、莫氏细小杆菌、水生鞘氨醇单胞菌、Spiroplasma alleghenense、中国螺原体、栖斑虻螺原体、栖蚊螺原体、栖萤火虫螺原体、白蚁孢杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜麦芽寡养单胞菌、Stomatobaculum longum、无乳链球菌ATCC 13813、嵴链球菌、马肠链球菌、戈氏链球菌、Streptococcus lactarius、副乳房链球菌、变异罕见小球菌、溶糊精琥珀酸弧菌、狗粪萨特氏菌、华德萨特氏菌、糖变互营球菌、策氏共养单胞菌OL-4、Terrisporobacter mayombei、白栖热嗜狮菌、齿垢密螺旋体、索氏密螺旋体、Tyzzerella nexilis DSM 1787、Vallitalea guaymasensis、Vallitaleapronyensis、嗜小球藻吸血弧菌、非典型韦荣氏球菌、坏齿韦荣氏球菌、殊异韦荣氏球菌、小韦荣氏球菌、瓦达食谷菌、中热度火山芽孢杆菌和混淆魏斯氏菌。

在一些实施方案中，不利的分布型、毒性关联分布型和/或无效分布型不包括以下中的一者或多于一者：柠檬酸杆菌属、海氏梭菌、Hungateiclostridium aldrichii、鼠柠檬酸杆菌、沟迹真杆菌、哈夫尼菌科、弗氏柠檬酸杆菌、霍氏真杆菌、阴沟肠杆菌、蜂房哈夫尼菌、哈夫尼菌属、人罗斯拜瑞氏菌、类肠膜魏斯氏菌、肠杆菌属、罗氏乳杆菌、芽孢杆菌属、乳杆菌目、产气克雷伯氏菌、克雷伯氏菌属、肠道拟杆菌、Coprobacter、Intestinibacterbartletti、Intestinibacter、Parasutterella secunda、产丙酸戴阿利斯特菌、人结肠厌氧棍状菌、栖异地克雷伯氏菌、大肠杆菌、多形拟杆菌、产甲酸草酸杆菌、Paraprevotellaclara、产雌马酚阿德勒氏菌、Clostridium bolteae、肺炎克雷伯氏菌、梭菌属、粪副拟杆菌、Klebsiella quasipneumoniae、Lachnoclostridium、粪居拟杆菌、普雷沃氏菌属种CAG:255、毛螺菌科、解没食子酸链球菌巴氏所亚种、乳酸乳球菌、梭菌目、变异链球菌、瘤胃球菌科细菌D16、厚壁菌门细菌CAG:102、震颤杆菌、梭状梭菌、马赛拟杆菌、裂解梭菌、粪副拟杆菌、真杆菌属种CAG:161、活泼瘤胃球菌、梭状梭菌，或者包含相对丰度小于30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％(或其中任何可派生范围)的来自以下中的一者或多于一者的细菌：柠檬酸杆菌属、海氏梭菌、Hungateiclostridiumaldrichii、鼠柠檬酸杆菌、沟迹真杆菌、哈夫尼菌科、弗氏柠檬酸杆菌、霍氏真杆菌、阴沟肠杆菌、蜂房哈夫尼菌、哈夫尼菌属、人罗斯拜瑞氏菌、类肠膜魏斯氏菌、肠杆菌属、罗氏乳杆菌、芽孢杆菌属、乳杆菌目、产气克雷伯氏菌、克雷伯氏菌属、肠道拟杆菌、Coprobacter、Intestinibacter bartletti、Intestinibacter、Parasutterella secunda、产丙酸戴阿利斯特菌、人结肠厌氧棍状菌、栖异地克雷伯氏菌、大肠杆菌、多形拟杆菌、产甲酸草酸杆菌、Paraprevotella clara、产雌马酚阿德勒氏菌、Clostridium bolteae、肺炎克雷伯氏菌、梭菌属、粪副拟杆菌、Klebsiella quasipneumoniae、Lachnoclostridium、粪居拟杆菌、普雷沃氏菌属种CAG:255、毛螺菌科、解没食子酸链球菌巴氏所亚种、乳酸乳球菌、梭菌目、变异链球菌、瘤胃球菌科细菌D16、厚壁菌门细菌CAG:102、震颤杆菌、梭状梭菌、马赛拟杆菌、裂解梭菌、粪副拟杆菌、真杆菌属种CAG:161、活泼瘤胃球菌和梭状梭菌。

在一些实施方案中，本公开的微生物组合物不包括来自瘤胃球菌科、梭菌科、毛螺旋菌科、微球菌科和/或韦荣氏球菌科中的一者或多于一者的细菌和/或包含少于1x10⁶、1x10⁵、1x10⁴、1x10³或1x10²个来自瘤胃球菌科、梭菌科、毛螺旋菌科、微球菌科和/或韦荣氏球菌科中的一者或多于一者的细菌的细胞或CFU(或其中任何可派生范围)。

在一些实施方案中，本公开的微生物组合物不包括来自以下中的一者或多于一者的细菌或者包含少于1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³或1×10²个来自以下中的一者或多于一者的细菌的细胞或CFU(或其中任何可派生范围)：凝固拟杆菌、阿尔顿梭菌、阿氏梭菌、碱纤维梭菌、杏仁香梭菌、芦笋状梭菌、纤维素梭菌、奇特龙梭菌、鲜黄梭菌DSM 19732、梭状梭菌、鹌鹑梭菌、居粪肥梭菌、平野氏梭菌、亨氏梭菌、海氏梭菌DSM 15053、吲哚梭菌、发酵乳酸梭菌、柔嫩梭菌、甲基戊糖梭菌、乳清酸梭菌、解溶纸梭菌DSM 2782、杨木梭菌、丙酸梭菌、解糖梭菌、裂解梭菌、球孢梭菌、粪堆梭菌、Clostridium straminisolvens、亮黄梭菌、白蚁梭菌、热产琥珀酸梭菌、绿色梭菌、解木聚糖梭菌、滴状脱硫肠状菌、直肠真杆菌ATCC33656、长真杆菌、挑剔真杆菌ATCC 27750、霍氏真杆菌、娇弱真杆菌、惰性真杆菌、纤细真杆菌、扭链瘤胃球菌、延长厌氧醋菌、Acetatifactor muris、解纤维素醋酸弧菌、产乙醇醋酸弧菌、甘蓝无胆甾原体0502、细小无胆甾原体、牛无胆甾原体、琼氏不动杆菌、猪放线杆菌、鲍氏放线菌、齿放线菌、龋齿放线菌、Acutalibacter muris、浅绿气球菌、苛求气微菌、芬氏别样杆菌、Alistipes obesi、昂氏别样杆菌、腐烂别样杆菌、沙氏别样杆菌、沙氏别样杆菌WAL 8301、提蒙别样杆菌JC136、糖发酵碱杆状菌、Alkaliphilus metalliredigens QYMF、产组胺阿里松氏菌、狗粪别样棒菌DSM 13633、Alloprevotella rava、Alloprevotellatannerae、Anaerobacterium chartisolvens、汤氏厌氧生活螺菌、Anaerobiumacetethylicum、八叠厌氧球菌NCTC 9810、Anaerococcus provenciensis、阴道厌氧球菌ATCC 51170、Anaerocolumna jejuensis、敏捷厌氧细线菌、人粪厌氧棒形菌、成双厌氧球形菌、Anaeromassilibacillus senegalensis、不容菌厌氧支原体、叉形厌氧杆形菌、运动厌氧生孢菌、Anaerostipes butyraticus、粪厌氧棒状菌、Anaerostipes hadrus、人结肠厌氧棍状菌、解嗅厌氧贪食菌、努比卤地无氧芽孢杆菌、Aquabacterium limnoticum、Arcobacter butzleri、Arthrospira platensis、隐藏不解糖杆菌、极小阿托波氏菌、粪拟杆菌、Bacteroides caecimuris、解纤维素拟杆菌、Bacteroides clarus YIT 12056、多氏拟杆菌、埃氏拟杆菌、芬氏拟杆菌、脆弱拟杆菌、鸡拟杆菌、马赛拟杆菌、Bacteroidesoleiciplenus YIT 12058、平常拟杆菌DSM 17135、腐蚀拟杆菌JCM 16496、多形拟杆菌、单形拟杆菌、溶木聚糖拟杆菌XB1A、解木聚糖拟杆菌、肠道巴恩斯氏菌、Beduinimassiliensis、双歧双歧杆菌、齿双歧杆菌、长双歧杆菌婴儿亚种、Blautia caecimuris、粪球布劳特氏菌、粪布劳特氏菌、Blautia glucerasea、汉氏布劳特氏菌DSM 20583、氢养布劳特氏菌、淤泥布劳特氏菌、淤泥布劳特氏菌DSM 14534、韦氏布劳特氏菌DSM 19850、水生布戴约维采菌、鸡盲肠丁酸球菌、Butyricimonas paravirosa、穗状丁酸弧菌、大岛氏热粪杆菌、柯氏喜热菌、解蛋白喜热菌、Caloramator quimbayensis、纤细弯曲杆菌、直肠弯曲杆菌、Campylobacter ureolyticus DSM 20703、牙龈二氧化碳嗜纤维菌、利氏二氧化碳嗜纤维菌、生痰二氧化碳嗜纤维菌、Casaltella massiliensis、Catabacter hongkongensis、三冈链形杆菌、Christensenella minuta、Christensenella timonensis、Chryseobacteriumtaklimakanense、弗氏柠檬酸杆菌、Cloacibacillus porcorum、Clostridioidesdifficile ATCC 9689＝DSM 1296、解淀粉梭菌、鲍氏梭菌、Clostridium butyricum、尸毒梭菌、狗肠梭菌、产气梭菌、缓纤维梭菌DSM 5427、海梭菌、水稻梭菌、类腐败梭菌、牧场梭菌、产气荚膜梭菌、奎氏梭菌、糖丁醇梭菌、生孢梭菌、Clostridium ventriculi、产气柯林斯氏菌、睾丸酮丛毛单胞菌、Coprobacter fastidiosus NSB1、规则粪球菌、Corynebacterium diphtheriae、坚硬棒杆菌、蕈状棒杆菌、Corynebacteriumpyruviciproducens ATCC BAA-1742、解结核硬脂酸棒杆菌、Culturomica massiliensis、Cuneatibacter caecimuris、Defluviitalea saccharophila、食酸戴尔福特菌、氧呼吸脱亚硫酸杆菌、还原金属脱亚硫酸杆菌、Desulfosporosinus acididurans、喜盐脱硫肠状菌、Desulfotomaculum intricatum、Desulfotomaculum tongense、脱硫脱硫弧菌脱硫亚种、爱达荷脱硫弧菌、海滨脱硫弧菌、懒惰脱硫弧菌、简单脱硫弧菌、大叶藻脱硫弧菌、乙酸氧化脱硫单胞菌、嗜碱还原硫素杆菌AHT 1、食氨基酸脱硫代硫酸菌、浑浊戴阿利斯特菌、产丙酸戴阿利斯特菌、Dielma fastidiosa、Dietzia alimentaria 72、长链多尔氏菌、嘉德营发酵单胞菌ATCC BAA-286、莫氏营发酵单胞菌、缓慢爱格士氏菌、啮噬艾肯氏菌、Eisenbergiellatayi、Emergencia timonensis、Enorma massiliensis phI、粪肠球菌、Enterorhabdusmuris、哈尔滨产乙酸菌YUAN-3、产粪甾醇真杆菌、黏液真杆菌、氧化还原真杆菌、沟迹真杆菌ATCC 35585、单形真杆菌、凸腹真杆菌、嗜木聚糖真杆菌、Extibacter muris、Ezakiellaperuensis、普氏栖粪杆菌、Faecalicoccus acidiformans、Faecalitalea cylindroides、绒毛产线菌、珀氏解黄酮菌、Flintibacter butyricus、Frisingicoccus caecimuris、Fucophilus fucoidanolyticus、Fusicatenibacter saccharivorans、死亡梭杆菌、具核梭杆菌文氏亚种、猴梭杆菌、可变梭杆菌、脱氮加西亚氏菌、溶血孪生球菌、甲酸芽殖菌、Gordonibacter urolithinfaciens、耐盐纤细杆菌JW/YJL-S1、挑食短链小球菌、牛古根海姆氏菌、溶血嗜血杆菌、盲肠螺杆菌、猪粪赫斯佩尔氏菌(Hespellia stercorisuis)、Holdemanella biformis、马赛霍兰德氏菌AP2、解脲霍华德氏菌、Hungatella effluvii、Hungatella hathewayi、解糖氢厌氧杆菌、Ihubacter massiliensis、Intestinibacterbartletti、Intestinimonas butyriciproducens、Irregularibacter muris、昆布基尔市螺菌DSM 19542、Kroppenstedtia guangzhouensis、Lachnoanaerobaculum orale、Lachnoanaerobaculum umeaense、Lachnoclostridium phytofermentans、嗜酸乳杆菌、低温乳杆菌、动物乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌、近茎轴乳杆菌、懒惰乳杆菌、戊糖乳杆菌、罗氏乳杆菌、格氏乳球菌、长卵形产内酯菌、口腔纤毛菌、霍氏纤毛菌、Leptotrichiahongkongensis、瓦氏纤毛菌、仁荷明串珠菌、Levyella massiliensis、Loriellopsiscavernicola、嗜热烂泥孢菌、鲑肉色嗜纤维菌JCM 21150、Marvinbryantiaformatexigens、光尾荧中间原体、史氏甲烷短杆菌ATCC 35061、Methanomassiliicoccusluminyensis B10、扭托甲基杆菌、贾氏光岗氏菌、Mobilitalea sibirica、柯氏动弯杆菌、细小难养杆菌、慢生难养杆菌、甘油穆尔氏菌、Moorella humiferrea、Moraxellanonliquefaciens、奥斯陆莫拉氏菌、摩氏摩根氏菌、产吲哚摩里氏菌、Muribaculumintestinale、Murimonas intestini、Natranaerovirga pectinivora、Neglectatimonensis、灰色奈瑟氏球菌、口奈瑟氏球菌、Nocardioides mesophilus、Novibacillusthermophilus、人苍白杆菌、内脏臭气杆菌、Olsenella profusa、龈乳杆菌、Oribacteriumasaccharolyticum ACB7、瘘管口腔杆菌、啮齿震颤杆菌GH1、产戊酸震颤杆菌、普氏产醋杆菌、成团泛菌、食桂皮酸乳头杆菌、Parabacteroides faecis、古氏副拟杆菌、戈登氏副拟杆菌、粪副拟杆菌、寡食副生孢杆菌、人类副萨特氏菌、Parasutterella secunda、微小小单胞菌、黑色消化球菌、Peptoniphilus duerdenii ATCC BAA-1640、Peptoniphilusgrossensis ph5、Peptoniphilus koenoeneniae、Peptoniphilus senegalensis JC140、口炎消化链球菌、Phascolarctobacterium succinatutens、Phocea massiliensis、Pontibacter indicus、本氏卟啉单胞菌、牙髓卟啉单胞菌、Porphyromonas pasteri、伯根普雷沃氏菌、口颊普雷沃氏菌ATCC 33574、栖牙普雷沃氏菌、抑制普雷沃氏菌、Prevotellafusca JCM 17724、洛氏普雷沃氏菌、变黑普雷沃氏菌、口普雷沃氏菌、苍白雷沃氏菌ATCC700821、粪普雷沃氏菌DSM 18206、提蒙医院普雷沃氏菌、Propionispira arcuata、奇异变形菌、雷氏普罗威登斯菌、Pseudobacteroides cellulosolvens ATCC 35603＝DSM 2933、瘤胃假丁酸弧菌、多毛假解黄酮菌ATCC 29799、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、Pseudomonasmandelii、硝基还原假单胞菌、恶臭假单胞菌、Raoultella ornithinolytica、Raoultellaplanticola、Raoultibacter massiliensis、Robinsoniella peoriensis、Romboutsiatimonensis、粪便罗斯拜瑞氏菌、人罗斯拜瑞氏菌A2-183、肠道罗斯拜瑞氏菌、食葡糖罗斯拜瑞氏菌DSM 16841、龋齿罗斯氏菌ATCC 17931、Ruminiclostridium thermocellum、白色瘤胃球菌、布氏瘤胃球菌、伶俐瘤胃球菌、Ruminococcus champanellensis 18P13＝JCM17042、粪瘤胃球菌JCM 15917、生黄瘤胃球菌、Ruminococcus gauvreauii、酸奶瘤胃球菌ATCC 29176、Rummeliibacillus pycnus、Saccharofermentans acetigenes、Scardoviawiggsiae、热脱聚合物赛托氏菌、香港沉积物棒菌、生痰月单胞菌ATCC 35185、弱生斯奈克氏菌ATCC 700122、Slackia piriformis YIT 12062、加拿大土壤杆形菌、莫氏细小杆菌、水生鞘氨醇单胞菌、Spiroplasma alleghenense、中华螺原体、栖斑虻螺原体、栖蚊螺原体、栖萤火虫螺原体、白蚁孢杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜麦芽寡养单胞菌、Stomatobaculumlongum、无乳链球菌ATCC 13813、嵴链球菌、马肠链球菌、戈氏链球菌、Streptococcuslactarius、副乳房链球菌、变异罕见小球菌、溶糊精琥珀酸弧菌、狗粪萨特氏菌、Sutterella wadsworthensis、糖变互营球菌、策氏共养单胞菌OL-4、Terrisporobactermayombei、白栖热嗜狮菌、齿垢密螺旋体、索氏密螺旋体、Tyzzerella nexilis DSM 1787、Vallitalea guaymasensis、Vallitalea pronyensis、嗜小球藻吸血弧菌、非典型韦荣氏球菌、坏齿韦荣氏球菌、殊异韦荣氏球菌、非典型韦荣氏球菌、瓦达食谷菌、中热度火山芽孢杆菌和混淆魏斯氏菌。

在一些实施方案中，方法还包括用免疫检查点阻断联合疗法治疗预测具有无毒性或有效应答的对象。在一些实施方案中，方法还包括用本公开的组合物治疗预测具有毒性和/或无效反应的对象。在一些实施方案中，所述方法还包括用(i)PD-1、PDL1或PDL2抑制剂和(ii)CTLA-4、B7-1或B7-2抑制剂的组合治疗对象。

在一些实施方案中，当确定本文描述的门、目、科、属或种的一种或多于一种细菌的相对丰度为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)时预测毒性、无毒性、有效或无效响应。在一些实施方案中，确定细菌的组合的总相对丰度为至少2％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或其中任何可派生范围)。

本公开的组合物可不包括本文描述的一种或多于一种细菌属或种或者可包含少于1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³或1×10²个本文描述的一种或多于一种细菌的细胞或CFU(或其中任何可派生范围)。

本文描述的有利或不利分布型可不包括本文描述的一种或多于一种细菌或者可包含相对丰度小于30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％(其其中任何可派生范围)的本文描述的一种或多于一种细菌。

在一些实施方案中，每个细菌群体以至少1×10³CFU的浓度存在于组合物中。在一些实施方案中，组合物为活细菌产品或活的生物治疗产品。在一些实施方案中，细菌是冻干的、冷冻干燥的或冷冻的。在一些实施方案中，组合物被配制为用于经口递送。在一些实施方案中，配制为用于经口递送的组合物为片剂或胶囊剂。在一些实施方案中，片剂或胶囊剂包含耐酸的肠溶衣。在一些实施方案中，组合物被配制为用于直肠施用、经由结肠镜施用、通过鼻胃管经由乙状结肠镜施用、或灌肠施用。在一些实施方案中，组合物能够被重新配制为为包含液体、悬浮液、凝胶、凝胶片、半固体、片剂、小袋、锭剂、胶囊剂或作为肠内制剂以用于最终递送。在一些实施方案中，组合物被配制为用于多次施用。在一些实施方案中，组合物还包含药学上可接受的赋形剂。

特别考虑的是，关于本发明的一个实施方案讨论的任何限制可适用于本发明的任何其他实施方案。此外，本发明的任何组合物可用于本发明的任何方法中，并且本发明的任何方法可用于生产或利用本发明的任何组合物。实施例中阐述的实施方案的方面也是可在不同的实施例中或本申请中别处如在发明内容、

具体实施方式

、权利要求书和附图说明中讨论的实施方案的上下文中实施的实施方案。

附图说明

以下附图构成本说明书的一部分并引入以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多于一个并结合本文提供的具体实施方案的详细描述，本发明可得到更好的理解。

图1.患者队列和生物试样模式。在开始抗CTLA-4和抗PD-1联合阻断之前和之后对患晚期黑色素瘤的患者(n＝53)评价临床结果和相关生物试样(肿瘤、外周血单核细胞、粪便微生物组)分析。

图2A-2G.应答的分子和免疫预测因子。(A)治疗前肿瘤样本(n＝26)中的非同义变体(NSV)计数，按二值化最佳总应答分组(BOR；R＝应答者，n＝20，NR＝无应答者，n＝6)。具体的客观应答由每个数据点的颜色指示(p＝0.20，Mann-Whitney检验)。(B)治疗前肿瘤样本(n＝26)中的拷贝数丢失负荷(受影响的基因组区域)，按二值化最佳总应答分组(p<0.05，Mann-Whitney检验)。(C)受拷贝数变异(CNV)显著影响的基因。(D)通过全外显子组测序(n＝26个肿瘤)评估的CNV景观，其显示了影响黑色素瘤中反复突变的选定基因、IFN-信号传导基因和抗原加工/呈递基因的CNV缺失和增加。(E)治疗前肿瘤中浸润CD8+细胞的密度(计数/mm²)，根据单色染色免疫组织化学确定，按二值化应答分组(n＝19R，n＝6NR；p＝0.052，单侧Mann-Whitney检验)。(F)治疗前瘤内T细胞受体(TCR)组库的熵，比较了R(n＝19)与NR(n＝6)组库(p＝0.058，Mann-Whitney检验)。(G)治疗前瘤内TCR组库的克隆性，按应答分组(n＝19R，n＝6NR；p＝0.28，Mann-Whitney检验)。

图3A-3F.循环T细胞组库组成和表型预测毒性。(A)按高级别irAE分组(分别为p<0.01和p＝0.013，Mann-Whitney检验)的患者(n＝14)之间治疗早期血液样本中CD8+T效应子(Teff细胞)内Ki67+细胞的比较。(B)根据≥3级irAE的发生(或不存在)(p＝0.028，Mann-Whitney检验)，根据治疗前外周血淋巴细胞(n＝24)的TCR测序数据测量的循环T细胞组库的多样性(逆辛普森)。用每个数据点的颜色指示是否接受过全身免疫疗法。(C)治疗前血液淋巴细胞中由TCR测序得到的循环T细胞组库熵(n＝24)，按3级或高于3级的免疫相关的不良事件(≥3级irAE)的发生分组(p<0.01，Mann-Whitney检验)。用颜色指示是否接受过全身免疫疗法。(D)治疗前外周血样本中CD4+T效应子(Teff)内CD27+细胞和(E)CD8+Teff内CD28+细胞的百分数(如所示的Mann-Whitney检验；用颜色指示是否接受过全身免疫疗法)。(F)堆叠条形图(上)和列联表(下)，其描绘了在接受过免疫疗法与抗CTLA-4和抗PD-1联合阻断后发生高级别免疫相关的不良事件的风险之间的关系(p＝0.016，Fisher精确检验)。

图4A-4F.肠道微生物组分布型与针对CICB的应答和毒性关联。(A)堆叠条形图，描绘了每个所分析的粪便样本(n＝31)的目级微生物组成。(B)粪便微生物组的α多样性(逆辛普森)，按对联合免疫检查点阻断的应答分组(p＝0.14，Mann-Whitney检验)。R＝应答者，NR＝无应答者。(C)粪便微生物组的α多样性(逆辛普森)，按开始CICB后高级别免疫相关的不良事件的发生分组(p＝0.59，Mann-Whitney检验)。(D)细菌分类群的LEfSe图，与针对CICB的应答或无应答差异关联。LDA＝线性判别分析。(E)细菌分类群的LEfSe图，与高级别(≥3级)免疫相关的不良事件(irAE)的发生或不发生差异关联。(F)关键的毒性关联或无毒性关联细菌分类群与循环免疫亚群之间的相关性热图(Spearman'srho)，通过基线血液样本(n＝9)的多参数流式细胞术定量。Teff＝T效应细胞，TCM＝T中枢记忆，TEM＝T效应记忆，Treg＝调节性T细胞。

图5A-5E.微生物组随CICB的变化与肿瘤大小相关。(A)4次注射指定抗体(x-轴)后MCA205肉瘤(左图)或RET黑色素瘤(右图)的肿瘤大小。总的来说，小鼠分别接受了6次或5次抗PD-1和抗CTLA-4注射或相关的同种型对照的治疗。实验条件包括抗PD-1治疗小鼠(n＝6MCA205，n＝6RET)、CICB治疗小鼠(n＝6MCA205，n＝10RET)或同种型治疗小鼠(n＝6MCA205，n＝8RET)。应答者以蓝色指示，无应答者以红色指示，其对应于尽管治疗但仍逃逸的肿瘤。使用Mann-Whitney检验：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。(B)MCA205(左图)和RET(右图)中粪便微生物群随时间的β多样性(橙色：治疗开始前，蓝色：2次注射后48小时，红色：5次注射后48小时)。(C)β-多样性，按MCA205(左图)和RET(右图)中的肿瘤大小着色，紫色的强度指示肿瘤大小增加。ANOSIM定义了组的分离；p值定义了样本经过999次排列后这种分离的显著性。(D)维恩图，显示了治疗开始前在肿瘤模型之间共享或不共享的细菌种的叠置图，对应于针对CICB的应答者(左图)。珀氏解黄酮菌优先见于与黑色素瘤患者共享(图4D-4E)的R小鼠(右图)中。(E)小鼠中在治疗前检测到的分类群的相对丰度的时相，发现这些分类群在患者和鼠肿瘤类型两者中在R(蓝色)与NR(红色)之间均存在丰度差异，丰度随时间的变化在种级上显示出明显的差异。

图6A-6I.荷瘤小鼠中微生物群依赖的回肠炎和结肠炎。(A-B)来自经用同种型对照、CICB或CICB+ATB治疗，然后用Erysipelatoclostridium ramosum或肠道拟杆菌重新定植的荷MCA205小鼠的回肠的代表性显微照片(比例尺：50μm)。经用同种型对照或CICB、或单独用抗生素或随后用肠道拟杆菌(BI)、Dielma fastidiosa(DF)或E.ramosum(ER)单一定植的MCA205荷瘤小鼠的H&E染色回肠的详细评分，n＝9-22/组。学生t检验：*p<0.05。(C)在使用或不使用抗生素或用指定细菌单一定植的情况下MCA205和RET荷瘤小鼠中相对的回肠IL1β表达。n＝5-22。(D)经用CICB或CICB与IL1R1受体的阻断治疗的MCA205荷瘤小鼠的H&E染色回肠的评分，n＝10-12只小鼠/组。(E)在对用同种型对照或CICB治疗的RET或MCA205荷瘤小鼠中的结肠进行H&E染色后固有层中炎症区域的病理学评估，n＝7-16/组。(F)在基因扩增子的16S rDNA测序中评估的粪便微生物群的β多样性(Bray-Curtis不相似性)，按RET荷瘤小鼠中结肠炎性浸润物的评分着色，紫色的强度指示炎性浸润物评分增加(左图)。在小鼠和患者之间共享的肠道拟杆菌和嗜小球藻吸血弧菌的相对丰度(右图)，基于应答(NR，红色；R，蓝色)及表现出结肠毒性的宿主和不表现出结肠毒性的宿主(高炎症评分，绿色；低炎症评分，黄色)来对比丰度。(G)在(H)和(I)中使用的实验设置：在SPF小鼠中使用抗生素3天后用无应答者(NR)肾癌患者粪便进行FMT。两周后，原位植入表达荧光素酶的RENCA细胞。五天后，在有或没有口管饲喂嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akk)或者用来自未经历3-4级irAE的应答者(R)患者的粪便进行FMT的情况下施用同种型对照或CICB。(H-I)第15天时在对用同种型对照或CICB治疗的RENCA荷瘤小鼠中进行H&E染色后结肠固有层中炎症区域的病理学评估。(I)粪便脂质运载蛋白-2水平的ELISA(n＝16/组)。C、D、E、H、I中的Mann-Whitney检验：*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。

图7A-7B，与图1和表3有关：患者治疗结果。(A)患者队列(n＝53)中无进展生存期的Kaplan-Meier曲线。(B)游泳图(swimmer plot)，指示每位患者的最佳总应答(彩色阴影)、最佳总应答的持续时间(条形的阴影部分的长度)和总体随访持续时间(条形的阴影+无阴影部分)，从第一剂免疫检查点阻断联合疗法当天起测量。

图8A-8E，与图2有关：联合免疫检查点阻断的分子标志物。(A)通过全外显子组测序(n＝26个肿瘤)鉴定的非同义变体(NSV)的景观，其影响黑色素瘤中反复突变的选定基因、IFN-信号传导基因和抗原加工/呈递基因。(B)在BRAF V600-突变患者(n＝19)与野生型(n＝6)患者之间比较NSV计数(p<0.001，排列检验)。(C)患者中总的预测新抗原及全结合、强结合和弱结合新抗原的计数差异，按最佳总应答分组(R＝应答者(蓝色)，n＝20；NR＝无应答者(红色)，n＝6；所有p>0.05，Mann-Whitney检验)。(D)受染色体拷贝数缺失影响的基因数目的条形图，展示了染色体5、10和15内的显著负荷。(E)全基因组SGOL评分表明了影响染色体10的CNV的富集。

图9A-9E，与图2和图3有关：CICB应答和毒性的免疫标志物。(A)在CICB开始之前(治疗前)和之后(治疗后)肿瘤内CD8+细胞密度的比较(n＝19R，n＝6NR；p＝ns，Mann-Whitney检验；最佳总应答(BOR)由每个数据点的颜色指示)。(B)通过外周血免疫组库的TCR测序检测到的显著扩增的T细胞克隆(治疗前到治疗时)数目的箱形图，按存在或不存在高级别免疫相关的不良事件分组(3级irAE；n＝7存在，n＝9不存在；p＝0.22，Mann-Whitney检验)。(C)在按高级别irAE分组(分别地，p<0.01和p＝0.013，Mann-Whitney检验)的患者(n＝14)之间的早期实效治疗(on-treatment)血液样本中T中枢记忆(TCM)细胞内Ki67+细胞的比较。(D)治疗开始前CD4+Teff内CD28+细胞和(E)CD8+Teff内CD27+细胞的百分数，按高级别irAE示出(分别地，p＝0.014、p>0.05，Mann-Whitney检验)。CD4+Teff内CD28+细胞的CD27+的百分数。

图10A-10E，与图4有关：与CICB应答和毒性关联的粪便微生物组特征。(A)经CICB治疗的患者(n＝31)中在治疗开始之前或之后不久取的肠道微生物群的α多样性，通过指定的度量指标量度(如所示的p值，Mann-Whitney检验)。(B-C)根据二分应答类别(B)或高级别毒性的发展(C)的OTU(所有分类学级别)成对比较的火山图。(D)基线处应答或无应答关联分类群与循环免疫细胞群体之间的相关性热图(Spearman’s r)(n＝9)。

图11A-11D，与图5有关：治疗诱导的肠道细菌组成变化的动力学及与肿瘤大小的相关性。(A，C).在2次(A)或5次(C)mAb注射后48小时区分物种的LEfSe图(橙色：同种型对照抗体，紫色：抗PD-1抗体，绿色：CICB)。将线性判别分析(LDA)与效应大小测量相结合以表示每个治疗组中差异存在的物种。LDA评分≥2(B，D)。Spearman相关性指数的热图，表示从对每个肿瘤模型的LEfSe分析确定的2次(B)或5次(D)注射后每种细菌物种与肿瘤大小的相关性，按字母顺序列出。红色代表与肿瘤大小正相关，而蓝色代表与肿瘤大小负相关。*p<0.05。

图12A.荷瘤小鼠中回肠和结肠的微生物群依赖性炎性细胞因子模式。(A)在有或没有抗生素或用指定的细菌单一定植的情况下MCA205和RET荷瘤小鼠的回肠和结肠中相对促炎基因表达的CICB/同种型对照比率的log2-倍变化的热图。n＝5-22/组。*p<0.05，**p<0.01，Mann-Whitney检验。

图13A-13F.肠道微生物组通过抗肿瘤免疫浸润物的有益变化影响晚期黑色素瘤患者中对抗PD1疗法的应答。A)肠道微生物组中应答者(R)与无应答者(NR)之间的α多样性比较。B)LDA效应大小直方图显示细菌在R与NR中差异富集，其中条形的长度指示与分类群关联的效应大小。C)如通过免疫组织化学所量化，pro-R肠道细菌与肿瘤内免疫浸润物之间的Spearman相关矩阵(n＝15)。D)无菌小鼠中研究的实验设计。E)在移植应答者(R-FMT)或无应答者(NR-FMT)粪便后或不经FMT后用抗PDL1治疗的小鼠中的肿瘤生长曲线。F)肿瘤注射后第14天时R-FMT与NR-FMT小鼠的粪便中的粪杆菌水平。

图14：在开始抗CTLA-4和抗PD-1联合阻断之前和之后对患晚期黑色素瘤的患者队列(n＝77)评价临床结果和相关生物试样分析。

图15A-15D：应答的分子和免疫预测因子。A)治疗前肿瘤样本(n＝26)中的拷贝数缺失负荷(CNV)(受影响的基因组区域)，按二值化最佳总应答分组(p<0.05，Mann-Whitney检验)。B)通过对黑色素瘤中反复突变的选定基因、IFN-信号传导基因和抗原加工/呈递基因的全外显子组测序(n＝26个肿瘤)评估的CNV景观。C)上图)治疗前循环T细胞组库(n＝24)的多样性(逆辛普森)，按≥3级irAE的发生(或不发生)(p＝0.028，Mann-Whitney检验)，和下图)治疗前外周血淋巴细胞(n＝24)的循环T细胞组库的熵，按≥3级irAE的发生(或不发生)。D)上图)CD4+T效应细胞内的CD27表达，和下图)CD8+T效应细胞内的CD28表达，按<或≥3级irAE分组(n＝15；分别地，p<0.01、p<0.05，Mann-Whitney检验)。

图16A-16C：通过16S rRNA测序表征肠道微生物组。A)堆叠条形图，描绘了来自皮肤和未知原发性队列的每个所分析的粪便样本的目级微生物组成(n＝40)。B)经CICB治疗的患皮肤或未知原发性黑色素瘤的患者(n＝40)中在治疗开始之前或之后不久取的粪便微生物组的α多样性，按应答分组，通过指定的度量指标量度(p＝0.68，Mann-Whitney检验；R＝应答者，NR＝无应答者)。C)粪便微生物组的α多样性(逆辛普森)，按具有粪便样本的所有患者中高级别免疫相关的不良事件的发生分组(p＝0.71，Mann-Whitney检验，n＝54)。

图17A-17B：根据LEfSe，细菌分类群的差异富集。患者中差异富集的细菌分类群的线性判别分析评分图，A)在对CICB为R或NR的患者中差异富集的细菌分类群的LDA评分图，来自皮肤和未知原发性队列(n＝40)。LDA＝线性判别分析。p<0.05，或B)在具有粪便样本的所有患者(n＝54)中与高级别(≥3级)免疫相关的不良事件(irAE)的发生或不发生显著关联的细菌分类群的LDA评分图。p<0.05。

图18A-18C：候选细菌分类群的发现和与无进展生存期的关联。根据自举法(在所有级别)，相对细菌丰度的成对Mann-Whitney比较的火山图，A)按皮肤/未知原发性队列(n＝40)中的二分应答类别对分类群(在所有级别)的成对比较的火山图，使用应用于1000个不同细菌丰度排列的Mann-Whitney检验。和B)按二分高级别(≥3级)免疫相关的不良事件类别(n＝54)对细菌分类群(在所有级别)的成对比较的火山图，使用应用于1000个不同细菌丰度排列的Mann-Whitney检验。

图19A-19B：循环免疫群体与在表型上最差异富集的细菌分类群之间的关联。A)基线处和应答或无应答关联的分类群与循环免疫细胞群体之间的相关性热图(Spearman'srho)(n＝8)，和B)关键的毒性关联或无毒性关联细菌分类群与循环免疫亚群之间的相关性热图(Spearman's rho)，通过基线血液样本(n＝8)的多参数流式细胞术定量。TEff＝T效应细胞，TCM＝T中枢记忆，TEM＝T效应记忆，Treg＝调节性T细胞。

图20A-20C.肠道微生物与CICB应答的关联。(A)结合两种肿瘤模型，处死时最终无瘤或荷瘤的CICB治疗小鼠之间T0时β多样性方差的偏最小二乘判别分析(PLS-DA)图。LV，潜在变量。(B)变量重要性(VIP)评分条形图，突出显示了T0时存在的细菌物种在由条颜色定义的组中与由边框颜色定义的组相比显著富集(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)，指示了CICB治疗后最终无瘤和荷瘤的小鼠(RET和MCA205模型)。对于每个物种，条颜色描绘所定义的物种具有最高平均相对丰度的队列，而边框颜色指示具有最低平均相对丰度的队列。不存在的边界指示比较队列中的平均相对丰度为零。绿框突出显示与患者数据一样的物种。Mann-Whitney检验：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns＝不显著。条形厚度报告了两个队列间每个物种的平均相对丰度的倍数比值。NA＝不适用。(C)CICB治疗小鼠中狄氏副拟杆菌(在T0、T2和T5时)的相对丰度与T5时的肿瘤大小的Pearson相关性。

图21.关键的毒性关联或无毒性关联细菌分类群与循环免疫亚群之间的相关性热图(Spearman's rho)，通过基线血液样本(n＝8)的多参数流式细胞术定量。TEff＝T效应细胞，TCM＝T中枢记忆，TEM＝T效应记忆，Treg＝调节性T细胞。

图22A-22G.肠道微生物组分布型与针对CICB的应答和毒性关联。(A)经用同种型对照或CICB±抗生素治疗的MCA205或RET荷瘤小鼠的H&E染色回肠的评分(范围0-4)，n＝9-22/组。学生t检验。(B)MCA205和RET荷瘤小鼠±抗生素的回肠和结肠中促炎免疫基因表达(CICB治疗与同种型)的log₂倍变化的热图(左图)。(C)经用同种型/CICB±抗生素治疗的荷瘤小鼠中的相对回肠Il1b表达。Mann-Whitney检验。n＝10-22只小鼠/组。(D)来自同种型与CICB治疗组的小鼠粪便中肠道拟杆菌的相对丰度的qPCR定量，以治疗前与治疗后配对的方式(链接点)。n＝21-26只小鼠/组。Wilcoxon符号秩检验。结合MCA205(n＝5-32/组，灰点)和RET(n＝5-26/组，白点)，在经抗生素治疗、然后在停用抗生素后让肠道拟杆菌自然重新定植或用肠道拟杆菌饲喂一次的小鼠中，在一次CICB注射后48小时的相对回肠Il1b表达(E)和回肠毒性评分(F)。数据代表使用三种不同的肠道拟杆菌菌株的两个单独实验的集合。对于回肠毒性评分，根据低毒性(0分或1分)与高毒性(2、3或4分)卡方检验对小鼠分类。使用Mann-Whitney检验分析回肠Il1b表达。(G)CICB(或同种型)治疗后的回肠毒性评分，比较了用肠道拟杆菌定植(高)与用供体FMT(低)的小鼠。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001

图23.患者治疗结果。按黑色素瘤亚型(n＝77，n＝63皮肤/未知原发性，n＝8黏膜，n＝6葡萄膜)分层的患者队列中无进展生存期的Kaplan-Meier曲线。

图24A-24D.CICB应答和毒性的免疫标志物。(A，B)和CD8+Teff(C,D)，来自单独的CICB治疗队列，在治疗前外周血样本中(如所示，p值来自Mann-Whitney检验)。

图25.既往免疫疗法和与毒性关联的T细胞表型。(C)堆叠条形图(上)和列联表(下)，描绘了在患皮肤或未知原发性黑色素瘤的患者中在接受过免疫疗法与抗CTLA-4和抗PD-1联合阻断后发生≥3级irAE的风险之间的关系(p＝0.028，Fisher精确检验)。

图26A-26B.在皮肤/未知原发性队列(n＝40)中按应答结果比较厚壁菌门(B)和梭菌目(C)的分组丰度。

图27A-27D.鼠科模型中的微生物组和应答。(A)在5次注射指定抗体后MCA205纤维肉瘤(左图)或RET黑色素瘤(中图)肿瘤生长动力学及处死时荷瘤或无瘤小鼠的百分数(右图)。实验组由同种型、抗PD-1或CICB治疗组成。x-轴上的箭头指示粪便采集时间点：T0＝治疗开始前，T2＝2次治疗后48小时，T5＝5次治疗后48小时。显示的肿瘤生长代表2个实验。n＝12-16只小鼠/组。使用方法中详述的软件进行统计分析：**p<0.01，***p<0.001。(B)在MCA205(左图)和RET(右图)荷瘤小鼠中，在治疗开始前(T0，橙色)、2次注射CICB或同种型对照后48小时(T2，蓝色)和5次注射CICB或同种型对照后48小时(T5，红色)采集的粪便样本中的微生物α多样性(上图)和粪便微生物β多样性的偏最小二乘判别分析(PLS-DA)(下图)，通过16S rRNA基因扩增子的测序使用香农指数评估。Mann-Whitney U检验：*p<0.05，**p<0.01。ANOSIM和PERMANOVA定义了组的分离；p值定义了样本经过999次排列后组分离的显著性。(C)T0时的β-多样性，按经CICB治疗的MCA205和RET中T5时的肿瘤大小着色；紫色的强度指示肿瘤大小增加。对于每个主坐标轴(PCo1和PCo2)，示出了采集的方差、Pearson rho系数和相应的p值。(D)在T0、T2和T5时从小鼠采样的粪便中狄氏副拟杆菌的相对丰度，结合两种肿瘤模型，在T5时最终发现荷瘤或无瘤的小鼠显示出明显的差异。Mann-Whitney检验：*p<0.05。

图28A-28H.(A)用同种型或CICB治疗的荷MCA205和RET小鼠的回肠的代表性显微照片(比例尺：50μm，放大倍数：100X)(左图)。(C).在结合发现和验证队列数据中的针对RET的T0、T2和T5时结肠浸润物评分与分类群的相对丰度之间的相关性热图(Pearson's rho)。红色代表与结肠浸润物评分正相关，而蓝色代表与结肠浸润物评分负相关。(D)通过16SrRNA基因扩增子的测序评估的粪便微生物群的β多样性排序(Bray-Curtis不相似性)，按RET荷瘤小鼠中结肠炎性浸润物的评分着色，紫色的强度指示发现(左图)和验证(右图)队列中炎性浸润物评分增加。在相关性分析之前将细菌相对丰度和结肠炎性浸润物既归一化又标准化。指示了比较每个主要分量与炎性浸润物的Pearson相关性和关联的p-值。(E)以配对的方式(链接点)表示的至少一次注射CICB疗法之前与之后的同种型对照与CICB治疗组中小鼠粪便中单形拟杆菌和脆弱拟杆菌的相对丰度的qPCR定量。n＝21-26只小鼠/组。(F)图3K和图H-I中使用的实验设置的示意图。(G)健康志愿者供体粪便中的肠道拟杆菌丰度(选择低与高)和确认的FMT后小鼠中的移植物，比较对照、肠道拟杆菌-低和肠道拟杆菌-高的供体受体小鼠(*p<0.05，Mann-Whitney检验)。(H)在用肠道拟杆菌-低或-高的供体粪便FMT之后的CICB后的小鼠中的相对Il1b表达(*p<0.05，Mann-Whitney检验)。

具体实施方式

用靶向细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)和程序性死亡受体-1(PD-1)的联合免疫检查点阻断(CICB)进行的治疗与在若干肿瘤类型中的临床获益相关联，但免疫相关的不良事件(irAE)的发生率高。因此，需要针对CICB的应答的生物标志物以及用CICB治疗后发生irAE的可能性。本文描述了在人类和小鼠队列中的肠道微生物群中鉴定出的针对CICB的应答和毒性的微生物决定因素。本申请的实施例还提供了证据，证明了靶向这些可降低在临床前模型中的毒性。总之，这些发现对使用CICB进行癌症的临床管理具有潜在的重要意义。

I.定义

如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白、其保持特异性结合能力的衍生物和具有与免疫球蛋白结合结构域同源或在很大程度上同源的结合结构域的蛋白质。这些蛋白质可源自天然来源，或者部分或完全合成产生。抗体可以是单克隆的或多克隆的。抗体可以是任何免疫球蛋白类别的成员，包括任何人类类别：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。与本文所述的方法和组合物一起使用的抗体通常是IgG类别的衍生物。术语抗体也指结合抗原的抗体片段。这样的抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、Fv、dsFv双特异抗体和Fd片段。抗体片段可通过任何措施产生。例如，抗体片段可通过完整抗体的片段化以酶促或化学方式产生，可由编码部分抗体序列的基因以重组方式产生，或者可完全或部分地以合成方式产生。抗体片段可任选地是单链抗体片段。或者，该片段可包含例如通过二硫键连接在一起的多条链。该片段还可任选地是多分子复合物。功能性抗体片段保留了以与完整抗体相当的亲和力结合其同源抗原的能力。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体的群体获得的抗体，例如，除了可能以小量存在的可能的突变例如天然发生的突变外构成该群体的各个抗体是相同的。因此，修饰语“单克隆”指示抗体的特征不是具有不同表位特异性的抗体的混合物。在某些实施方案中，这样的单克隆抗体通常包括包含结合靶标的多肽序列的抗体，其中所述靶标结合多肽序列通过包括从多个多肽序列中选择单个靶标结合多肽序列的方法获得。例如，选择过程可以是从多种克隆如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的库中选择独特的克隆。应理解，可进一步改变选定的靶标结合序列，例如以改善对标靶的亲和力、使靶标结合序列人源化、改善其在细胞培养物中的产量、降低其体内免疫原性、产生多特异性抗体等，并且包含改变的靶标结合序列的抗体也是本公开的单克隆抗体。与通常包含针对不同决定簇(表位)的若干不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体都针对抗原上的单个决定簇。除了其特异性外，单克隆抗体制剂的优势还在于它们通常不会被其他免疫球蛋白所污染。

表述“药物组合物”或“药学上可接受的组合物”是指当酌情施用于动物如人时不会产生不良反应、过敏反应或其他意外反应的分子实体和组合物。根据本公开，包含抗体或额外活性成分的药物组合物的制备将是本领域技术人员已知的。此外，对于动物(例如，人)的施用，应理解制剂应满足如FDA生物标准办公室所要求的无菌、致热原性、一般安全性和纯度标准。

如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有水性溶剂(例如，水、醇/水溶液、盐水溶液、肠胃外媒介物如氯化钠和林格氏右旋糖)、非水性溶剂(例如，丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射的有机酯如油酸乙酯)、分散介质、涂料、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂或抗真菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、药物、药物稳定剂、凝胶、黏结剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、流体和营养补充剂，如类似的材料及其组合，这是本领域普通技术人员所知的。药物组合物中各种成分的pH和准确浓度可根据熟知的参数进行调节。

术语“单位剂量”或“剂量”是指适合在对象中使用的物理上离散的单元，每个单元含有预定的量的治疗组合物，所述量计算为产生与其施用，即适当的途径和治疗方案，相关的本文讨论的期望应答。根据治疗次数和单位剂量，待施用的量取决于期望的治疗效果。施用于患者或对象的本发明实施方案的组合物的实际剂量量可根据物理和生理因素确定，如对象的体重、年龄、健康和性别，所治疗的疾病的类型、疾病渗透的程度、先前或同时进行的治疗干预、患者的特发性、施用的途径以及特定治疗物质的效力、稳定性和毒性。例如，每次施用的剂量也可包括约1μg/kg/体重至约1000mg/kg/体重(该范围包括中间剂量)或多于1000mg/kg/体重，以及其中可派生的任何特定剂量。在可从本文所列数字衍生出的范围的非限制性实例中，可施用约5μg/kg/体重至约100mg/kg/体重、约5μg/kg/体重至约500mg/kg/体重等的范围。在任何情况下，负责施用的执业医师将确定组合物中一种或多于一种活性成分的浓度和个体对象的一种或多种适宜剂量。

细菌的“群体”可指包含单一种或不同种的混合物的细菌组合物？

术语“免疫检查点”是指调节免疫应答的广度和幅度的各种刺激、共刺激和抑制信号，这些信号对于维持免疫稳态和宿主存活是必不可少的。已知的免疫检查点蛋白质包括CTLA-4、PD-1及其配体PD-L1和PD-L2，另外还有LAG-3、BTLA、B7H3、B7H4、TIM3、KIR。涉及LAG3、BTLA、B7H3、B7H4、TIM3和KIR的通路在本领域中被认为构成类似于CTLA-4和PD-1依赖性通路的免疫检查点通路(参见例如Pardoll,2012,Nature Rev Cancer 12:252-264；Mellman等人,2011,Nature 480:480-489)。

术语“抑制剂”是指阻断或降低蛋白质的一种或多于一种功能的可能为有机或无机的分子、蛋白质、多肽、抗体、小分子、碳水化合物或核酸的分子。抑制剂可以是通过与蛋白质直接相互作用而起作用的直接抑制剂或者可以是可能不与蛋白质直接相互作用但仍抑制蛋白质的一种或多于一种功能的间接抑制剂。

“免疫检查点抑制剂”是指抑制免疫检查点蛋白质的功能的任何化合物。抑制包括功能的降低和完全阻断。特别地，免疫检查点蛋白质为人免疫检查点蛋白质。因此，特别地，免疫检查点蛋白质抑制剂为人免疫检查点蛋白质的抑制剂。

“对象”和“患者”是指人类或非人类，如灵长类动物、哺乳动物和脊椎动物。在特别的实施方案中，对象为人。

如本文所用，当在疾病、病症或医学病况的提及中使用时，术语“治疗”、“处理”或“改善”是指病况的治疗性治疗，其中目的在于逆转、缓解、改善、抑制、减缓或停止症状或病况的进展或严重性。术语“治疗”包括减轻或缓解病况的至少一种不良影响或症状。如果一种或多于一种症状或临床标志物减少，则治疗通常是“有效的”。或者，如果病况的进展减慢或停止，则治疗是“有效的”。也就是说，“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，而且包括停止或至少减缓在没有治疗的情况下预期会发生的症状的进展或恶化。有益的或期望的临床结果包括但不限于与在没有治疗的情况下所预期的相比一种或多于一种症状的缓解、缺乏程度的减小、肿瘤或恶性肿瘤的稳定(即，不恶化)状态、肿瘤生长和/或转移的延迟或减缓以及增加的寿命。

“肠道微生物群”或“肠道微生物组”指的是生活在对象的肠中的微生物群体(及其基因组)。

术语“α多样性”是样本内多样性的量度并且是指样本内所有微生物群的分布和组装模式并计算为每个样本的标量值。“β多样性”是样本间多样性的术语，并涉及样本彼此之间的比较，其提供每个样本对之间距离或相异性的量度。

术语“相对数量”，也可称为“相对丰度”，定义为生物学样本中特定分类级别(从门到种)的细菌数目占该级别的细菌总数的百分数。例如，可通过测量样本中存在的归属于这些细菌的16S rRNA基因序列的百分数来评估这种相对丰度。其可通过熟练技术人员已知的任何合适的技术来测量，如特定细菌16SrRNA基因标志物的454焦磷酸测序或特定基因的定量PCR。

在本文中，“对治疗的良好应答者”，也称为“应答者”或“有应答的”患者，或换言之，“受益于”这种治疗的患者，是指患有癌症并且在接受这种治疗后表现出或将表现出临床上显著的癌症缓解的患者。相反，“不良应答者”或“无应答者”是指在接受这种治疗后不显示出或将不显示出临床上显著的癌症缓解的患者。可根据本领域公认的标准，如免疫相关应答标准(irRC)、WHO或RECIST标准，来评估对治疗的降低的应答。例如，有应答的患者可以是鉴定为具有完全应答(CR)——所有靶标病变均消失的患者、或鉴定为具有部分应答(PR)——最长直径(LD)靶标病变的总和(以基线总和LD为参考)减小至少30％的患者，而无应答的患者可被鉴定为罹患稳定的疾病(SD)——对应于既无足够的缩小以符合PR，也无足够的增大以符合进展性疾病(PD)(以治疗开始以来的最小LD总和为参考)，或可鉴定为罹患进行性疾病(PD)——靶标病变的LD的总和(以治疗开始或者一个或多于一个新病变的出现以来记录的最小LD总和为参考)增大至少20％。

术语“分离的”涵盖一种细菌或其他实体或物质，其已(1)与最初产生时(无论是在自然界中还是在实验环境中)和其相关的至少一些组分相分离，和/或(2)由人手工生产、制备、纯化和/或制造。分离的细菌可与最初和其相关的至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或多于90％的其他组分相分离。在一些实施方案中，分离的细菌具备大于约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或大于约99％的纯度。如本文所用，如果某物质基本上不含其他组分，则该物质是“纯的”。

术语“纯化”和“经纯化的”是指已与在最初产生或生成时(例如，无论是在自然界中还是在实验环境中)或者在其最初产生后的任何时间过程中和其相关的至少一些组分相分离的细菌或其他材料。如果细菌或细菌群体在制备时或制备后如从含有该细菌或细菌群体的材料或环境分离出来，则可认为该细菌或细菌群体是经纯化的，并且经纯化的细菌或细菌群体可含有高达约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、或高于约90％的其他材料而仍被认为是“分离的”。在一些实施方案中，经纯化的细菌和细菌群体具备大于约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或大于约99％的纯度。在本文提供的细菌组合物的情况下，组合物中存在的一种或多于一种细菌类型可独立地从含有该细菌类型的材料或环境中产生和/或存在的一种或多于一种其他细菌中纯化。细菌组合物及其细菌组分通常从残余生境产物中纯化。

术语“确定具有”是指已经测试并报告为具有某种结果如微生物组状态的患者群体。

术语“降低”、“减少”、“降低”、“减小”或“抑制”在本文中均通常用于指统计学上显著的量的减小。然而，为避免疑义，“降低”、“减少”、“减小”或“抑制”指的是与参考水平相比减小至少10％，例如减小至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或高达并包括100％的减小(即与参考样品相比不存在的水平)，或与参考水平相比10-100％之间的任何减小。

术语“增加”、“增强”或“激活”在本文中均通常用于指统计学上显著的量的增加；为避免任何疑义，术语“增加”、“增强”或“激活”指的是与参考水平相比增加至少10％，例如增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或高达并包括100％的增加，或与参考水平相比10-100％之间的任何增加，或与参考水平相比至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍的增加、或2倍与10倍之间的任何增加或更大。

与“包括”、“含有”或“特征在于”同义的术语“包含”是容他性的或开放性的而不排除另外的、未记述的要素或方法步骤。表述“由……组成”排除未指定的任何元素、步骤或成分。表述“基本上由……组成”将所描述的主题的范围限制为所指定的材料或步骤及不会实质性地影响其基本和新颖特性的材料或步骤。该术语允许不会实质性地影响本发明的该实施方案的一个或多个基本和新颖或功能特性的另外的要素的存在。关于药物组合物，术语“基本上由……组成”包括所记述的活性成分，排除任何其他活性成分，但不排除任何药物赋形剂或其他没有治疗活性的组分。预期在术语“包含”的上下文中描述的实施方案也可在术语“由……组成”或“基本上由……组成”的上下文中实施。

术语“由……组成”是指如本文所述的组合物、方法及它们各自的组分，其不包括任何在实施方案的描述中未记述的要素。

如在本说明书及所附的权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代，上下文另有明确规定除外。因此，例如，对“该方法”的提及包括一种或多于一种方法，和/或本文所述类型的步骤和/或本领域技术人员在阅读本公开等后将显而易见的那些。

如本文所用，就特定组分而言，“基本上不含”在本文中用于指没有哪种指定组分被有意配制到组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。由组合物的任何意外污染导致的指定组分的总量因此远低于0.01％。最优选的是其中用标准分析方法无法检测到任何量的指定组分的组合物。

如本文所用，术语“或”和“和/或”用于描述彼此组合或相互排斥的多个组分。例如，“x、y和/或z”可单独指“x”、单独指“y”、单独指“z”、“x、y和z”、“(x和y)或z”、“x或(y和z)”或“x或y或z”。特别考虑到可从实施方案特别排除x、y或z。

在整个本申请中，术语“约”根据其在细胞生物学领域中的普通含义使用以指示值包含用于确定该值的设备或方法的误差的标准偏差。

表述“有效量”或“治疗有效量”或“足够的量”指的是足以产生期望的结果的药物或药剂的剂量。期望的结果可以是肿瘤尺寸的减小，癌细胞生长速率的减小，转移的减少，肿瘤或肿瘤免疫浸润物中CD8+T淋巴细胞的增加，肿瘤中CD45+、CD3+/CD20+/CD56+、CD68+和/或HLA-DR+细胞的增加，肿瘤免疫浸润物中CD3、CD8、PD1、FoxP3、颗粒酶B和/或PD-L1表达的增加，肿瘤免疫浸润物中RORγT表达的减少，体循环或外周血中效应子CD4+、CD8+T、单核细胞和/或髓样树突状细胞的增加，对象的体循环或外周血中B细胞、调节性T细胞和/或髓源抑制性细胞的减少，或上述的任何组合。

II.检查点抑制剂和联合治疗

实施方案涉及包含a)CTLA-4、B7-1和/或B7-2抑制剂和b)PD-1、PDL1和/或PDL2抑制剂的联合治疗。在一些实施方案中，治疗是使用将阻断CTLA-4与B7-1或B7-2之间的相互作用的抑制剂与将阻断PD-1与PDL1或PDL2的相互作用的抑制剂的组合。

在所提供的方法、组合物或试剂盒中的任何一种的一些实施方案中，免疫检查点抑制剂为小分子抑制剂。在所提供的方法、组合物或试剂盒中的任何一种的一些实施方案中，免疫检查点抑制剂为将抑制免疫检查点通路的多肽。在所提供的方法、组合物或试剂盒中的任何一种的一些实施方案中，抑制剂为融合蛋白。在所提供的方法、组合物或试剂盒中的任何一种的一些实施方案中，免疫检查点抑制剂为抗体。在所提供的方法、组合物或试剂盒中的任何一种的一些实施方案中，抗体为单克隆单体。

A.PD-1、PDL1和PDL2抑制剂

PD-1可在T细胞遭受感染或肿瘤的肿瘤微环境中起作用。激活的T细胞将上调PD-1并继续在外周组织中表达它。细胞因子如IFN-γ将诱导PDL1在上皮细胞和肿瘤细胞上的表达。PD-1的主要作用是限制外周中效应T细胞的活性并防止在免疫应答过程中对组织的过度损伤。本公开的抑制剂可阻断PD-1和/或PDL1活性的一种或多于一种功能。

“PD-1”的替代名称包括CD279和SLEB2。“PDL1”的替代名称包括B7-H1、B7-4、CD274和B7-H。“PDL2”的替代名称包括B7-DC、Btdc和CD273。在一些实施方案中，PD-1、PDL1和PDL2为人PD-1、PDL1和PDL2。

在一些实施方案中，PD-1抑制剂为将抑制PD-1与其配体结合配偶体的结合的分子。在一个具体的方面，PD-1配体结合配偶体为PDL1和/或PDL2。在另一个实施方案中，PDL1抑制剂为将抑制PDL1与其结合配偶体的结合的分子。在一个具体的方面，PDL1结合配偶体为PD-1和/或B7-1。在另一个实施方案中，PDL2抑制剂为将抑制PDL2与其结合配偶体的结合的分子。在一个具体的方面，PDL2结合配偶体为PD-1。抑制剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。示例性抗体在美国专利号8735553、8354509和8008449中描述，其均通过引用并入本文。用于本文提供的方法和组合物中的其他PD-1抑制剂是本领域已知的，如在美国专利申请号US2014/0294898、US2014/022021和US2011/0008369中描述的，其均通过引用并入本文。

在一些实施方案中，PD-1抑制剂为抗PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些实施方案中，抗PD-1抗体选自纳武单抗、帕博利珠单抗和匹地利珠单抗。在一些实施方案中，PD-1抑制剂为免疫黏附素(例如，包含融合到恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)的PDL1或PDL2的细胞外或PD-1结合部分的免疫黏附素)。在一些实施方案中，PDL1抑制剂包含AMP-224。纳武单抗，也称MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558和是WO2006/121168中描述的抗PD-1抗体。帕博利珠单抗，也称MK-3475、Merck3475、lambrolizumab、和SCH-900475，是WO2009/114335中描述的抗PD-1抗体。匹地利珠单抗，也称CT-011、hBAT或hBAT-1，是WO2009/101611中描述的抗PD-1抗体。AMP-224，也称B7-DCIg，是WO2010/027827和WO2011/066342中描述的PDL2-Fc融合可溶性受体。另外的PD-1抑制剂包括MEDI0680，也称AMP-514和REGN2810。

在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂为PDL1抑制剂如度伐利尤单抗(也称MEDI4736)、阿替利珠单抗(也称MPDL3280A)、阿维鲁单抗(也称MSB00010118C、MDX-1105、BMS-936559)或其组合。在某些方面，免疫检查点抑制剂为PDL2抑制剂如rHIgM12B7。

在一些实施方案中，本文描述的抗体(如抗PD-1抗体、抗PDL1抗体或抗PDL2抗体)还包含人或鼠恒定区。在一些实施方案中，人恒定区选自IgGl、IgG2、IgG2、IgG3和IgG4。在还又一个具体的方面，人恒定区为IgG1。在还又一个方面，鼠恒定区选自IgGl、IgG2A、IgG2B和IgG3。在又一个具体的方面，抗体具有降低的或极小的效应子功能。在又一个具体的方面，极小的效应子功能由在原核细胞中的产生而产生。在又一个具体的方面，极小的效应子功能由“无效应子Fc突变”或无糖基化产生。

在一些实施方案中，抑制剂包含纳武单抗、帕博利珠单抗或匹地利珠单抗的重链和轻链CDR或VR。相应地，在一个实施方案中，抑制剂包含纳武单抗、帕博利珠单抗或匹地利珠单抗的VH区的CDR1、CDR2和CDR3结构域以及纳武单抗、帕博利珠单抗或匹地利珠单抗的VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个实施方案中，该抗体与上述抗体竞争与和/或向PD-1、PDL1或PDL2上同一表位的结合。在另一个实施方案中，该抗体与上述抗体具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％(或其中任何可派生范围)的可变区氨基酸序列同一性。

相应地，本文使用的抗体可以是无糖基化的。抗体的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链的附连。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X为非脯氨酸的任何氨基酸，是碳水化合物部分与天冬酰胺侧链的酶促附连的识别序列。因此，多肽中任一这些三肽序列的存在将产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种与羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸的附连，但也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。通过改变氨基酸序列使得上述三肽序列(对于N-连接的糖基化位点)中的一种被去除来方便地完成糖基化位点从抗体的去除。可通过将糖基化位点内的天冬酰胺、丝氨酸或苏氨酸残基替换为另一氨基酸残基(例如，甘氨酸、丙氨酸或保守性替换)来进行改变。

抗体或其抗原结合片段可使用本领域已知的方法来制备，例如，通过包括在适合于产生这样的抗体或片段的条件下培养宿主细胞和回收所述抗体或片段的方法，其中所述宿主细胞含有以适合于表达的形式编码任何先前描述的抗PDLl、抗PD-1或抗PDL2抗体或抗原结合片段的核酸。

B.CTLA-4、B7-1和B7-2

可在本文提供的方法中靶向的另一个免疫检查点为细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)，也称CD152。人CTLA-4的完整cDNA序列具有Genbank登录号L15006。CTLA-4存在于T细胞的表面上并在与抗原呈递细胞的表面上的B7-1(CD80)或B7-2(CD86)结合时充当“关闭”开关。CTLA4是免疫球蛋白超家族的成员，其在辅助性T细胞的表面上表达并向T细胞传递抑制信号。CTLA4类似于T细胞共刺激蛋白CD28，两种分子都与抗原呈递细胞上的B7-1和B7-2结合。CTLA-4向T细胞传递抑制信号，而CD28则传递共刺激信号。细胞内CTLA-4也见于调节性T细胞中并且对其功能可能很重要。通过T细胞受体和CD28激活T细胞会导致CTLA-4(B7分子的抑制性受体)的表达增加。本公开的抑制剂可阻断CTLA-4、B7-1和/或B7-2活性的一种或多于一种功能。在一些实施方案中，抑制剂将阻断CTLA-4和B7-1相互作用。在一些实施方案中，抑制剂将阻断CTLA-4和B7-2相互作用。

在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂为抗CTLA-4抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。

适合用于本发明方法中的抗人CTLA-4抗体(或自其衍生的VH和/或VL结构域)可使用本领域公知的方法生成。或者，可使用本领域公认的抗CTLA-4抗体。例如，可在本文公开的方法中使用以下文献中公开的抗CTLA-4抗体：US 8119129；WO 01/14424；WO 98/42752；WO 00/37504(CP675206，也称曲美木单抗，原先的替西木单抗)；美国专利号6207156；Hurwitz等人,1998。前述出版物中的每一个的教导在此通过引用并入。也可使用与任何这些本领域公认的结合CTLA-4的抗体竞争的抗体。例如，国际专利申请号WO2001/014424、WO2000/037504和美国专利号8017114中描述了人源化的CTLA-4抗体；所有内容均通过引用并入本文。

可在本公开的方法和组合物中用作检查点抑制剂的又一种抗CTLA-4抗体为伊匹单抗(也称10D1、MDX-010、MDX-101和或其抗原结合片段和变体(参见例如WO0 1/14424)。

在一些实施方案中，抑制剂包含曲美木单抗或伊匹单抗的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个实施方案中，抑制剂包含曲美木单抗或伊匹单抗的VH区的CDR1、CDR2和CDR3结构域以及曲美木单抗或伊匹单抗的VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个实施方案中，该抗体与上述抗体竞争与和/或向PD-1、B7-1或B7-2上同一表位的结合。在另一个实施方案中，该抗体与上述抗体具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％(或其中任何可派生范围)的可变区氨基酸序列同一性。

用于调节CTLA-4的其他分子包括可溶性CTLA-4配体和受体，如在美国专利号US5844905、US5885796及国际专利申请号WO1995001994和WO1998042752中所描述的，其均通过引用并入本文；和免疫黏附素，如在美国专利号US8329867中所描述的，其通过引用并入本文。

III.微生物调节剂

在一些方面，本公开涉及的方法包括在对象中检测以下中的一这或多于一者：粪便拟杆菌、粪拟杆菌、肠道拟杆菌、戴阿利斯特菌属、脆弱拟杆菌、吸血弧菌属、泰泽氏菌属、珀氏解黄酮菌、Dielma fastidiosa、Butyricimonas faecihominis、别样杆菌属、嗜黏蛋白阿克曼氏菌、罗氏乳杆菌、粪源普雷沃氏菌、沙氏普雷沃氏菌、柠檬酸杆菌属、海氏梭菌、Hungateiclostridium aldrichii、鼠柠檬酸杆菌、沟迹真杆菌、哈夫尼菌科、弗氏柠檬酸杆菌、霍氏真杆菌、阴沟肠杆菌、蜂房哈夫尼菌、哈夫尼菌属、人罗斯拜瑞氏菌、类肠膜魏斯氏菌、肠杆菌属、芽孢杆菌属、乳酸杆菌属、产气克雷伯氏菌、克雷伯氏菌属、Coprobacter、Intestinibacter bartletti、Intestinibacter、Parasutterella secunda、产丙酸戴阿利斯特菌、狄氏副拟杆菌、Fournierella、Fournierella massiliensis、嗜粪拟杆菌、Eisenbergiella tayi、蒂西耶氏菌目、Hungateiclostridium thermocellum、长链多尔氏菌、柯氏喜热菌、Muricomes、Muricomes intestini、地生孢杆菌、地下地生孢杆菌和Anaerotignum lactatifermentans或图28C中公开的细菌种。

在另一个方面，本公开涉及的方法包括在对象中检测以下中的一者或多于一者：粪便拟杆菌、粪拟杆菌、肠道拟杆菌、戴阿利斯特菌属、脆弱拟杆菌、吸血弧菌属、泰泽氏菌属、粪便拟杆菌、珀氏解黄酮菌、Dielma fastidiosa、嗜黏蛋白阿克曼氏菌、罗氏乳杆菌、脆弱拟杆菌、粪源普雷沃氏菌、沙氏普雷沃氏菌、厚壁菌门、梭菌目、瘤胃球菌科、Alistipesindistinctus、Bacteroides stercorirosoris、Clostridium lactatifermentans orus、Abyssivirga alkaniphila、Acetatifactor muris、解纤维素醋弧菌、产乙醇醋弧菌、牛无胆甾原体、德雷氏无色小杆菌、Acidovorax radices、产雌马酚阿德勒氏菌、嗜黏蛋白阿克曼氏菌、Alistipes indistinctus、Alistipes obesi、腐烂别样杆菌、塞内加尔别样杆菌、提蒙别样杆菌、糖发酵碱杆状菌、Alkalibaculum bacchi、狗粪别样棒菌、Anaerobacteriumchartisolvens、Anaerocolumna cellulosilytica、运动厌氧生孢菌、Anaerotaeniatorta、人结肠厌氧棍状菌、Anaerotruncus rubiinfantis、解嗅厌氧贪食菌、产酸拟杆菌、Bacteroides caecimuris、多氏拟杆菌、Bacteroides faecichinchillae、腐蚀拟杆菌、Bacteroides stercorirosoris、解木聚糖拟杆菌、肠道巴恩斯氏菌、Beduinimassiliensis、假长双歧杆菌、淤泥布劳特氏菌、Breznakia blatticola、Breznakiapachnodae、鸡盲肠丁酸球菌、穗状丁酸弧菌、Catabacter hongkongensis、Christensenella massiliensis、Christensenella minuta、Christensenellatimonensis、耐氧梭菌,阿尔顿梭菌、碱纤维梭菌、芦笋状梭菌、速生梭菌、产纤维二糖梭菌、解纤维梭菌、鲜黄梭菌、耳蜗形梭菌、鹌鹑梭菌、海氏梭菌、吲哚梭菌、济州岛梭菌、发酵乳酸梭菌、拉华尔梭菌、甲基戊糖梭菌、乳清酸梭菌、水稻梭菌、溶纸莎草梭菌、解多糖梭菌、波氏梭菌、解糖梭菌、Clostridium saudiense、裂解梭菌、Clostridium straminisolvens、绿色梭菌、解木素梭菌、Coprobacter secundus、尖锐粪球菌、Culturomica massiliensis、Defluviitalea saccharophila、哥本哈根脱亚硫酸菌、还原金属脱亚硫酸杆菌、东方脱硫芽孢弯曲菌、脱硫脱硫弧菌、简单脱硫弧菌、产甲酸多尔氏菌、Eisenbergiellamassiliensis、Emergencia timonensis、小肠肠球菌、居肠黏膜肠杆状菌、Enterorhabdusmuris、Erysipelatoclostridium ramosum、幼虫丹毒丝菌、弗格森埃希氏菌、产粪甾醇真杆菌、长真杆菌、啮齿真杆菌、惰性真杆菌、多曲真杆菌、凸腹真杆菌、腐蚀栖粪杆菌、Flavimarina pacifica、珀氏解黄酮菌、Flintibacter butyricus、Gordonibacterfaecihominis、耐盐纤细杆菌、Harryflintia acetispora、马赛霍兰德氏菌、解糖氢厌氧杆菌、Ihubacter massiliensis、Intestinimonas butyriciproducens、Irregularibactermuris、Lachnoclostridium pacaense、动物乳杆菌、粪乳杆菌、加氏乳杆菌、人乳杆菌、肠乳杆菌、约氏乳杆菌、路氏乳杆菌、罗氏乳杆菌、台湾乳杆菌、胞内劳森氏菌、Longibaculummuris、Marvinbryantia formatexigens、Millionella massiliensis、舍氏小螺菌、Muribaculum intestinale、Murimonas intestini、Natranaerovirgapectinivora、Neglecta timonensis、内脏臭气杆菌、Olsenella profusa、啮齿震颤杆菌、产戊酸震颤杆菌、食桂皮酸乳头杆菌、古氏副拟杆菌、香港副爱格氏菌、人类副萨特氏菌、Parvibacter caecicola、黑色消化球菌、Phocea massiliensis、托氏卟啉单胞菌、口普雷沃氏菌、粪普雷沃氏菌、提蒙医院普雷沃氏菌、瘤胃假丁酸弧菌、多毛假解黄酮菌、Pseudoflavonifractor phocaeensis、Raoultibacter timonensis、Rhizobiumstraminoryzae、粪便罗斯拜瑞氏菌、人罗斯拜瑞氏菌、肠道罗斯拜瑞氏菌、Ruminiclostridium thermocellum、Ruminococcus champanellensis、粪瘤胃球菌、生黄瘤胃球菌、活泼瘤胃球菌、Ruthenibacterium lactatiformans、Sphingomonaskyeonggiensis、速生螺原体、白蚁孢杆菌、Stomatobaculum longum、少酸链球菌、Streptococcus danieliae、沃氏共养单胞菌、台湾栖温境单胞菌、加利福尼亚丁达尔氏菌、特斯科科湖丁达尔氏菌、血尿杆菌、Turicimonas muris、Tyzzerella nexilis、Vallitaleapronyensis和嗜小球藻吸血弧菌和/或图28C中公开的细菌。

在另一个方面，本公开涉及的组合物包含至少两种属于以下的属或种中的一者或多于一者的经分离或经纯化的细菌群体：解黄酮菌属、Dielma、阿克曼氏菌属、别样杆菌属、拟杆菌属、丁酸单胞菌属、吸血弧菌属、泰泽氏菌属、狄氏副拟杆菌、Fournierella、Fournierella massiliensis、Eisenbergiella tayi、蒂西耶氏菌目、Hungateiclostridium thermocellum、长链多尔氏菌、柯氏喜热菌、Muricomes、地生孢杆菌、沼泽普雷沃氏菌、嗜黑麦乳杆菌、芬氏拟杆菌、约氏乳杆菌、堆肥副土地杆菌和Anaerotignum lactatifermentans。在一些实施方案中，所述组合物包含至少两种属于以下的属或种中的一者或多于一者的经分离或经纯化的细菌群体：解黄酮菌属、拟杆菌属、丁酸单胞菌属、Dielma、阿克曼氏菌属、别样杆菌属、粪便拟杆菌、狄氏副拟杆菌、Fournierella、Fournierella massiliensis、嗜粪拟杆菌、Eisenbergiella tayi、蒂西耶氏菌目、Hungateiclostridium thermocellum。

在另一个方面，本公开涉及的组合物包含以下的至少一种、至少两种、或3、4、5、6、7、8、9、10、15或20种(或其中任何可派生范围)的经分离或经纯化的细菌群体：狄氏副拟杆菌、Fournierella、Fournierella massiliensis、Eisenbergiella tayi、蒂西耶氏菌目、Hungateiclostridium thermocellum、长链多尔氏菌、柯氏喜热菌、Muricomes、地生孢杆菌、沼泽普雷沃氏菌、嗜黑麦乳杆菌、芬氏拟杆菌、约氏乳杆菌、堆肥副土地杆菌、解黄酮菌属、拟杆菌属、丁酸单胞菌属、Dielma、阿克曼氏菌属、别样杆菌属、Anaerotignumlactatifermentans、嗜粪拟杆菌、粪便拟杆菌、粪拟杆菌、肠道拟杆菌、戴阿利斯特菌属、脆弱拟杆菌、吸血弧菌属、泰泽氏菌属、粪便拟杆菌、解黄酮菌plautii、Dielma fastidiosa、Akkermansia muciniphila、罗氏乳杆菌、脆弱拟杆菌、粪源普雷沃氏菌、沙氏普雷沃氏菌、厚壁菌门、梭菌目、瘤胃球菌科、Alistipes indistinctus、Bacteroidesstercorirosoris、Clostridium lactatifermentans orus、Abyssivirga alkaniphila、Acetatifactor muris、解纤维素醋酸弧菌、产乙醇醋酸弧菌、牛无胆甾原体,德雷氏无色小杆菌、Acidovorax radices、产雌马酚阿德勒氏菌、Akkermansia muciniphila、Alistipesindistinctus、Alistipes obesi、腐烂别样杆菌、塞内加尔别样杆菌、提蒙别样杆菌、糖发酵碱杆状菌,Alkalibaculum bacchi、狗粪别样棒菌、Anaerobacterium chartisolvens、Anaerocolumna cellulosilytica、运动厌氧生孢菌、Anaerotaenia torta、人结肠厌氧棍状菌、Anaerotruncus rubiinfantis、解嗅厌氧贪食菌、产酸拟杆菌、Bacteroidescaecimuris、多氏拟杆菌、Bacteroides faecichinchillae、腐蚀拟杆菌、Bacteroidesstercorirosoris、解木聚糖拟杆菌、肠道巴恩斯氏菌、Beduini massiliensis、假长双歧杆菌、淤泥布劳特氏菌、Breznakia blatticola、Breznakia pachnodae、鸡盲肠丁酸球菌、穗状丁酸弧菌、Catabacter hongkongensis、Christensenella massiliensis、Christensenella minuta、Christensenella timonensis、耐氧梭菌、阿尔顿梭菌、碱纤维梭菌、芦笋状梭菌、快生梭菌、产纤维二糖梭菌、解纤维素梭菌、鲜黄梭菌、螺蜗形梭菌、鹌鹑梭菌、海氏梭菌、吲哚梭菌、济州岛梭菌、发酵乳酸梭菌、拉华尔梭菌、甲基戊糖梭菌、乳清酸梭菌、水稻梭菌、解溶纸梭菌、解多糖梭菌、杨木梭菌、解糖梭菌、Clostridium saudiense、裂解梭菌、Clostridium straminisolvens、绿色梭菌、解木聚糖梭菌、Coprobactersecundus、规则粪球菌、Culturomica massiliensis、Defluviitalea saccharophila、哥本哈根脱亚硫酸杆菌、还原金属脱亚硫酸杆菌、东方脱硫弯曲孢菌、脱硫脱硫弧菌、简单脱硫弧菌、产甲酸多尔氏菌、Eisenbergiella massiliensis、Emergencia timonensis、小肠肠球菌、居肠黏膜肠杆状菌、Enterorhabdus muris、Erysipelatoclostridium ramosum、幼虫丹毒丝菌、弗氏埃希氏菌、产粪甾醇真杆菌、长真杆菌、啮齿真杆菌、惰性真杆菌、多曲真杆菌、凸腹真杆菌、腐蚀栖粪杆菌、Flavimarina pacifica、珀氏解黄酮菌、Flintibacterbutyricus、Gordonibacter faecihominis、耐盐纤细杆菌、Harryflintia acetispora、马赛霍兰德氏菌、解糖氢厌氧杆菌、Ihubacter massiliensis、Intestinimonasbutyriciproducens、Irregularibacter muris、Lachnoclostridium pacaense、动物乳杆菌、粪乳杆菌、加氏乳杆菌、人乳杆菌、肠乳杆菌、约氏乳杆菌、路氏乳杆菌、罗氏乳杆菌、台湾乳杆菌、胞内劳森氏菌、Longibaculum muris、Marvinbryantia formatexigens、Millionella massiliensis、舍氏小螺菌、Muribaculum intestinale、Murimonasintestini、Natranaerovirga pectinivora、Neglecta timonensis、内脏臭气杆菌、Olsenella profusa、啮齿震颤杆菌、产戊酸震颤杆菌、食桂皮酸乳头杆菌、古氏副拟杆菌、香港副爱格氏菌、人类副萨特氏菌、Parvibacter caecicola、黑色消化球菌、Phoceamassiliensis、卡托氏卟啉单胞菌、口普雷沃氏菌、粪普雷沃氏菌、提蒙医院普雷沃氏菌、瘤胃假丁酸弧菌、多毛假解黄酮菌、Pseudoflavonifractor phocaeensis、Raoultibactertimonensis、Rhizobium straminoryzae、粪便罗斯拜瑞氏菌、人罗斯拜瑞氏菌、肠道罗斯拜瑞氏菌、Ruminiclostridium thermocellum、Ruminococcus champanellensis、粪瘤胃球菌、生黄瘤胃球菌、活泼瘤胃球菌、Ruthenibacterium lactatiformans、Sphingomonaskyeonggiensis、速生螺原体、白蚁孢杆菌、Stomatobaculum longum、少酸链球菌、Streptococcus danieliae、沃氏共养单胞菌、台湾栖温境单胞菌、加利福尼亚丁达尔氏菌、特斯科科湖丁达尔氏菌、血尿杆菌、Turicimonas muris、Tyzzerella nexilis、Vallitaleapronyensis和/或嗜小球藻吸血弧菌。

在一些实施方案中，组合物包含或还包含至少一种属于以下种类中的一者或多于一者的经分离或经纯化的细菌群体：解黄酮菌属、粪便拟杆菌、Butyricimonasfaecihominis、Dielma、阿克曼氏菌属和Alistipes indistinctus。在一些实施方案中，组合物不包括粪便拟杆菌。在一些实施方案中，组合物包含或还包含至少一种属于Dielma和阿克曼氏菌属中的一这或多于一者的经分离或经纯化的细菌群体。在一些实施方案中，组合物包含或还包含至少一种属于别样杆菌属、Dielma和阿克曼氏菌属中的一者或多于一者的经分离或经纯化的细菌群体。在一些实施方案中，组合物包含或还包含至少一种属于阿克曼氏菌属的经分离或经纯化细菌群。在一些实施方案中，组合物包含或还包含至少一种经分离或经纯化的嗜黏蛋白阿克曼氏菌菌群。在一些实施方案中，组合物包含或还包含包含嗜黏蛋白阿克曼氏菌和Dielma fastidiosa以及Alistipes indistinctus中的一者或多于一者的细菌群。在一些实施方案中，解黄酮菌属的细菌包括珀氏解黄酮菌。在一些实施方案中，组合物包含或还包含至少一种属于以下的属或种中的一者或多于一者的经分离或经纯化的细菌群体：脆弱拟杆菌、吸血弧菌属、泰泽氏菌属、长链多尔氏菌、柯氏喜热菌、Muricomes、Muricomes intestini、地生孢杆菌、地下地生孢杆菌、Anaerotignumlactatifermentans。在一些实施方案中，组合物包含或还包含至少一种经分离或经纯化的肠道拟杆菌菌群。在一些实施方案中，组合物包含或还包含至少一种属于厚壁菌门、梭菌目和瘤胃球菌科的经分离或经纯化的细菌群体。在一些实施方案中，组合物包含或还包含珀氏解黄酮菌和/或Dielma fastidiosa。在一些实施方案中，组合物包含或还包含粪便拟杆菌、Butyricimonas faecihominis、珀氏解黄酮菌、Dielma fastidiosa、Alistipesindistinctus和嗜黏蛋白阿克曼氏菌。

在一些实施方案中，组合物包含少于1×10⁵个、1×10⁴个、1×10³个或1×10²个的归类为厚壁菌门、梭菌目和瘤胃球菌科的细菌的CFU或细胞(或其中任何可派生范围)。在一些实施方案中，组合物包含少于1×10⁵个、1×10⁴个、1×10³个或1×10²个的属于瘤胃球菌科、梭菌科、毛螺旋菌科、微球菌科和/或韦荣氏球菌科的细菌的CFU或细胞(或其中任何可派生范围)。

在另一个方面，本文提供了用于治疗癌症的微生物调节剂组合物和特别是用于改变已经用或将用免疫检查点抑制剂联合疗法治疗的对象的微生物组的方法。

本公开还提供了一种药物组合物，其包含一种或多于一种如上文和例如在本发明的发明内容中所述的微生物群体。因此，细菌种以活细菌的剂型存在，无论是干燥形式、冻干形式还是孢子化形式。这可优选适用于合适的施用；例如，以片剂或粉末形式，可能带有肠溶衣，以经口治疗。

在特别的方面，组合物配制为用于经口施用。可使用可咀嚼配制物、溶解配制物、包囊/包衣配制物、多层锭剂(以分离活性成分和/或活性成分与赋形剂)、缓慢释放/定时释放配制物或本领域技术人员已知的其他合适的配制物来实现经口施用。尽管本文使用了“片剂”一词，但配制物可呈多种物理形式，这些形式通常可用其他术语来指代，如锭剂、丸剂、胶囊剂等。

虽然本公开的组合物优选配制为用于经口施用，但可采用其他施用途径，包括但不限于皮下、肌内、皮内、经皮、眼内、腹膜内、黏膜、阴道、直肠和静脉。

本公开的组合物的所需剂量可以在全天以适当时间间隔施用的多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个或更多个)子剂量提供。

在一个方面，所公开的组合物可制备为胶囊剂。胶囊(即，载体)可以是由各种物质如明胶、纤维素、碳水化合物等形成的中空的、通常为圆柱形的胶囊。

在另一个方面，所公开的组合物可制备为栓剂。栓剂可包含但不限于细菌和一种或多于一种载体，如聚乙二醇、阿拉伯树胶、乙酰化单甘油酯、巴西棕榈蜡、邻苯二甲酸乙酸纤维素、玉米淀粉、邻苯二甲酸二丁酯、多库酯钠、明胶、甘油、铁氧化物、高岭土、乳糖、硬脂酸镁、对羟基苯甲酸甲酯、药用釉料、聚维酮、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠、失水山梨醇单油酸酯、蔗糖滑石粉、二氧化钛、白蜡和着色剂。

在一些方面，所公开的微生物调节剂组合物可制备为片剂。片剂可包含细菌和一种或多于一种制片剂(即，载体)，如磷酸氢钙、硬脂酸、交联甲羧纤维素、二氧化硅、纤维素和纤维素包衣。可使用直接压缩工艺来形成片剂，但本领域技术人员应理解可使用各种技术来形成片剂。

在其他方面，所公开的微生物调节剂组合物可形成为食品或饮料，或者，形成为食品或饮料的添加剂，其中向食品或饮料中添加合适量的细菌以使得食品或饮料成为载体。

本公开的微生物调节剂组合物可还包含本领域已知的一种或多于一种益生元，如乳糖醇、菊粉或其组合。

在一些实施方案中，微生物调节剂组合物可还包含有效刺激存在于对象胃肠道中的梭菌目细菌的生长的食品或营养补充剂。在一些实施方案中，营养补充剂由与健康人肠道微生物组相关的细菌产生。

IV.另外的疗法

本公开的当前方法和组合物可包括本领域已知和/或本文描述的一种或多于一种另外的疗法。在一些实施方案中，另外的疗法包括另外的癌症治疗。这样的治疗的实例在本文中有述。

A.免疫疗法

在一些实施方案中，另外的疗法包括进一步的癌症免疫疗法。癌症免疫疗法(有时称为免疫肿瘤学，缩写为IO)是利用免疫系统来治疗癌症。免疫疗法可分为主动型、被动型或混合型(主动和被动)。这些方法利用了癌细胞在其表面上通常有可被免疫系统检测到的分子，称为肿瘤相关抗原(TAA)；它们通常是蛋白质或其他大分子(例如，碳水化合物)。主动免疫疗法通过靶向TAA来引导免疫系统攻击肿瘤细胞。被动免疫疗法增强现有的抗肿瘤反应并包括使用单克隆抗体、淋巴细胞和细胞因子。免疫疗法是本领域已知的，并且下文描述了一些。

1.共刺激分子的抑制

在一些实施方案中，免疫疗法包括共刺激分子的抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂包括B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD28、ICOS、OX40(TNFRSF4)、4-1BB(CD137；TNFRSF9)、CD40L(CD40LG)、GITR(TNFRSF18)的抑制剂及其组合。抑制剂包括抑制性抗体、多肽、化合物和核酸。

2.树突状细胞疗法

树突状细胞疗法通过使树突状细胞将肿瘤抗原呈递给淋巴细胞来激活淋巴细胞，引发它们杀伤呈递抗原的其他细胞，从而激发抗肿瘤反应。树突状细胞是哺乳动物免疫系统中的抗原呈递细胞(APC)。在癌症治疗中，它们有助于癌症抗原靶向。基于树突状细胞的细胞癌症疗法的一个实例为sipuleucel-T，其以Provenge(R)出售。

诱导树突状细胞呈递肿瘤抗原的一种方法是用自体肿瘤裂解物或短肽(对应于癌细胞上的蛋白质抗原的小部分蛋白质)接种。这些肽通常与佐剂(高免疫原性物质)联合施用以增加免疫和抗肿瘤反应。其他佐剂包括吸引和/或激活树突状细胞的蛋白质或其他化学品，如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。

树突状细胞也可通过使肿瘤细胞表达GM-CSF而在体内被激活。这可通过基因工程改造肿瘤细胞以产生GM-CSF或通过用表达GM-CSF的溶瘤病毒感染肿瘤细胞来实现。

另一种策略是从患者的血液中取出树突状细胞并在体外激活它们。在肿瘤抗原的存在下激活树突状细胞，肿瘤抗原可以是单一肿瘤特异性肽/蛋白质或肿瘤细胞裂解物(裂解的肿瘤细胞的溶液)。输注这些细胞(与任选的佐剂)并激发免疫反应。

树突状细胞疗法包括使用与树突状细胞表面上的受体结合的抗体。可向抗体中加入抗原并可诱导树突状细胞成熟和提供对肿瘤的免疫力。树突状细胞受体如TLR3、TLR7、TLR8或CD40已被用作抗体靶标。

3.CAR-T细胞疗法

嵌合抗原受体(CAR，也称嵌合免疫受体、嵌合T细胞受体或人工T细胞受体)为工程化的受体，其将新的非MHC限制特异性与免疫细胞相结合来靶向癌细胞。通常，这些受体将单克隆抗体的特异性移植到T细胞上。这些受体被称为嵌合体，因为它们由来自不同来源的部分融合而成。CAR-T细胞疗法是指出于治疗性目的使用这种转化细胞的治疗，例如治疗癌症。

CAR-T细胞设计的基本原理涉及组合抗原结合和T细胞激活功能的重组受体。CAR-T细胞的一般前提是人工生成靶向至癌细胞上发现的标志物的T细胞。科学家可从人身上取出T细胞，对它们进行基因改造，然后将它们放回到患者体内以便它们攻击癌细胞。一旦T细胞被工程化为CAR-T细胞，它便会充当“活的药物”。CAR-T细胞将在细胞外配体识别结构域与细胞内信号传导分子之间建立联系，这继而会激活T细胞。细胞外配体识别结构域通常是衍生自抗体的单链可变片段(scFv)。CAR-T细胞疗法的安全性的一个重要方面是如何确保仅癌性肿瘤细胞被靶向，而正常细胞不被靶向。CAR-T细胞的特异性由被靶向的分子的选择所决定。

示例性的CAR-T疗法包括Tisagenlecleucel(Kymriah(R))和Axicabtageneciloleucel(Yescarta(R))。在一些实施方案中，CAR-T疗法靶向CD19。

4.细胞因子疗法

细胞因子是由存在于肿瘤内的许多类型的细胞产生的蛋白质。它们可调节免疫反应。肿瘤常采用它们来让其生长并降低免疫反应。这些免疫调节作用使得它们能够用作激发免疫反应的药物。两种常用的细胞因子是干扰素和白介素。

干扰素由免疫系统的细胞产生。它们通常涉及抗病毒反应，但也对癌症有影响。它们分为三组：I型(IFNα和IFNβ)、II型(IFNγ)和III型(IFNλ)。

白介素具有一系列免疫系统作用。IL-2是一种示例性的白介素细胞因子疗法。

5.过继性T细胞疗法

过继性T细胞疗法是通过转输T细胞(过继细胞转移)的被动免疫形式。T细胞见于血液和组织中并通常在其发现外来病原体时激活。具体而言，当T细胞受体(TCR)遇到在其表面抗原上显示出部分外来蛋白质的细胞时，它们就会激活。这些细胞可以是被感染的细胞，也可以是抗原呈递细胞(APC)。它们见于正常组织中和肿瘤组织中，在那里它们被称为肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。它们会因APC如呈递肿瘤抗原的树突状细胞的存在而激活。尽管这些细胞可攻击肿瘤，但肿瘤内的环境是高度免疫抑制性的，从而将防止免疫介导的肿瘤死亡。

已开发了多种产生和获得肿瘤靶向T细胞的方法。可从肿瘤样本(TIL)中取出或从血液过滤对肿瘤抗原特异性的T细胞。离体进行随后的激活和培养，并重新输注所得被激活T细胞制剂。激活可通过将T细胞暴露于肿瘤抗原来进行。

B.溶瘤病毒

在一些实施方案中，另外的疗法包括溶瘤病毒。溶瘤病毒是一种优先感染和杀伤癌细胞的病毒。当被感染的癌细胞被溶瘤作用破坏时，它们会释放出新的传染性病毒颗粒或小病毒粒子以帮助破坏余下的肿瘤。溶瘤病毒被认为不仅会引起肿瘤细胞的直接破坏，而且会刺激宿主的抗肿瘤免疫反应以用于长期免疫治疗。

C.多糖

在一些实施方案中，另外的疗法包括多糖。在蘑菇中发现的某些化合物，主要是多糖，可上调免疫系统并可能具有抗癌性。例如，β-葡聚糖如香菇多糖已在实验室研究中显示会刺激巨噬细胞、NK细胞、T细胞和免疫系统细胞因子并已在临床试验中作为免疫佐剂进行了研究。

D.新抗原

在一些实施方案中，另外的疗法包括新抗原施用。许多肿瘤会表达突变。这些突变潜在地会产生新的可靶向抗原(新抗原)以用于T细胞免疫疗法中。如使用RNA测序数据所鉴定的，癌症病变中CD8+T细胞的存在在具有高突变负荷的肿瘤中更高。在许多人类肿瘤中，与自然杀伤细胞和T细胞的细胞溶解活性相关的转录水平与突变负荷呈正相关。

E.化学疗法

在一些实施方案中，另外的疗法包括化学疗法。合适类别的化学治疗剂包括(a)烷基化剂，如氮芥(例如，双氯乙基甲胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥)、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺类(例如，六甲基三聚氰胺、噻替派)、烷基磺酸盐(例如，白消安)、亚硝基脲类(例如，卡莫司汀、洛莫司汀、氯唑菌素(chlorozotocin)、链佐星)和三嗪(例如，达卡巴嗪)，(b)抗代谢药，如叶酸类似物(例如，甲氨蝶呤)、嘧啶类似物(例如，5-氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、氮杂尿苷)和嘌呤类似物及相关材料(例如，6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、喷司他丁)，(c)天然产物，如长春花生物碱(例如，长春碱、长春新碱)、表鬼臼毒素(例如，依托泊苷、替尼泊苷)、抗生素(例如、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、博来霉素、普卡霉素和米托蒽醌)、酶(例如，L-天冬酰胺酶)和生物反应调节剂(例如，干扰素-α)，和(d)其他药剂，如铂配位络合物(例如，顺铂、卡铂)、取代的脲(例如，羟基脲)、甲基肼衍生物(例如，丙卡巴肼)和肾上腺皮质抑制剂(例如紫杉醇和米托坦)。在一些实施方案中，顺铂是特别合适的化学治疗剂。

顺铂已被广泛用于治疗癌症，例如转移性睾丸癌或卵巢癌、晚期膀胱癌、头颈癌、宫颈癌、肺癌或其他肿瘤。顺铂不能经口吸收，因此必须经由其他途径递送，例如静脉内、皮下、瘤内或腹膜内注射。顺铂可单独使用或与其他药剂联合使用，临床应用中使用的有效剂量包括约15mg/m²至约20mg/m²，每三周5天，在某些实施方案中考虑总共三个疗程。在一些实施方案中，与包含可操作地连接至编码治疗性多肽的多核苷酸的Egr-1启动子的构建体一起递送至细胞和/或对象的顺铂的量小于单独使用顺铂时递送的量。

其他合适的化学治疗剂包括抗微管剂，例如紫杉醇(“Taxol”)和盐酸多柔比星(“多柔比星”)。经由腺病毒载体和多柔比星递送的Egr-1启动子/TNFα构建体的组合被确定可有效克服对化学疗法和/或TNF-α的抗性，这表明该构建体和多柔比星的联合治疗克服了对多柔比星和TNF-α两者的抗性。

多柔比星吸收差并优选静脉内施用。在某些实施方案中，对于成人的适宜静脉内剂量包括每隔约21天约60mg/m²至约75mg/m²，或在连续的2或3天中的每一天约25mg/m²至约30mg/m²，每隔约3周至约4周重复一次，或者每周一次约20mg/m²。在老年患者中，当存在由既往的化疗引起的既往骨髓抑制或肿瘤性骨髓侵袭时，或当与其他骨髓生成抑制药物联合用药时，应使用最低剂量。

氮芥是另一种可用于本公开的方法中的合适的化学治疗剂。氮芥可包括但不限于双氯乙基甲胺(HN₂)、环磷酰胺和/或异环磷酰胺、美法仑(L-溶肉瘤素)和苯丁酸氮芥。环磷酰胺可自Mead Johnson获得，可自Adria获得)是另一种合适的化学治疗剂。对于成人，合适的口服剂量包括例如约1mg/kg/天至约5mg/kg/天，静脉内剂量包括例如初始在约2天至约5天的时间段内以分剂量施用约40mg/kg至约50mg/kg，或约每7天至约10天约10mg/kg至约15mg/kg，或一周两次约3mg/kg至约5mg/kg，或约1.5mg/kg/天至约3mg/kg/天。由于胃肠道不良反应，优选静脉途径。药物有时也肌肉内施用、通过渗透施用或施用到体腔中。

另外的合适的化学治疗剂包括嘧啶类似物，如阿糖胞苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷)、5-氟尿嘧啶(氟尿嘧啶；5-FU)和氟尿苷(氟尿嘧啶脱氧核苷；FudR)。5-FU可以以约7.5mg/m²至约1000mg/m²的任何剂量施用于对象。此外，5-FU给药方案可针对多个时间段，例如至多六周，或者由本公开所属领域的普通技术人员决定。

吉西他滨二磷酸盐Eli Lilly&Co.,"gemcitabine")是另一种合适的化学治疗剂，其被推荐用于治疗晚期和转移性胰腺癌，并因此也可用于本公开中以治疗这些癌症。

递送至患者的化学治疗剂的量可以是可变的。在一个合适的实施方案中，当化学疗法与构建体一起施用时，化学治疗剂可以有效引起宿主中癌症的停止或消退的量施用。在其他实施方案中，化学治疗剂可以以化学治疗剂的化学治疗有效剂量的1/2至1/10000的任何量施用。例如，化学治疗剂可以以化学治疗剂的有效剂量约1/20、约1/500或甚至约1/5000的量施用。可在体内测试本公开的化学治疗剂与构建体联用的期望治疗活性，以及确定有效剂量。例如，可在人体中测试之前在合适的动物模型系统中测试这样的化合物，包括但不限于大鼠、小鼠、鸡、奶牛、猴、兔等。也可使用体外测试来确定合适的组合和剂量，如实施例中所述。

F.放射疗法

在一些实施方案中，另外的疗法或既往疗法包括辐射，如电离辐射。如本文所用，“电离辐射”指的是包含粒子或光子的辐射，该粒子或光子具有足够能量或可经由核相互作用产生足够的能量以产生电离(电子的得失)。一种示例性且优选的电离辐射为x-辐射。向靶标组织或细胞呈送x-辐射的手段是本领域公知的。

在一些实施方案中，电离辐射的量大于20戈瑞(Gy)并以一剂施用。在一些实施方案中，电离辐射的量为18Gy并以三剂施用。在一些实施方案中，电离辐射的量为至少、至多或恰好2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy、15Gy、16Gy、17Gy、18Gy、19Gy、20Gy、21Gy、22Gy、23Gy、24Gy、25Gy、26Gy、27Gy、18Gy、19Gy、30Gy、31Gy、32Gy、33Gy、34Gy、35Gy、36Gy、37Gy、38Gy、39Gy、40Gy、41Gy、42Gy、43Gy、44Gy、45Gy、46Gy、47Gy、48Gy、49Gy或40Gy(或其中任何可派生范围)。在一些实施方案中，电离辐射以至少、至多或恰好1剂、2剂、3剂、4剂、5剂、6剂、7剂、8剂、9剂、或10剂(或其中任何可派生范围)施用。当施用多于一剂时，每一剂可隔开约1小时、4小时、8小时、12小时或24小时或者1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天或者1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、12周、14周或16周，或其中任何可派生范围。

在一些实施方案中，IR的量可以IR的总剂量呈现，其然后以分次剂量施用。例如，在一些实施方案中，总剂量为50Gy，分10次分次剂量施用，每个5Gy。在一些实施方案中，总剂量为50-90Gy，分20-60次分次剂量施用，每个2-3Gy。在一些实施方案中，IR的总剂量为至少、至多或约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、125、130、135、140或150(或其中任何可派生范围)。在一些实施方案中，总剂量以至少、至多或恰好1Gy、2Gy、3Gy、4Gy、5Gy、6Gy、7Gy、8Gy、9Gy、10Gy、12Gy、14Gy、15Gy、20Gy、25Gy、30Gy、35Gy、40Gy、45Gy或50Gy(或其中任何可派生范围)的分次剂量施用。在一些实施方案中，施用至少、至多或恰好2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100次分次剂量(或其中任何可派生范围)。在一些实施方案中，每天施用至少、至多或恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次(或其中任何可派生范围)分次剂量。在一些实施方案中，每周施用至少、至多或恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30次(或其中任何可派生范围)分次剂量。

G.手术

约60％的癌症患者将经历某些类型的手术，包括预防性、诊断性或分期、治愈性和姑息性手术。治愈性手术包括切除术，其中全部或部分癌组织被物理地除去、切除和/或破坏并可与其他疗法结合使用，如本发明实施方案的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代的疗法。肿瘤切除是指物理地除去肿瘤的至少一部分。除了肿瘤切除外，通过手术的治疗还包括激光手术、冷冻手术、电外科和显微控制手术(莫氏手术)。

在切除部分或全部癌细胞、组织或肿瘤后，可能在体内形成空腔。治疗可通过灌注、直接注射或区域局部应用另外的抗癌疗法来完成。这样的治疗可例如每1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或者每1周、2周、3周、4周和5周或者每1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月重复一次。这些治疗也可具有不同的剂量。

H.其他药剂

预期其他药剂可与本发明实施方案的某些方面组合使用以提高治疗的疗效。这些另外的药剂包括影响细胞表面受体和GAP连接的上调的药剂、细胞生长抑制和分化剂、细胞黏附抑制剂、增加过度增殖细胞对凋亡诱导剂的敏感性的药剂或其他生物药剂。通过提升GAP连接的数目来增加细胞间信号传导会增加对邻近的过度增殖细胞群体的抗过度增殖作用。在其他实施方案中，细胞生长抑制或分化剂可与本发明实施方案的某些方面组合使用以改善治疗的抗过度增殖功效。预期细胞黏附抑制剂会改善本发明实施方案的功效。细胞黏附抑制剂的实例为局部黏着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀。还预期会增加过度增殖细胞对凋亡的敏感性的其他药剂如抗体c225可与本发明实施方案的某些方面组合使用以改善治疗功效。

V.治疗组合物的施用

本文提供的疗法包括施用免疫检查点抑制剂与微生物调节剂的组合。疗法可以本领域已知的任何合适的方式施用。例如，免疫检查点抑制剂(例如，PD-1抑制剂和/或CTLA-4抑制剂)和微生物调节剂可依次(在不同的时间)或同时(在相同的时间)施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂与微生物调节剂在分开的单独组合物中。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂与微生物调节剂在同一组合物中。

本公开的实施方案涉及包含CTLA-4、B7-1和/或B7-2抑制剂中的一种或多于一种与PD-1、PDLl和/或B7-2抑制剂中的一种或多于一种的组合的组合物和方法。免疫检查点抑制剂可在一种组合物中或在多于一种组合物如2种组合物、3种组合物或4种组合物中施用。可采用抑制剂的各种组合，例如，CTLA-4、B7-1或B7-2抑制剂为“A”，而PD-1、PDL1或PDL2抑制剂为“B”：

在一些实施方案中，方法包括与PD-1、PDLl和/或PDL2抑制剂中的一种或多于一种同时施用CTLA-4、B7-1和/或B7-2抑制剂中的一种或多于一种。在一些实施方案中，CTLA-4、B7-1和/或B7-2抑制剂中的一种或多于一种先于PD-1、PDLl和/或PDL2抑制剂中的一种或多于一种施用。在一些实施方案中，CTLA-4、B7-1和/或B7-2抑制剂中的一种或多于一种先于PD-1、PDL1和/或PDL2抑制剂中的一种或多于一种至少、至多或恰好3小时、5小时、6小时、12小时、24小时或2天、3天、4天、6天、8天、10天或2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周(或其中任何可派生范围)施用。在一些实施方案中，PD-1、PDLl和/或PDL2抑制剂中的一种或多于一种先于CTLA-4、B7-1和/或B7-2抑制剂中的一种或多于一种施用。在一些实施方案中，PD-1、PDL1和/或PDL2抑制剂中的一种或多于一种先于CTLA-4、B7-1和/或B7-2抑制剂中的一种或多于一种至少、至多或恰好3小时、5小时、6小时、12小时、24小时或2天、3天、4天、6天、8天、10天或2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周(或其中任何可派生范围)施用。在一些实施方案中，CTLA-4、B7-1和/或B7-2抑制剂中的一种或多于一种在PD-1、PDL1和/或PDL2抑制剂中的一种或多于一种施用的1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、12周、14周、16周、18周或20周(或其中任何可派生范围)内施用。

在一些实施方案中，微生物调节剂组合物先于免疫检查点抑制剂施用。在一些实施方案中，微生物调节剂组合物先于免疫检查点抑制剂至少、至多或恰好1小时、2小时、3小时、5小时、6小时、12小时、24小时或2天、3天、4天、6天、8天、10天或2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周(或其中任何可派生范围)施用。在一些实施方案中，至少1、2、3、4、5、6或7剂(或其中任何可派生范围)微生物调节剂组合物先于免疫检查点抑制剂至少、至多或恰好1小时、2小时、3小时、5小时、6小时、12小时、24小时或2天、3天、4天、6天、8天、10天或2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周(或其中任何可派生范围)施用。在一些实施方案中，微生物调节剂组合物在免疫检查点抑制剂之后施用。在一些实施方案中，微生物调节剂组合物在免疫检查点抑制剂之后或在免疫检查点抑制剂中的至少一种之后或在免疫检查点抑制剂中的至少2种之后至少、至多或恰好1小时、2小时、3小时、5小时、6小时、12小时、24小时或2天、3天、4天、6天、8天、10天或2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周(或其中任何可派生范围)施用。在一些实施方案中，至少1、2、3、4、5、6或7剂(或其中任何可派生范围)微生物调节剂组合物在免疫检查点抑制剂之后或在免疫检查点抑制剂中的至少一种之后或在免疫检查点抑制剂中的至少2种之后至少、至多或恰好1小时、2小时、3小时、5小时、6小时、12小时、24小时或2天、3天、4天、6天、8天、10天或2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周(或其中任何可派生范围)施用。

本公开的联合疗法还包括微生物调节剂组合物。在一些实施方案中，微生物调节剂组合物先于PD-1、PDL1和/或PDL2抑制剂中的一种或多于一种施用。在一些实施方案中，微生物调节剂组合物先于PD-1、PDL1和/或PDL2抑制剂中的一种或多于一种至少、至多或恰好1小时、2小时、3小时、5小时、6小时、12小时、24小时或2天、3天、4天、6天、8天、10天或2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周(或其中任何可派生范围)施用。在一些实施方案中，至少1、2、3、4、5、6或7剂(或其中任何可派生范围)微生物调节剂组合物先于PD-1、PDL1和/或PDL2抑制剂中的一种或多于一种至少、至多或恰好1小时、2小时、3小时、5小时、6小时、12小时、24小时或2天、3天、4天、6天、8天、10天或2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周(或其中任何可派生范围)施用。在一些实施方案中，微生物调节剂组合物在PD-1、PDL1和/或PDL2抑制剂中的一种或多于一种之后施用。在一些实施方案中，微生物调节剂组合物在PD-1、PDL1和/或PDL2抑制剂中的一种或多于一种之后或者在PD-1、PDL1或PDL2中的至少一种或至少两种之后至少、至多或恰好1小时、2小时、3小时、5小时、6小时、12小时、24小时或2天、3天、4天、6天、8天、10天或2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周(或其中任何可派生范围)施用。在一些实施方案中，至少1、2、3、4、5、6或7剂(或其中任何可派生范围)微生物调节剂组合物在PD-1、PDL1或PDL2抑制剂中的一种或多于一种之后或者在PD-1、PDL1或PDL2抑制剂中的至少一种或至少两种之后至少、至多或恰好1小时、2小时、3小时、5小时、6小时、12小时、24小时或2天、3天、4天、6天、8天、10天或2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周(或其中任何可派生范围)施用。

本公开的联合疗法还包括微生物调节剂组合物。在一些实施方案中，微生物调节剂组合物先于CTLA-4、B7-1和/或B7-2抑制剂中的一种或多于一种施用。在一些实施方案中，微生物调节剂组合物先于CTLA-4、B7-1和/或B7-2抑制剂中的一种或多于一种至少、至多或恰好1小时、2小时、3小时、5小时、6小时、12小时、24小时或2天、3天、4天、6天、8天、10天或2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周(或其中任何可派生范围)施用。在一些实施方案中，至少1、2、3、4、5、6或7剂(或其中任何可派生范围)微生物调节剂组合物先于CTLA-4、B7-1和/或B7-2抑制剂中的一种或多于一种至少、至多或恰好1小时、2小时、3小时、5小时、6小时、12小时、24小时或2天、3天、4天、6天、8天、10天或2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周(或其中任何可派生范围)施用。在一些实施方案中，微生物调节剂组合物在CTLA-4、B7-1和/或B7-2抑制剂中的一种或多于一种之后施用。在一些实施方案中，微生物调节剂组合物在CTLA-4、B7-1和/或B7-2抑制剂中的一种或多于一种之后或者在CTLA-4、B7-1或B7-2中的至少一种或至少两种之后至少、至多或恰好1小时、2小时、3小时、5小时、6小时、12小时、24小时或2天、3天、4天、6天、8天、10天或2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周(或其中任何可派生范围)施用。在一些实施方案中，至少1、2、3、4、5、6或7剂(或其中任何可派生范围)微生物调节剂组合物在CTLA-4、B7-1和/或B7-2抑制剂中的一种或多于一种之后或者在CTLA-4、B7-1或B7-2抑制剂中的至少一种或至少两种之后至少、至多或恰好1小时、2小时、3小时、5小时、6小时、12小时、24小时或2天、3天、4天、6天、8天、10天或2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周(或其中任何可派生范围)施用。

在一些实施方案中，微生物调节剂组合物被配制为用于经口施用。本领域技术人员知道各种配方，它们可包含活的或杀死的微生物并且可作为食品补充剂(例如，丸剂、片剂等)或作为功能食品如饮料或发酵酸奶存在。

免疫检查点抑制剂和微生物调节剂可通过相同的施用途径或通过不同的施用途径施用。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂静脉内、肌肉内、皮下、局部、经口、经皮、腹膜内、眼窝内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内施用。在一些实施方案中，微生物调节剂静脉内、肌肉内、皮下、局部、经口、经皮、腹膜内、眼窝内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内施用。在特别的方面，免疫检查点抑制剂静脉内施用而微生物调节剂经口施用。可施用有效量的免疫检查点抑制剂和微生物调节剂以预防或治疗疾病。免疫检查点抑制剂和/或微生物调节剂的适宜剂量可基于待治疗的疾病的类型、疾病的严重程度和病程、个体的临床状况、个体的临床病史和对治疗的应答以及主治医师的判断来确定。

例如，实施方案的微生物调节剂组合物的至少一种经分离或经纯化的细菌群体中的每一种或者至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种或15种经分离或经纯化的细菌群体中的每一种施用于人的治疗有效量或足够量将为至少约1×10³个细菌菌落形成单位(CFU)或至少约1×10⁴个、1×10⁵个、1×10⁶个、1×10⁷个、1×10⁸个、1×10⁹个、1×10¹⁰个、1×10¹¹个、1×10¹²个、1×10¹³个、1×10¹⁴个、1×10¹⁵个CFU(或其中任何可派生范围)。在一些实施方案中，一剂将含有至少、至多或恰好1×10⁴个、1×10⁵个、1×10⁶个、1×10⁷个、1×10⁸个、1×10⁹个、1×10¹⁰个、1×10¹¹个、1×10¹²个、1×10¹³个、1×10¹⁴个、1×10¹⁵个或高于1×10¹⁵个指定细菌CFU(或其中任何可派生范围)的量的细菌(如本文描述的特定细菌或者种、属或科)。在一些实施方案中，一剂将含有至少、至多或恰好1×10⁴个、1×10⁵个、1×10⁶个、1×10⁷个、1×10⁸个、1×10⁹个、1×10¹⁰个、1×10¹¹个、1×10¹²个、1×10¹³个、1×10¹⁴个、1×10¹⁵个或高于1×10¹⁵个总细菌CFU(或其中任何可派生范围)。在具体的实施方案中，细菌以孢子形式或以孢子化细菌提供。在特别的实施方案中，每种经分离或经纯化的细菌群体例如每个种、亚种或菌株的孢子的浓度为至少、至多或恰好1×10⁴个、1×10⁵个、1×10⁶个、1×10⁷个、1×10⁸个、1×10⁹个、1×10¹⁰个、1×10¹¹个、1×10¹²个、1×10¹³个、1×10¹⁴个、1×10¹⁵个或高于1×10¹⁵(或其中任何可派生范围)个活细菌孢子每克组合物或每施用剂。在一些实施方案中，组合物包含或方法包括施用至少、至多或恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40或50个(或其中任何可派生范围)不同的细菌种、不同的细菌属或不同的细菌科。

在一些实施方案中，实施方案的微生物调节剂组合物的所述至少一种经分离或经纯化的细菌群体中的每一种或者至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种经分离或经纯化的细菌群体中的每一种施用于人的治疗有效或足够量将为至少约1×10³个细菌细胞或至少约1×10⁴个、1×10⁵个、1×10⁶个、1×10⁷个、1×10⁸个、1×10⁹个、1×10¹⁰个、1×10¹¹个、1×10¹²个、1×10¹³个、1×10¹⁴个、1×10¹⁵个细胞(或其中任何可派生范围)。在一些实施方案中，一剂将含有至少、至多或恰好1×10⁴个、1×10⁵个、1×10⁶个、1×10⁷个、1×10⁸个、1×10⁹个、1×10¹⁰个、1×10¹¹个、1×10¹²个、1×10¹³个、1×10¹⁴个、1×10¹⁵个或高于1×10¹⁵个指定细菌的细胞(或其中任何可派生范围)的量的细菌(如本文描述的特定细菌或者种、属或科)。在一些实施方案中，一剂将含有至少、至多或恰好1×10⁴个、1×10⁵个、1×10⁶个、1×10⁷个、1×10⁸个、1×10⁹个、1×10¹⁰个、1×10¹¹个、1×10¹²个、1×10¹³个、1×10¹⁴个、1×10¹⁵个或高于1×10¹⁵个总细菌的细胞(或其中任何可派生范围)。在具体的实施方案中，细菌以孢子形式或以孢子化细菌提供。在特别的实施方案中，每种经分离或经纯化的细菌群体例如每个种、亚种或菌株的孢子的浓度为至少、至多或恰好1×10⁴个、1×10⁵个、1×10⁶个、1×10⁷个、1×10⁸个、1×10⁹个、1×10¹⁰个、1×10¹¹个、1×10¹²个、1×10¹³个、1×10¹⁴个、1×10¹⁵个或高于1×10¹⁵(或其中任何可派生范围)个活细菌孢子每克组合物或每施用剂。在一些实施方案中，组合物包含或方法包括施用至少、至多或恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40或50个(或其中任何可派生范围)不同的细菌种、不同的细菌属或不同的细菌科。

瘤内注射或向肿瘤脉管中注射特别预期用于离散的、实体的、易得的肿瘤。局部、区域或全身施用也可能是适宜的。对于>4cm的肿瘤，待施用的量为约4-10ml(特别是10ml)，而对于<4cm的肿瘤，将使用约1-3ml(特别是3ml)的量。以单剂量递送的多次注射包含约0.1至约0.5ml的量。例如，腺病毒颗粒可有利地通过对肿瘤施用多次注射来接触。

治疗方案也可变化，并通常取决于肿瘤类型、肿瘤位置、疾病进展以及患者的健康和年龄。显然，某些类型的肿瘤需要更积极的治疗，而同时，某些患者无法忍受更繁重的治疗方案。临床医师将最适合基于治疗性配制物的已知功效和毒性(如果有)做出此类决定。

在某些实施方案中，被治疗的肿瘤可能不可、至少最初不可切除。由于边缘处的收缩或通过某些特别侵袭性的部分的消除，用治疗性病毒构建体进行治疗可能增加肿瘤的可切除性。治疗后，切除可能是可行的。切除后的额外治疗将有助于消除肿瘤部位处的微观残留疾病。

治疗可包括各种“单位剂量”。单位剂量定义为含有预定的量的治疗组合物。待施用的量及具体的途径和配制物的确定在临床领域技术人员的判断能力范围内。单位剂量不必作为单次注射施用，而是可包括在设定的时间段内连续输注。在一些实施方案中，单位剂量包含单一可施用剂量。

根据治疗次数和单位剂量，待施用的量取决于期望的治疗效果。有效剂量应理解为是指达到特定效果所需的量。在某些实施方案的实践中，预期在10mg/kg至200mg/kg的范围内的剂量可影响这些药剂的保护能力。因此，预期剂量包括约0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195和200、300、400、500、1000μg/kg、mg/kg、μg/天或mg/天的剂量或其中可派生的任何范围。此外，这样的剂量可在一天中多次和/或在数天、数周或数月内施用。

在一些实施方案中，无论是通过一次还是多次施用，免疫检查点抑制剂如抗体和/或微生物调节剂施用于人的治疗有效或足够量将处于约0.01至约50mg/kg患者体重的范围内。在一些实施方案中，使用的抑制剂为例如每天施用约0.01至约45mg/kg、约0.01至约40mg/kg、约0.01至约35mg/kg、约0.01至约30mg/kg、约0.01至约25mg/kg、约0.01至约20mg/kg、约0.01至约15mg/kg、约0.01至约10mg/kg、约0.01至约5mg/kg或约0.01至约1mg/kg。在一些实施方案中，以15mg/kg施用抑制剂。然而，可能可使用其他剂量方案。在一个实施方案中，在21天周期的第1天以约100mg、约200mg、约300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg、约1000mg、约1100mg、约1200mg、约1300mg或约1400mg的剂量向对象施用本文所述的抑制剂。该剂量可作为一剂或作为多剂(例如，2或3剂)施用，如输注。该疗法的进展可通过常规技术容易地监测。

在一些实施方案中，药物组合物的有效剂量为可提供约1μM至150μM的血液水平的剂量。在另一个实施方案中，有效剂量提供的血液水平为约4μM至100μM；或约1μM至100μM；或约1μM至50μM；或约1μM至40μM；或约1μM至30μM；或约1μM至20μM；或约1μM至10μM；或约10μM至150μM；或约10μM至100μM；或约10μM至50μM；或约25μM至150μM；或约25μM至100μM；或约25μM至50μM；或约50μM至150μM；或约50μM至100μM(或其中可派生的任何范围)。在其他实施方案中，所述剂量可提供由向对象施用治疗剂产生的以下药剂血液水平：约、至少约或至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100μM或其中可派生的任何范围。在某些实施方案中，施用于对象的治疗剂在体内代谢为经代谢的治疗剂，在这种情况下，血液水平可指该经代谢的治疗剂的量。或者，就治疗剂未被对象代谢的程度而言，本文讨论的血液水平可指未代谢的治疗剂。

治疗组合物的精确量还取决于执业医师的判断并且是每个个体所特有的。影响剂量的因素包括患者的身体和临床状态、施用途径、预期的治疗目标(缓解症状还是治愈)以及对象可能正在接受的特定治疗性物质或其他疗法的效力、稳定性和毒性。

本领域技术人员应理解并意识到，剂量单位μg/kg或mg/kg体重可换算并以μg/ml或mM(血液水平)的相当浓度单位表示，如4μM至100μM。还应理解，吸收是物种和器官/组织依赖性的。与吸收和浓度量度相关的适用换算因子和生理学假设是众所周知的，并且将允许本领域技术人员将一种浓度量度换算为另一种并就本文所述的剂量、功效和结果做出合理的比较和结论。

VI.治疗方法

本文提供了用于治疗个体中的癌症或延缓个体中癌症的进展的方法，其包括向已被施用或正被施用免疫检查点疗法的对象个体施用有效的微生物改良剂组合物。本文还提供了通过评估对象的微生物分布型来选择将对免疫检查点疗法作出有利应答的对象和向经鉴定具有有利的微生物分布型的对象施用免疫检查点抑制剂的方法。

在一些实施方案中，治疗在个体中导致治疗停止后的持续应答。本文描述的方法可用于治疗期望增强免疫原性的病况，如增加肿瘤免疫原性以治疗癌症。本文还提供了如在患有癌症的个体中增强免疫功能的方法，其包括向个体施用有效量的免疫检查点抑制剂(例如，PD-1抑制剂和/或CTLA-4抑制剂)和微生物调节剂。在一些实施方案中，个体为人类。

在一些实施方案中，个体患有对一种或多于一种抗癌疗法具有抗性(已证实具有抗性)的癌症。在一些实施方案中，对抗癌疗法的抗性包括癌症的复发或难治性癌症。复发可指治疗后癌症在原位点或新位点的再次出现。在一些实施方案中，对抗癌疗法的抗性包括在用抗癌疗法治疗期间癌症的进展。在一些实施方案中，癌症处于早期或处于晚期。

在本公开的方法的一些实施方案中，癌症的T细胞浸润水平低。在一些实施方案中，癌症的T细胞浸润物不可检测到。在一些实施方案中，癌症为非免疫原性癌症(例如，非免疫原性结直肠癌和/或卵巢癌)。不受理论的束缚，相对于所述组合的施用之前，联合治疗可增加T细胞(例如，CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、记忆T细胞)的引发、激活、增殖和/或浸润。

癌症可以是实体瘤、转移性癌症或非转移性癌症。在某些实施方案中，癌症可源于膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳房、泌尿系统、子宫颈、食道、十二指肠、小肠、大肠、结肠、直肠、肛门、牙龈、头部、肾脏、肝脏、肺、鼻咽、颈、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌头或子宫。

癌症具体可以是以下组织学类型的，但不限于这些：恶性赘生物；癌；未分化型膀胱癌、血癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、泌尿道癌、食道癌、胸腺瘤、十二指肠癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、牙龈癌、头癌、肾癌、软组织癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、颈癌、卵巢癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、舌癌、子宫癌、胸腺癌、皮肤鳞状细胞癌、非结肠直肠胃肠道癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、默克尔细胞癌、肾细胞癌、宫颈癌、肝细胞癌、尿路上皮癌、非小细胞肺癌、头颈癌、子宫内膜癌、食管胃癌、小细胞肺间皮瘤、卵巢癌、食管胃癌、胶质母细胞瘤、肾上腺皮质癌、葡萄膜癌、胰腺癌、生殖细胞癌、巨细胞癌和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管癌；肝细胞癌；合并肝细胞癌和胆管癌；小梁状腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉内腺癌；腺癌；家族性结肠息肉病；实体癌；恶性类癌瘤；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡状腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；非包膜硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜癌；皮肤附属器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；黏液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；黏液性囊腺癌；黏液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；乳房佩吉特氏病；腺泡细胞癌；腺鳞癌；伴鳞状化生腺癌；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质瘤；恶性泡膜细胞瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性睾丸母细胞瘤；Sertoli细胞癌；恶性Leydig细胞瘤；恶性脂质细胞瘤；恶性副神经节瘤；恶性乳腺外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑色素瘤；无黑色素黑色素瘤；浅表扩散性黑色素瘤；呈巨大色素痣的恶性黑色素瘤；上皮样细胞黑色素瘤；恶性蓝痣皮肤黑色素瘤；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；黏液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；腺泡状横纹肌肉瘤；基质肉瘤；恶性混合瘤；苗勒管混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；恶性间叶瘤；恶性布伦纳氏瘤；恶性叶状肿瘤；恶性滑膜肉瘤；无性细胞瘤；胚胎癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢甲状腺瘤；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西肉瘤；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性软骨母细胞瘤；间叶性软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤文肉瘤；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；原纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；神经胶母细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层肿瘤；小脑肉瘤；神经节神经母细胞瘤；神经母细胞瘤；成视网膜细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金病；霍奇金氏淋巴瘤；副肉芽肿；小淋巴细胞性恶性淋巴瘤；大细胞弥散性恶性淋巴瘤；恶性卵泡淋巴瘤；蕈样肉芽肿；其他指定的非霍奇金氏淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴性白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；骨髓性白血病；嗜碱性粒细胞白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞性白血病；肥大细胞白血病；巨核母细胞白血病；髓系肉瘤；和毛细胞白血病。

在一些实施方案中，癌症包括皮肤鳞状细胞癌、非结肠直肠和结肠直肠胃肠癌、默克尔细胞癌、肛门癌、宫颈癌、肝细胞癌、尿路上皮癌、黑色素瘤、肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、头颈癌、肾癌、膀胱癌、霍奇金氏淋巴瘤、胰腺癌或皮肤癌。

在一些实施方案中，癌症包括肺癌、胰腺癌、转移性黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、头颈癌或霍奇金氏淋巴瘤。

方法可涉及确定、施用或选择适宜的癌症“管理方案”并预测其结果。如本文所用，表述“管理方案”是指指定提供给有此需要的对象(例如，被诊断患有癌症的对象)的检查、筛查、诊断、监测、护理和治疗(如剂量、时间表和/或治疗持续时间)的类型的管理计划。

术语“治疗”或“处理”指的是对哺乳动物中的疾病的任何治疗，包括：(i)预防疾病，即通过在疾病的诱发之前施用保护性组合物来使疾病的临床症状不发生；(ii)压制疾病，即通过在事件的诱发之后但在疾病的临床出现或再次出现之前施用保护性组合物来使疾病的临床症状不发生；(iii)抑制疾病，即在临床症状最初出现之后通过施用保护性组合物来阻止其发展；和/或(iv)缓解疾病，即在临床症状最初出现之后通过施用保护性组合物来使其消退。在一些实施方案中，治疗可不包括疾病的预防。

在某些方面，可进行进一步的癌症或转移检查或筛查或进一步的诊断如造影剂增强计算机断层扫描(CT)、正电子发射断层扫描-CT(PET-CT)和磁共振成像(MRI)以在确定具有某种肠道微生物组组成的患者中检测癌症或癌症转移。

VII.确定微生物组组成的方法

在一些实施方案中，方法涉及获得微生物组分布型。在一些实施方案中，获得微生物组分布型包括以下步骤或有序步骤：i)获得从对象(例如，人对象)获得的样本，ii)从样本分离一种或多于一种细菌种，iii)从至少一种细菌种分离一种或多于一种核酸，iv)对分离的核酸测序，和v)将测序的核酸与参考核酸序列进行比较。在进行需要基因分型的方法时，可使用任何基因分型测定法。例如，这可通过对16S或23S核糖体亚基测序或通过与宏转录组学相关的宏基因组学鸟枪法测序来进行。

确定微生物组组成的方法可包括一种或多于一种微生物学方法如测序、下一代测序、免疫印迹、比较基因组杂交、PCR、ELISA等。

VIII.试剂盒

本公开的某些方面还包括用于执行本公开的方法的试剂盒，如癌症的检测、诊断或治疗和/或微生物的检测和定性或定量表征。这样的试剂盒可由容易获得的材料和试剂制备。例如，这样的试剂盒可包含以下材料中的任何一种或多于一种：酶、反应管、缓冲液、表面活性剂、引物、探针、抗体。在一个优选的实施方案中，这些试剂盒允许执业医师获得血液、眼泪、精液、唾液、尿液、组织、血清、粪便、痰、脑脊液和来自细胞裂解物的上清液中的肿瘤细胞样本。在另一个优选的实施方案中，这些试剂盒包含用于进行RNA提取、RT-PCR和凝胶电泳的所需装置。试剂盒中可还包含关于进行测定法的说明。

在一个特定的方面，这些试剂盒可包含多种用于评估或鉴定微生物的试剂，其中该试剂盒被容纳在容器中。试剂盒可还包含关于使用试剂盒来评估序列的说明、用于转化和/或分析序列数据以生成预后的手段。试剂盒中用于测量生物标志物表达的试剂可包含用于qRT-PCR的多个PCR探针和/或引物和/或用于评估生物标志物的表达的多个抗体或其片段。在另一个实施方案中，试剂盒中用于测量生物标志物表达的试剂可包含与本发明的生物标志物的mRNA互补的多核苷酸阵列。也可包含用于将表达数据转化为表达值和用于分析表达值以生成预测存活或预后的评分的可能手段。

试剂盒可包含带有标签的容器。合适的容器包括例如瓶子、小瓶和试管。容器可由各种材料形成，如玻璃或塑料。容器可容纳组合物，该组合物包括可用于预后判断或非预后判断应用的探针，如上文所述。容器上的标签可指示该组合物用于特定的预后判断或非预后判断应用，也可指示其是用于体内还是体外用途，如上述那些。试剂盒可包含上述容器和一个或多个其他容器，所述其他容器包含从商业和用户角度需要的材料，包括缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器和带有使用说明的包装插页。

进一步的试剂盒实施方案涉及包含本公开的治疗组合物的试剂盒。试剂盒可能可用于本公开的治疗方法中并包含使用说明。

IX.实施例

引入以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应理解，以下实施例中公开的技术代表了本发明人发现的在本发明的实践中很好地起作用的技术，并因此可视为构成其实践的优选模式。然而，根据本公开，本领域技术人员应理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可对所公开的具体实施方案进行许多修改并仍获得类似或相似的结果。

实施例1-对CTLA-4和PD-1联合阻断的应答和毒性中的分子、免疫和微生物因素

在基因组和免疫水平上理解和深入表征肿瘤的能力方面的并行进展的推动下，癌症的治疗范式正在迅速发展。针对在患者中导致无效抗肿瘤免疫应答的负调控通路的检查点阻断免疫疗法现在是广泛临床使用中实用且有效的策略。多种新药剂正在开发中，其被设计以阻断免疫抑制或激活免疫刺激分子靶标。提高对检查点阻断的应答率的工作目前由联合药物策略主导，策略的示例为CTLA-4和PD-1抑制剂的组合(联合免疫检查点阻断，CICB)。虽然在诱导客观应答方面更有效(Larkin等人,2015)，但这种联合与显著的免疫相关的不良事件(irAE)相关联(Hammers等人,2017；Sznol等人,2017)，并且对于预计会对单独的PD-1阻断产生应答且伴随而来的严重irAE的风险较低的多达40％的非选患者来说可能既不必要也不适宜(Robert等人,2015a；Robert等人,2015b)。尽管最近付出了努力，但尚未鉴定出可靠的治疗前毒性预测因子，并且迫切需要该预测因子。

发明人试图在接受CICB的黑色素瘤患者中鉴定出应答和免疫相关毒性的潜在肿瘤来源和全身性分子、免疫和肠道微生物生物标志物。召集了一组同时接受了抗CTLA-4抗体伊匹单抗和抗PD-1抗体(纳武单抗或帕博利珠单抗)治疗的晚期黑色素瘤患者。根据应答和毒性对患者分类，使用客观放射学评估来确定应答并使用高级别(3级或高于3级)irAE的发生率来确定毒性。

较低的毒性与较低多样性的外周T细胞组库相关联，并且免疫表型表明有更多的抗原刺激过的T细胞。引人注目的是，这种表型还与既往免疫疗法药剂的接受相关联，其预测较低级别的毒性。应答者中粪便微生物α多样性的中位数在数值上更高，粪便拟杆菌、嗜黏蛋白阿克曼氏菌、粪源普雷沃氏菌和脆弱拟杆菌的丰度差异与应答和毒性有关。在两个肿瘤小鼠模型中检查了肠道微生物群在促进CICB介导的亚临床回肠炎和结肠炎中的因果作用，其证实了哺乳动物物种之间不同的共生生态系统驱动免疫刺激或抑制作用的共同点。

A.结果

1.研究方案和生物试样采集

发明人在2014年1月1日至2017年8月31日之间召集了一组在临床试验中或作为标准护理(SOC)疗法接受CICB的转移性黑色素瘤患者(图1，表1)。如果患者患有黏膜或葡萄膜黑色素瘤亚型、缺乏与治疗期相关的适宜生物试样，或者如果没有足够的数据来确定放射学应答和毒性数据，则将患者排除在主要研究队列之外。

基于由RECIST v1.1测量的其对CICB的最佳总应答(BOR)，将患者归类为“应答者”(R)或“无应答者”(NR)，并还归类为具有任何3级或高于3级的irAE与低于3级的irAE。收集可用的治疗前和治疗时肿瘤和外周血样本用于相关分子和免疫分析，同时使用OMNIgene-GUT试剂盒收集和冷冻治疗前或治疗早期的粪便试样，然后通过16S rDNA测序确定微生物组分布型(表1)。

2.患者特征、CICB的临床疗效和毒性

队列包含53名患者，主要患有IV期疾病(n＝45,85％)，其中大多数患者未接受过针对晚期疾病的既往全身治疗(n＝39,74％)(表2)。五分之一(n＝11,20.8％)的患者曾接受过某种形式的既往免疫疗法；伊匹单抗或抗PD-1(不作为联合疗法)、抗PD-L1药剂，一种细胞因子药剂(单独地或作为辅助或姑息性目的的生物化学治疗方案的一部分)(表2)。

伊匹单抗+抗PD-1药剂组合的中位剂数为3(范围1-4)(表3)，初始联合给药后抗PD-1药剂单一疗法的中位剂数为1(范围0-44)。总体应答率为77.4％(41/53名患者)，在15.6个月的中位随访时间后，21名患者中发生了进展(未达到中位PFS，进展者中中位进展时间为3.0个月；图1)。几乎所有患者(n＝51，96.2％)都经历了任何级别的治疗相关(“可能的”、“很可能的”或“明确的”关联)不良事件(AE)，28位(52.8％)患者中发生了高级别的治疗相关、免疫相关的AE(irAE)(≥3级)，最常见的是腹泻/结肠炎、转氨炎(transaminitis)、甲状腺功能减退/甲状腺功能亢进、其他内分泌疾病和皮肤毒性(皮疹、瘙痒)(表3)。治疗相关毒性导致21名(39.6％)患者中断治疗，但没有与治疗相关的死亡。

3.针对CICB的应答和抗性的分子和免疫决定簇

由于突变负荷在不同肿瘤类型之间差异很大并且先前已证明会影响对CTLA-4或PD-1阻断单一疗法的客观应答(Hugo等人,2016；Snyder等人,2014；Van Allen等人,2015)，在非小细胞肺癌的CICB治疗情景下也报道了一些证据(Hellmann等人,2018)，故发明人首先研究了突变负荷与针对CICB的应答之间的关系。在可用的治疗前肿瘤样本(n＝26，表1)中进行全外显子组测序。如对皮肤黑色素瘤所预期的那样，所有病例均显示出占优势的以C>T转换为特征的UV损伤特征(数据未示出)。在针对CICB的应答者(R，n＝20)和无应答者(NR，n＝6)之间的总外显子突变或非同义变体(NSV)之间没有观察到统计意义上的显著差异(图2A)，但在低突变负荷范围(<1000NSV)中注意到显著的重叠，这表明高突变负荷可能允许应答，但不是应答的必要条件。

接下来，发明人检查了黑色素瘤或免疫相关的信号传导通路的特定突变驱动因子是否与CICB应答相关联。常见的黑色素瘤驱动突变均匀分布在整个患者来源的肿瘤中，而不管应答状态如何，没有根据突变类型(例如：错义、无义、插入缺失)、归类为黑色素瘤驱动因子、IFN-γ-通路和抗原加工通路基因集合的受影响的基因或基因群的明确模式(图8A)。如预期的那样，BRAF^V600突变与较低的总体体细胞突变负荷显著相关(p<0.001)(图8B)，但与应答无关。

鉴于与新抗原负荷有关的免疫原性预计与潜在的非同义突变负荷成比例，本发明人使用netMHCpan算法(Nielsen等人,2007)进行了计算机模拟地新抗原预测，该算法揭示在两个应答组之间的总或高结合亲和力预测新抗原的数目上没有显著差异(n＝26，图8C)。由于在突变或预测的新抗原负荷与应答之间不存在相关性，故发明人随后检查了基因组拷贝数变化(CNA)是否会影响应答。与突变负荷不同，拷贝数缺失负荷表现出与应答的统计学意义上的关联(p＝0.04，图2B)，这由NR中较高的主要影响染色体5、15和特别是10的染色体拷贝数缺失负荷驱动(图2C、图8D-8E)。先前牵涉在对免疫检查点阻断单一疗法的抗性中的若干基因似乎完全(CD74)或主要(PDIA3、B2M、PTEN)受NR肿瘤中拷贝数缺失的影响(图2D)，这表明了对CICB的抗性的潜在免疫基因组机制(Ekmekcioglu等人,2016；Peng等人,2016；Roh等人,2017；Tanese等人,2015；Zaretsky等人,2016)。

为了进一步探索肿瘤与浸润的免疫细胞之间塑造对CICB的结果的复杂微环境相互作用，发明人接下来检查了瘤内和全身免疫群体以鉴定潜在的应答标志物。如预期的那样，与NR肿瘤相比，在R的基线肿瘤免疫浸润物中观察到数值上更高的CD8+密度，然而这没有达到统计显著性，很可能是由于队列规模有限和无应答者的比例相对较小(n＝19R，n＝6NR；p＝0.052，单侧Mann-Whitney检验，图2E)。值得注意的是，无论治疗应答如何，CD8+T细胞密度在CICB治疗后都趋于增加(图9A)。通过T细胞受体(TCR)测序(n＝25，表1)对瘤内T细胞组库的分析揭示了R的肿瘤T细胞浸润物更高熵的强烈趋势(图2F)。基线肿瘤的TCR测序证实在R与NR之间的克隆性没有显著差异(p＝0.28，图2G)，然而这再次受到队列大小和R/NR比例的限制(n＝19R，n＝6NR)。

4.抗原刺激过的T细胞组库和既往免疫疗法与3-4级irAE的不存在相关

严重的irAE在接受CICB的患者中特别常见，尽管临床应答良好，但3级或高于3级irAE的发生常常会导致治疗的中断。缺乏来自CICB的irAE的精确免疫机制和可靠的预测性生物标志物(Carlino and Long,2016)。发明人研究了全身免疫参数与毒性之间的关联，假设全身循环代表了最容易达到的区室，自该区室可对潜在的自身反应性免疫细胞采样并从而鉴定患者针对经历CICB的irAE的易感性的免疫特征。本发明人使用多参数流式细胞术进行了外周血白细胞的全面免疫分析，并用TCR测序评价了循环T细胞组库。与先前报道的发现一致，即伊匹单抗疗法后循环CD8+T细胞克隆的治疗诱导扩增可预测在前列腺癌患者中的毒性(Subudhi等人,2016)，TCR测序分析(n＝16)也表明，虽然外周血中55个扩增克隆的截断值与高级别毒性关联，但没有承载较低数目扩增克隆的TCR组库的可用阴性预测值(总体p＝0.22，图9B)。经历毒性的患者在治疗早期的效应和中枢记忆CD8+T淋巴细胞中也具有更高的Ki67增殖指数，这与促成免疫相关毒性的细胞毒性T细胞的加速扩增一致(p＝0.0044，n＝14；图3A、图9C)。值得注意的是，在CICB开始之前收集的外周血淋巴细胞(n＝24)揭示出显著较高的T细胞组库多样性(p＝0.028，图3B)，并在随后经历高级别irAE的患者中揭示出显著较高的熵(p＝0.0068，图3C)。这些结果共同表明，包含更大数目的潜在自身反应性克隆的不太集中的T细胞组库可能促成针对CICB的毒性。

为了更深入地了解这些循环淋巴细胞的表型，发明人对基线外周血样本(n＝14-18)进行了多参数流式细胞术。在未发生严重irAE的患者的循环CD4+和CD8+T淋巴细胞中注意到显著较低的表面CD28和CD27的表达(CD4 Teff中的CD27，p＝0.0022；CD4 Teff中的CD28，p＝0.014；CD8 Teff中的CD27，p＝0.072；CD8 Teff中的CD28，p＝0.04；图3D-3E，图9D-9E)，表明具有更多抗原刺激过的T细胞组库的患者在用CICB治疗时具有较低的后续毒性发生率。

由于该免疫特征暗示了既往免疫激活的特征，故发明人接下来在接受过免疫疗法的患者与未接受过的患者之间比较了CD27和CD28的T淋巴细胞表达。据推测，既往免疫疗法会导致更多抗原刺激过的T细胞组库，其表型更类似于终末分化、反复刺激的T细胞。本发明人首先根据患者的既往免疫刺激疗法历史和irAE状态对患者队列分层。本发明人观察到，在暴露于任何既往免疫疗法的患者中(p＝0.016，Fisher精确检验)，高级别irAE(RR＝0.29，95％CI＝0.08-0.81)的风险显著降低(图3F)。另外，与推测一致，与接受过免疫疗法的患者相比，未接受过免疫疗法的患者在基线处确实在效应CD4/8T细胞群体上具有显著更高的CD27和/或CD28表达(n＝12未接受过免疫疗法，n＝3经历过免疫疗法；CD4 T效应细胞中的CD27，p＝0.0044，CD8 T效应细胞中的CD28，p＝0.018；图3D-3E，既往免疫疗法用颜色指示)。

5.肠道微生物组分布型与CICB的功效和毒性关联

本发明人接下来试图研究差异多样性和肠道微生物群的组成对在用CICB治疗的患者中免疫检查点阻断单一疗法的临床结果的影响。在进行如所述(图1)CICB治疗的患者中在可行时于治疗开始时收集粪便微生物组样本，并使用16S rDNA测序(n＝31，包括n＝24R，n＝7NR，n＝19≥3级irAE，n＝12无≥3级irAE；表1)。在整个队列中，粪便微生物组成差异很大，拟杆菌目和梭菌目在所有粪便样本中丰度最大(图4A)。基于先前的研究——其表明R中的肠道微生物组对抗PD-1阻断具有更高的多样性(Gopalakrishnan等人,Science2018)，本发明人首先比较了R和NR中对CICB的中位α多样性，并观察到跨多个多样性度量指标保留的类似趋势(p＝0.14，图4B，图10A)。本发明人接下来评价了肠道微生物组的多样性与针对CICB的毒性之间的关系，证实在具有严重irAE的患者与没有严重irAE的患者之间没有明显的趋势(p＝0.59，图4C)。然后，本发明人使用效应大小的线性判别分析(LEfSe)(Segata等人,2011)和相对分类学丰度的成对比较来评价R与NR之间对CICB的组成差异。若干细菌分类群在R中对CICB富集，包括嗜黏蛋白阿克曼氏菌、粪便拟杆菌和Dielmafastidiosa等(根据Mann-Whitney检验，分别地，p＝0.032、p＝0.019、p＝0.018；图4D、图10B)。相反，注意到在NR中是另外的细菌分类群富集，包括罗氏乳杆菌、脆弱拟杆菌和粪源普雷沃氏菌(图4D)(根据Mann-Whitney检验，分别地，p＝0.040、p＝0.040、p＝0.033，图10B)。另外，与先前的发现一致，厚壁菌门、梭菌目(p＝0.21)、瘤胃球菌科(p＝0.56)在应答者中也往往较高，然而关联相对较弱，这可能是由于与使用CICB相比在抗PD-1单一疗法的情况下截然不同的微生物应答关联(图10B)。若干细菌分类群也与高级别irAE相关联，包括粪便拟杆菌(也与有应答的患者有关)、粪拟杆菌和戴阿利斯特菌属(根据Mann-Whitney检验，分别地，p＝0.040、p＝0.033、p＝0.038；图4E、图10C)。在没有irAE的患者中富集的细菌分类群包括脆弱拟杆菌、吸血弧菌属和泰泽氏菌属等(LEfSe,图4E；分别地，成对p＝0.014、p＝0.014、p＝0.018，图10C)。

为了确定特定的全身免疫群体是否介导对治疗相关irAE的发展的微生物影响，本发明人然后在具有匹配的粪便微生物组数据及治疗前外周血免疫表型(n＝9)和粪便微生物组数据的病例中检查了循环免疫细胞亚群与和应答相关联的关键分类群之间的相关性。先前鉴定的关键应答相关分类群粪便拟杆菌、珀氏解黄酮菌、Dielma fastidiosa和嗜黏蛋白阿克曼氏菌(图4D)与循环PD-1+T细胞群体的治疗前丰度直接相关并且总体CD8 T细胞丰度的度量(CD8总量，与CD4:CD8比率成负相关；图10D)与对潜在肿瘤反应性淋巴细胞富集并准备在CICB治疗后应答的全身免疫特征一致。然后，本发明人在循环免疫群体和与高级别irAE的发生或不发生相关联的细菌分类群之间进行了类似的分析。在若干毒性关联的拟杆菌属分类群和PD-1+T细胞群体的丰度之间观察到一致的正相关性，这与CICB开始后导致毒性的多种免疫特异性的潜在(重新)激活一致(图4F)。出乎意料地，毒性关联的拟杆菌属物种表现出与先前鉴定的CD27和CD28的CD4+和CD8+T细胞表达不一致的关联；值得注意的是，与CD27/CD28水平成反相关的粪便拟杆菌也与应答高度关联。另外，若干毒性关联的拟杆菌属物种与T细胞亚群内的CD27/28+级分之间的不一致相关性在治疗时的样本中变得更加明显(n＝9，图10E)。这些数据表明，在和毒性更明确地关联的分类群与和毒性和/或应答都关联的那些分类群之间存在截然不同的细菌免疫关联(图4F)。

6.CICB诱导的肠道微生物组中的细菌变化与应答性相关联

由于肠道微生物组成在影响黑色素瘤患者中CICB的功效和毒性方面的关联，本发明人接下来研究了微生物模式是否会影响小鼠中ICB单一疗法或CICB的结果。本发明人用单独的抗PD-1抗体或与抗CTLA-4抗体的组合治疗确定的MCA205肉瘤和RET黑色素瘤2周(分别6次和5次施用)，并观察到采用每种治疗方式的MCA205中延长和/或完全的消退(2/6的抗PD-1治疗小鼠和6/6的CICB治疗小鼠为应答者(R)，应答者定义为在两次连续测量中肿瘤消退或大小不增加的小鼠；图5A，左图)。在RET黑色素瘤模型中的类似研究显示了相似的结果但无应答者(NR)小鼠的数目更多，无应答者(NR)小鼠定义为在两次连续测量中其肿瘤增大的小鼠(5/6的抗PD-1治疗小鼠和2/10的CICB治疗小鼠为NR；图5A，右图)。

为了测试两种肿瘤模型间在治疗过程中微生物组成的差异，本发明人进行了微生物β多样性的主坐标分析，这提供了样本之间的总体相关关系(或其缺乏)的度量。在考虑在2剂或5剂CICB之前和之后收集的纵向粪便样本时，本发明人找出了两种肿瘤模型中微生物组组成随时间的显著变化(图5B，左图和右图)，并在在RET模型中施用5剂CICB后获得的样本中观察到最明显的聚类效应(图10A-D)。在纵向样本的相同混合物中，主坐标分析揭示了对于两种肿瘤模型在每个样本收集时间点时粪便微生物群与肿瘤大小之间的显著关联(MCA205中p＝0.001，RET中p＝0.039；图5C)。合在一起，这些数据找出了微生物群、免疫疗法和肿瘤生长动力学之间的动态相互作用。

发明人接下来比较了在两种肿瘤模型(MCA205和RET)中的任一种中的随后对CICB有应答的小鼠的治疗前肠道微生物群中存在的细菌，发现在两种模型中都存在169个分类群，包括Alistipes indistinctus和嗜黏蛋白阿克曼氏菌。此外，珀氏解黄酮菌在对CICB有应答的人类患者中也富集(图4D、图5D、表4)。为了确定患者样本和鼠肿瘤模型中细菌的进一步共性，发明人比较了患者中由LEfSe鉴定的应答相关联的分类群与两种鼠肿瘤模型中使用LEfSe鉴定为在R和NR小鼠之间对CICB差异富集的那些分类群。此外，鉴于肠道微生物组成随时间显著且依赖于模型变化的发现，本发明人试图通过关注人类应答相关联的分类群来丰富分类学发现和额外的生物学信息，在CICB过程中所述分类群在任一小鼠模型中变得或保持差异富集，并且其与肿瘤大小相关(或反相关)(图11A-D)。发明人检查了两个时间点，试图确定治疗和肿瘤大小是否与肠道微生物群相关联以及肠道微生物群在开始治疗后是否保持稳定。在治疗早期(2次注射后)，解黄酮菌属(MCA205中的珀氏解黄酮菌)和Dielma(MCA205中的D.fastidiosa)被鉴定为与CICB应答者患者的微生物群指纹重叠(图11A-B)。在5次注射后，阿克曼氏菌属(MCA205中的嗜黏蛋白阿克曼氏菌)、拟杆菌属(MCA205中的B.stercorirosoris)和Dielma(RET中的D.fastidiosa)常见于有应答的小鼠和患者中(图11C)。值得注意的是，嗜黏蛋白阿克曼氏菌与RET肿瘤中的肿瘤大小以及先前报道的共生物种(如E.hirae)(图11D)(Routy等人,2018)反相关。相比之下，不同的乳杆菌属(如动物乳杆菌)与CICB治疗的RET和抗PD-1治疗的MCA205肿瘤中的肿瘤生长呈正相关(图11D)并注意到与人类患者中对CICB的无应答相关联(图4D)。当在不同的时间点分离针对CICB的应答者(R)与无应答(NR)小鼠时，无论肿瘤类型如何，发明人均发现，不仅嗜黏蛋白阿克曼氏菌和Dielma fastidiosa而且Alistipes indistinctus也与黑色素瘤患者中的应答相关联(图5E，表4)。

7.肠道共生体引起或减轻CICB诱发的亚临床回肠炎或结肠炎

接下来，发明人聚焦于肠道毒性(结肠和回肠)分析了小鼠模型中肠道微生物群与毒性之间的潜在相关性。值得注意的是，鼠科模型不能很好地再现明显的结肠irAE(例如：体重减轻、黏膜出血、粪便量和稠度改变)，因此发明人首先对在单独施用CICB后或与广谱抗生素(ATB)共同施用CICB后肠道上皮细胞和固有层的组织学异常(绒毛和隐窝的不规则或破坏或长度减小，炎性浸润物的存在)进行了评分，其中有或没有由人类并行分析报告的特定共生细菌的单一定植。事实上，CICB诱导了亚临床回肠毒性，该毒性通过用ATB对小鼠肠道的灭菌而得到高度缓解(图6A-B)。用不同的共生菌(如Erysipelatoclostridiumramosum)补充经ATB处理的小鼠可恢复回肠毒性，而其他(肠道拟杆菌)似乎具有保护作用(图6A-B)。接下来，发明人对经处理的小鼠的回肠和结肠进行了基因表达谱分析，表明这种回肠毒性伴随着促炎细胞因子IL-1β的转录的迅速和选择性上调，但TNFα和IL-6并非如此，并且仅在有E.ramosum而不是肠道拟杆菌或D.fastidiosa的肠道微生物菌群或单一定植的存在下是这样(图6C，图12)。与IL-1β在应答CICB的回肠炎症发生中的特定作用一致，伴随CICB的IL-1R1阻断减轻了回肠毒性(图6D)。

与回肠毒性相比，亚临床小鼠结肠炎的发展与肿瘤有关，并在针对RET黑色素瘤的CICB期间观察到，但对MCA205纤维肉瘤未观察到(图6E)。而且，粪便微生物组的组成与RET肿瘤模型中结肠黏膜中免疫浸润物的存在相关联(图6F左图)。在与提示小鼠结肠炎的高度结肠免疫浸润物相关联的十个物种中，只有肠道拟杆菌也与人类队列中的毒性关联，表明患者中高级别irAE的定义不限于胃肠道毒性，微生物组队列中仅7/31的患者经历了胃肠道毒性(图4E、图6F右图)。相比之下，高丰度的嗜小球藻吸血弧菌与经治疗小鼠的结肠中的低免疫浸润物相关联，并且在患者中也注意到与高级别毒性的较低可能性相关联(图6F右图、图4E)。在患者中与较低毒性关联的发酵乳酸梭菌(图4E)也存在于对CICB有应答的小鼠中(表4)。

最后，本发明人通过将来自对ICB没有应答且未经历毒性的肾细胞癌(RCC)患者的粪便物质转移到ATB灭菌的avatar小鼠中，随后植入原位RENCA肿瘤并如前所述用CICB治疗来测试肠道微生物组对亚临床结肠毒性的影响(图6G)(Routy等人,2018)。粪便物质向荷瘤小鼠中的移植导致了CICB治疗后的结肠炎症，这种炎症可通过口管饲喂嗜黏蛋白阿克曼氏菌(嗜黏蛋白阿克曼氏菌先前已被鉴定为是与抗PD-1应答相关联的物种(Routy等人,2018))或者来自对治疗有应答且未经历3-4级irAE的RCC患者的粪便物质来预防，如通过抗微生物肽脂质运载蛋白-2的免疫组织化学和粪便水平来监测(图6H-I)。有应答的RCC患者的粪便的宏基因组分析表明存在A.indistinctus，其也存在于有应答的黑色素瘤患者(图4D)和有应答的小鼠(图5E)的粪便微生物群中，但在无应答的RCC患者的粪便中不存在。

这些微生物分析一起表明了细菌生态系统在调节对CICB的治疗性应答和毒性中的因果作用，证明了治疗前肠道微生物组组成和CICB诱导的组成变化与治疗结果或毒性之间的强关联。这些发现还凸显了跨肿瘤类型和哺乳动物物种(人类、小鼠)的不同细菌群落出人意料的共性。

B.讨论

与单药疗法相比，抗CTLA-4和抗PD-1联合疗法在晚期黑色素瘤的治疗中提供了优异的应答率，然而，这种强化方案因严重irAE的高发生率而受到阻碍(Carlino and Long,2016)。本实施例中描述的研究在联合免疫检查点阻断的背景下鉴定了应答和irAE的新生物标志物。发现更高的拷贝数缺失负荷是CICB抗性的预测因子。优先在无应答者中缺失的基因集中在5、10和15号染色体上。仔细推敲后，在这些受拷贝数变化影响的区域上找出了先前牵涉在肿瘤炎症或对免疫疗法的应答中的基因，包括PTEN、B2M和CD74(Ekmekcioglu等人,2016；Peng等人,2016；Tanese等人,2015；Zaretsky等人,2016)。

肠道微生物群的分析提供了对应答的潜在可改变生物标志物的启发性见解。本发明人确定在应答者中拟杆菌属和阿克曼氏菌属的成员会优先富集，而在对CICB的无应答者中乳杆菌属的成员将富集。在CICB期间，阿克曼氏菌属和嗜黏蛋白阿克曼氏菌菌株在荷肉瘤小鼠中也高频出现(并都对CICB有应答)并且在应答者中至少保持稳定，同时跨肿瘤模型在无应答者中减少。在用CICB治疗的转移性黑色素瘤患者的此队列中的有应答患者组中以及在用CICB的治疗期间跨肿瘤模型的有应答小鼠组中也发现了A.indistinctus。D.fastidiosa也是目前的患者队列中和治疗期间CICB应答小鼠中的共同特征并凸显了培养组学作为研究微生物群的工具的重要性。

迄今为止，大多数生物标志物的注意力都集中在客观抗肿瘤应答上，然而，这些药剂的安全和最佳使用——特别是在联合方案中——需要更多地考虑毒性的生物标志物。在此研究中，发明人发现了更多样化的TCR组库可预测高级别irAE。这些数据高度表明，治疗相关的自身免疫可能是由潜伏的、低丰度的自反应性T细胞克隆驱动的，其存在与循环淋巴细胞库的整体多样性成正比。最重要的是发现更多终末分化/抗原刺激过的T细胞组库的特征——与更“集中”、更少多样性的组库的概念一致——与高级别毒性显著较低的可能性相关联。循环淋巴细胞库的群体水平结构可能会影响激活肿瘤反应性(期望的)T细胞克隆而不是自身反应性(不期望的)T细胞克隆的相对可能性，并且可能是在经免疫疗法治疗的患者中观察到的应答与毒性之间的联系的基础。既往的免疫疗法暴露可能促进有利于毒性避免的T细胞表型的并行观察结果提供了诱人的初步证据，即治疗前的药理学操作可能能够减轻高强度免疫治疗方案的毒性。具有针对现代免疫治疗药剂的充分记录的且更均匀的既往接受(或未接受)的更大队列将为研究循环T细胞组库、免疫调节干预、微生物群和irAE的相互作用提供宝贵的机会。另外，为了剖析具有任何类型irAE或器官-系统特异性(例如：转氨炎、结肠炎、甲状腺炎)irAE的关联之间的病因学差异，将需要大的队列。

肠道微生物群也可代表对发生检查点免疫疗法相关自身免疫毒性的可能性的关键且可改变的影响。本发明人鉴定出了若干与高级别免疫相关毒性的发生或不发生强烈关联的分类群。重要的是，除了粪便拟杆菌外，大多数应答相关联的细菌分类群与毒性都不是高度关联的，并且在与毒性关联的全身淋巴细胞亚群的相关性中存在明显的种级别变化。该数据表明，构成与irAE的关联的基础的潜在不同免疫调节微生物机制扩展到非常低的分类(种)级别，因此即使是紧密相关的分类群也可能与irAE存在相互冲突的关联。在小鼠中，CICB在回肠处比在结肠处更具毒性，具有明显的不同生态系统的因果作用。事实上，采用广谱抗生素或粪便微生物移植的疗法可改善回肠炎或结肠炎评分。一些细菌种类似乎比其他种类(如E.ramosum)更具毒性。CICB诱发的回肠炎可能归因于毒性关联的共生体诱导黏膜IL-1β的能力，因为IL-1R1阻断减轻了CICB诱发的回肠炎。在与肠道毒性关联的共生体方面，还发现了哺乳动物之间的共性。在目前用CICB治疗的转移性黑色素瘤患者队列中以及在(C)ICB治疗的RET/MCA205荷瘤小鼠中，肠道拟杆菌都是与3-4级毒性关联的共生体。然而，在模型系统中，单独的肠道拟杆菌未能诱发回肠炎或结肠炎，要么是因为该菌株没有固有的细胞毒性，要么是因为它需要适当的生态系统(和其他菌株)来改变黏膜屏障。

除了在预测性生物标志物鉴定中的作用外，这些全面的分子、免疫和微生物研究已找出了探索肠道微生物群的操纵和淋巴细胞组库的塑造的有前景途径，目的是在CICB的情况下解耦应答和毒性。这些发现在个性化医疗时代具有重要的临床意义，并有必要在更大的数据集和多种癌症类型中验证。

C.实验模型和对象详情

1.患者队列

从临床记录的详细回顾性和前瞻性研究中确定2014年1月23日至2017年8月31日期间在UT MD Anderson癌症中心接受了至少一剂伊匹单抗与PD-1检查点阻断剂(纳武单抗或帕博利珠单抗)的组合作为联合免疫检查点阻断(CICB)来治疗的晚期(III/IV期)黑色素瘤患者。CICB治疗是作为临床试验或扩大准入计划协议(NCT01844505、NCT02186249、NCT02089685、NCT01621490、NCT02519322、NCT02320058)的一部分或作为标准护理疗法提供的。由于已知黑色素瘤亚型之间潜在生物学和免疫治疗反应的差异，故仅纳入了皮肤黑色素瘤(即：本研究排除了黏膜和葡萄膜黑色素瘤)。为了允许转化分析，排除了不可获得的与CICB治疗期相关的生物试样的患者，或者得不到足够的数据来确定放射学反应和毒性结果的患者。总体而言，确定了符合上述标准的40名患者的初始队列并研究了应答和毒性的分子和免疫相关性。由于最初有限的粪便微生物群采样和研究间隔期间更广泛的参与，随后确定了另外13名可自其获得可用粪便试样的患者，将其纳入到微生物组相关转化分析中并完全整合到所有临床分析中。

2.小鼠

所有小鼠实验均得到当地机构委员会的批准并根据政府和机构的指导方针和规定进行。雌性C57Bl/6和BALB/c分别购自Harlan(法国)和Janvier(法国)。使用在8至16周龄之间的小鼠。所有小鼠实验均在Gustave Roussy Cancer Campus进行并且小鼠被关在无特定病原体的条件下或保持在隔离器中。

3.细胞系

将MCA205和RET黑色素瘤(在金属硫蛋白-1启动子控制下的Ret原癌基因的转基因强制表达，其驱动自发性黑色素瘤发生，由Viktor Umansky教授友情提供)(与C57BL/6J小鼠同源)及荧光素酶转染肾癌(RENCA)细胞系(与BALB/c小鼠同源，由法国伊尔基什的Transgene友情提供)在37℃、5％CO₂下于RPMI-1640培养基中培养，该培养基补充有10％的热灭活胎牛血清(FBS)、1％的青霉素/链霉素、2mM的L-谷氨酰胺和1％的丙酮酸钠及非必需氨基酸(均来自Gibco-Invitrogen)，本文称为完全RPMI培养基。将RENCA保持在补充有0.7mg/ml遗传霉素(Invitrogen,LifeTechnologies)的完全RPMI中。定期检验细胞系的支原体污染并且不使用传代超过10代的细菌。

D.方法细节

1.临床评估和生物试样

应答评估.每名患者由至少两名临床研究人员独立地进行临床反应注释(MCA、PAP、HT)。根据RECIST 1.1标准(Eisenhauer等人,2009)使用最佳总反应(BOR)来定义治疗反应，比较在标准疾病再评估时间点研究与基线(治疗前)研究中进行的再分期成像的肿瘤负荷。在整个治疗期间对纵向再分期扫描进行评价，直至开始后续治疗或最后一次已知的随访日期。成像方式尽可能匹配为有利于胸部、腹部和骨盆的造影剂增强CT，脑部的造影剂增强MRI或CT，以及颈部或四肢的成像，如由已知的疾病部位所指示。如果患者取得可归因于CICB的客观完全应答(CR；肿瘤负荷减少100％)或部分应答(PR；肿瘤负荷减少≥30％)，则将患者归类为“应答者”(R)。如果他们获得进展疾病(PD；疾病负荷增加≥20％)或疾病稳定(SD；不符合CR/PR/PD标准)的BOR，则将患者归类为无应答者。如果小鼠的肿瘤在治疗期间消退或稳定，则将小鼠定义为应答者(R)，或当肿瘤在两次连续测量中大小增大时定义为无应答者(NR)。

毒性评估.根据NCI不良事件通用术语标准(CTCAE)4.0标准对免疫相关的不良事件(irAE)评分并根据至少两名独立临床研究人员的共识意见对CICB疗法的免疫相关关系(“可能的”、“很可能的”、“确定的”关联)进行划分(MCA、HT、WSC)。

生物试样采集.可用的肿瘤和外周血样本通过查询机构研究生物试样单位来确定，必要时还可从诊断试样查询档案病理学单位来确定。肿瘤活检以穿孔、空芯针或切除性活检形式获得并保存为速冻(对于RNA/DNA提取)或福尔马林固定石蜡包埋(FFPE；对于免疫组织化学或DNA提取)试样。外周血样本经过密度梯度离心以分离外周血单核细胞(PBMC)，然后冷冻保存直至需要进行种系DNA提取或流式细胞术。根据赫尔辛基宣言按UT MDAnderson癌症中心机构审查委员会批准的协议检索、采集和分析生物试样。在门诊使用OMNIgene-GUT试剂盒(DNA Genotek Inc(加拿大渥太华))根据制造商的建议在治疗临床医师的详细解释和指导后获得粪便样本。稳定的粪便样本在采集后30天内亲自或通过邮件返回。

2.基因组分析

全外显子组测序分析.全外显子组测序(WES)使用与先前描述的相同的协议(Roh等人,2017)进行。总共包括26个治疗前样本(19R、7NR)。在病理评估和确认肿瘤含量后，从肿瘤样本提取DNA。采集匹配的外周血白细胞作为种系DNA对照。剪切步骤的初始基因组DNA输入为750ng。使用KAPA Hyper Prep试剂盒(#KK8504)进行末端修复、碱基添加、使用分叉Illumina配对末端接头进行的接头连接和文库富集聚合酶链反应(PCR)，然后进行固相反向固定珠清理和成簇。按照制造商的说明进行文库构建。使用650-750ng的准备好的文库，用Agilent SureSelectXT Target Enrichment(#5190-8646)协议按照制造商的说明进行目标富集。使用Eppendorf Mastercycler EP Gradient仪器将富集的文库归一化为相等浓度，在Agilent Bravo B平台上合并为等摩尔量，并使用KAPA LibraryQuantification试剂盒(#KK4824)定量。将合并的文库调整至2nM，用0.2M NaOH变性，使用Illumina杂交缓冲液稀释，并按照制造商的说明使用HiSeq v3簇化学和Illumina Multiplexing测序引物试剂盒进行簇扩增。然后使用76bp双端读取在Illumina HiSeq 2000/2500v3系统上对库测序，并使用RTA v.1.13或更高版本进行分析。外显子组数据的平均覆盖率在肿瘤中为221×而在种系中为100×。然后使用Picard和GATK软件处理对齐的BAM文件以识别重复、重新对齐和重新校准。使用MuTect(v1.1.4)鉴定体细胞点突变并使用Pindel(v0.2.4)鉴定小的插入/缺失。然后应用另外的调用后过滤器，包括：(a)肿瘤样本中的总读取计数>30，(b)匹配的正常样本中的总读取计数>10，(c)肿瘤样本中的VAF(变异等位基因频率)>0.05,(d)匹配的正常样本中的VAF<0.01，和(e)移除dbSNP129和千人基因组计划(1000Genomes Project)中报告的SNV。

拷贝数变化分析.如前所述进行拷贝数变化分析(Roh等人,2017)。基本上，将Sequenza(v2.1.2)算法应用于对齐的BAM数据以获得每个肿瘤样本的log₂拷贝数比率(肿瘤/正常)。使用R包“CNTools”(v1.24.0)确定出基因水平下的拷贝数增加(log₂拷贝比率>log₂1.5)和缺失(log₂拷贝比率<-log₂1.5)。拷贝数增加或缺失的负荷定义为每个样本拷贝数增加或缺失的基因总数。为了定义复发性CNA，将R包“cghMCR”(v1.26.0)应用于计算的log₂拷贝比率(肿瘤/正常)以识别复发性CNA的基因组区域(最小公共区域，MCR)。为了识别应答者与无应答者中优先缺失或增加的基因，在每个基因位置处进行Fisher精确检验，并由FDR调整后的p<0.05定义统计显著性。排除少于3个样本中具有CNA的基因。

新抗原预测.审查了来自WES的非同义外显子突变(NSEM)，使用包含NSEM的所有可能的8-至12-聚体肽进行新抗原预测并与野生型肽比较。使用PHLAT预测每个病例的HLA(Bai等人,2014)。结合亲和力通过NetMHCpan(v2.8)算法(Hoof等人,2009)在考虑到患者HLA的情况下进行评价。预测的IC50<500nM的候选肽被认为是HLA结合的。

3.免疫分析

流式细胞术.通过MD Anderson免疫治疗平台的成员来分析从研究患者获得的外周血单核细胞(PBMC)。抽取治疗前和治疗后的血液样本进行PBMC的免疫表型分析。PBMC样本来自20名患者，包括10名≥3级irAE的患者和10名<3级irAE的患者。使用荧光偶联的单克隆抗体通过若干板进行PBMC的多参数流式细胞术分析：CD4 AF532(SK3,eBioscience)、CD3PerCP-Cy5.5(UCHT1,Biolegend)、CD8 AF700(RPA-T8,BD Biosciences)、CD127 BV711(HIL-7R-M21,BD Biosciences)、ICOS PE-Cy7(ISA-3,eBioscience)、PD-1BV650(EH12.1BD Biosciences)和FOXP3 PE-e610(PCH101；eBioscience)；CD3 PE-CF594、CD4 Pe-Cy5.5、CD8 AF532、CD45RA BV650(HI100,Biolegend)、CCR7 BV785(G043H7,Biolegend)、CD27PeCy5(0323,eBioscience)、CD28 APC-e780(CD28.2 eBioscience)、PD-1BV650(EH12.1 BDBiosciences)、EOMES e660(WD1928,eBioscience)和TBET BV605(4B10 Biolegend)。Live/Dead可固定黄色染色剂购自Thermo Fisher Scientific。使用LSR Fortessa(BDBiosciences)运行样本并使用FlowJo软件程序进行分析。在适宜的前向/侧向散射和活单细胞门控后，发明人确定了总CD3+T细胞、CD8+ T细胞(CD3+CD8+)和CD4+ T细胞(CD3+CD4+)的频率。在CD4中，有CD4+效应T细胞(CD4+FOXP3-)和CD4+调节性T细胞(CD4+FOXP3+CD127-/低)。在这些群体中评价了PD-1和ICOS表达。使用CD4和CD8 T细胞上的CD45RA和CCR7表达来定义初始T中枢记忆(TCM)、T效应记忆(TEM)和效应T(Teff)亚群。在这些区室中的每一个中评价PD-1、CD28、CD27、EOMES和TBET表达。

免疫组织化学.从每个FFPE肿瘤样本获得苏木精和伊红(H&E)染色的载玻片以确认肿瘤的存在。用低浓度过氧化氢漂白黑色素对重着色样本进行预处理。选定的抗体组包括程序性死亡配体1(PD-L1)克隆E1L3N(1:100,Cell Signaling Technology)、PD-1克隆EPR4877(1:250,Epitomics)、CD3多克隆(1:100,DAKO)、CD4克隆4B12(1:80,LeicaBiosystems)、CD8克隆C8/144B(1:25,Thermo Scientific)、FOXP3克隆206D(1:50,BioLegend)和颗粒酶B克隆11F1(即用型,Leica Microsystems)。使用Leica Bond Max自动染色仪(Leica Biosystems,Buffalo Grove,IL)对有限抗体组进行IHC染色。使用LeicaBond Polymer Refine检测试剂盒(Leica Biosystems)进行IHC反应，并使用二氨基联苯胺(DAB)作为色原体。用苏木精复染。在所有下游IHC分析之前使用Aperio AT Turbo(LeicaBiosystems)扫描所有IHC载玻片。使用Aperio Image Toolbox分析软件(LeicaBiosystems)，从肿瘤区域内五个随机选择的1mm²区域中选择每个标准物的平均值如前所述进行数字分析(Chen等人,2016)。PD-L1表达通过H-score来评价，其评价阳性细胞百分数(0至100)和染色强度(0至3+)，总分在0至300的范围内。其余标志物以细胞密度打分。

TCR测序.使用QIAamp DNA FFPE组织试剂盒(Qiagen)从可用的FFPE肿瘤组织(19R、6NR)和PBMC(15名患者≥3级irAE，12名患者<3级irAE)提取DNA。使用ImmunoSeqhsTCRB试剂盒(Adaptive Biotechnologies)进行CDR3可变区的下一代TCR测序，然后在MiSeq 150×(Illumina)上测序并使用ImmunoSeqTM Analyzer软件v3.0(AdaptiveBiotechnologies)进行分析，仅考虑最少检测到1000个独特模板的样本。克隆性是一个与TCR多样性成反相关的指标并以1-(熵)/log₂(生产性独特序列数目)度量。优先克隆扩增定义为与治疗前血液样本相比治疗后显著扩增的T细胞克隆数。

4.鼠科模型

抗生素治疗.用含有氨苄西林(1mg/ml)、链霉素(5mg/ml)和黏菌素(1mg/ml)(Sigma-Aldrich)的抗生素溶液(ATB)处理小鼠，该溶液中加入或不加入万古霉素(0.25mg/ml)(使用饮用水)。溶液和瓶子分别每周更换3次和一次。通过在COS(含有5％羊血的哥伦比亚琼脂)平板上于37℃下在有氧和无氧条件下培养以0.1g/ml重悬于BHI+15％甘油中的粪粒48小时来确认抗生素活性。ATB处理的持续时间随实验设置而略有不同。简言之，小鼠在肿瘤植入之前接受了2周的处理并在MCA205和RET实验的整个实验过程中继续，而在使用RENCA的实验中，在粪便微生物群转移之前施用3天的ATB处理。

肿瘤激发和治疗.给小鼠侧腹皮下(s.c.)注射0.8×10⁶个MCA205或0.5x10⁶个RET细胞。当肿瘤达到20至30mm²时开始治疗。给小鼠腹膜内(ip)注射抗PD-1mAb(250μg/小鼠；克隆RMP1-14)和/或抗CTLA-4mAb(100μg/小鼠，克隆9D9)，具有或不具有抗IL1R(阿那白滞素，500μg/小鼠)或相应的同种型对照，如附图中所示。用于体内的所有mAb均来自BioXcell(美国新罕布什尔州西黎巴嫩)，使用除阿那白滞素外的推荐的同种型对照mAb(SwedishOrphan Biovitrum，瑞典)。

粪便微生物群转移实验.在ATB处理3天后，使用来自无反应患者的样本进行粪便微生物群转移((FMT)。将冷冻的粪便样本解冻并彻底涡旋。让大颗粒材料在重力作用下沉降。通过口管饲喂以单剂施用200μL上清液。向每只动物的皮毛上涂施另外100μL。FMT两周后，用异氟烷麻醉BALB/c小鼠，向右肾的囊下空间中注射在30μL PBS中的1x10⁴个RENCA肿瘤细胞。然后用手术夹闭合皮肤切口。肿瘤接种后5天开始治疗。在有或没有口管饲喂来自有反应患者的粪便样本或嗜黏蛋白阿克曼氏菌的情况下用抗PD-1 mAb和抗CTLA-4治疗小鼠。在IVIS成像系统50系列(Analytic Jenap)上每周一次监测肿瘤生长。

用专门的共生物种进行肠道定植.将嗜黏蛋白阿克曼氏菌CSURP2261(由Instituthospitalo-universitaire Méditerranée Infection(法国马赛)提供)、Dielmafastidiosa(自人样本分离)、Erysipelatoclostridium ramosum(自人样本分离)和肠道拟杆菌(自小鼠样本分离)在COS平板上在无氧条件下使用无氧发生器(Biomerieux)于37℃下培养24-72小时。使用荧光分光光度计(Eppendorf)获得在600nm下测得光密度为1的10⁹CFU/mL的悬浮液。在抗体治疗前24小时施用并且与每次抗体治疗一起进行10⁸或10⁹个CFU的100μL悬浮液的口管饲喂。使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱仪(Microflex LT分析仪，Bruker Daltonics，德国)验证细菌。

细胞因子定量.收集粪便样本并储存在-80℃下直至进一步处理。将样品解冻并重悬(以100mg/mL)于含有0.1％吐温20的PBS中。在室温下振荡孵育20分钟后，将样品以12000rpm离心10分钟，收获上清液并储存在-20℃下直至分析。按照制造商的说明，使用小鼠脂质运载蛋白-2/NGAL DuoSet ELISA试剂盒(R&D Systems,Minneapolis,MN)测量脂质运载蛋白-2水平。

免疫组织化学.将肠道组织保存在福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)或最佳切割温度化合物(OCT)中。在处死小鼠时取出回肠和结肠，在PBS中洗涤，纵向切割，翻滚，并在4％的PFA中于4℃下过夜固定，或在一些实验中于室温下固定2小时。然后将组织用Tissue- 6真空渗入处理器(Sakura)进行石蜡包埋，或者在15％的蔗糖中再水化1小时，然后在30％的蔗糖中过夜，OCT包埋(Sakura)并速冻。纵向切片用苏木精、伊红和番红染色剂(H&E)复染。

肠道组织毒性的组织学评估.回肠：由病理学家(P.O.)对每个切片的炎症性病灶、黏膜下层的出现、绒毛的长度和固有层的厚度打分。评分定义为：0＝正常，1＝局灶性和轻微病变；2＝弥漫性和轻微病变；3＝弥漫性、轻微和主要病变；4＝具有仅含结缔组织的区域的主要病变。结肠：炎性浸润物，按生理(0)水平、低(1)水平、中等(2)水平和高(3)水平的定义打分。

5.微生物组分析

患者粪便样本.使用OMNIgene GUT试剂盒(DNA Genotek，加拿大渥太华)采集基线粪便样本。根据最初的40名患者队列，有18份粪便样本可用于分析。为了扩展微生物组分析，从另外13名接受CICB的患者采集了粪便样本。对总共31份粪便样本进行了细菌16SrDNA测序(6R和24NR；19名患者≥3级irAE，12名患者<3级irAE)。在该队列中，在CICB开始后早期获得的一些样本被纳入作为替代基线样本，因为对从接受免疫检查点阻断单一疗法的患者采集的纵向样本的并行研究显示治疗开始后粪便微生物群没有显著变化(Gopalakrishnan等人,2018)。

人粪便DNA提取和细菌16S rDNA测序.人粪便样本的制备和测序与BaylorCollege of Medicine的Alkek Center for Metagenomics and Microbiome Research(CMMR)合作进行，使用改编自NIH-人类微生物组计划(Human Microbiome Project,2012a,b)的方法。之前已报道了分析管道的扩展细节(Gopalakrishnan等人,2018)。简言之，对使用MO BIO PowerSoil DNA分离试剂盒(MO BIO Laboratories，美国)提取的细菌基因组DNA进行16S rDNA V4区域的PCR扩增并使用MiSeq平台(Illumina,Inc,加利福尼亚州圣地亚哥)测序。通过open-reference OTU picking将具有>97％同一性的质量过滤序列聚类到称为操作分类单元(OTU)的箱中并参考NCBI 16S核糖体RNA序列数据库(发布日期2017年2月11日；ncbi-blast+包2.5.0)在种级别下分类。通过使用BLAST将代表性OTU序列与NCBI分类数据库(发布日期2017年2月16日)进行映射来获得系统发育信息。

小鼠微生物群表征.使用Mothur pipeline v.1.39.5分析原始FASTQ文件以在工作站DELL T7910(Round Rock，美国德克萨斯州)上进行质量检查和过滤(测序错误、嵌合体)。对原始读取结果(总共15512959个，每个样本平均125104个)进行过滤(总共6342281个，每个样本平均51147个)并聚类到操作分类单元(OTU)中，然后消除低群体OTU(直至5个读取结果)并使用标准化参数及SILVA rDNA数据库v.1.19以97％的成对同一性进行denovo OTU以便比对。考虑到RET和MCA样本，总共鉴定了427种细菌。用Mothur计算样本覆盖率，结果所有样本的平均覆盖率高于99％，因此意味着是后续分析的合适规范化程序。使用Python v.2.7.11对识别的OTU进行生物信息学和统计分析。每个OTU中最具代表性且最高丰度的读取结果(如前一步用Mothur v.1.39.5所证实)使用国家生物技术信息中心(NCBI)Blast软件(ncbi-blast-2.3.0)和2018年4月末访问的最新NCBI 16S微生物数据库(可在ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/在线找到)进行核苷酸比对(nucleotide Blast)。在每个分类级别(门、纲、目、科、属、种)下建立细菌相对丰度矩阵用于后续的多变量统计分析。

微生物群和OTU级别分析.使用SciKit-learn包v.0.4.1在OTU级别下计算α多样性(样本多样性内)的测量值，如观察到的otu和香农指数。β-多样性(样本多样性之间)的探索性分析使用由Mothur计算并在主坐标分析(PCoA)中表示的Bray-Curtis差异度量计算，而对于层次聚类分析(HCA)，使用自定义脚本(Python v.2.7.11)实施‘Bray-Curtis’度量和‘complete linkage’方法。为了比较微生物群分类群与基因表达数据集，使用自定义Python脚本进行多变量统计Spearman相关分析(和相关P值)。分别采用Mann-Whitney U和Kruskall-Wallis检验来评估成对或多重比较的显著性，p值≤0.05视为显著。

使用组间成对的Mann-Whitney检验计算患者样本内差异富集的分类群。效应大小以检验统计量与样本量平方根的比率估计。基于所有粪便样本中最少的读取结果数来设置计算α多样性的稀疏化限制。使用逆辛普森指数估计患者样本的分类学α多样性，计算公式为(pi为全部物种S中物种i所占的比例)(Morgan and Huttenhower,2012)，并估计如图中所指示的其他多样性度量指标。相似性分析(ANOSIM，其表示数据集质心的差异)或Pearson相关系数(当指出时)使用Python 2.7.11计算。

使用LEfSe对微生物生物标志物的统计评估.使用Kruskal-Wallis检验，使用LEfSe方法来根据反应(即：R与NR之间)和毒性的发生(即：≥3级irAE与<3级irAE的患者之间)比较所有细菌进化枝的丰度(统计显著性对于反应定义为p<0.05，对于毒性定义为p<0.1)(Segata等人,2011)。使用研究组之间具有差异丰度的细菌分类群作为线性判别分析(LDA)的输入来计算效应大小。用Mothur v.1.39.5对鼠分类群进行LEfSe分析。

E.量化和统计分析

1.统计分析

使用R软件(可在R-project.org/的线上网址找到)、Microsoft Excel(MicrosoftCo.,美国华盛顿州雷德蒙德436)或Prism 5(GraphPad,美国加利福尼亚州圣地亚哥)进行数据分析和呈现。使用R包“survival”(Therneau and Grambsch,2000)生成患者队列生存曲线。在低样本二分变量的情况下，使用未配对的Mann-Whitney U检验或Fisher精确检验进行患者队列基因组和免疫参数的组间比较，将p<0.05视为统计学上显著的。所有比较都是双侧的，除非强有力的先验假设保证了单侧方法(适当时指出)。排列检验通过随机排列样本标签达总共1000次迭代来进行。在鼠科研究中，使用ANOVA进行收集不止两个组的统计分析，然后用Bonferroni调整进行成对比较。否则，对于两个组，使用非配对t检验进行统计分析。使用Grubbs检验(可在graphpad.com/quickcalcs/Grubbs1.cfm的线上网址找到)测试给定分布内的异常值，阈值为p<0.05。所有肿瘤生长曲线均使用Guido Kroemer教授实验室开发的软件进行分析，有关统计分析的信息可在以下链接：kroemerlab.shinyapps.io/TumGrowth/的在线网址中找到。简言之，对于纵向分析，在统计检验之前对原始肿瘤测量值进行对数转换。当观察到肿瘤完全消退时，用最小值除以2来估算零值(zeros)。保留p<0.1的自动异常值检测，用于纵向分析和Kaplan Meier曲线。使用Cox回归估计生存曲线并使用Bonferroni调整考虑多重检验。p值是双侧的，置信区间为95％，当p<0.05时被认为是显著的。符号显著性：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

F.表格

表1，与图1相关：生物试样利用情况。

既往免疫疗法：IL-2、IFN、抗CTLA-4、抗PD-1(帕博利珠单抗、纳武单抗)。3级+irAE：3级或高于3级免疫相关的不良事件。治疗前/治疗后/早期：相对于CICB开始的试样采样时间点。BOR：根据RECIST v1.1的最佳总反应。

表2，与图1相关：患者特征。

表S3，与图1相关：临床结果

*R＝PR+CR的最佳总应答，NR＝PD的最佳总应答。百分数表示相对于每个应答组内的患者数目。

表4，与图5相关：微生物与应答的关联。

实施例2：转移性黑色素瘤中联合免疫检查点阻断的疗效和耐受性受肠道微生物组的影响

肠道微生物组越来越被认为是基于抗PD1的癌症免疫疗法的强大调节剂。令人信服的证据表明了应答者(R)与无应答者(NR)中的差异细菌富集和多样性，这是由对全身和抗肿瘤免疫浸润物的深远影响介导的。然而，这尚未在用联合免疫检查点阻断(CICB)治疗的背景下进行研究，CICB伴随优异的应答率，但潜在的致衰弱毒性有着更高的发生率。方法：本发明人召集了一组正接受CICB的转移性黑色素瘤患者(n＝54)。基于RECIST v1.1，将所有患者归类为R(n＝31，CR+PR)或NR(n＝23，SD+PD)，并根据NCI CTCAE 4.0标准归类为具有3级或高于3级(T；n＝29)或者低于3级(NT；n＝25)免疫相关的不良事件。基线粪便样本通过16S rRNA测序进行表征。对匹配的治疗前血液样本进行根据流式细胞术(n＝12)的外周免疫细胞群体与根据TCR测序(n＝12)的循环T细胞组库的相关性分析。结果：这些患者中的总体肠道微生物景观随拟杆菌目和梭菌目的高丰度而异。β-多样性距离的排序揭示了原发性肿瘤亚型(葡萄膜、黏膜、皮肤)缺乏聚类，这与无肿瘤组织学的显著影响一致。虽然基于多样性没有明显的表观应答或毒性关联，但了解到显著的组成差异。LEfSe(LDA>2,p<0.05)和成对Mann-Whitney检验的相对丰度的比较揭示了R中粪便拟杆菌(p＝0.03)和狄氏副拟杆菌(p＝0.04)的富集及NR中乳酸杆菌(p＝0.005)的富集。与先前的发现一致，梭菌目的中位相对丰度在R中(0.34)比在NR中(0.26)再次较高。另一方面，肠道拟杆菌(p＝0.01)和Anaerotignum lactatifermentans(p＝0.006)分别在T和NT中富集。重要的是，对循环免疫细胞亚群的相关性分析揭示了不同细菌富集的不同关联(包括总体CD8+T细胞丰度与R-分类群之间的正相关)和高或低T细胞组库熵的聚类效应。结论：这些发现建立在先前的工作之上并支持肠道微生物组与对检查点阻断疗法的治疗结果之间存在密切联系的观点。目前正在对匹配的人生物试样和临床前模型进行广泛的研究以进一步了解与免疫标志物的相互作用机制，并确立因果关系。总之，这些数据支持肠道微生物组作为预测工具和治疗目标的关键作用。

与单药疗法相比，抗CTLA-4和抗PD-1联合疗法在晚期黑色素瘤的治疗中提供了优异的应答率，然而，这种强化方案因严重irAE的高发生率而受到阻碍。图13至图19表明，虽然肠道多样性没有因应答或毒性而有大的差异，但在分类学富集方面存在显著差异，特别是R中的粪便拟杆菌和NR中的罗氏乳杆菌(也与PFS相关联)；以及具有3级(或更高irAE)的患者中的肠道拟杆菌和irAE低于3级的患者中的Anaerotignum lactatifermentans。相关分析揭示了在因应答和irAE而差异富集的分类群中与循环免疫细胞亚群的对比性关联。进一步的实验考虑了转移性黑色素瘤患者中治疗类型之间微生物组关联的整合、临床前鼠科模型中的机制研究以及宿主生活方式因素及其与微生物特征的关联的调查。

实施例3：外周免疫组库和肠道微生物组特征与针对CTLA-4和PD-1联合阻断的毒性关联

用靶向CTLA-4和PD-1的联合免疫检查点阻断(CICB)进行的治疗与在若干肿瘤类型中的临床获益关联，但免疫相关的不良事件(irAE)的发生率也高。需要深入了解生物标志物以及针对CICB的应答和毒性的机制。为了解决这个问题，本发明人分析了77名接受CICB治疗的晚期黑色素瘤患者的血液、肿瘤和肠道微生物组，任何≥3级irAE的发生率均高(49％)。针对CICB的应答的免疫和基因组生物标志物与针对抗CTLA-4和抗PD-1单一疗法鉴定出的那些相似。来自CICB的毒性与更多样化的T细胞组库和较少抗原刺激过的表型相关联。在患者肠道微生物群中鉴定出了针对CICB的毒性的新型微生物决定因素，如肠道拟杆菌，并在鼠科模型中进行了验证。总之，就治疗毒性的潜在生物标志物和机制而言，这些发现对于使用CICB的临床管理具有重要意义。

用CICB的治疗伴随高的客观应答率(Larkin,2015#1)，然而，相当大一部分患者会经历免疫相关的不良事件(irAE)(Hammers,2017#3；Sznol,2017#2)。有趣的是，临床应答率和irAE似乎是有联系的(Attia,2005#10)，尽管治疗毒性背后的不同机制尚不完全理解。目前缺乏针对CICB的应答的稳健生物标志物，很可能多达40％的接受CICB治疗的未选黑色素瘤患者预计会对单独的PD-1阻断产生应答，并因此可能潜在地避免与此方案相关联的严重irAE的风险增加(Robert,2015#4；Robert,2015#5；Larkin,2015#1)。

为了帮助解决这个问题，本发明人在接受CICB的77名患有晚期黑色素瘤(主要为皮肤型)的患者队列中研究了针对CICB的应答和毒性的生物标志物，无论是在临床试验中还是作为护理治疗标准(图14，扩展数据表1)。大多数患者患有IV期疾病(n＝65，84％)，并且未经历既往全身治疗(n＝57，74％)(扩展数据表1，图23)。在此队列中，任何级别irAE的发生率都很高(n＝72，93.5％)，近一半的患者(49％)经历了严重的(≥3级)irAE(扩展数据表2)，这与其他已出版系列(Sznol,2017#2；Wolchok,2013#9；Postow,2015#71；Larkin,2015#1；D'Angelo,2017#70)一致。

本发明人首先在可用的治疗前肿瘤样本中进行了全外显子组测序以评估总突变负荷(TMB)与针对CICB的应答的关联(n＝26，扩展数据表3)。总体上，发明人在针对CICB的应答者(R,n＝20)中比在无应答者(NR,n＝6)中观察到更高的TMB(图2A,p＝0.20)，这与先前研究的发现一致(Hellmann,2018#40；Hugo,2016#14；Snyder,2014#13；Van Allen,2015#6)。然而，应答者群体内似乎存在2个亚组；一个亚组TMB高，对于他们来说，抗PD-1单一疗法可能是足够的；而一个亚组具有较低的TMB，其与无应答者范围重叠，因此对于他们来说，突变负荷不是有用的应答预测因子。因此，存在可对CICB产生应答的低TMB的患者亚群，尽管这些患者应答的机制尚不清楚。该队列中突变景观的定性评估未揭示R与NR中常见黑色素瘤驱动因子IFN-γ-通路和抗原加工通路基因集中突变频率的显著差异(图8A)。类似地，在R与NR之间的新抗原负荷方面没有发现显著差异(图8C)，但这些分析的队列规模相对较小。

鉴于先前的发现表明高的拷贝数缺失负荷与对用靶向CTLA-4和PD-1的相继检查点阻断的治疗的抗性相关联(Roh,2017#22)，本发明人接下来评估了拷贝数缺失与针对CICB的应答之间的关联。在当前队列中，发明人观察到，与R相比，对CICB的NR具有显著更高的拷贝数缺失负荷(p＝0.04，图15A)。对CICB的抗性主要与影响染色体5、10和15的拷贝数缺失相关联(图8D-8E、2C)。先前牵涉在对免疫检查点阻断单一疗法的抗性中的若干基因似乎完全(CD74)或主要(PDIA3、B2M、PTEN)受NR肿瘤中拷贝数缺失的影响(图15B)，这表明了对CICB的抗性的潜在免疫基因组机制(Ekmekcioglu,2016#25；Peng,2016#23；Roh,2017#22；Tanese,2015#26；Zaretsky,2016#24)。

鉴于先前的研究凸显了CD8+T细胞的密度和分布在对ICB单一疗法的应答中的预后判断意义(Tumeh,2014#72；Peng,2016#23)，本发明人接下来评估了对CICB的R和NR的基线肿瘤活检中CD8+T细胞的密度。与NR相比，在R的肿瘤中观察到更高密度的CD8+T细胞(n＝19R，n＝6NR；p＝0.052，单侧，图2E)。发明人还经由TCR测序评估了对CICB的R和NR的基线肿瘤样本中的T细胞组库。尽管与应答的关联有限，但R中的T细胞组库熵较高(p＝0.058，图2F)，这表明了与ICB单一疗法相比可能的方案特异性差异(Roh,2017#22)。

在此之后，发明人试图找出针对CICB的毒性的推定生物标志物，因为严重的irAE特别常见，并且可能由于计划外的治疗中断而限制治疗(Carlino,2016#16)。为此，发明人首先经由基线和治疗时外周血淋巴细胞(PBL)的TCR测序来研究全身免疫参数之间的关联。在这些研究中，发明人在随后经历高级别irAE的患者中观察到显著较高的基线T细胞组库多样性(p＝0.028,n＝24；图15C(顶部))。这与先前发表的检查点阻断单一疗法报告一致(Oh,2017#11；Subudhi,2016#12)，并表明基线处的TCR多样性可帮助预测针对CICB的毒性，尽管这需要在另外的队列中检验。还观察到T细胞克隆从基线到治疗时的多克隆扩增，与具有<3级irAE的患者相比，对CICB经历3级或高于3级毒性的患者具有≥55个循环CD8+T细胞克隆的扩增(p＝0.22，图9A)，这与先前报道的在接受靶向CTLA-4的ICB单一疗法的前列腺癌患者中的发现一致(Subudhi,2016#12)。

接下来，发明人在基线处和治疗时经由多参数流式细胞术在具有3级或高于3级irAE的患者中分析PBL的表型。在这些研究中，发明人在早期治疗时间点(p＝0.0044,n＝14,图3A、9C)观察到其效应和中枢记忆CD8+T淋巴细胞更高的增殖指数，表明细胞毒性T细胞的加速扩增可能有助于免疫相关毒性。与TCR测序数据一起，这些结果表明，包含更大数目的潜在自身反应性克隆的更多样性的T细胞组库可能促成CICB后的irAE。

受这些发现的启发，本发明人随后评估了在具有高级别与低级别irAE的患者的PBL中CD28和CD27的表达，因为已知这些标志物会在抗原刺激过的T细胞中逐步下调，呈现独特的“老化”功能状态(Moro-Garcia,2012#73；Chen,2010#74)。在这些研究中，发明人观察到未发生严重irAE的患者的循环CD4+和CD8+效应T淋巴细胞上表面CD28和CD27显著较低的表达(CD4 Teff中的CD27,p＝0.0022；CD4 Teff中的CD28,p＝0.014；CD8 Teff中的CD27,p＝0.072；CD8 Teff中的CD28,p＝0.04；图3D、15D(底部)、图9D-9E)。值得注意的是，在用CICB治疗的黑色素瘤患者的第二队列中也观察到类似的表型趋势，该第二队列考察来自患者的治疗前外周血淋巴细胞样本，比较≥3级毒性与<3级毒性(图24A-24D)，其特征在于倾向于CD4/8T效应细胞亚群中CD27/28的降低表达。有趣的是，在队列中，这种表型在先前暴露于全身免疫疗法的患者中更频繁地观察到(比值比0.21，95％CI＝0.03-0.93，p＝0.028，Fisher精确检验)(图3D、3E、25)，并且在考虑所有的黑色素瘤亚型时，既往免疫疗法暴露与不发生高级别irAE之间的关联仍然显著(比值比0.27，95％CI＝0.06-1.02，p＝0.047，Fisher精确检验)。这些数据可能表明既往免疫疗法暴露会驱动这种表型的发生，但需要进一步的研究来验证和可能地利用这一发现。

在血液和肿瘤样本的分析之后，鉴于越来越多的关于肠道微生物群在对检查点阻断的应答中的作用的证据(Gopalakrishnan,2018#19；Matson,2018#20；Routy,2018#18)，本发明人接下来评估了肠道微生物组特征与针对CICB的应答和毒性的关联。重要的是，发明人评估了在人类患者中的分布型，并在临床前模型中进行了研究以进行对应答和/或毒性的推定微生物贡献者的跨物种验证。关注首先放在与应答相关联的候选分类群上，发明人使用16S rRNA基因测序分析了基线粪便微生物组样本(n＝54；扩展数据表3,图16A)。发明人首先通过使用LEfSE(图17A)和成对比较(图18A)进行的R与NR之间的组成差异研究来查询肠道微生物群与应答的关联。找出了若干差异富集的细菌分类群，包括R中的粪便拟杆菌、狄氏副拟杆菌和Fournierella massiliensis(根据Mann-Whitney检验，分别地，p＝0.03、p＝0.03、p＝0.005；图17A、18A)及NR中的产气克雷伯氏菌和罗氏乳杆菌(根据Mann-Whitney检验，分别地，p＝0.04、p＝0.009；图17A、18A)。与先前的发现一致，厚壁菌门目和梭菌目在应答者中往往较高(分别地，p＝0.39、p＝0.38；图26A-B)。与发明人在接受抗PD-1单一疗法的患者中的发现相反，本发明人在该队列中未观察到R与NR相比在α多样性方面有任何显著差异(图16B)，但不可否认的是样本量有限。

发明人接下来在用CICB治疗的临床前模型中分析与应答相关联的候选分类群(数据未示出)。在这些研究中，与对照和用抗PD-1单一疗法治疗的小鼠相比，在两种肿瘤模型中用CICB的治疗均与延长的应答和/或完全的肿瘤消退相关联(图27A)。有趣的是，用CICB的治疗与肠道微生物群随时间的变化相关联，其中α多样性增加(图27B)。

为了确定微生物组是否可预测针对CICB的应答，本发明人利用监督分析(偏最小二乘判别分析；PLS-DA)来探索T0时微生物组组成的不同，比较T2时的最终荷瘤小鼠与无瘤小鼠，并注意到两组之间的明显区别(图20A，p＝0.001)。使用PLS-DA衍生的变量重要性(VIP)评分(图20B)比较T0时每种细菌物种丰度对观察到的组分离的相对贡献，揭示了治疗前的狄氏副拟杆菌作为CICB应答的预测，这也在人类患者中观察到。重要的是，在T0、T2和T5时狄氏副拟杆菌的相对丰度与T5时的肿瘤大小呈负相关(图20C)，并且在最终无瘤的接受CICB的小鼠中在T0和T2时显著高频出现(图27D)。注意每个肿瘤模型中与应答相关联的其他分类群(扩展数据表4-5)。合在一起，这些数据确定了CICB与肠道共生微生物群之间的动态相互作用，在两种鼠肿瘤模型和人类患者之间在富集的分类群方面(如狄氏副拟杆菌)具有共性，这与有利的肿瘤应答正相关。

在评估肠道微生物群对应答的潜在影响之后，发明人接下来在患者队列中和在鼠科模型中查询了肠道微生物群与对治疗的毒性之间的关联。在患者队列中，发生≥3级irAE的患者与不发生≥3级irAE的患者的基线肠道微生物组样本中有若干个体细菌分类群的差异富集，包括肠道拟杆菌和Intestinibacter bartletti(根据Mann-Whitney检验，分别地，p＝0.009、p＝0.009；图17B、18B)。值得注意的是，通过LEfSe和成对比较，还找出了在未发生≥3级irAE的那些中富集的分类群，包括Anaerotignum lactatifermentans和长链多尔氏菌(分别地，p＝0.016和p＝0.06，图17B、18B)。

在人类队列中，发明人接下来在具有可用匹配基线样本的患者(n＝13)中评估了肠道中的候选分类群与外周免疫组库的表型之间的关系。在肠道拟杆菌和PD-1+T细胞群体的丰度之间观察到一致的正相关性，这与CICB开始后导致毒性的多种免疫特异性的潜在(重新)激活一致(图21)。有趣的是，与不发生≥3级irAE相关联的分类群，如长链多尔氏菌、Muricomes intestini和Anaerotignum lactatifermentans，与先前牵涉的表达CD27和CD28的CD4+和CD8+T细胞的丰度成反相关，提示了将这些分类群与观察到的临床结果联系起来的潜在免疫调节途径。在此队列中，发明人没有检测到微生物α多样性与≥3级irAE之间的任何关联(图16C)。

在评估人类队列中的肠道微生物群和毒性之后，发明人接下来评估了鼠科模型中肠道微生物群与毒性(结肠炎和回肠炎)之间的关系。尽管目前的模型在毒性评估方面存在局限性，因为鼠科模型很少表现出明显的结肠irAE，但本发明人仔细评估了与亚临床毒性关联的肠道上皮细胞和固有层的组织学异常(图28A-B)并将其与肠道中的候选分类群相比较。

本发明人首先评估了在与或不与广谱抗生素(ATB)共同施用的情况下施用CICB后的毒性。在这些研究中，用CICB的治疗与亚临床回肠毒性关联，该毒性通过用ATB对肠道灭菌而得到高度缓解(图22A)。值得注意的是，该回肠炎伴随着促炎细胞因子Il1b而非Tnf或Il6的转录的迅速的且选择性的上调，并仅在存在完整肠道微生物菌群的情况下(图22B-C)。受此发现的启发，发明人接下来查询了发生结肠炎的患者的人体组织并观察到结肠炎样本中IL1B表达与健康结肠对照相比显著的增加(数据未示出)。

由于患者队列中肠道拟杆菌与毒性显著关联(图17B)，故通过qPCR在CICB之前和之后从小鼠采集的粪便样本中评估了肠道拟杆菌的相对丰度。CICB诱导了肠道拟杆菌的显著增加(图22D)，但没有诱导其他拟杆菌属物种如单形拟杆菌或脆弱拟杆菌(图28E)。为了阐明在黑色素瘤中CICB期间肠道拟杆菌的作用，发明人用三种不同的肠道拟杆菌菌株给小鼠灌胃或允许在抗生素治疗后共生体的自发重新定植，发现肠道拟杆菌特异性地诱导回肠Il1b转录(图22E)并使回肠对CICB诱导的损伤敏感(图22F)。类似地，使用包含低或高的内源肠道拟杆菌水平(图28F-G)的健康人供体粪便对RET黑色素瘤小鼠模型进行FMT再现了如下发现，即肠道拟杆菌诱导的对CICB诱导损伤的回肠敏感性(图22G)与升高的Il1b表达相关联(图28H)。

综上，这些研究建立在免疫检查点单一疗法的先前发现的基础上以鉴定在CICB的情况下应答和irAE的新型生物标志物，独特的特征可应用于此。检查点阻断单一疗法的许多预测因子也可预测CICB应答和抗性(包括TMB、CD8+T细胞密度和拷贝数缺失负荷)，但队列规模可能不足并迫切需要额外的研究。尽管如此，在该队列中观察到了关于对治疗的毒性的有趣信号：在基线时表现出更多样化的TCR组库的患者发生高级别irAE的可能性更高。这表明循环淋巴细胞库的群体水平结构可能会影响激活肿瘤反应性(期望的)T细胞克隆和潜在的自身反应性(不期望的)T细胞克隆的相对可能性，并且如数据所表明，甚至可能会像数据显示的那样由既往治疗决定，但这也需要在额外/更大的队列中得到验证。此外，这些研究得到了对肠道微生物群内应答和毒性的潜在可改变决定因素的启发性见解。总之，这些研究的见解可为针对CICB的应答和毒性的生物标志物方面提供新的策略并为潜在地消除毒性提供新的治疗靶标。

A.方法细节

1.临床评估和生物试样

应答评估.每名患者由至少两名临床研究人员独立地进行临床应答注释(MCA、PAP、HT)。根据RECIST 1.1标准(Eisenhauer,2009#29)使用最佳总应答(BOR)来定义治疗应答，比较在标准疾病再评估时间点研究与基线(治疗前)研究中进行的再分期成像的肿瘤负荷。在整个治疗期间对纵向再分期扫描进行评价，直至开始后续治疗或最后一次已知的随访日期。成像方式尽可能匹配为有利于胸部、腹部和骨盆的造影剂增强CT，脑部的造影剂增强MRI或CT，以及颈部或四肢的成像，如由已知的疾病部位所指示。如果患者取得可归因于CICB的客观完全应答(CR；肿瘤负荷减少100％)或部分应答(PR；肿瘤负荷减少≥30％)，则将患者归类为“应答者”(R)。如果他们获得进展疾病(PD；疾病负荷增加≥20％)或疾病稳定(SD；不符合CR/PR/PD标准)的BOR，则将患者归类为无应答者(扩展数据表2)。如果小鼠的肿瘤在治疗期间消退或稳定，则将小鼠定义为应答者(R)，或当肿瘤在两次连续测量中大小增大时定义为无应答者(NR)。

毒性评估.根据NCI不良事件通用术语标准(CTCAE)4.0标准对免疫相关的不良事件(irAE)评分并根据至少两名独立临床研究人员的共识意见对CICB疗法的免疫相关关系(“可能的”、“很可能的”、“确定的”关联)进行划分(MCA、HT、WSC)。二元毒性分类基于患者是否经历了任何3级或更高级别的irAE与低于3级的irAE(扩展数据表2)。

生物试样采集.可用的治疗前和治疗时肿瘤和外周血样本通过查询机构研究生物试样单位来确定，必要时还可从诊断试样查询档案病理学单位来确定。肿瘤活检以穿孔、空芯针或切除性活检形式获得并保存为速冻(对于RNA/DNA提取)或福尔马林固定石蜡包埋(FFPE；对于免疫组织化学或DNA提取)试样。外周血样本经过密度梯度离心以分离外周血单核细胞(PBMC)，然后冷冻保存直至需要进行种系DNA提取或流式细胞术。根据赫尔辛基宣言按UT MD Anderson癌症中心机构审查委员会批准的协议检索、采集和分析生物试样。在门诊使用OMNIgene-GUT试剂盒(DNA Genotek Inc(加拿大渥太华))根据制造商的建议在治疗临床医师的详细解释和指导后获得粪便样本。稳定的粪便样本在采集后30天内亲自或通过邮件返回。患者水平的样本利用率为如扩展数据表3中所示。

2.基因组分析

全外显子组测序分析.全外显子组测序(WES)使用与先前描述的相同的协议(Roh,2017#22)进行。总共包括26个治疗前样本(19R、7NR)。在病理评估和确认肿瘤含量后，从肿瘤样本提取DNA。采集匹配的外周血白细胞作为种系DNA对照。剪切步骤的初始基因组DNA输入为750ng。使用KAPA Hyper Prep试剂盒(#KK8504)进行末端修复、碱基添加、使用分叉Illumina配对末端接头进行的接头连接和文库富集聚合酶链反应(PCR)，然后进行固相反向固定珠清理和成簇。按照制造商的说明进行文库构建。使用650-750ng的准备好的文库，用Agilent SureSelectXT Target Enrichment(#5190-8646)协议按照制造商的说明进行目标富集。使用Eppendorf Mastercycler EP Gradient仪器将富集的文库归一化为相等浓度，在Agilent Bravo B平台上合并为等摩尔量，并使用KAPA LibraryQuantification试剂盒(#KK4824)定量。将合并的文库调整至2nM，用0.2M NaOH变性，使用Illumina杂交缓冲液稀释，并按照制造商的说明使用HiSeq v3簇化学和Illumina Multiplexing测序引物试剂盒进行簇扩增。然后使用76bp双端读取在Illumina HiSeq 2000/2500v3系统上对库测序，并使用RTA v.1.13或更高版本进行分析。外显子组数据的平均覆盖率在肿瘤中为221×而在种系中为100×。然后使用Picard和GATK软件处理对齐的BAM(hg19)文件以识别重复、重新对齐和重新校准。使用MuTect(v1.1.4)鉴定体细胞点突变并使用Pindel(v0.2.4)鉴定小的插入/缺失。然后应用另外的调用后过滤器，包括：(a)肿瘤样本中的总读取计数>30，(b)匹配的正常样本中的总读取计数>10，(c)肿瘤样本中的VAF(变异等位基因频率)>0.05,(d)匹配的正常样本中的VAF<0.01，和(e)移除dbSNP129和千人基因组计划(1000GenomesProject)中报告的SNV。

拷贝数变化分析.如前所述进行拷贝数变化分析(Roh,2017#22)。基本上，将Sequenza(v2.1.2)算法应用于对齐的BAM数据以获得每个肿瘤样本的log2拷贝数比率(肿瘤/正常)。使用R包“CNTools”(v1.24.0)确定出基因水平下的拷贝数增加(log2拷贝比率>log21.5)和缺失(log2拷贝比率<-log21.5)。拷贝数增加或缺失的负荷定义为每个样本拷贝数增加或缺失的基因总数。为了定义复发性CNA，将R包“cghMCR”(v1.26.0)应用于计算的log2拷贝比率(肿瘤/正常)以识别复发性CNA的基因组区域(最小公共区域，MCR)。为了识别应答者与无应答者中优先缺失或增加的基因，在每个基因位置处进行Fisher精确检验，并由FDR调整后的p<0.05定义统计显著性。排除少于3个样本中具有CNA的基因。

新抗原预测.审查了来自WES的非同义外显子突变(NSEM)，使用包含NSEM的所有可能的8-至12-聚体肽进行新抗原预测并与野生型肽比较。使用PHLAT预测每个病例的HLA(Bai,2014#38)。结合亲和力通过NetMHCpan(v2.8)算法(Nielsen,2007#15；Hoof,2009#33)在考虑到患者HLA的情况下进行评价。预测的IC50<500nM的候选肽被认为是HLA结合的。

3.免疫分析

流式细胞术.通过MD Anderson免疫治疗平台的成员来分析从研究患者获得的外周血单核细胞(PBMC)。抽取治疗前和治疗后的血液样本进行PBMC的免疫表型分析。PBMC样本来自20名患者，包括10名≥3级irAE的患者和10名<3级irAE的患者。使用荧光偶联的单克隆抗体通过若干板进行PBMC的多参数流式细胞术分析：CD4 AF532(SK3,eBioscience)、CD3PerCP-Cy5.5(UCHT1,Biolegend)、CD8 AF700(RPA-T8,BD Biosciences)、CD127 BV711(HIL-7R-M21,BD Biosciences)、ICOS PE-Cy7(ISA-3,eBioscience)、PD-1BV650(EH12.1BD Biosciences)和FOXP3 PE-e610(PCH101；eBioscience)；CD3 PE-CF594、CD4 Pe-Cy5.5、CD8 AF532、CD45RA BV650(HI100,Biolegend)、CCR7 BV785(G043H7,Biolegend)、CD27PeCy5(0323,eBioscience)、CD28 APC-e780(CD28.2 eBioscience)、PD-1BV650(EH12.1 BDBiosciences)、EOMES e660(WD1928,eBioscience)和TBET BV605(4B10 Biolegend)。Live/Dead可固定黄色染色剂购自Thermo Fisher Scientific。使用LSR Fortessa(BDBiosciences)运行样本并使用FlowJo软件程序进行分析。在适宜的前向/侧向散射和活单细胞门控后，发明人确定了总CD3+T细胞、CD8+T细胞(CD3+CD8+)和CD4+T细胞(CD3+CD4+)的频率。在CD4中，有CD4+效应T细胞(CD4+FOXP3-)和CD4+调节性T细胞(CD4+FOXP3+CD127-/低)。在这些群体中评价了PD-1和ICOS表达。使用CD4和CD8 T细胞上的CD45RA和CCR7表达来定义初始、T中枢记忆(TCM)、T效应记忆(TEM)和效应T(Teff)亚群。在这些区室中的每一个中评价PD-1、CD28、CD27、EOMES和TBET表达。

免疫组织化学.从每个FFPE肿瘤样本获得苏木精和伊红(H&E)染色的载玻片以确认肿瘤的存在。用低浓度过氧化氢漂白黑色素对重着色样本进行预处理。选定的抗体组包括程序性死亡配体1(PD-L1)克隆E1L3N(1:100,Cell Signaling Technology)、PD-1克隆EPR4877(1:250,Epitomics)、CD3多克隆(1:100,DAKO)、CD4克隆4B12(1:80,LeicaBiosystems)、CD8克隆C8/144B(1:25,Thermo Scientific)、FOXP3克隆206D(1:50,BioLegend)和颗粒酶B克隆11F1(即用型,Leica Microsystems)。使用Leica Bond Max自动染色仪(Leica Biosystems,Buffalo Grove,IL)对有限抗体组进行IHC染色。使用LeicaBond Polymer Refine检测试剂盒(Leica Biosystems)进行IHC反应，并使用二氨基联苯胺(DAB)作为色原体。用苏木精复染。在所有下游IHC分析之前使用Aperio AT Turbo(LeicaBiosystems)扫描所有IHC载玻片。使用Aperio Image Toolbox分析软件(LeicaBiosystems)，从肿瘤区域内五个随机选择的1mm2区域中选择每个标准物的平均值如前所述进行数字分析(Chen,2016#27)。PD-L1表达通过H-score来评价，其评价阳性细胞百分数(0至100)和染色强度(0至3+)，总分在0至300的范围内。其余标志物以细胞密度打分。

4.鼠科模型

肿瘤激发和治疗.给小鼠侧腹皮下(s.c.)注射0.8×10⁶个MCA205或0.5×10⁶个RET细胞。当肿瘤达到20至30mm2时开始治疗。每三天一次给小鼠腹膜内(ip)注射抗PD-1mAb(250μg/小鼠；克隆RMP1-14，MCA205中6次注射，RET中5次注射)和/或抗CTLA-4mAb(100μg/小鼠，克隆9D9，MCA205和RET中均5次注射)，具有或不具有抗IL-1R(阿那白滞素，500μg/小鼠，每周三次i.p.注射)或相应的同种型对照，如附图中所示。用于体内的所有mAb均来自BioXcell(美国新罕布什尔州西黎巴嫩)，使用除阿那白滞素外的推荐的同种型对照mAb(Swedish Orphan Biovitrum，瑞典)。

粪便微生物群转移实验.在ATB处理3天后，使用来自PD-1抑制剂应答者或无应答者患者的样本进行粪便微生物群转移((FMT)。将冷冻的粪便样本解冻并彻底涡旋。让大颗粒材料在重力作用下沉降。通过口管饲喂以单剂施用200μL上清液。向每只动物的皮毛上涂施另外100μL。FMT两周后，用异氟烷麻醉BALB/c小鼠，向右肾的囊下空间中注射在30μL PBS中的1×10⁴个RENCA肿瘤细胞。然后用手术夹闭合皮肤切口。肿瘤接种后5天开始治疗。在有或没有口管饲喂来自未经历毒性的有应答患者的粪便样本的情况下用CICB治疗小鼠。在IVIS成像系统50系列(Analytic Jenap)上每周一次监测肿瘤生长。

用专门的共生物种进行肠道定植.将肠道拟杆菌CSURP836(由Instituthospitalo-universitaire Méditerranée Infection(法国马赛)提供；自人样本分离)、来自everImmune的肠道拟杆菌(自免疫疗法前肺癌患者的粪便分离)和肠道拟杆菌(自小鼠样本分离)在COS平板上在无氧条件下使用无氧发生器(Biomerieux)于37℃下培养24-72小时。使用分光光度计(Eppendorf)获得在600nm下测得光密度为1的10⁹CFU/mL的悬浮液。在抗体治疗前24小时施用并且与每次抗体治疗一起进行10⁹个CFU的100μL悬浮液的口管饲喂。使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱仪(Microflex LT分析仪，Bruker Daltonics，德国)验证细菌。

细胞因子定量.收集粪便样本并储存在-80℃下直至进一步处理。将样品解冻并重悬(以100mg/mL)于含有0.1％吐温20的PBS中。在室温下振荡孵育20分钟后，将样品以12,000rpm离心10分钟，收获上清液并储存在-20℃下直至分析。按照制造商的说明，使用小鼠脂质运载蛋白-2/NGAL DuoSet ELISA试剂盒(R&D Systems,Minneapolis,MN)测量脂质运载蛋白-2水平。

肠道组织毒性的组织学评估.评分系统由病理学家(P.O.)开发。回肠：对每个切片的炎症性病灶、黏膜下层的出现、绒毛的长度和固有层的厚度打分。评分定义为：0＝正常，1＝局灶性和轻微病变；2＝弥漫性和轻微病变；3＝弥漫性、轻微和主要病变；4＝具有仅含结缔组织的区域的主要病变。结肠：炎性浸润物，按生理(0)水平、低(1)水平、中等(2)水平和高(3)水平的定义打分。

通过实时定量PCR分析测定肠道免疫基因表达.使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)提取RNA并使用SuperScript III逆转录酶和RNaseOUT^TM重组核糖核酸酶抑制剂(LifeTechnologies)使用随机引物(Promega，美国威斯康星州)和PCR级脱氧核苷三磷酸组(Roche，瑞士巴塞尔)逆转录成cDNA。根据制造商的说明在7500快速实时PCR系统(AppliedBiosystems)上使用TaqMan方法用Gene Expression Assays和TaqmanUniversal Master Mix II(Invitrogen)通过实时定量PCR(RT-qPCR)来分析基因表达。通过2-ΔCt方法将表达归一化为β-2微球蛋白的管家基因的表达。使用了以下引物(均来自Gene Expression Assay,ThermoFisher)：B2m(Mm00437762_m1)、Il1b(Mm00434228_m1)、Il6(Mm00446190_m1)、Tnf(Mm00443258_m1)。

5.微生物组分析

患者粪便样本.使用OMNIgene GUT试剂盒(DNA Genotek,加拿大渥太华)采集基线粪便样本。对总共54个粪便样本进行了细菌16S rRNA基因测序，包括一个皮肤/未知原发性队列(29R，11NR；24例具有≥3级的irAE，16例具有<3级的irAE)和一个仅用于毒性分析的黏膜队列(3例具有≥3级的irAE，5例没有)及一个葡萄膜黑色素瘤队列(2例具有≥3级的irAE，4例没有)。在该队列中，在CICB开始后早期获得的一些样本被纳入作为替代基线样本，因为对从接受免疫检查点阻断单一疗法的患者采集的纵向样本的并行研究显示治疗开始后早期粪便微生物群没有显著变化(Gopalakrishnan,2018#19)。

人粪便DNA提取和细菌16S rRNA基因测序.人粪便样本的制备和测序与BaylorCollege of Medicine的Alkek Center for Metagenomics and Microbiome Research(CMMR)合作进行，使用改编自NIH-人类微生物组计划(Human Microbiome Project,2012#34；人类基因组计划,2012#35)的方法。之前已报道了分析管道的扩展细节(Gopalakrishnan,2018#19)。简言之，对使用MO BIO PowerSoil DNA分离试剂盒(MO BIOLaboratories，美国)提取的细菌基因组DNA进行16S rRNA基因V4区域的PCR扩增并使用MiSeq平台(Illumina,Inc,加利福尼亚州圣地亚哥)测序。通过open-reference OTUpicking将具有>97％同一性的质量过滤序列聚类到称为操作分类单元(OTU)的箱中并参考NCBI 16S核糖体RNA序列数据库(发布日期2017年2月11日；ncbi-blast+包2.5.0)在种级别下分类。通过使用BLAST将代表性OTU序列与NCBI分类数据库(发布日期2017年2月16日)进行映射来获得系统发育信息。

小鼠样本.从小鼠(n＝71)采集至少两个纵向粪便样本并储存在-80℃下直至DNA提取。

小鼠粪便DNA提取和微生物群表征.小鼠粪便样本的制备和测序在法国马赛的IHUMéditerranée Infection进行。简言之，使用两个方案提取DNA。第一个方案包括物理和化学裂解，分别使用玻璃粉和蛋白酶K，然后使用Macherey-Nagel DNA组织提取试剂盒(Duren，德国)(Dridi，2009#64)进行处理。第二个方案与第一个方案相同，但增加了糖蛋白裂解和去糖基化步骤(Angelakis,2016#65)。对所得DNA进行测序，如前所述靶向16S rRNA基因的V3-V4区域(Million,2016#63)。使用Mothur pipeline v.1.39.5分析原始FASTQ文件以在工作站DELL T7910(Round Rock，美国德克萨斯州)上进行质量检查和过滤(测序错误、嵌合体)。对原始读取结果(总共15512959个，每个样本平均125104个)进行过滤(总共6342281个，每个样本平均51147个)并聚类到操作分类单元(OTU)中，然后消除低群体OTU(直至5个读取结果)并使用标准化参数及SILVA rDNA数据库v.1.19以97％的成对同一性进行de novo OTU以便比对。考虑到RET和MCA样本，使用≥20％的患病率阈值总共鉴定了427种细菌。用Mothur计算样本覆盖率，结果所有样本的平均覆盖率高于99％，因此意味着是后续分析的合适规范化程序。使用Python v.2.7.11对识别的OTU进行生物信息学和统计分析。每个OTU中最具代表性且最高丰度的读取结果(如前一步用Mothur v.1.39.5所证实)使用国家生物技术信息中心(NCBI)Blast软件(ncbi-blast-2.3.0)和2019年4月末访问的最新NCBI 16S微生物数据库(可在ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/在线找到)进行核苷酸比对(nucleotide Blast)。在每个分类级别(门、纲、目、科、属、种)下建立细菌相对丰度矩阵用于后续的多变量统计分析。

通过qPCR对细菌定量.使用QIAamp DNA Stool Mini试剂盒(Qiagen)按照制造商的说明从粪便样本提取基因组DNA。使用TaqMan技术(针对靶向所有细菌结构域的系统)或针对不同拟杆菌物种的SYBR Green应用靶向qPCR系统。使用了以下引物和探针：

微生物群和OTU级别分析.对于小鼠实验，首先将原始数据归一化，然后使用Sci-Kit学习包v0.20.3中的QuantileTransformer和StandardScaler方法标准化。使用output_distribution＝'normal'选项进行归一化将每个变量转换为严格的高斯形状分布，而标准化导致每个归一化变量的均值为零，方差为一。归一化后的这两个标准化步骤将确保具有不同动态范围的变量的正确比较，如细菌相对丰度、肿瘤大小或结肠浸润物评分。

使用SciKit-learn包v.0.4.1在OTU级别下计算α多样性(样本多样性内)的测量值，如观察到的otu和香农指数。β-多样性(样本多样性之间)的探索性分析使用由Mothur计算并在主坐标分析(PCoA)中表示的Bray-Curtis差异度量计算，而对于层次聚类分析(HCA)，使用自定义脚本(Python v.2.7.11)实施‘Bray-Curtis’度量和‘completelinkage’方法。本发明人实施了偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和随后的作为监督分析的变量重要性图(VIP)以便在荷瘤和无瘤小鼠中以及在不同时间点(T0、T2、T5)之间鉴定最具判别力的细菌种。如2D中所描绘，条形厚度报告了两个队列间每个种的平均相对丰度的倍数比(FR)值，而不适用(N/A)是指与零相对丰度的组的比较。不存在的边界指示比较队列中的平均相对丰度为零。为了比较微生物群分类群与基因表达数据集或肿瘤大小和结肠毒性，使用自定义Python脚本进行多变量统计Spearman(或Pearson，对于小鼠数据)相关分析(和相关P值)。分别采用Mann-Whitney U和Kruskal-Wallis检验来评估成对或多重比较的显著性，p值<0.05视为显著。

使用Mann-Whitney检验然后用1000个排列的自举法来进行患者样本内鉴定出的分类群之间的相对丰度的成对比较。仅考虑以所有样本的至少40％存在的分类群。基于所有粪便样本中最少的读取结果数设置计算α多样性的稀疏化限制。使用逆辛普森指数估计患者样本的分类学α多样性，计算公式为(pi为全部物种S中物种i所占的比例)(Morgan,2012#36)，并估计如图中所指示的其他多样性度量指标。使用Spearman’srho估计候选分类群的相对丰度与外周免疫标志物之间的相关性。相似性分析(ANOSIM，其表示数据集质心的差异)或Pearson相关系数(当指出时)使用Python 2.7.11计算。

使用LEfSe对微生物生物标志物的统计评估.使用Kruskal-Wallis检验，使用LEfSe方法来根据应答(即：R与NR之间)和毒性的发生(即：≥3级irAE与<3级irAE的患者之间)比较所有细菌进化枝的丰度(统计显著性定义为p<0.05)(Segata,2011#21)。使用研究组之间具有差异丰度的细菌分类群作为线性判别分析(LDA)的输入来计算效应大小。用Mothur v1.39.5对鼠分类群进行LEfSe分析。

B.量化和统计分析

1.统计分析

使用R软件(可自万维网R-project.org/获得)、Microsoft Excel(MicrosoftCo.,美国华盛顿州雷德蒙德436)或Prism 5(GraphPad,美国加利福尼亚州圣地亚哥)进行数据分析和表示。使用R包“survival”(Therneau,2000#37)生成患者队列生存曲线。在低样本二分变量的情况下，使用未配对的Mann-Whitney U检验或Fisher精确检验进行患者队列基因组和免疫参数的组间比较，将p<0.05视为统计学上显著的。所有比较都是双侧的，除非强有力的先验假设保证了单侧方法(适当时指出)。排列检验通过随机排列样本标签达总共1000次迭代来进行。在鼠科研究中，使用ANOVA进行收集不止两个组的统计分析，然后用Bonferroni调整进行成对比较。否则，对于两个组，使用非配对t检验进行统计分析。使用Grubbs检验(在graphpad.com/quickcalcs/Grubbs1.cfm在线找到)测试给定分布内的异常值，阈值为p<0.05。所有肿瘤生长曲线均使用Guido Kroemer教授实验室开发的软件进行分析，有关统计分析的信息可在以下链接(https):kroemerlab.shinyapps.io/TumGrowth/(Enot,2018#66)在线找到。简言之，对于纵向分析，在统计检验之前对原始肿瘤测量值进行对数转换。当观察到肿瘤完全消退时，用最小值除以2来评估零值(zeros)。保留p<0.1的自动异常值检测，用于纵向分析和Kaplan Meier曲线。使用Cox回归估计生存曲线并使用Bonferroni调整考虑多重检验。p值是双侧的，置信区间为95％，当p<0.05时被认为是显著的。符号显著性：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

C.表格

扩展数据表1：患者特征。

扩展数据表2：临床结果

百分数表示相对于每个所指示的组内的患者数目。中位数中的舍入由非整数值表示。

*R＝PR+CR的最佳总应答，NR＝SD+PD的最佳总应答。

扩展数据表3：生物试样使用概述。

0＝试样不适用，1＝试样被采用。

扩展数据表4：微生物与无瘤小鼠的关联。

扩展数据表5：微生物与荷瘤小鼠的关联。

根据本公开，可在没有过度实验的情况下实现和执行本文公开和要求保护的所有方法。虽然本发明的组合物和方法已用优选实施方案进行了描述，但对于本领域技术人员来说显而易见的是，可对本文描述的方法和方法的步骤或方法的步骤的顺序加以改变而不偏离本发明的构思、精神和范围。更特别地，很明显，某些既化学相关又生理学相关的药剂可替代本文所述的药剂而同时获得相同或相似的结果。所有这样的对本领域技术人员来说显而易见的类似替代和修改都被认为在附随的权利要求书所限定的本发明的精神、范围和构思之内。

参考文献

以下参考文献，在一定程度上，它们提供了示例性程序或其他细来对本文阐述的内容进行补充，通过引用明确并入本文。

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