阅读说明：本技术 重组沙门氏菌vnp20009-m在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用 (Application of recombinant salmonella VNP20009-M in preparation of medicine for treating osteosarcoma ) 是由 赵子建 张馨丹 李芳红 赵正刚 李美蓉 萧耿苗 于 2019-10-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种基因工程菌VNP20009-M在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用,包括诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖和迁移,属于肿瘤生物学领域。本发明利用减毒沙门氏菌作为载体携带甲硫氨酸酶基因,目的是特异性地在骨肉瘤中消耗甲硫氨酸以抑制骨肉瘤生长。本发明所述的基因工程菌VNP20009-M,可以显著抑制肿瘤细胞的增殖,以及体内骨肉瘤增长,预示该基因工程菌VNP20009-M有望成为抗骨肉瘤增殖研究的重要靶点,为制备抗骨肉瘤增殖药物提供了基础,具有良好的开发应用前景,具有潜在的临床应用价值。上述的基因工程菌的给药方式优选为瘤内注射。(The invention relates to application of a genetically engineered bacterium VNP20009-M in preparation of a medicine for treating osteosarcoma, which comprises induction of apoptosis, inhibition of cell proliferation and migration, and belongs to the field of tumor biology. The present invention utilizes attenuated salmonella as a vector carrying a gene for methionine enzyme in order to specifically deplete methionine in osteosarcoma to inhibit the growth of osteosarcoma. The genetically engineered bacterium VNP20009-M can obviously inhibit the proliferation of tumor cells and the growth of osteosarcoma in vivo, indicates that the genetically engineered bacterium VNP20009-M is expected to become an important target for anti-osteosarcoma proliferation research, provides a foundation for preparing anti-osteosarcoma proliferation medicines, has good development and application prospects, and has potential clinical application values. The administration mode of the genetically engineered bacteria is preferably intratumoral injection.)

重组沙门氏菌VNP20009-M在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种基因工程菌VNP20009-M在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用，包括诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖和迁移，属于肿瘤生物学领域。

背景技术

骨肉瘤(OS)是最常见的恶性骨肿瘤之一，其发病率居原发性骨肿瘤的第一位，好发于0～24岁青少年，其次为老年人，其中青少年的发病率及发病年龄比较稳定，而老年人发病率及发病年龄变异较大。20世纪70年代之前，截肢手术是治疗OS最常见的方法，但用该方法治疗的OS患者的5年生存率一直未超过20％。随着外科手术技术的进步、新辅助化疗理念的提出、术后放化疗治疗水平的提高，传统截肢术逐渐被新辅助化疗联合保肢手术所取代，其生存率得到了明显的提高。但在近30年的研究中发现，OS患者经过新辅助化疗联合保肢手术治疗，5年生存率约为70％，并未显著变化。尽管增加了化疗时间，提高了化疗药物的剂量，或应用免疫治疗，患者病情改善仍局限。近年来OS的治疗新方法在不断出现，免疫治疗、TSC途径治疗、靶向治疗、基因治疗等新方法为治疗OS提供了新思路，但将其完全攻克仍需世界各国的科研工作者与临床医生的不断努力。因此，新型的治疗骨肉瘤的药物仍处于市场缺乏状态，开发新型的药物具有极为重要的现实意义。

沙门菌属是一群在人和动物肠道内寄生的革兰氏阴性、侵袭性细胞内兼性厌氧菌。VNP20009为msbB、purI基因缺失的减毒鼠伤寒沙门菌株，遗传稳定，对抗生素敏感。msbB基因为脂质酰化为内毒素所必需，其缺失使类脂质A末端不能酰化，降低了毒性；purI基因参与嘌呤代谢，其缺失使细菌的繁殖需要外源性腺嘌呤。VNP20009还降低了自身诱导机体产生的肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor，TNF)，从而降低炎性反应。因此，它的低致病性提高了用于临床治疗的安全性。VNP20009已被广泛用于癌症研究，它可作用多种小鼠实体瘤模型，包括黑色素瘤、肺癌、结肠癌、乳腺癌、肾癌。VNP20009作为肿瘤基因治疗载体的一个主要优点是它能够高度靶向聚集于肿瘤部位。研究人员在多种实体肿瘤的小鼠模型中发现，VNP20009在肿瘤内的数量较肝脏等主要器官内高200～l000倍。VNP20009能在肿瘤组织缺氧坏死区优先聚集并繁殖，相同时间内肿瘤组织内细菌的扩增代次显著高于正常组织，使得减毒沙门菌成为新型抗瘤制剂和肿瘤靶向治疗的载体成为可能。沙门菌导致肿瘤生长减慢可能机制包括：肿瘤生长所需要的营养物质为细菌所消耗，细菌所产生的酶，如天冬酰胺酶，可耗竭肿瘤生长必需氨基酸；细菌向胞外微环境分泌的局部毒素或者产生的肿瘤坏死因子α，都可影响肿瘤血管形成；此外，在细菌生长部位的非特异性炎症反应可潜在激活抗肿瘤T细胞。

肿瘤细胞为了维持其高增殖率，需要足够的营养，除糖之外，对甲硫氨酸(Methionine，Met)、谷胺酰氨、精氨酸等需要量尤其大。研究证实Met依赖性是绝大多数肿瘤细胞的共同特征，如乳腺癌、肺癌、结肠癌、肾癌、膀胱癌、黑色素瘤、神经胶质瘤等，而正常细胞不存在Met依赖性。一些体内体外实验相继证实，直接食用甲硫氨酸缺乏的膳食可以延缓肿瘤细胞的增殖。但是若膳食中Met长期缺乏或不足，将会引起机体营养不良、代谢障碍，还可因DNA长期处于低甲基化状态加剧癌变。那么，通过甲硫氨酸酶(L-methioninase)特异性地将Met分解，从而降低体内甲硫氨酸水平，则能更加有效地抑制肿瘤细胞生长或使之消退。动物实验已证明经腹膜内注射甲硫氨酸酶可以抑制裸鼠的吉田肉瘤和肺肿瘤的增长。临床试验选四个分别患有乳腺癌、肺癌、肾癌和淋巴瘤的患者每24h静脉注射一次甲硫氨酸酶，发现甲硫氨酸酶可以明显减少血浆中甲硫氨酸含量。但是，由于哺乳动物本身不表达甲硫氨酸酶，所以外源性给与的方式有一定的副作用，往往引起机体的免疫反应。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基因工程菌VNP20009-M在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用，具体表现为抑制其增殖和迁移，诱导骨肉瘤细胞凋亡。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：

基因工程菌VNP20009-M在制备抑制骨肉瘤增殖和迁移、诱导骨肉瘤细胞凋亡的药物中的应用在本发明的保护范围之内。

本发明利用体外肿瘤细胞培养以及构建体内裸鼠皮下荷瘤，通过细胞增殖实验，细胞迁移实验，瘤内注射观察肿瘤体积研究VNP20009-M对骨肉瘤细胞的病理生理学作用。实验证实：基因工程菌VNP20009-M与骨肉瘤细胞共培养能够显著诱导细胞凋亡；过表达甲硫氨酸酶能够显著抑制人源骨肉瘤细胞MNNG-HOS的增殖能力；明显调低MNNG-HOS，U2OS，SaoS-2的迁移能力；VNP20009-M治疗能显著抑制皮下荷瘤模型肿瘤增长。

本发明所述的基因工程菌VNP20009-M来自于发明专利减毒鼠伤寒沙门氏菌及其基因工程菌在制备治疗胰腺癌的药物上的应用，专利号为201310688936.3。

有益效果：本发明利用减毒沙门氏菌作为载体携带甲硫氨酸酶基因，目的是特异性地在骨肉瘤中消耗甲硫氨酸以抑制骨肉瘤生长。本发明所述的基因工程菌VNP20009-M，可以显著抑制肿瘤细胞的增殖，以及体内骨肉瘤增长，预示该基因工程菌VNP20009-M有望成为抗骨肉瘤增殖研究的重要靶点，为制备抗骨肉瘤增殖药物提供了基础，具有良好的开发应用前景，具有潜在的临床应用价值。上述的基因工程菌的给药方式优选为瘤内注射。

附图说明

图1是基因工程菌VNP20009-M、PBS对照组、细菌对照组分别与骨肉瘤细胞共培养后，诱导细胞凋亡的情况示意图。所有数据均用平均值±标准偏差表示。(n＝3)，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001and****P<0.0001均与溶剂对照组相比。

图2是U2OS、Saos-2、MNNG-HOS过表达甲硫氨酸酶之后，细胞迁移能力示意图。(n＝3)，*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001and****P<0.0001均与溶剂对照组B相比。

图3是过表达甲硫氨酸酶基因对骨肉瘤细胞的增殖抑制示意图(n＝3)，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001and****P<0.0001均与溶剂对照组B相比。

图4是基因工程菌VNP20009-M治疗后裸鼠皮下骨肉瘤种植瘤生长示意图。所有数据均用平均值±标准偏差表示。(n＝3)，*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001and****P<0.0001均与溶剂对照组相比。

具体实施方式

为让本领域的技术人员更加清晰直观的了解本发明，下面将结合附图，对本发明作进一步的说明。

实施例1

流式细胞术检测VNP20009-M对骨肉瘤细胞凋亡的诱导作用

1)取对数生长期的MNNG-HOS骨肉瘤细胞，以2*10⁵个/ml接种于6孔培养板，每孔2ml；

2)铺完板后，分别加入实验浓度菌，菌胞比为1:50，同时设PBS对照组，细菌对照组，将细胞继续培养4h；

3)4h后收获细胞，冷PBS洗涤2次，用1*BindingBuffer制备成1×10⁶个/mL的细胞悬液，取100μl于流式管中，按试剂盒说明书加入5μL 7AA-D和5μL PE染色，轻柔的涡旋细胞，室温避光孵育15min，再加400uL*BindingBuffer于管中，1h内进行流式细胞检测，FlowJoV10分析软件分析结果。

结果如图1所示：VNP20009-M能显著诱导MNNG-HOS骨肉瘤细胞凋亡。

实施例2

U2OS、Saos-2、MNNG-HOS过表达甲硫氨酸酶之后，细胞迁移能力检测。

1)取转染质粒后的细胞MNNG-HOS、U2OS、Saos-2制备单细胞悬液，按每孔2*10⁵个/200ul接种于transwell室上。共分为3组:完全对照组A，质粒转染对照组B，质粒转染组C；

2)中等含量的20％FBS在下腔中作为化学吸引剂。用棉签去除非侵入细胞。入侵细胞用结晶紫染色，并采集显微镜图像来定量入侵细胞。

结果如图2所示：骨肉瘤细胞的迁移能力显著性降低。CON为完全对照组，EGFP为质粒对照组，MEGL为携带甲硫氨酸酶基因的质粒组(实验组)。

实施例3

CCK8法检测过表达甲硫氨酸酶基因对骨肉瘤细胞增殖的影响。

1)取对数生长期的细胞MNNG-HOS制备单细胞悬液。按每孔2ml细胞悬液(含2×10⁵个细胞)接种于6孔板中，共分为3组:完全对照组A，质粒转染对照组B，质粒转染组C；

2)铺完板后，各组分别加入脂质体，脂质体与对照质粒混合液，脂质体与携带甲硫氨酸酶质粒混合液，将细胞继续培养24h；

3)取转染质粒后的细胞MNNG-HOS制备单细胞悬液，按每孔100ul细胞悬液(含2×10³个细胞)接种于96孔板中，共分为3大组:完全对照组A，质粒转染对照组B，质粒转染组C；每个大组里设置24h,48h,72h,96h检测孔，复孔为3个。

3)分别在24h,48h,72h,96h每孔加入10ulCCK-8溶液，避免产生气泡；

4)将细胞继续孵育1-2小时，将培养板取出，用酶标仪测定在450uM处的吸光度。

结果如图3所示：骨肉瘤细胞MNNG-HOS的增殖能力在各个时间点显著性降低。

实验例4

构建裸鼠皮下荷瘤模型，观察VNP20009-M对实体瘤的治疗作用。

1)取对数生长期的细胞MNNG-HOS制备单细胞悬液。用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养骨肉瘤细胞MNNG-HOS，以细胞数4.5×10⁶个皮下接种于裸鼠右侧腋下。每隔2～3天，观察小鼠状态，用游标卡尺测量肿瘤大小(体积＝0.52×长×宽²)。

2)实验动物分组与给药方案

待肿瘤体积达到60～80mm³时，将荷瘤裸鼠随机分为3组(n＝8)，采用瘤内注射方式给药一次，对照组注射同等体积PBS，连续测量小鼠的体重，观察其活动状态并定期通过游标卡尺测量小鼠肿瘤的大小，计算肿瘤体积，并绘制肿瘤的生长曲线。

(1)PBS组：瘤内给予同等体积的PBS，作为空白对照。

(2)药物对照组：瘤内给予10μl的2×106CFU/只的VNP20009，给药一次。

(3)VNP20009-M组：瘤内给予10μl的2×106CFU/只的SGN1，给药一次。

3)荷瘤鼠体重测定

每2～3天测量荷瘤鼠体重和进行记录。

结果如图4所示：肿瘤明显变小，VNP20009-M显著抑制皮下肿瘤生长。

以上研究结果表明，本发明所采用的基因工程菌VNP20009-M能抑制骨肉瘤细胞增殖及迁移；在体内抑制骨肉瘤生长；具有良好的抗肿瘤效果。

上述对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，对于本明做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。