一种石斛直播育苗方法
阅读说明：本技术 一种石斛直播育苗方法 (Dendrobium direct seeding seedling method ) 是由 向增旭 贾悦 王若彤 张子璇 赵家靖 廖月月 万应鸿 于 2021-09-02 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种石斛直播育苗方法,涉及人工育苗技术领域。本发明利用石斛原球茎直播育苗,省去了人工转接和培养基配制的步骤,大大节约了育苗成本；液体萌发培养基配方简单易得,减去植物激素的使用,减少对石斛种质稳定性的影响。本发明所述石斛原球茎直播育苗改变了传统的石斛组培快繁育苗方式,拓展了石斛栽培繁殖体系。本发明所述石斛原球茎直播育苗生长发育全过程,为石斛原球茎直播育苗提供参考。(The invention provides a direct seeding and seedling raising method for dendrobium, and relates to the technical field of artificial seedling raising. According to the invention, the dendrobium protocorm is used for direct seeding and seedling raising, so that the steps of manual transfer and culture medium preparation are omitted, and the seedling raising cost is greatly saved; the formula of the liquid germination culture medium is simple and easy to obtain, and the influence on the germplasm stability of the dendrobium is reduced by subtracting the use of plant hormones. The dendrobium protocorm direct seeding seedling method changes the traditional dendrobium tissue culture rapid propagation seedling method and expands the dendrobium cultivation propagation system. The whole process of direct seeding, seedling raising and growth development of the dendrobium protocorm provides a reference for direct seeding and seedling raising of the dendrobium protocorm.)
技术领域
本发明属于人工育苗技术领域，具体涉及一种石斛直播育苗方法。
背景技术
石斛(Dendrobium)为兰科石斛属多年生附生草本植物，以新鲜或干燥的茎段入药，具有滋阴清热、益胃生津的功效，是我国传统名贵中药材，被誉为中华“九大仙草”之首。现代药理研究表明，石斛碱、石斛多糖、芪类、氨基酸等是其发挥药理活性的物质基础，具有提高人体免疫力、抗肿瘤、抗衰老、降血糖等功效。
石斛由于种子细小，无胚乳，野生环境下只有与真菌共生的条件下才能萌发。目前，石斛的工厂化育苗主要采用组织培养快繁的方法，虽然石斛组培技术已经非常成熟，但组培过程中石斛种苗变异、品质衰退、组培过程繁琐、成本高等问题已让制约着石斛产业的发展，因此，研究石斛直播技术是十分必要的。大量研究表明，在自然环境条件下，石斛种子直播育苗只有在真菌共生的条件下才成功，但萌发率不高，且真菌的生长受环境条件的限制，不利于直播技术的普及。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种石斛直播育苗方法，改变传统的石斛组培快繁育苗方式，拓展石斛栽培繁殖体系，降低育苗成本，提高种苗质量。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种石斛直播育苗方法，包括以下步骤：(1)对成熟的石斛蒴果表面消毒后取出种子，置于原球茎萌发培养基中进行萌发培养，得原球茎；所述原球茎萌发培养基以N6培养基为基本培养基，还包括28～32g/L的蔗糖；
(2)取出所述原球茎后洗去表面营养液，于直播育苗基质上进行播种和直播育苗管理，得石斛直播苗；所述直播育苗基质包括椰糠、松树皮和花生壳。
优选的，步骤(1)所述表面消毒包括：用洗衣粉液清洗蒴果表面灰尘，在流水下冲洗30～40min；在无菌环境中用75％乙醇溶液消毒30～60s，无菌水冲洗3～4次，再用0.1％的升汞溶液消毒6～8min，用无菌水冲洗3～5次。
优选的，步骤(1)所述原球茎萌发培养基的制备方法，包括每600ml的去离子水中加入4.12g的N6培养基和28～32g蔗糖，溶解后定容至1000ml，调pH值为5.6～5.8。
优选的，在所述原球茎萌发培养基上进行种子的萌发培养，所述萌发培养的温度为24±1℃，湿度为80±5％，光照时间为14～16h/d，光照强度为2000～2500Lx。
优选的，所述萌发培养的时间为25～30d。
优选的，步骤(2)所述洗去表面营养液包括将所述原球茎捞出后，去离子水冲洗1～2h。
优选的，步骤(2)所述直播育苗基质的制备方法，包括：将椰糠、松树皮和花生壳分别在质量百分含量为0.5％的高锰酸钾水溶液中浸泡20min，用自来水清洗3～4次，沥干水分后121℃消毒20min，将消毒后的椰糠、消毒后的松树皮和消毒后的花生壳等体积混合。
优选的，步骤(2)所述直播育苗管理的温度为23～25℃，湿度为60～70％，光照强度为1500Lx，光照时间为10～12h/d。
优选的，步骤(2)所述直播育苗管理还包括在石斛原球茎长出2片真叶之后，每10天施用一次1/4霍格兰营养液。
有益效果：本发明提供了一种石斛直播育苗方法，石斛原球茎直播育苗，省去了人工转接和培养基配制的步骤，大大节约了育苗成本；液体萌发培养基配方简单易得，减去植物激素的使用，减少对石斛种质稳定性的影响。采用液体培养基使石斛种子发育成原球茎，不仅缩短了萌发时间，还解决了种子直播由于种胚发育不良而造成的萌发困难问题，提高石斛直播的成功率。石斛原球茎直播育苗改变了传统的石斛组培快繁育苗方式，拓展了石斛栽培繁殖体系。本发明所述石斛原球茎直播育苗生长发育全过程，为石斛原球茎直播育苗提供参考。
附图说明
图1为实施例1中石斛种子萌发培养20d时石斛原球茎的情况；
图2为实施例1中石斛种子萌发培养30d时石斛原球茎的情况；
图3为实施例1中用100目钢丝网捞出石斛原球茎的情况；
图4为实施例1中石斛原球茎直播育苗所用的育苗盘；
图5为实施例1中直播20d左右石斛原球茎萌动的生长情况；
图6为实施例1中直播40d左右石斛原球茎长出一片真叶的生长情况；
图7为实施例1中直播60d左右石斛原球茎长出两片真叶的生长情况；
图8为实施例1中直播90d左右石斛原球茎长至1cm左右的生长情况；
图9为实施例1中直播120d左右石斛原球茎长至3～5cm的生长情况。
具体实施方式
本发明提供了一种石斛直播育苗方法，包括以下步骤：(1)对成熟的石斛蒴果表面消毒后取出种子，置于原球茎萌发培养基中进行萌发培养，得原球茎；所述原球茎萌发培养基以N6培养基为基本培养基，还包括30g/L的蔗糖；
(2)取出所述原球茎后洗去表面营养液，于直播育苗基质上进行播种和直播育苗管理，得石斛直播苗；所述直播育苗基质包括椰糠、松树皮和花生壳。
本发明对成熟的石斛蒴果表面消毒后取出种子，置于原球茎萌发培养基中进行萌发培养，得原球茎；所述原球茎萌发培养基以N6培养基为基本培养基，还包括28～32g/L的蔗糖。
本发明优选果实饱满，无病虫害，无破裂的石斛成熟蒴果进行表面消毒，所述表面消毒优选包括：用洗衣粉液清洗蒴果表面灰尘，在流水下冲洗30～40min；在无菌环境中用75％乙醇溶液消毒30～60s，无菌水冲洗3～4次，再用0.1％的升汞溶液消毒6～8min，用无菌水冲洗3～5次。本发明优选利用超净工作台提供所述无菌环境，并在所述超净工作台上完成乙醇消毒、无菌水冲洗、升汞溶液消毒和无菌水冲洗的操作。本发明在所述无菌水冲洗3～5次后，优选用滤纸吸干表面水分。
本发明优选将经所述表面消毒后的蒴果放入无菌盘上用刀片将其剥开，将种子撒入原球茎萌发培养基，所述原球茎萌发培养基的制备方法，优选包括每600ml的去离子水中加入4.12g的N6培养基和28～32g蔗糖，溶解后定容至1000ml，调pH值为5.6～5.8，所述蔗糖的用量更优选为30g。本发明在所述原球茎萌发培养基上进行种子的萌发培养，所述萌发培养的温度优选为24±1℃，湿度优选为80±5％，光照时间优选为14～16h/d，光照强度优选为2000～2500Lx；且所述萌发培养的时间优选为25～30d。本发明在实施例中，优选每个培养瓶内倒入150～200mL所述原球茎萌发培养基，并向所述原球茎萌发培养基中撒入种子；在所述萌发培养的10～20天是种子萌发阶段，可以观察到石斛种子慢慢变为绿色、体积略有膨大的原球茎。液体萌发培养基配方简单易得，减去植物激素的使用，减少对石斛种质稳定性的影响。本发明所述原球茎萌发培养基为液体培养基，采用液体培养基使石斛种子发育成原球茎，不仅缩短了萌发时间，还解决了种子直播由于种胚发育不良而造成的萌发困难问题，提高石斛直播的成功率。
得原球茎后，本发明取出所述原球茎后洗去表面营养液，于直播育苗基质上进行播种和直播育苗管理，得石斛直播苗；所述直播育苗基质包括椰糠、松树皮和花生壳。
本发明优选利用100目钢丝网捞出液体培养基中的原球茎，去离子水冲洗1～2h，洗去表面营养液，避免其在自然环境下因营养丰富而染菌死亡，之后将清洗后的原球茎用去离子水稀释成原球茎液，浓度优选为25～35粒/1000μL，取35～45ml均匀地撒入直播育苗基质中。
本发明所述直播育苗基质的制备方法，优选包括：将椰糠、松树皮和花生壳分别在质量百分含量为0.5％的高锰酸钾水溶液中浸泡20min，用自来水清洗3～4次，沥干水分后置于121℃的高压蒸汽锅中消毒20min，杀死基质中的虫卵和微生物，尽量保证基质的干净，将消毒后的椰糠、消毒后的松树皮和消毒后的花生壳等体积混合，将其放入到育苗盘中，高度大约5～6cm。
本发明所述播种和直播育苗管理优选均在人工气候室中进行，人工气候室培养条件优选设置为：温度23～25℃，湿度60～70％，光源为LED灯，光照强度为1500Lx，光照时间10～12h/d，前期只补充水分，保持基质湿度在50％～60％在石斛原球茎长出2片真叶之后，每10天施用一次1/4霍格兰营养液200ml，中间补充浇水。
下面结合实施例对本发明提供的一种石斛直播育苗方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
石斛原球茎的准备：选取果实饱满，无病虫害，无破裂的石斛成熟蒴果，先用洗衣粉液清洗蒴果表面灰尘，再在流水下冲洗30min，在超净工作台上用75％乙醇消毒30s，无菌水冲洗3次，再用0.1％的升汞消毒7分钟后，用无菌水冲洗4次，滤纸吸干外表水分。将经过消毒处理的石斛蒴果放入无菌盘上用刀片将其剥开，将种子撒入原球茎萌发培养基中培养30天(图1和图2)，培养条件为：温度24±1℃，湿度80±5％，光照14h/d，光照强度2000Lx。
原球茎萌发液体培养基的配制：往600ml的去离子水中加入4.12g的N6基本培养基、30g的蔗糖，搅拌溶解，将体积添加至1000ml，调pH值为5.6～5.8即可。
表1不同培养时间原球茎的生长情况
培养时间
原球茎生长情况
10d
石斛种子有变绿迹象，培养基整体颜色为淡黄色
20d
大部分石斛种子变为绿色，培养基整体颜色为黄绿色
30d
原球茎体积稍微膨大，培养基整体颜色为绿色
40d
原球茎体积大，部分原球茎白化
原球茎直播育苗：将上述所得到的石斛原球茎，用100目钢丝网捞出(图3)，倒掉营养液后，用去离子水缓慢冲洗2h，洗去表面营养，之后将清洗后的原球茎撒入直播育苗基质中。
直播育苗基质的配制：将椰糠、松树皮和花生壳三种基质用0.5％高锰酸钾浸泡20min，用自来水清洗4遍，洗去高锰酸钾，沥干水分，将其置于121℃的高压蒸汽锅中消毒20min，杀死基质中的虫卵和微生物，尽量保证基质的干净，然后将基质等体积比例混合均匀，将其放入到育苗盘(图4)中，高度大约5～6cm。
直播育苗管理：整个育苗过程在人工气候室进行，人工气候室培养条件为温度25℃，湿度60％，光源为LED灯，光照强度为1500Lx，光照时间12h/d，前期只补充水分，保持基质湿度在50％～60％，在石斛原球茎长出2片真叶之后，每10天施用一次1/4霍格兰营养液200ml，中间补充浇水。
结果如图5～图9所示，石斛原球茎直播20d左右观察到有萌动的迹象，生长点突起，此时要控制浇水，避免由于基质过于湿润而导致杂菌滋生；40d左右可以观察到部分原球茎长出一片真叶，并且石斛原球茎与基质建立起附生关系，此时附生能力较弱，控制浇水，精心管理，避免水流等外力因素破坏附生关系；60d左右石斛原球茎长出两片真叶，少部分可以观察到原球茎的下段开始突起，有生根的迹象；90d左右石斛原球茎长至1cm左右的小苗，有3～4片小叶，根1-2条，根长0.3～0.8cm；120d左右石斛原球茎长至3～5cm的小苗，假鳞茎茎粗、叶面积变大、根3～5条，根长2.0～3.0cm。
对比例1：选取果实饱满，无病虫害，无破裂的石斛成熟蒴果，用刀片将其剥开，将种子直接撒入直播育苗基质中，育苗基质的配制和育苗管理如实施例1一样。结果为石斛种子无萌发迹象，直播失败。
对比例2：直播育苗基质的配制：将蛭石用0.5％高锰酸钾浸泡20min，用自来水清洗3～4遍，洗去高锰酸钾，沥干水分，将其置于121℃的高压蒸汽锅中消毒20min，杀死基质中的虫卵和微生物，尽量保证基质的干净，然后将蛭石放入到育苗盘中，高度大约5～6cm。
对比例3：直播育苗基质的配制：将椰糠用0.5％高锰酸钾浸泡20min，用自来水清洗3～4遍，洗去高锰酸钾，沥干水分，将其置于121℃的高压蒸汽锅中消毒20min，杀死基质中的虫卵和微生物，尽量保证基质的干净，然后将椰糠放入到育苗盘中，高度大约5～6cm。
对比例4：直播育苗基质的配制：将松树皮用0.5％高锰酸钾浸泡20min，用自来水清洗3～4遍，洗去高锰酸钾，沥干水分，将其置于121℃的高压蒸汽锅中消毒20min，杀死基质中的虫卵和微生物，尽量保证基质的干净，然后将松树皮放入到育苗盘中，高度大约5～6cm。
对比例5：直播育苗基质的配制：将花生壳用0.5％高锰酸钾浸泡20min，用自来水清洗3～4遍，洗去高锰酸钾，沥干水分，将其置于121℃的高压蒸汽锅中消毒20min，杀死基质中的虫卵和微生物，尽量保证基质的干净，然后将花生壳放入到育苗盘中，高度大约5～6cm。
对比例6：直播育苗基质的配制：将椰糠和花生壳用0.5％高锰酸钾浸泡20min，用自来水清洗3～4遍，洗去高锰酸钾，沥干水分，将其置于121℃的高压蒸汽锅中消毒20min，杀死基质中的虫卵和微生物，尽量保证基质的干净，然后将基质等体积比例混合均匀，将其放入到育苗盘中，高度大约5～6cm。
对比例7：直播育苗基质的配制：将椰糠和松树皮用0.5％高锰酸钾浸泡20min，用自来水清洗3～4遍，洗去高锰酸钾，沥干水分，将其置于121℃的高压蒸汽锅中消毒20min，杀死基质中的虫卵和微生物，尽量保证基质的干净，然后将基质等体积比例混合均匀，将其放入到育苗盘中，高度大约5～6cm。
对比例8：直播育苗基质的配制：将蛭石和松树皮用0.5％高锰酸钾浸泡20min，用自来水清洗3～4遍，洗去高锰酸钾，沥干水分，将其置于121℃的高压蒸汽锅中消毒20min，杀死基质中的虫卵和微生物，尽量保证基质的干净，然后将基质等体积比例混合均匀，将其放入到育苗盘中，高度大约5～6cm。
对比例9：直播育苗基质的配制：将蛭石、松树皮和花生壳用0.5％高锰酸钾浸泡20min，用自来水清洗3～4遍，洗去高锰酸钾，沥干水分，将其置于121℃的高压蒸汽锅中消毒20min，杀死基质中的虫卵和微生物，尽量保证基质的干净，然后将基质等体积比例混合均匀，将其放入到育苗盘中，高度大约5～6cm。
表2石斛原球茎在不同基质中的萌发情况
编号
基质组成
萌发情况
实施例1
椰糠+松树皮+花生壳
可以萌发出2片真叶，且数量较多
对比例2
蛭石
可以萌发出子叶，后期逐渐死亡
对比例3
椰糠
可以萌发出子叶，后期逐渐死亡
对比例4
松树皮
少部分可以分化出2片真叶，后期逐渐死亡
对比例5
花生壳
少部分可以分化出2片真叶，后期逐渐死亡
对比例6
椰糠+花生壳
可以萌发出2片真叶
对比例7
椰糠+松树皮
可以萌发出2片真叶
对比例8
蛭石+松树皮
可以萌发出2片真叶
对比例9
蛭石+松树皮+花生壳
可以萌发出2片真叶
表3不同基质中铁皮石斛苗的品质对比
苗高/cm
根数/条
平均根长/cm
成活率/％
实施例1
4.85±0.28a
4.33±0.58a
2.91±0.19a
41.6±1.5a
对比例6
2.63±0.91b
2.33±0.58b
1.36±0.07d
20.3±0.6c
对比例7
2.64±0.80b
2.68±0.57b
1.63±0.08c
18.3±1.5c
对比例8
2.40±0.12b
2.33±0.57b
1.45±0.08cd
19.0±1.0c
对比例9
4.26±0.45a
3.33±0.58ab
2.63±0.11b
37.0±1.0b
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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