一种呕吐毒素半抗原、人工抗原的合成方法及其应用
阅读说明：本技术 一种呕吐毒素半抗原、人工抗原的合成方法及其应用 (Synthetic method and application of vomitoxin hapten and artificial antigen ) 是由 周皓 张勋 柳家鹏 于 2021-06-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种呕吐毒素半抗原,该半抗原的分子结构如下所示：,本发明还公开了该半抗原、人工抗原和以此人工抗原制备抗体的方法,以及半抗原、抗体的用途。本发明制备的抗体特异性好、灵敏度高,与结构类似物交叉反应低。因此,本发明的抗原和制备的抗体可用于建立免疫学检测方法,从而用于快速检测食品中的呕吐毒素。(The invention discloses a vomitoxin hapten which has the following molecular structure: the invention also discloses the hapten, the artificial antigen, a method for preparing the antibody by using the artificial antigen, and application of the hapten and the antibody. The antibody prepared by the invention has good specificity and high sensitivity, and is similar to a structureThe cross reaction is low. Therefore, the antigen and the prepared antibody of the invention can be used for establishing an immunological detection method, thereby being used for quickly detecting vomitoxin in food.)
技术领域
本发明属于食品安全检测领域，具体涉及一种呕吐毒素半抗原、人工抗原的合成方法及其应用。
背景技术
呕吐毒素(vomitoxin)，又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON) ，主要由禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、粉红镰刀菌、雪腐镰刀菌等镰刀菌产生。另外，头孢菌属、漆班菌属、木霉属等的菌株都可产生该毒素。单端孢霉烯族毒素共有150多种，是一类强有力免疫抑制剂，所引起典型症状是采食量降低，所以这类毒素又叫饲料拒食毒素。呕吐毒素（DON）是其中最重要一种毒素，主要来自镰刀菌属（Fusarium），尤其是禾谷镰刀菌（Fusariumgraminearum）和黄色镰刀菌（Fusarium culmorum）。由于它可以引起猪的呕吐，故又名呕吐毒素（vomitoxin，VT）。由于它们具有很高的细胞毒素及免疫抑制性质，因此，对人类及动物的健康构成了威胁，特别是对免疫功能具有明显的影响。根据DON的剂量和暴露时间不同可引起免疫抑制或免疫刺激。当人摄入了被DON污染的食物后，会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血系统造成死亡。由于中国传统饮食习惯中粮谷比例大大高于西方，使得呕吐毒素的危害更为突出。1998年，在国际癌症研究机构公布的评价报告中，呕吐毒素被列为3类致癌物。欧盟要求呕吐毒素要小于1.0mg/kg；中国饲料要求低于1ppm。
目前对的检测方法多为仪器检测，如薄层色谱法、液相色谱法、液相色谱-质谱法、气相色谱-质谱法等。仪器检测法虽然具有较高的准确性，但是样品前处理繁琐、检测时间长、仪器贵重，从而限制了该方法的广泛应用。酶联免疫吸附测定技术Enzyme-LinkedImmunosorbent Assay(ELISA)，是将免疫技术与现代测试手段相结合而建立的一种超微量的测定方法，具有成本低、速度快、灵敏度高、仪器设备简单的特点，可以进行现场操作。适合大批量样品的快速分析。而免疫学检测方法的基础是高特异性、高亲和力的抗体的制备，而呕吐毒素作为小分子化合物，本身不具备免疫原性，因此，其半抗原的结构改造和全抗原合成是建立免疫速测技术的关键和难点之一。
发明内容
为了解决以上现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种呕吐毒素半抗原、人工抗原的合成方法及其应用。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种呕吐毒素半抗原，该半抗原的分子结构如下所示：
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进一步的，本发明所述呕吐毒素半抗原的制备方法，包括以下步骤：
（1）取5mL单口瓶，称取呕吐毒素标准品10mg、ZnCl2 2mg、γ-氨基丁酸5mg，加入二氯甲烷2mL，室温搅拌反应过夜；
（2）TLC检测反应完全后，加入5mL水，用5mL二氯甲烷萃取3次，无水硫酸钠干燥有机相后旋干有机相，即得到呕吐毒素半抗原。
一种呕吐毒素人工抗原，所述人工抗原由权利要求1所述的半抗原与载体蛋白偶联后制备而得。
进一步的，本发明所述呕吐毒素人工抗原的制备方法，包括以下步骤：
（1）取4mg权利要求1所述的半抗原、3.5 mg NHS、5 mg EDC溶于200μL DMF溶液中，反应2h；
（2）将20 mg载体蛋白溶于2mL的pH9.6缓冲溶液中，将步骤（1）的反应液滴加至载体蛋白溶液中，反应过夜，即得呕吐毒素人工抗原。
进一步的，本发明所述呕吐毒素人工抗原的制备方法，所述载体蛋白为BSA、OVA或KLH。
一种采用本发明所述的呕吐毒素人工抗原免疫小鼠制得的能与呕吐毒素发生特异性免疫反应的呕吐毒素抗体。
一种本发明所述的呕吐毒素抗体在检测食品中呕吐毒素残留量的应用。
有益效果：本发明提供了一种呕吐毒素半抗原、人工抗原的合成方法及其应用，使用该方法合成的半抗原制备的人工抗原，免疫小鼠后得到的单克隆抗体的检测限为1ng/mL。本发明制备的抗体特异性好、灵敏度高，与结构类似物交叉反应低。因此，本发明的抗原和制备的抗体可用于建立免疫学检测方法，从而用于快速检测食品中的呕吐毒素。
附图说明
图1 为呕吐毒素半抗原的合成路线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1 半抗原的合成与鉴定
所述呕吐毒素半抗原的制备方法，包括以下步骤：
（1）取5mL单口瓶，称取呕吐毒素标准品10mg、ZnCl2 2mg、γ-氨基丁酸5mg，加入二氯甲烷2mL，室温搅拌反应过夜；
（2）TLC检测反应完全后，加入5mL水，用5mL二氯甲烷萃取3次，无水硫酸钠干燥有机相后旋干有机相，即得到呕吐毒素半抗原。
合成路线如下所示：
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核磁共振鉴定结果：1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 6.62 (dq, J=5.9, 1.4Hz,1H), 5.31 (dt, J=11.2, 4.4Hz, 1H), 4.81 (s, 1H), 4.78 (s, 2H), 4.74 (d, J=5.9Hz, 1H), 3.99 (d, J=4.5Hz, 1H), 3.86 (d, J=11.5Hz, 1H), 3.77 (br, 1H),3.76 (d, J=11.5Hz, 1H), 3.22 (d, J=4.1Hz, 1H), 3.14 (d, J=4.1Hz, 1H), 2.80(dd, J=15.7, 4.3Hz, 1H), 2.5(m, 2H), 2.25 (m, 3H), 1.91 (br, 3H), 1.78 (m,2H), 1.71 (br, 1H), 1.17 (s, 3H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 201.3, 182.5,140.0, 136.9, 88.8, 86.0, 78.8, 71.0, 67.0 , 62.1, 50.4, 50.2, 49.9, 47.5,42.3, 35.9, 25.9, 18.0, 16.5. HRMS (ESI) Calcd for C19H30NO8+ (M+H)+400.1966, found: 400.1983.
实施例2 人工抗原的合成
1、免疫原的合成
（1）取4mg权利要求1所述的半抗原、3.5 mg NHS、5 mg EDC溶于200μL DMF溶液中，反应2h；
（2）将20 mg BSA溶于2mL的pH9.6缓冲溶液中，将步骤（1）的反应液滴加至载体蛋白溶液中，反应过夜，即得呕吐毒素人工抗原。
2、包被原的合成
（1）取4mg权利要求1所述的半抗原、3.5 mg NHS、5 mg EDC溶于200μL DMF溶液中，反应2h；
（2）将20 mg OVA溶于2mL的pH9.6缓冲溶液中，将步骤（1）的反应液滴加至载体蛋白溶液中，反应过夜，即得呕吐毒素人工抗原。
实施例3 单克隆抗体制备
一种呕吐毒素单克隆抗体，是将实施例2制备的免疫原免疫6～8周龄的BALB/c小鼠制备而得，用于检测食品中呕吐毒素的残留量。
（1）小鼠免疫：将完全抗原作为免疫原来免疫Balb/C雌性小鼠。使用无菌生理盐水将完全抗原稀释至1mg/mL，取适量稀释液，与等体积的快速免疫佐剂混合，振荡均匀后，按照10μg/只的剂量进行肌肉单点注射。三周后，按照同样的剂量和方式进行第二次免疫，并于免疫后七天对小鼠进行尾部采血并检测效价。
（2）细胞融合：将采集的小鼠尾血分离血清后，采用间接ELISA和间接竞争ELISA测定血清的效价和抑制。选择效价高、抑制好的小鼠进行细胞融合。小鼠在最后一次免疫后18天冲击免疫，三天后通过无菌操作去除脾脏，制备脾单细胞悬液，按照10:1的比例与对数期生长的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞进行混合。离心去除上清液体，将细胞振散后，通过聚乙二醇法进行细胞融合。
（3）亚克隆：融合后第3天和第5天，分别进行50％、90％HAT培养液换液，第7～9天进行细胞上清的筛选。挑选阳性的细胞上清，利用ELISA测定抑制情况，并选择抑制最好的细胞孔进行亚克隆。亚克隆采用有限稀释法，每孔0.5～2个细胞，重复三次亚克隆。第一次亚克隆使用HT培养液，后两次使用1640培养液，所有培养液中血清含量均为15％，最终得到所需的单克隆抗体细胞株。
（4）细胞冻存与复苏纯化：将得到的细胞株扩大培养后，冻存保种，其余细胞继续培养，通过体内腹水法制备单克隆抗体，采用辛酸硫酸铵法或蛋白G方法进行纯化。
实施例4 呕吐毒素单克隆抗体酶联免疫检测方法的构建
一、采用间接ELISA方法检测血清效价，具体操作步骤如下：
1、包被：将实施例2制备的包被原用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液从5μg/mL开始倍比稀释，100μL/孔，37°C反应2h。
2、洗涤：将板内溶液倾去，甩干，并用洗涤液洗涤3次，每次3min。
3、封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37°C反应2h，洗涤后烘干备用。
4、加样：将实施例3所得单抗从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔，37°C反应1h；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37°C反应1h。
5、显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37°C避光反应15min。
6、终止和测定：每孔加入100μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值。
二、最低检测限以及特异性的检测
具体操作步骤如下：
1、用上述的间接ELISA方阵滴定法确定包被原和抗体的工作浓度，以OD450值在1.5左右时所对应的抗原和抗体浓度为最适工作浓度。
2、包被：将包被原用包被缓冲液稀释至最适工作浓度，100μL/孔，37°C反应2h。
3、洗涤和封闭：方法操作同上述间接ELISA法。
4、配制呕吐毒素标准溶液：将呕吐毒素标准品用0.01mol/L，pH7.4的PBS溶液配制成1mg/mL的母液，然后，再用0.01mol/L、pH7.4的PBS溶液倍比稀释成系列浓度。
5、加样：每孔加入50μL倍比稀释的标准品，然后再加入50μL/孔最适稀释倍数的抗体，37°C反应1h。充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37°C反应1h。
6、显色反应：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37°C避光反应15min。
7、终止和测定：每孔加入100μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值。8、数据处理：以呕吐毒素各浓度的对数为横坐标，以对应的OD值为纵坐标，绘制标准曲线，计算半数抑制浓度（IC50，即OD450值从零标准溶液对应的数值下降到50%时所对应的标准品浓度），从而判定抗血清对呕吐毒素是否具有特异性。
抗体交叉反应的测定：
通过以上间接竞争ELISA测得呕吐毒素单克隆抗体的IC50及与其类似物（3-乙酰-脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰-脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇以及镰刀菌烯酮 X）的交叉反应率。
交叉反应率（%）=IC50（呕吐毒素）/IC50（类似物），实验设3次重复，结果取平均值。
结果显示，呕吐毒素单克隆抗体的检测限为1ng/mL，各类似物的交叉反应率均小于0.1%。
对比例1
一、使用琥珀酸酐法制备呕吐毒素半抗原：首先用丁基硼酸将7, 15位碳上的羟基连接起来（封闭），然后在3位碳上连接琥珀酸酐以引入羧基，最后将丁基硼酸除去，以实现羧基与载体蛋白的偶联。
（1）DON-BBA的制备：用5mL无水吡啶溶解10mgDON，称量25mg丁基硼酸加入到反应液中，将此混合物在室温下搅拌过夜，即得中间产物；
（2）BBA-DON-HS的制备：在搅拌条件下，向反应瓶中加入12mg的琥珀酸酐，然后将反应瓶密封，使之在100C的油浴中反应3 h，即得中间产物；
（3）3-HS-DON的制备：将吡啶在室温下氮吹干，加入1mL的双蒸水，然后将残余物3-HS-DON溶解于1mL乙酸乙酯中，超声波处理15 min后，1500 g离心3 min，取上清液。将沉淀物用乙酸乙酯溶解，重复上述操作，合并上清液，旋蒸得终产物即DON的半琥珀酸酯。
二、人工抗原的制备
使用与实施例2相同的方法制备人工免疫原和包被原。
三、单克隆抗体的制备
使用与实施例3相同的方法制备DON单克隆抗体。
四、最低检测限以及特异性的检测
使用与实施例4相同的方法构建酶联免疫检测方法，通过该方法测得的呕吐毒素单克隆抗体的检测限为10ng/mL，各类似物的交叉反应率小于0.1%。
综上所述，本发明所述人工抗原制备的单克隆抗体的检测限明显低于对比例1制得的抗体的检测限，从而说明本发明半抗原的合成方法比对比例1半抗原的合成方法具有更好的技术效果，本发明制得的抗体极大的提高了对DON检测的灵敏度，更有利于对实际样本的检测应用。