具体实施方式

I.命名法

本发明的靶向的IL-15/RαFc融合蛋白以几种不同形式列出。每个多肽被给予唯一的“XENP”编号，尽管如本领域将理解的，较长的序列可能含有较短的编号。一些分子具有三种多肽，因此具有组分的XENP编号被用作名称。因此，呈开瓶器形式的分子 XENP24116包含三个序列，通常称作“XENP24116_人IL15Rα(sushi结构域)_(GGGGS)₅_人IL15(N65D；单链)-Fc”、“XENP24116_51.1[CD8]_H1L1 Fab-Fc重链”和“XENP24116_51.1[CD8]_H1L1 Fab-Fc轻链”或等效物，但所述领域技术人员将能够通过序列比对容易地鉴别这些。这些XENP编号在序列表以及标识符中，并且在附图中使用。另外，一个包含三种组分的分子产生多个序列标识符。例如，Fab单体的列表具有全长序列、可变重链序列和可变重链序列的三个CDR；轻链具有全长序列、可变轻链序列和可变轻链序列的三个CDR；并且scFv-Fc结构域具有全长序列、scFv序列、可变轻链序列、3个轻链 CDR、scFv接头、可变重链序列和3个重链CDR；注意本文中具有scFv结构域的所有分子使用单个带电scFv接头(+H)，尽管可以使用其它接头。另外，特定可变结构域的术语命名法使用“Hx.xx_Ly.yy”类形式，其中编号作为特定可变链序列的唯一标识符。因此， XENP26229的Fab侧的可变结构域是“OKT8_H2.166_L1.103”，其表示重链可变结构域 H2.166与轻链结构域L1.103组合。在这些序列按scFv形式使用的情况下，名称“OKT8_H2.166_L1.103”表示重链可变结构域H2.166与轻链结构域L1.103组合，并且由N 末端到C末端呈vh-接头-vl定向。具有与重链和轻链可变结构域一致但呈相反顺序的序列的这种分子将命名为“OKT8_L1.103_H2.166”。类似地，不同构建体可能“混合和匹配”重链和轻链，如从序列表和图中将显而易见的。

II.定义

为了可以更全面地理解本申请，下面阐述几个定义。此类定义意在涵盖语法等同物。

本文中的“消融”意指结合和/或活性的降低或去除。因此，举例来说，“消融FcγR结合”意指初始结合比不含有特定变异的Fc区小50％的Fc区氨基酸变异，其中优选小于70-80-90-95-98％的结合损失，并且一般来说，结合低于在Biacore分析中可检测到的结合水平。在FcγR结合的消融中特别有用的是在图29所示的那些。然而，除非另外指出，否则本发明的Fc单体保持与FcRn的结合。

如本文所使用的，“ADCC”或“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”意指其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体并且随后引起靶细胞溶解的细胞介导反应。ADCC与结合FcγRIIIa相关；与FcγRIIIa结合增加引起ADCC活性增加。如本文所讨论的，本发明的许多实施方式完全消融ADCC活性。

通过如本文所用的“ADCP”或抗体依赖性细胞介导的吞噬作用意指细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体，并且随后引起靶细胞的吞噬作用。

本文中通过“抗原结合结构域”或“ABD”意指一组六个互补决定区(CDR)，当作为多肽序列的一部分存在时，其特异性结合如本文所论述的靶抗原。因此，“NKG2D 抗原结合结构域”结合本文概述的人NKG2D抗原。如本领域中已知，这些CDR通常作为可变重CDR(vhCDR或V_HCDR)的第一组和可变轻CDR(vlCDR或V_LCDR)的第二组存在，其各自包含三个CDR：重链的vhCDR1、vhCDR2、vhCDR3和轻链的vlCDR1、 vlCDR2和vlCDR3。CDR分别存在于重链可变结构域和轻链可变结构域中，并且一起形成 Fv区。因此，在一些情况下，抗原结合结构域的六个CDR由可变重链和可变轻链贡献。在“Fab”形式中，6个CDR的组由两个不同的多肽序列贡献，可变重链结构域(vh或V_H；含有vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3)和可变轻链结构域(vl或V_L；含有vlCDR1、vlCDR2 和vlCDR3)，其中vh结构域的C末端连接到重链CH1结构域的N末端，并且vl结构域的 C末端连接到轻链恒定结构域的N末端(并且因此形成轻链)。在scFv形式中，vh和v1结构域通常通过使用如本文所述的接头共价连接成单个多肽序列，其可以是(从N末端开始) vh-接头-vl或vl-接头-vh，前者通常是优选的(包括每侧的可选结构域接头，这取决于使用的形式(例如US 62/353,511的图1中的))。

本文中的“修饰”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失或对与蛋白质化学连接的部分的更改。例如，修饰可以是附接于蛋白质的改变的碳水化合物或PEG结构。本文中通过“氨基酸修饰”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。为清楚起见，除非另外说明，否则氨基酸修饰总是针对由DNA编码的氨基酸，例如具有DNA和 RNA中的密码子的20种氨基酸。

本文中通过“氨基酸取代”或“取代”意指用不同的氨基酸替换亲本多肽序列中特定位置的氨基酸。特别地，在一些实施方式中，取代是针对并非天然存在于特定位置、并非天然存在于生物体内或任何生物体内的氨基酸。例如，取代E272Y是指变体多肽，在这一情况下是指Fc变体，其中位置272处的谷氨酸用酪氨酸代替。为了清楚起见，已经过工程化以改变核酸编码序列但不改变起始氨基酸(例如将CGG(编码精氨酸)换成CGA (仍然编码精氨酸)来提高宿主生物体表达水平)的蛋白质不是“氨基酸取代”；也就是说，尽管创建了编码相同蛋白质的新基因，但是如果蛋白质在其起始的特定位置具有相同的氨基酸，那么它就不是氨基酸取代。

如本文所使用的，“氨基酸插入”或“插入”意指在亲本多肽序列中的特定位置处添加氨基酸序列。例如，-233E或233E表示在位置233之后和位置234之前插入谷氨酸。另外，-233ADE或A233ADE表示在位置233之后和位置234之前插入AlaAspGlu。

本文所用的“氨基酸缺失”或“缺失”是指去除亲本多肽序列中特定位置的氨基酸序列。例如，E233-或E233#，E233()或E233del表示在位置233处的谷氨酸的缺失。另外，EDA233-或EDA233#表示从位置233开始的序列GluAspAla的缺失。

如本文所用的“变异蛋白质”或“蛋白质变体”或“变体”意指凭借至少一个氨基酸修饰而不同于亲本蛋白质的蛋白质。蛋白质变体可以指蛋白质本身、包含蛋白质的组合物或编码其的氨基酸序列。优选地，蛋白质变体与亲本蛋白相比具有至少一个氨基酸修饰，例如，与亲本相比，约一个至约七十个氨基酸修饰，并且优选地约一个至约五个氨基酸修饰。如下文所描述的，在一些实施方式中，亲本多肽，例如，Fc亲本多肽，是人野生型序列，如来自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区。本文的蛋白变体序列将优选与亲本蛋白序列具有至少约80％的同一性，并且最优选至少约90％的同一性，更优选至少约95-98-99％的同一性。变异蛋白可以指代变异蛋白本身、包括蛋白变体的组合物或编码所述蛋白变体的 DNA序列。

因此，通过如本文所用的“Fc变体”或“变异Fc”意指包含Fc结构域中的氨基酸修饰的蛋白。本发明的Fc变体根据构成它们的氨基酸修饰来定义。因此，例如， N434S或434S是相对于亲本Fc多肽在位置434处具有取代丝氨酸的Fc变体，其中编号是根据EU索引。同样，M428L/N434S定义了相对于亲本Fc多肽具有取代M428L和N434S 的Fc变体。WT氨基酸的身份标识可以是非特定的，在此情况下前述变体称为428L/434S。应注意，提供取代的顺序是任意的，也就是说，例如，428L/434S是与M428L/N434S相同的 Fc变体等。关于本发明中所讨论的与抗体有关的所有位置，除非另外指出，否则氨基酸位置编号根据EU编号。EU编号或如Kabat或EU编号方案中的EU编号是指EU抗体的编号 (Edelman等人，1969、Proc Natl AcadSci USA 63:78-85，所述文献特此以引用方式整体并入)。修饰可以是添加、缺失或取代。取代可以包含天然存在的氨基酸，以及在一些情况下合成氨基酸。示例包括美国专利第6,586,207号；WO 98/48032；WO 03/073238；US2004- 0214988A1；WO 05/35727A2；WO 05/74524A2；J.W.Chin等人，(2002)，Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027；J.W.Chin和P.G.Schultz、(2002)， ChemBioChem 11:1135-1137；J.W.Chin等人，(2002)，PICAS United States of America 99:11020-11024；和L.Wang和P.G.Schultz，(2002)、Chem.1-10，所有所述文献以引用方式整体并入本文中。

如本文所用，本文的“蛋白”意指至少两个共价附接的氨基酸，包含蛋白、多肽、寡肽和肽。

如本文所用的“残基”意指蛋白质中的位置及其相关的氨基酸实体。举例来说，天冬酰胺297(也称为Asn297或N297)是人类抗体IgG1的位置297处的残基。

如本文所用的“Fab”或“Fab区”意指包含VH、CH1、VL和CL免疫球蛋白结构域的多肽。Fab可以单独指代该区域，或者在全长抗体、抗体片段或Fab融合蛋白的背景下指代该区域。

本文所用的“Fv”或“Fv片段”或“Fv区”是指包含单一抗体的VL和VH 结构域的多肽。如本领域技术人员所理解的，这些通常由两条链组成，或者可以组合(通常与本文所述的接头)以形成scFv。

本文中通过“单链Fv”或“scFv”意指通常使用如本文所讨论的scFv接头来共价附接至可变轻链结构域以形成scFv或scFv结构域的可变重链结构域。scFv结构域从N 末端至C末端可呈任一取向(vh-接头-vl或vl-接头-vh)。

如本文所用的“IgG亚类修饰”或“同种型修饰”意指将一种IgG同种型的一个氨基酸转化为不同的对齐的IgG同种型中的相应氨基酸的氨基酸修饰。例如，因为在EU 位置296处IgG1包含酪氨酸并且IgG2包含苯丙氨酸，所以IgG2中的F296Y取代被认为是IgG亚类修饰。

如本文所用的“非天然存在的修饰”意指不是同型的氨基酸修饰。例如，因为 IgG均不包含位置434处的丝氨酸，所以IgG1、IgG2、IgG3或IgG4(或其杂交体)中的取代434S被视为非天然存在的修饰。

如本文所用的“氨基酸”和“氨基酸实体”意指由DNA和RNA编码的20种天然存在的氨基酸之一。

如本文所用的“效应子功能”意指由抗体Fc区与Fc受体或配体相互作用产生的生物化学事件。效应子功能包括但不限于ADCC、ADCP和CDC。

如本文所用的“Fcγ受体”、"FcγR"或"FcgammaR"意指结合IgG抗体Fc区并由FcγR基因编码的蛋白家族的任何成员。在人中，这个家族包括但不限于FcγRI(CD64)，包括同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc；FcγRII(CD32)，包括同种型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)，和FcγRIIc；和FcγRIII(CD16)，包括同种型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1 和FcγRIIIb-NA2)(Jefferis等人，2002，免疫学快报(Immunol Lett)82:57-65，以引用方式整体并入本文中)，以及任何未发现的人FcγRs或FcγR同种型或同种异型。

如本文所用的“FcRn”或“新生Fc受体”意指结合IgG抗体Fc区且至少部分地由FcRn基因编码的蛋白。如本领域已知的，功能性FcRn蛋白包含两个多肽，通常称为重链和轻链。轻链是β-2微球蛋白且重链由FcRn基因编码。除非本文另有说明，否则FcRn 或FcRn蛋白是指FcRn重链与β-2-微球蛋白的复合物。多种FcRn变体可用于增加与FcRn 受体的结合，并且在一些情况下，可用于增加血清半衰期。通常，除非另有说明，否则本发明的Fc单体保持与FcRn受体的结合(并且如下所示，可包括氨基酸变体以增加与FcRn受体的结合)。

如本文所用的“亲本多肽”意指随后经过修饰以产生变体的起始多肽。亲本多肽可以是天然存在的多肽或者天然存在的多肽的变体或改造形式。亲本多肽可以指代多肽本身、包括所述亲本多肽的组合物或编码所述亲本多肽的氨基酸序列。

如本文所用的“Fc”或“Fc区”或“Fc结构域”是指包含抗体恒定区(不包括第一恒定区免疫球蛋白结构域(例如CH1))的多肽，并且在一些情况下是铰链的一部分。对于IgG来说，Fc结构域包含免疫球蛋白结构域CH2和CH3(Cγ2和Cγ3)以及位于 CH1(Cγ1)与CH2(Cγ2)之间的较低铰链区。虽然Fc区的边界可以变化，但是人类IgG重链 Fc区通常被界定成包括残基C226或P230到其羧基末端，其中编号是根据如Kabat中的EU 索引进行。因此，在IgG的下背景中，“CH”结构域如下：“CH1”是指根据如Kabat中的EU索引的位置118-215。“铰链”是指根据如Kabat中的EU索引的位置216-230。“CH2”根据如Kabat中的EU编号是指位置231-340，并且“CH3”根据如Kabat中的EU编号是指位置341-447。因此，“Fc结构域”包含-CH2-CH3结构域，和可选地铰链结构域(铰链- CH2-CH3)。在本文的实施方式中，当scFv或IL-15复合体附接至Fc结构域时，scFv构建体的C末端附接至Fc结构域的全部或部分铰链；例如，其通常附接至是铰链的开始的序列 EPKS。在一些实施方式中，如下文更充分描述的，对Fc区进行氨基酸修饰，例如以改变与一个或多个FcγR受体或与FcRn受体的结合，以及使得能够进行异二聚体形成和纯化，如本文所概述的。

本文中的“重链恒定区”意指抗体的CH1-铰链-CH2-CH3部分。

如本领域技术人员将理解的，重链恒定区结构域的确切编号和位置在不同编号系统间可能不同。根据EU和Kabat的重链恒定区编号的有用比较如下，参见Edelman等人，1969，美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)63:78-85和Kabat等人,1991,免疫学相关蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，贝塞斯达美国国家卫生研究院公共卫生服务部(United States Public Health Service,National Institutes of Health, Bethesda)，这些文献以引用方式整体并入本文中。

表1

本文中的“Fc融合蛋白”或“免疫粘附素”意指包含Fc区的蛋白质，通常与不同的蛋白质，如与IL-15和/或IL-15Rα(sushi)连接(任选地通过如本文所述的接头部分)，如本文所述的。在一些情况下，两种Fc融合蛋白可以形成同源二聚Fc融合蛋白或异二聚Fc 融合蛋白，后者是优选的。在一些情况下，异二聚Fc融合蛋白的一种单体包含单独的Fc结构域(例如，空Fc结构域)，并且另一种单体是Fc融合体，其包含变异Fc结构域和蛋白结构域，例如受体、配体或其它结合配偶体。

如本文所用的“位置”意指蛋白序列中的位置。位置可以顺序地编号，或根据确定的形式，例如用于抗体编号的EU索引来编号。

本文中在本发明的异二聚抗体的单体的下背景通过“链性(strandedness)”意指与“匹配”的两条DNA链相似，将异二聚化变体并入每种单体中以保留“匹配”以形成异二聚体的能力。例如，如果将一些pI变体改造为单体A(例如使pI更高)，则作为也可以利用的“电荷对”的空间变体不会干扰pI变体，例如将使pI更高的带电变体放在相同的“链”或“单体”上以保留两种功能。类似地，对于组中成对出现的“偏斜”变体，如下面更全面概述的，技术人员在决定并入一组配对的链或单体将进入哪一个时将考虑pI，使得也使用偏斜的pI将pI分离最大化。

如本文所用的“靶细胞”意指表达靶抗原的细胞，在这种情况下是人CD8、人NKG2A、或人NKG2D。

在本文中，在产生根据本发明的靶向的IL-15/Rα-Fc融合蛋白的上下文中，“宿主细胞”意指含有对靶向的IL-15/Rα-Fc融合蛋白的组分进行编码的外源性核酸并且能够在适合条件下表达靶向的IL-15/Rα-Fc融合蛋白的细胞。下文中讨论了适合的宿主细胞。

如本文所用的“可变区”意指免疫球蛋白的区域，其包含一个或多个基本上由分别构成κ、λ和重链免疫球蛋白基因座的Vκ、Vλ和/或VH基因中的任一种编码的Ig结构域。

“野生型或WT”在本文中意指在自然界中发现的氨基酸序列或核苷酸序列，包括等位基因变体。WT蛋白质具有未经有意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。

本发明的异二聚蛋白通常是分离的或重组的。当用于描述本文公开的各种多肽时，“分离的”意指多肽已经从表达其的细胞或细胞培养物中鉴定和分离和/或回收。通常，将通过至少一个纯化步骤制备分离的多肽。“分离的蛋白”是指基本上不含具有不同结合特异性的其它蛋白的蛋白。“重组的”意指使用重组核酸技术在外源宿主细胞中产生蛋白。

相对于蛋白序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在对齐序列和在需要时引入缺口以实现最大序列同一性百分比之后，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分，候选序列中与特定(亲本)序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以本领域的能力范围内的各种方式实现，例如使用可共开获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR) 软件实现。所属领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。一种特定的程序是在美国公开第20160244525号的第[0279]到[0280]段中概述的ALIGN-2程序，所述公开特此以引用方式并入。

本发明的氨基酸序列(“发明序列”)与亲本氨基酸序列之间的同一性的程度被计算为在两个序列的比对中精确匹配的数除以“发明序列”的长度或亲本序列的长度，以最短者为准。结果以同一性百分比表示。

在一些实施方式中，两个或更多个氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％或90％同一性。在一些实施方式中，两个或更多个氨基酸序列具有至少95％、97％、98％、99％或甚至100％同一性。

“特异性结合”或“特异性结合至”特定抗原或表位(在此情况下为人 NKG2D)，或对该特定抗原或表位“具有特异性”意指与非特异性相互作用可测量地不同的结合。可以例如通过相比对照分子的结合确定分子的结合来测量特异性结合，所述对照分子通常是不具有结合活性的类似结构的分子。例如，可通过与类似于靶标的对照分子竞争来确定特异性结合。

针对特定分子或表位的特异性结合可以例如通过抗原或表位的KD为至少约 10^{- 4}M、至少约10^-5M、至少约10^-6M、至少约10^-7M、至少约10^-8M、至少约10^-9M、替代地至少约10^-10M、至少约10^-11M、至少约10^-12M、或更大的抗原结合分子来展现。通常，特异性结合抗原的抗原结合分子的K_D是对照分子相对于抗原或表位大20倍、50倍、100倍、 500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍。

而且，特定抗原或表位的特异性结合可以例如通过抗体来展现，所述抗体具有的对抗原或表位的KA或Ka对于表位相对于对照要大至少20倍、50倍、100倍、500倍、 1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍，其中KA或Ka是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率。通常使用Biacore测试法测量结合亲和力。

“融合”或“共价连接”在本文中意指组分(例如，IL-15蛋白和Fc结构域) 通过肽键直接或经由本文概述的结构域接头连接。

在进一步描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定实施方式，并且因此当然可以变化。还应了解，本文中所使用的术语仅出于描述特定实施方式的目的，并且不希望具有限制性，原因是本发明的范围仅由所附权利要求书限定。

III.靶向IL-15/IL-15Rαx抗原结合结构域异二聚Fc融合蛋白

本文提供了靶向的IL-15/IL-15Rα异二聚融合蛋白，所述靶向的IL-15/IL-15Rα异二聚融合蛋白可以与抗原结合并且可以与共同γ链(γc；CD132)和IL-2受体β链(IL- 2Rβ；CD122)复合。所述异二聚融合蛋白可含有IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白和抗原结合结构域。IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白可包括共价附接至IL-15Rα的IL-15蛋白，以及Fc结构域。任选地，IL-15蛋白和IL-15Rα蛋白是非共价附接的。抗原结合结构域特异性结合至靶抗原，例如但不限于CD8、NKG2A和NKG2D。

A.Fc结构域

本发明的Fc结构域组分如本文所述，其通常包含偏斜变体和/或可选的pI变体和/或本文概述的消除变体。参见例如WO2017/218707以标题“IV异二聚体抗体(IVHeterodimeric Antibodies)”公开的内容，包括IV.A、IV.B、IV.C、IV.D、IV.E、IV.F、IV.G、IV.H和IV.I部分，其全部以引用方式明确地整体并入本文中。在本发明的异二聚蛋白中特别有用的是包含如本文概述的“偏斜变体”、“pI变体”、“消融变体”和FcRn变体的Fc 结构域。特别有用的Fc结构域是如图8A至图8D所示的那些。因此，可以使用来源于IgG1 的变异Fc结构域，以及具有S228P变异的IgG4变体。

Fc结构域可以来源于IgG Fc结构域，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc结构域，其中IgG1 Fc结构域在本发明中特别有用。以下描述了可用于IL-15/IL-15RαFc融合单体的Fc结构域和本发明的双特异性异二聚蛋白的检查点抗体片段。

因此，“Fc结构域”包括-CH2-CH3结构域和可选的铰链结构域，并且可以来自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，其中Fc结构域来源于IgG1。在本文的实施方式中，当 scFv附接至Fc结构域时，scFv构建体的C末端附接至Fc结构域的全部或部分铰链；例如，它通常附接至是铰链的开始的序列EPKS。在其它实施方式中，当蛋白片段，例如IL-15或 IL-15Rα附接至Fc结构域时，IL-15或IL-15Rα构建体的C末端附接至Fc结构域的CH1结构域。

在Fc结构域蛋白的本文概述的一些构建体和序列中，IL-15或IL-15Rα蛋白片段的C末端附接至结构域接头的N末端，结构域接头的C末端附接至恒定Fc结构域的N末端(N-IL-15或IL-15Rα蛋白片段-接头-Fc结构域-C)，尽管其可以转换(N-Fc结构域-接头 -IL-15或IL-15Rα蛋白片段-C)。在本文概述的其它构建体和序列中，任选地经由结构域接头将第一蛋白片段的C末端附接至第二蛋白片段的N末端，任选地经由结构域接头将第二蛋白片段的C末端附接至恒定Fc结构域的N末端。在本文概述的其它构建体和序列中，提供了未附接至第一蛋白片段或第二蛋白片段的恒定Fc结构域。异二聚Fc融合蛋白可含有两种或更多种本文所述的例示性单体Fc结构域蛋白。

在一些实施方式中，接头是“结构域接头”，其用于将如本文概述的任何两个结构域连接在一起，其中一些描绘于图6中。虽然可以使用任何合适的接头，但许多实施方式利用甘氨酸-丝氨酸聚合物，包括例如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:8)、(GGGGS)n (SEQ IDNO:9)和(GGGS)n(SEQ ID NO:10)，其中n是为至少一的整数(并且通常为1 到2到3到4到5)以及允许具有足够的长度和柔性的两个结构域重组连接的任何肽序列以允许每个结构域保留其生物学功能。在一些情况下，并且注意“链型”，如下所概述，接头是带电荷的结构域接头。因此，在一些实施方式中，本发明提供异二聚Fc融合蛋白，其依赖于使用两种不同的重链变体Fc序列，其将自组装以形成异二聚Fc结构域融合多肽。

在一个实施方式中，异二聚Fc融合蛋白含有至少两个恒定结构域，所述至少两个恒定结构域可以被工程化以产生异二聚体，如pI工程化。可以使用的其它Fc结构域包括含有一个或多个已经过pI工程化的本发明的CH1、CH2、CH3和铰链结构域的片段。特别地，图57A至图57K中所描绘的形式是异二聚Fc融合蛋白，意指所述蛋白质具有自组装成异二聚Fc结构域的两个相关联的Fc序列和至少一个蛋白片段(例如，1个、2个或更多个蛋白片段)。在一些情况下，第一蛋白片段连接至第一Fc序列，并且第二蛋白片段连接至第二Fc序列。在一些情况下，异二聚Fc融合蛋白含有第一蛋白片段，所述第一蛋白片段连接至第二蛋白片段，所述第二蛋白片段接至第一Fc序列；以及第二Fc序列，所述第二Fc 序列不连接至第一蛋白片段或第二蛋白片段。

本发明涉及用于提供允许与一个或多个结合配偶体、配体或受体结合的异二聚Fc融合蛋白的新颖构建体。异二聚Fc融合构建体基于抗体的重链的两个Fc结构域(例如，组装成“二聚体”的两个“单体”)的自组装性质。通过改变如下面更充分讨论的每种单体的氨基酸序列来制备异二聚Fc融合体。因此，本发明总体上涉及产生异二聚Fc融合蛋白，所述异二聚Fc融合蛋白可以以若干方式共同接合一个或多个结合配偶体或一个或多个配体或一个或多个受体，这依赖于恒定区中的在每个链上有所不同的促进异二聚体形成和/或允许相比于同源二聚体易于纯化异二聚体的氨基酸变体。

存在多种机制可以用于生成本发明的异二聚体。另外，如本领域技术人员将了解的，这些机制可以组合以确保高异二聚化。因此，导致异二聚体产生的氨基酸变体被称为“异二聚化变体”。如下所论述，异二聚化变体可包括空间变体(例如下文所述的“杵和臼”或“偏斜”变体和下文描述的“电荷对”变体)以及允许从异二聚体中纯化同源二聚体的“pI变体”。正如WO2014/145806(以全文引用方式并入本文中)中大体所述，并且如下文关于“异二聚化变体”的论述具体所述，适用的异二聚化机制包括“杵和臼”(“KIH”；本文中有时称为“偏斜”变体)(参见WO2014/145806中的论述)、如WO2014/145806中所述的“静电转向”或“电荷对”、如WO2014/145806中所述的pI变体，以及如 WO2014/145806和下文中所概述的一般其它Fc变体。

在本发明中，存在可以产生易于纯化异二聚体蛋白的几种基础机制；一种依赖于pI变体的使用，以便每种单体和后续每种二聚体物质具有不同pI，因此允许对A-A、A-B 和B-B二聚体蛋白进行等电纯化。可替代地，某些形式还允许基于尺寸进行分离。如下文中进一步概述的，还可能相比于同源二聚体“偏斜”异二聚体的形成。因此，空间异二聚化变体与pI或电荷对变体的组合特别用于本发明。

通常，特别用于本发明的实施方式依赖于包含偏斜变体的变体组，所述偏斜变体相比于同源二聚化形成鼓励异二聚化形成、与pI变体偶联，所述pI变体增加两个单体与每个二聚体物种之间的pI差。

另外，如下文更全面地概述的，取决于异二聚Fc融合蛋白的形式，pI变体可以包含在单体的恒定结构域和/或Fc结构域内或者可以使用结构域接头。也就是说，本发明还提供在一种或两种单体上的pI变体，和/或带电荷的结构域接头。另外，用于替代功能的额外氨基酸工程化也可赋予pI变化，例如Fc、FcRn和KO变体。

在使用pI作为分离机制以允许对异二聚体蛋白纯化的本发明中，可以将氨基酸变体引入一个或两个单体多肽中；即，一种单体(为了简单起见，本文中称为“单体A”) 的pI可以加以工程化以与单体B分离，或单体A和B两者都可以改变，其中单体A的pI增加，而单体B的pI降低。如所讨论的，任一个单体或两个单体的pI变化可以通过以下进行：去除或添加带电荷残基(例如，由带正电荷的氨基酸残基或带负电荷的氨基酸残基替代中性氨基酸，例如，谷氨酰胺到谷氨酸)、将带电荷残基从带正电或带负电改变为相反电荷(例如，天冬氨酸到赖氨酸)或将带电荷残基改变为中性残基(例如，电荷损失；赖氨酸到丝氨酸)。多种这些变体示出在附图中。

因此，本发明的这个实施方式提供了产生单体中的至少一个单体的充分pI变化，从而使得异二聚体可以与同源二聚体分离。如本领域技术人员将了解的并且如下文中进一步讨论的，这可以通过以下来完成：使用“野生型”重链恒定区和已经工程化以增大或减小其pI的变体区(wt A:B+或wt A:B-)或增大一个区并减小另一个区(A+:B-或A-:B+)。

因此，通常，本发明的一些实施方式的组分是恒定区中的氨基酸变体，所述氨基酸变体涉及通过将氨基酸取代(“pI变体”或“pI取代”)并入到单体中的一个或两个单体中来更改二聚体蛋白的单体中的至少一个单体(如果不是两个单体的话)的等电点(pI)。异二聚体与两个同源二聚体的分离可以在两个单体的pI相差少至0.1个pH单位时完成，0.2 个、0.3个、0.4个和0.5个或更多个pH单位可用于本发明。

如本领域技术人员将了解的，每一个或两个单体上要包含的用于得到良好分离的pI变体数量将部分地取决于组分的起始pI。换句话说，为了确定对哪个单体进行工程化或处于哪个“取向”(例如，更具阳性或更具阴性)，计算Fc结构域的序列，并且在一些情况下，计算与Fc结构域连接的一个或多个蛋白结构域，并据此做出决定。如本领域已知的，不同的Fc结构域和/或蛋白结构域将具有用于本发明中的不同起始pI。通常，如本文所概述的，pI被工程化以使各个单体的总pI差为至少约0.1log，如本文所概述的优选的是0.2 到0.5。

此外，如本领域技术人员将了解的并且如本文所概述的，在一些实施方式中，可以基于大小来使异二聚体与同源二聚体分离。如图所示，例如，若干种形式允许基于大小来分离异二聚体和同源二聚体。

在pI变体用于实现异二聚化的情况下，通过使用一个或多个Fc结构域的一个或多个恒定区，提供了用于设计和纯化异二聚体Fc融合蛋白的更模块化方法。因此，在一些实施方式中，异二聚化变体(包含偏斜和纯化异二聚化变体)必须被工程化。另外，在一些实施方式中，通过从不同的IgG同种型输入pI变体，由pI变体造成免疫原性的可能性显著降低，使得在未引入显著免疫原性的情况下改变pI。因此，要解决的另一个问题是阐明具有较高人序列含量的低pI恒定结构域，例如最小化或避免任何特定位置处的非人残基。

可能与这个pI工程化一起发生的负效应同样是血清半衰期延长和FcRn结合增加。换句话说，如USSN 13/194,904(以引用方式以其全文并入)所描述的，降低抗体恒定结构域(包含在抗体和Fc融合中找到的那些)的pI可能导致血清保留在体内更长时间。具有增加的血清半衰期的这些pI变体也促进了pI变化以进行纯化。

另外，应注意，异二聚化变体的pI变体给予了Fc融合蛋白的分析和质量控制过程另外的益处，因为在同源二聚体存在时消除、最小化和进行区分的能力是显著的。类似地，可靠地测试异二聚体Fc融合蛋白产生的再现性的能力是重要的。

1.异二聚化变体

本发明提供异二聚蛋白，包括呈多种形式的异二聚Fc融合蛋白，其利用异二聚变体以允许异二聚体形成和/或从同源二聚体纯化。异二聚融合构建体基于两个Fc结构域的自组装性质，例如，组装成“二聚体”的两个“单体”。

存在适合的多对异二聚化偏斜变体组。这些变体以成“对”的“组”出现。换句话说，所述对中的一组并入第一单体中并且所述对中的另一组并入第二单体中。应注意，这些组不一定表现为“臼包杵”型变体，其中一个单体上的残基与另一个单体上的残基之间存在一对一对应；也就是说，组中的这些对形成了两个单体之间的界面，促进了异二聚体形成且阻碍了同源二聚体形成，从而使在生物学条件下自发形成异二聚体的百分比超过90％，而非预期的50％(25％同源二聚体A/A:50％异二聚体A/B:25％同源二聚体B/B)。

2.空间变体

在一些实施方式中，通过添加空间变体可以辅助异二聚体的形成。也就是说，通过改变每条重链中的氨基酸，相比于形成具有相同Fc氨基酸序列的同源二聚体，不同的重链更可能缔合以形成异二聚结构。合适的空间变体包括在USSN 15/141,350的图29中，所有这些文献都以全文引用的方式并入本文中，以及图1A至图1E中。

一种机制在所属领域通常称为“杵和臼”，是指形成空间影响以利于异二聚体形成和不利于同源二聚体形成的氨基酸工程化，如在USSN 61/596,846,Ridgway等人， ProteinEngineering 9(7):617(1996)；Atwell等人，J.Mol.Biol.1997 270:26；美国专利第 8,216,805号中所述，所有这些都以全文引用方式并入本文中。附图标识了许多依赖于“杵和臼”的“单体A-单体B”对。另外，如Merchant等人，Nature Biotech.16:677(1998)中所述，这些“杵和臼”突变可以与二硫键组合以偏斜形成异二聚化。

一种用于产生异二聚抗体的另一种机制有时称为“静电转向”，如 Gunasekaran等人，J.Biol.Chem.285(25):19637(2010)中所述，所述文献以全文引用方式并入本文中。这在本文中有时被称作“电荷对”。在这个实施方式中，静电用于歪斜形成异二聚化。如所属领域的技术人员将了解，这些还可以影响pI且从而影响纯化，且因此在一些情况下还可以被视为pI变异体。然而，由于这些是为了强制发生异二聚化而产生并且不是作为纯化工具使用，因此其被分类为“空间变体”。这些包括但不限于与 D221R/P228R/K409R配对的D221E/P228E/L368E(例如这些是“单体对应组”)和与 C220R/E224R/P228R/K409R配对的C220E/P228E/368E。

其它单体A和单体B变体可以任选地和独立地以任何量与其它变体(例如本文中概述的pI变体或US 2012/0149876的图37中所示的其它空间变体，其所有以引用方式明确并入本文中)组合。

在一些实施方式中，本文所概述的空间变体可以任选且独立地与任何pI变体 (或其它变体，如Fc变体、FcRn变体等)并入到一个或两个单体中，并且可以独立且任选地包含在本发明的蛋白质中或并不包含在内。

合适的偏斜变体的列表在图1A至图1E中找到。在多个实施方式中，特别适用的是包括但不限于以下的组的对：S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K； L368E/K370S:S364K；T411E/K360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L； K370S:S364K/E357Q和T366S/L368A/Y407V:T366W(任选地包括二硫桥键、 T366S/L368A/Y407V/Y349C：T366W/S354C)。就命名法而言，对“S364K/E357Q:L368D/K370S”意指单体中的一者具有双变体组S364K/E357Q并且另一者具有双变体组L368D/K370S；如上文所提及，这些对的“链型”取决于起始pI。

3.用于异二聚体的pI(等电点)变体

一般来说，如所属领域的技术人员将了解，pI变体存在两种通用类别：提高蛋白质pI(碱性变化)的变体和降低蛋白质pI(酸性变化)的变体。如本文所描述的，可以使用这些变体的所有组合：一个单体可以属于野生型或是不显示出与野生型显著不同的pI的变体，并且另一个可以更具碱性或更具酸性。可替代地，可以改变每种单体，一种具有更强碱性且一种具有更强酸性。

pI变体的优选组合展示于USSN 15/141,350的图30中，所有这些文献都以全文引用的方式并入本文中。如本文所概述和图中所示，这些变化相对于IgG1展示，但所有同型可以这种方式改变，以及同型杂合体。在重链恒定结构域来自IgG2-4的情况下，也可以使用R133E和R133Q。

在一个实施方式中，如果Fc单体中的一个Fc单体包括CH1结构域，则pI变体的优选组合具有包含208D/295E/384D/418E/421D变异(当相对于人IgG1时为 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D)的一种单体。在一些情况下，第二单体包括带正电的结构域接头，包含(GKPGS)₄(SEQ ID NO:31)。在一些情况下，第一单体包括CH1结构域，包括位置208。因此，在不包含CH1结构域的构建体中(例如对于在其中一个结构域上不利用CH1结构域的异二聚Fc融合蛋白，例如以双scFv形式)，优选的负pI变体Fc组包括 295E/384D/418E/421D变异(当相对于人IgG1时，Q295E/N384D/Q418E/N421D)。

在一些实施方式中，突变在Fc多臂的铰链结构域中进行，包括221位、222位、 223位、224位、225位、233位、234位、235位和236位。应当注意，可以进行233至236 的改变以增加IgG2骨架中的效应子功能(以及327A)。因此，pI突变和特别是取代可以在221位至225位中的一个或多个中进行，其中1、2、3、4或5个突变可用于本发明。同样，单独或与其它结构域中的其它pI变体一起考虑所有可能的组合。

可用于降低铰链结构域的pI的具体取代包括但不限于221位处的缺失、222位处的非天然缬氨酸或苏氨酸、223位处的缺失、224位处的非天然谷氨酸、225位处的缺失、 235位处的缺失，以及236位处的缺失或非天然丙氨酸。在一些情况下，仅在铰链结构域中进行pI取代，并且在其它情况下，这些取代以任何组合添加至其它结构域中的其它pI变体。

在一些实施方式中，可以在CH2区域中进行突变，包括274位、296位、300 位、309位、320位、322位、326位、327位、334位和339位。同样，可以对这10个位置进行所有可能的组合；例如，pI抗体可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个CH2 pI取代。

可用于降低CH2结构域的pI的特定取代包括但不限于274位的非天然谷氨酰胺或谷氨酸、296位的非天然苯丙氨酸、300位的非天然苯丙氨酸、309位的非天然缬氨酸、 320位的非天然谷氨酸、322位的非天然谷氨酸、326位的非天然谷氨酸、327位的非天然甘氨酸、334位的非天然谷氨酸、339位的非天然苏氨酸，以及CH2和其它结构域内的所有可能组合。

在这个实施方式中，突变可以独立地和任选地选自355位、359位、362位、 384位、389位、392位、397位、418位、419位、444位和447位。可用于降低CH3结构域的pI的特定取代包括但不限于355位处的非天然谷氨酰胺或谷氨酸、384位处的非天然丝氨酸、392位处的非天然天冬酰胺或谷氨酸、397位处的非天然蛋氨酸、419位处的非天然谷氨酸、359位处的非天然谷氨酸、362位处的非天然谷氨酸、389位处的非天然谷氨酸、418 位处的非天然谷氨酸、444位处的非天然谷氨酸，以及447位处的缺失或非天然天冬氨酸。图2中提供pI变体的例示性实施方式。

4.同种型变体

另外，本发明的许多实施方式依赖于将来自一种IgG同种型的特定位置的pI 氨基酸“引进”另一种IgG同种型中，从而减少或排除变体中引入非所需免疫原性的可能性。许多这些示出在美国公开申请第2014/0370013号的图21中，该美国公开申请以引用方式并入本文中。也就是说，出于多种原因，包括高效应子功能，IgG1是治疗性抗体的常见同种型。然而，IgG1的重链恒定区具有比IgG2的重链恒定区更高的pI(8.10相对于7.31)。通过将特定位置的IgG2残基引入IgG1骨架中，使得所得单体的pI降低(或提高)且另外展现出较长的血清半衰期。例如，IgG1在137位具有甘氨酸(pI 5.97)，IgG2具有谷氨酸(pI 3.22)；输入谷氨酸会影响所得蛋白的pI。如下所述，通常需要许多氨基酸取代来显著影响变异抗体的pI。然而，应该注意，如下所述，即使IgG2分子的变化也允许延长血清半衰期。

在其它实施方式中，进行非同种型氨基酸变化，以减少所得蛋白的总电荷状态(例如通过将更高的pI氨基酸变为更低的pI氨基酸)，或允许在结构中调节稳定性等等，如下文进一步描述。

另外，通过pI工程化重恒定结构域和轻恒定结构域两者，可以看到异二聚体的每个单体的显著变化。如本文所论述，使两种单体的pI相差至少0.5可以允许通过离子交换色谱或等电点聚焦或对等电点敏感的其它方法来实现分离。

5.计算pI

每种单体的pI可以取决于变体重链恒定结构域的pI和总单体的pI，总单体包括变体重链恒定结构域和融合配偶体。因此，在一些实施方式中，使用US2014/0370013的图19中的图表，基于变体重链恒定结构域计算pI变化。如本文所讨论，要工程化哪个单体通常由每种单体的固有pI决定。

6.用于额外功能的额外Fc变体

除pI氨基酸变体之外，可以出于多种原因，包括但不限于改变与一种或多种 FcγR受体的结合、改变与FcRn受体的结合等，而制造多个有用的Fc氨基酸修饰。

相应地，本发明的蛋白可以包括氨基酸修饰，包括本文所概述的异二聚化变体，其包括pI变体和空间变体。每组变体可以独立地并且任选地包括任何特定的异二聚体蛋白或排除任何特定的异二聚体蛋白。

7.FcγR变体

因此，可以制造多个有用的Fc取代来改变与一种或多种FcγR受体的结合。导致结合增加以及结合减少的取代可能是有用的。例如，已知与FcγRIIIa的结合增加引起ADCC增加(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上所结合的抗体且随后造成靶细胞溶解)。类似地，在一些情况下，与FcγRIIb(一种抑制性受体)的结合减少也可能是有利的。可以用于本发明中的氨基酸取代包括USSN 11/124,620(特别是图41)、USSN 11/174,287、USSN 11/396,495、USSN 11/538,406中列出的那些，其均明确地以引用方式整体并入本文中并且特别是针对其中公开的变体。可以使用的特定变体包括但不限于236A、239D、239E、332E、332D、239D/332E、 267D、267E、328F、267E/328F、236A/332E、239D/332E/330Y、239D、332E/330L、243A、 243L、264A、264V和299T。

另外，增加对FcγRIIc的亲和力的氨基酸取代也可包括在本文概述的Fc结构域变体中。例如，USSN 11/124,620和USSN 14/578,305中描述的取代是有用的。

另外，如USSN 12/341,769中具体公开的，存在可用于增加与FcRn受体的结合和延长血清半衰期的另外Fc取代，该专利在此以引用方式整体并入本文中，所述另外Fc 取代包括但不限于434S、434A、428L、308F、259I、428L/434S、259I/308F、436I/428L、 436I或V/434S、436V/428L和259I/308F/428L。

8.消融变体

类似地，另一类功能变体包括“FcγR消融变体”或“Fc敲出(FcKO或KO)”变体。在这些实施方式中，对于一些治疗应用，期望减少或去除Fc结构域与一种或多种或所有Fcγ受体(例如FcγR1、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa等)的正常结合，以避免另外的作用机制。也就是说，例如，在许多实施方式中，特别是在使用双特异性免疫调节蛋白时，需要消除FcγRIIIa结合以消除或显著降低ADCC活性，使得一个Fc结构域包含一个或多个 Fcγ受体消融变体。这些消融变体在USSN 15/141,350的图31中描绘，其均通过引用方式整体并入本文中，并且每个都可以独立地并且任选地被包括或排除，其中优选的方面利用选自由以下项组成的组的消融变体：根据EU索引，G236R/L328R、 E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、 E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和 E233P/L234V/L235A/G236del。应该注意的是，本文提及的消融变体消融FcγR结合，但通常不消融FcRn结合。

图3中提供了pI变体的示例性实施方式。

9.异二聚体与Fc变体的组合

如本领域技术人员将理解的，所有所述异二聚化变体(包括偏斜和/或pI变体) 都可以任选地并且独立地以任何方式组合，只要其保留其“链性”或“单体划分”。另外，所有这些变体可以组合成异二聚化形式中的任一种异二聚化形式。

在pI变体的情况下，虽然附图中示出了特别有用的实施方式，但是可以遵循改变两个单体之间的pI差以促进纯化的基本规则，以生成其它组合。

另外，任何异二聚化变体、偏斜和pI也可独立地和任选地与如本文一般概述的Fc消融变体、Fc变体、FcRn变体组合。

另外，单体Fc结构域可包含一组氨基酸取代，该一组氨基酸取代包括 C220S/S267K/L368D/K370S或C220S/S267K/S364K/E357Q。

另外，异二聚Fc融合蛋白可包含歪斜变体(例如，如USSN 15/141,350的图 1A至图1C中所示的一组氨基酸取代，其均以引用方式整体并入本文中)，其中特别有用的偏斜变体选自由以下项组成的组：S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K； L368E/K370S:S364K；T411E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L、 K370S:S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V:T366W和 T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C、任选的消融变体、任选的带电的结构域接头和包含pI变异的重链。

在一些实施方式中，Fc结构域包含选自由以下项组成的组的氨基酸取代： 236R、239D、239E、243L、M252Y、V259I、267D、267E、298A、V308F、328F、328R、 330L、332D、332E、M428L、N434A、N434S、236R/328R、239D/332E、M428L、 236R/328F、V259I/V308F、267E/328F、M428L/N434S、Y436I/M428L、Y436V/M428L、 Y436I/N434S、Y436V/N434S、239D/332E/330L、M252Y/S254T/T256E、 V259I/V308F/M428L、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、G236R/L328R和PVA/S267K。在一些情况下，Fc结构域包含氨基酸取代239D/332E。在其它情况下，Fc结构域包含氨基酸取代G236R/L328R或PVA/S267K。

在一个实施方式中，可用于本发明的偏斜和pI变体的特定组合是 T366S/L368A/Y407V:T366W(任选地包括桥接二硫键， T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)，其中一个单体包含 Q295E/N384D/Q418E/N481D且另一个包含带正电荷的结构域接头。如本领域将理解的，“臼包杵”变体不改变pI，并且因此可用于任一单体上。

IV.IL-15/IL-15Rα-Fc融合单体

本发明的靶向的异二聚融合蛋白包括IL-15/IL-15受体α(IL-15Rα)-Fc融合单体。在一些情况下，IL-15和IL-15受体α(IL-15Rα)蛋白结构域处于不同的方向。附图(包括但不限于图4A至图4E、图5A至图5D和图8A至图8D)中提供IL-15/IL-15Rα-Fc融合单体的例示性实施方式。

在一些实施方式中，人IL-15蛋白具有NCBI参考序列第NP_000576.1号或 SEQ IDNO:1中所阐述的氨基酸序列。在一些情况下，人IL-15的编码序列阐述于NCBI参考序列第NM_000585号中。本文概述的Fc融合异二聚蛋白的例示性IL-15蛋白可具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列或SEQ ID NO:1的氨基酸49-162。在一些实施方式中，IL-15蛋白具有与SEQ IDNO:2至少90％、例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性。在一些实施方式中，IL-15蛋白具有SEQ ID NO:2中所阐述的氨基酸序列和氨基酸取代N72D。在其它实施方式中，IL-15蛋白具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列和一个或多个选自由以下组成的群组的氨基酸取代：C42S、L45C、Q48C、 V49C、L52C、E53C、E87C和E89C。任选地，IL-15蛋白还具有N72D取代。Fc融合蛋白的IL-15蛋白可具有1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸取代。在一些实施方式中，Fc 融合蛋白的人IL-15蛋白包含氨基酸取代N4D。在一些实施方式中，Fc融合蛋白的人IL-15 蛋白包含氨基酸取代D30N。在一些实施方式中，Fc融合蛋白的人IL-15蛋白包含氨基酸取代N65D。在一些实施方式中，Fc融合蛋白的人IL-15蛋白包含氨基酸取代N4D/N65D。在一些实施方式中，Fc融合蛋白的人IL-15蛋白包含氨基酸取代D30N/N65D。在一些实施方式中，Fc融合蛋白的人IL-15蛋白包含氨基酸取代D30N/E64Q/N65D。

在一些实施方式中，Fc融合蛋白的人IL-15蛋白与SEQ ID NO:2的氨基酸序列一致。在一些情况下，人IL-15蛋白没有氨基酸取代。

氨基酸取代可以是IL-15:IL-2β和IL-15:共同γ链界面处的同配取代。

在一些实施方式中，人IL-15变体在SEQ ID NO:2的N65位处包含氨基酸取代，并且进一步在SEQ ID NO:2的N1位、N4位、D8位、D30位、D61位、E64位和/或 Q108处包含一个或多个氨基酸取代。在一些情况下，IL-15变体在选自由以下项组成的组的位置处包含氨基酸取代：a)N1和N65；b)N4和N65；c)D30和N65；d)E64和N65；e) N65和Q108；f)N1、N4和N65；g)N4、D61和N65；和h)D30、E64和N65。在一些实施方式中，IL-15变体的氨基酸取代选自由以下项组成的组：a)N1D和N65D；b)N4D和 N65D；c)D30N和N65D；d)E64Q和N65D；e)N65D和Q108E；f)N1D、N4D和N65D；g) N4D、D61N和N65D；和h)D30N、E64Q和N65D。

在一些实施方式中，人IL-15变体在SEQ ID NO:2的E64位处包含氨基酸取代，并且进一步在SEQ ID NO:2的N1位、N4位、D8位、D30位、D61位、N65位和/或Q108 处包含一个或多个氨基酸取代。在一些情况下，IL-15变体在选自由以下项组成的组的位置上包含氨基酸取代：a)N1和E64；b)N4和E64；c)D8和E64；d)D61和E64；e)E64和 N65；f)E64和Q108；g)D30、E64和N65；h)D61、E64和N65；i)N1、D61、E64和 Q108；以及j)N4、D61、E64和Q108。在一些实施方式中，IL-15变体的氨基酸取代选自由以下项组成的组：a)N1D和E64Q；b)N4D和E64Q；c)D8N和E64Q；d)D61N和E64Q；e) E64Q和N65D；f)E64Q和Q108E；g)D30N、E64Q和N65D；h)D61N、E64Q和N65D；i) N1D、D61N、E64Q和Q108E；以及j)N4D、D61N、E64Q和Q108E。

在一些实施方式中，人IL-15变体在SEQ ID NO:2的D61位处包含氨基酸取代，并且进一步在SEQ ID NO:2的N1位、N4位、D8位、D30位、E64位、N65位和/或 Q108处包含一个或多个氨基酸取代。在一些情况下，IL-15变体在选自由以下项组成的组的位置上包含氨基酸取代：a)N1和D61；b)N4和D61；c)D8和D61；d)D61和E64；e)D61、 E64和N65；f)N1、D61、E64和Q108；g)N4、D61、E64和Q108；以及h)N4、D61和 N65。在一些实施方式中，IL-15变体的氨基酸取代选自由以下项组成的组：a)N1D和D61N； b)N4D和D61N；c)D8N和D61N；d)D61N和E64Q；e)D61N、E64Q和N65D；f)N1D、 D61N、E64Q和Q108E；g)N4D、D61N、E64Q和Q108E；以及h)N4D、D61N和N65D。

在一些实施方式中，人IL-15蛋白具有SEQ ID NO:2的序列并且具有一个或多个选自由以下项组成的组的氨基酸取代：N1D、N4D、D8N、D30N、D61N、E64Q、N65D、 Q108E和它们的任何组合。在一些实施方式中，IL-15蛋白具有氨基酸取代Q108E。在一些情况下，IL-15蛋白具有1、2、3、4、5、6、7、8个或更多个氨基酸取代。IL-15蛋白可以具有N1D、N4D、D8N、D30N、D61N、E64Q、N65D或Q108E取代。在一些实施方式中，氨基酸取代可包括D30N、N1D/D30N、N1D/D61N、N1D/E64Q、N4D/D30N、N4D/D61N、 N4D/E64Q、N4D/N65D、D8N/D61N、D8N/E64Q、D30N/E64Q、D30N/N65D、 D30N/E64Q/N65D、D61N/E64Q、E64Q/Q108E、N1D/N4D/D8N、D30N/E64Q/N65D、 D61N/E64Q/N65D、N1D/D61N/E64Q、N1D/D61N/E64Q/Q108E、或N4D/D61N/E64Q/Q108E。在一些实施方式中，IL-15蛋白具有氨基酸取代N4D。在某些实施方式中，IL-15蛋白具有氨基酸取代N65D。在某些实施方式中，IL-15蛋白具有氨基酸取代D30N。在一些实施方式中，IL-15蛋白具有氨基酸取代N4D/N65D。在一些实施方式中，IL-15蛋白具有氨基酸取代 N1D/D30N。在一些实施方式中，IL-15蛋白具有氨基酸取代N4D/D30N。在一些实施方式中， IL-15蛋白具有氨基酸取代N4D/N65D。在一些实施方式中，IL-15蛋白具有氨基酸取代 D30N/E64Q。在一些实施方式中，IL-15蛋白具有氨基酸取代D30N/N65D。在一些实施方式中，IL-15蛋白具有氨基酸取代D30N/E64Q/N65D。在一些实施方式中，本文提供的靶向 NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合蛋白的IL-15变体具有图38A所示的氨基酸取代。

在一些实施方式中，人IL-15受体α(IL-15Rα)蛋白具有NCBI参考序列第 NP_002180.1号或SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列。在一些情况下，人IL-15Rα的编码序列阐述于NCBI参考序列第NM_002189.3号中。本文概述的Fc融合异二聚蛋白的IL- 15Rα蛋白的例示性可包含SEQ ID NO:3的sushi结构域(例如，SEQ ID NO:3的氨基酸31- 95)或由其组成，或换句话说，SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施方式中，IL-15Rα蛋白具有SEQID NO:4的氨基酸序列和选自由以下项组成的组的氨基酸插入：D96、P97、 A98、D96/P97、D96/C97、D96/P97/A98、D96/P97/C98和D96/C97/A98，其中氨基酸位置是相对于全长人IL-15Rα蛋白或SEQ ID NO:3。例如，可以将诸如D(例如Asp)、P(例如Pro)、 A(例如Ala)、DP(例如Asp-Pro)、DC(例如Asp-Cys)、DPA(例如Asp-Pro-Ala)、DPC(例如 Asp-Pro-Cys)或DCA(例如Asp-Cys-Ala)的氨基酸添加到SEQ ID NO:4的IL-15Rα蛋白的C 末端。在一些实施方式中，IL-15Rα蛋白具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列和一个或多个选自由以下项组成的组的氨基酸取代：K34C、A37C、G38C、S40C和L42C，其中氨基酸位置是相对于SEQ ID NO:4。IL-15Rα蛋白可具有1、2、3、4、5、6、7、8个或更多个氨基酸突变(例如，取代、插入和/或缺失)。

SEQ ID NO:1(人IL-15前体)是

MRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLI QSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNG NVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS。

SEQ ID NO:2(人IL-15成熟形式)是

NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDT VENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS。

SEQ ID NO:3(人IL-15受体α)是

MAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLRPPATRGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSG FKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSP SGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTA SASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALP VTWGTSSRDEDLENCSHHL。

SEQ ID NO:4(人IL-15受体α，sushi结构域)是

ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSL KCIR。

在一些实施方式中，IL-15蛋白附接至Fc结构域的N末端，并且IL-15Rα蛋白附接至IL-15蛋白的N末端。在其它实施方式中，IL-15Rα蛋白附接至Fc结构域的N末端，并且IL-15Rα蛋白非共价附接至IL-15蛋白。在又其它实施方式中，IL-15Rα蛋白附接至Fc 结构域的C末端，并且IL-15Rα蛋白非共价附接至IL-15蛋白。

在一些实施方式中，IL-15蛋白和IL-15Rα蛋白通过接头附接在一起。任选地，蛋白质不通过接头附接。在其它实施方式中，IL-15蛋白和IL-15Rα蛋白是非共价附接的。在一些实施方式中，IL-15蛋白通过接头附接至Fc结构域。在其它实施方式中，IL-15Rα蛋白通过接头附接至Fc结构域。任选地，不使用接头将IL-15蛋白或IL-15Rα蛋白附接至Fc 结构域。

在一些示例中，通过接头(例如结构域接头)将免疫检查点ABD共价附接至 Fc结构域的N末端。

在一些实施方式中，接头是“结构域接头”，其用于将如本文所概述的任何两个结构域连接在一起。虽然可以使用任何合适的接头，但许多实施方式利用甘氨酸-丝氨酸聚合物，包括例如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:8)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:9)和(GGGS)n(SEQ IDNO:10)，其中n是为至少1的整数(并且通常为1到2到3到4到5) 以及允许具有足够的长度和柔性的两个结构域重组连接的任何肽序列以允许每个结构域保留其生物学功能。在一些情况下，并且注意“链型”，如下所概述，可以如本文所讨论和图6 和图7中所示使用带电荷的结构域接头。

V.抗原结合结构域单体

专注于CD8+ T细胞增殖和活化的治疗策略可以在临床上为癌症治疗提供广阔前景。癌症可以被认为是患者无法识别和消除癌细胞。在许多示例中，这些转化的(例如，癌性)细胞抵消免疫监视。存在限制体内T细胞活化的自然控制机制以防止无限制的T细胞活性，其可被癌细胞利用以逃避或抑制免疫反应。恢复免疫效应细胞(尤其是T细胞)识别和消除癌症的能力是免疫疗法的目标。免疫肿瘤学领域，有时被称为“免疫疗法”，正在迅速发展，最近批准了几种T细胞检查点抑制性抗体，例如和通常理解的是，共刺激和共抑制的各种免疫调节信号可用于协调最佳抗原特异性免疫反应。

本发明涉及与免疫细胞结合的靶向的异二聚体蛋白的产生，所述免疫细胞例如CD8+ T细胞或NK细胞和/或表达IL-2Rβ和共同γ链(γc；CD132)的细胞。靶向的异二聚体蛋白可以包括可以与免疫抗原或免疫细胞结合的任何有用抗体形式的抗原结合单体。在一些实施方式中，抗原结合单体包括与Fc结构域连接的Fab或scFv。

A.靶抗原

本发明的靶向异二聚体蛋白具有至少一个与靶抗原结合的抗原结合结构域(ABD)，所述靶抗原与Fc结构域和不同Fc结构域中融合的IL-15/IL-15Rα蛋白结构域融合。合适的靶抗原包括人类(并且有时是食蟹猴)NKG2D。在一些实施方式中，以二价双功能形式或三价双功能形式存在与两种不同靶抗原(“靶对”)结合的两种不同ABD。因此，合适的双功能ABD的非限制性示例结合CD8和NKG2D，或NKG2A和NKG2D，或NKG2D和其它靶抗原。在又其它实施方式中，靶向的异二聚体蛋白具有两个以二价双功能形式或三价双功能形式与相同靶抗原(“靶对”)结合的不同抗原结合结构域(ABD)和与蛋白的Fc结构域中的一个Fc结构域融合的IL-15/IL-15Rα蛋白结构域。

ABD可以呈各种形式，例如Fab形式或scFv形式。用于本发明的例示性ABD 公开于US 62/353,511中，其内容出于所有目的以其整体并入本文中。

在一些实施方式中，ABD中的一种ABD结合NKG2D。结合NKG2D的合适 ABD在PCT/US2018/040653的图59(XENP24365)和本文提供的图117A至图117C中示出。如所属领域技术人员将理解，如其加下划线，合适的ABD可包含一组如这些图中所描绘的 6个CDR。

另外，本发明的抗体包括与本文概述的抗原结合结构域结合于相同表位的抗体，或与本文概述的抗原结合结构域竞争结合。在一些实施方式中，双功能检查点抗体可含有本文概述的ABD中的一种ABD和与本文概述的ABD中的一种ABD竞争结合的第二ABD。在一些实施方式中，两种ABD与本文概述的对应ABD竞争结合。通常使用如本文概述的 Biacore测定来确定结合竞争。

如所属领域技术人员将理解的并且在下文中更全面地讨论，本发明的异二聚融合蛋白可具有多种构形，如通常描绘于US 62/353,511的图1中。一些图描绘“单端”构形，其中分子的一个“臂”上存在一种类型的特异性并且另一个“臂”存在不同特异性。其它附图描绘了“双端”配置，其中分子的“顶部”有至少一种类型的特异性并且分子的“底部”有一种或多种不同的特异性。参见，图57A至图57K。因此，本发明涉及新颖的免疫球蛋白组合物，其可共同接合免疫抗原和IL-15/IL-15Rα结合配偶体。

B.抗体

如下所讨论，通常使用术语“抗体”。可用于本发明的抗体可呈现如本文所述的多种形式，包括本文所述和图中所描绘的传统抗体以及抗体衍生物、片段和模拟物。在一些实施方式中，本发明提供含有抗原结合结构域和Fc结构域的抗体融合蛋白。在一些实施方式中，抗体融合蛋白与本文所述的IL-15/IL-15RαFc融合蛋白形成双功能靶向的异二聚体蛋白。这类双功能靶向的异二聚体蛋白的例示性形式包括但不限于图57A至图57K中所描绘的形式。

传统抗体结构单位通常包括四聚体。每个四聚体通常由两对相同的多肽链构成，每对具有一个“轻链”(通常具有约25kDa的分子量)和一个“重链”(通常具有约50-70 kDa的分子量)。人轻链被分类为κ轻链和λ轻链。本发明涉及通常基于IgG类的抗体或抗体片段(抗体单体)，其具有几个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。通常， IgG1、IgG2和IgG4比IgG3更频繁地使用。应注意IgG1具有在356(D或E)和358(L或 M)处具有多型性的不同同种异型。本文描述的序列使用356D/358M同种异型，然而本文包括其它同种异型。也就是说，本文包括的包含IgG1 Fc结构域的任何序列可以具有替代 356D/358M同种异型的356E/358L。

另外，本文中的许多序列在220位处的至少一个半胱氨酸被丝氨酸取代；通常，这是在本文中所描绘的大多数序列的“scFv单体”侧，尽管它也可以在“Fab单体”侧或两者上，以减少二硫化物的形成。本文序列中特别包括这些半胱氨酸中的一个或两个被取代(C220S)。

因此，如本文所用的“同种型”意指根据其恒定区的化学和抗原特征界定的免疫球蛋白的任一子类。应当理解，治疗性抗体还可以包含同种型和/或亚类的杂合体。举例来说，如以引用的方式并入的美国公开申请第2009/0163699号中所示，本发明覆盖IgG1/G2 杂合体的pI工程化。

高变区通常涵盖以下氨基酸残基：轻链可变区中的约氨基酸残基24-34 (LCDR1；“L”表示轻链)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)以及重链可变区中的约 31-35B(HCDR1；“H”表示重链)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；Kabat等人， SEQUENCES OF PROTEINS OFIMMUNOLOGICAL INTEREST，第5版，马里兰州贝塞斯达美国国家卫生研究院公共卫生服务部(Public Health Service,National Institutes of Health, Bethesda,Md.)(1991)和/或那些形成高变环的残基(例如轻链可变区中的残基26-32(LCDR1)、 50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)以及重链可变区中的26-32(HCDR1)、53-55(HCDR2)和96- 101(HCDR3)；Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917。下面描述本发明的特定CDR。

如本领域技术人员将理解的，CDR的确切编号和放置在不同编号系统中可以是不同的。然而，应理解，可变重链和/或可变轻链序列的公开包括相关(固有)CDR的公开。因此，每个重链可变区的公开内容是vhCDR(例如vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3)的公开内容，并且每个轻链可变区的公开内容是vlCDR(例如vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3) 的公开内容。CDR编号的有用比较如下，参见Lafranc等人,Dev.Comp.Immunol.27(1):55-77 (2003)。

表2

在通篇本发明说明书中，当提及可变结构域中的残基(大致是轻链可变区中的残基1-107和重链可变区中的残基1-113)时通常使用Kabat编号系统且Fc区使用EU编号系统(例如Kabat等人，同上(1991))。

重链的另一种类型的Ig结构域是铰链区。本文的“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”或“铰链结构域”意指包括抗体的第一恒定结构域与第二恒定结构域之间的氨基酸的柔性多肽。在结构上，IgG CH1结构域在EU位置215处终止，并且IgG CH2结构域在残基EU位置231处开始。因此，对于IgG，抗体铰链在本文中定义为包括位置216 (IgG1中的E216)到230(IgG1中的P230)，其中编号根据如Kabat中的EU索引。在一些情况下，使用“铰链片段”，其在铰链结构域的N末端和C末端的一个或两个处含有较少的氨基酸。如本文所提及，pI变体还可在铰链区中制成。

轻链通常包含两个结构域，即可变轻链结构域(含有轻链CDR并且与可变重链结构域一起形成Fv区)和恒定轻链区(通常称为CL或Cκ)。

下文概述的用于其它取代的另一相关区是Fc区。

本发明提供大量不同的CDR组。在这种情况下，“完整CDR组”包含三个可变轻链和三个可变重链CDR，例如vlCDR1、vlCDR2、vlCDR3、vhCDR1、vhCDR2和 vhCDR3。这些可以分别是较大可变轻结构域或可变重结构域的一部分。另外，如本文中更全面地概述的，当使用重链和轻链时(例如当使用Fab时)，可变重链结构域和可变轻链结构域可以在单独的多肽链上，或在scFv序列的情况下在单个多肽链上。

CDR有助于形成抗体的抗原结合位点，或更具体来说，表位结合位点。“表位”是指与称为互补位的抗体分子可变区中的特定抗原结合位点相互作用的决定簇。表位是诸如氨基酸或糖侧链的分子的组，并且通常具有特定的结构特征以及特定的电荷特征。单个抗原可具有多于一个表位。

表位可以包含直接参与结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性组分)和不直接参与结合的其它氨基酸残基，如被特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基；换句话说，氨基酸残基在特异性抗原结合肽的覆盖面积内。

表位可以是构象的也可以是线性的。通过来自线性多肽链的不同区段的空间并置的氨基酸产生构象表位。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。构象和非构象表位的区别可以在于在变性溶剂存在下，与前者而非后者的结合丧失。

表位通常包括独特空间构象中的至少3个，并且更通常至少5个或8-10个氨基酸。识别相同表位的抗体可以在简单的免疫分析中验证，展示一种抗体阻断另一种抗体与目标抗原结合的能力，例如“框并”。如下文所概述，本发明不仅包括本文所列举的抗原结合结构域和抗体，还包括竞争与所列举的抗原结合结构域结合的表位结合的抗原结合结构域和抗体。

因此，本发明提供不同的抗体结构域。如本文所述以及所属领域中已知，本发明的异二聚体抗体包括重链和轻链内的不同结构域，其也可以是重叠的。这些结构域包括但不限于Fc结构域、CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、铰链结构域、重链恒定结构域 (CH1-铰链-Fc结构域或CH1-铰链-CH2-CH3)、可变重链结构域、可变轻链结构域、轻链恒定结构域、FAb结构域和scFv结构域。

因此，“Fc结构域”包括-CH2-CH3结构域和任选的铰链结构域(-H-CH2-CH3)。在本文的实施方式中，当scFv附接于Fc结构域时，其为附接于Fc结构域的全部或部分铰链的scFv构建体的C末端；例如，其通常附接于作为铰链的开始的序列EPKS(SEQ ID NO: 7)。重链包含可变重链结构域和恒定结构域，其包括包含CH2-CH3的CH1-任选的铰链-Fc 结构域。轻链包括可变轻链结构域和轻链恒定结构域。scFv包括可变重链、scFv接头以及可变轻链结构域。在本文所概述的大多数构建体和序列中，可变重链的C末端连接到scFv 接头的N末端，scFv接头的C末端连接到可变轻链的N末端(N-vh-接头-vl-C)，尽管此顺序可以调换(N-vl-接头-vh-C)。

本发明的一些实施方式包含至少一个scFv结构域，其虽然不是天然存在的，但是通常包括通过scFv接头连接在一起的可变重链结构域和可变轻链结构域。如本文概述的，虽然scFv结构域通常从N末端到C末端取向成vh-scFv接头-vl，但是对于scFv结构域中的任何scFv结构域(或使用来自Fab的vh和vl序列构建的那些)，这可以颠倒成vl- scFv接头-vh，其中在一端或两端处的任选接头取决于形式(通常参见图57A至图57K)。

在一些实施方式中，用于本发明的靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合蛋白的可变重结构域和可变轻结构域对选自本文所述的可变重结构域和可变轻结构域对中的任何一个，包括在附图和序列表中，包括1D7B4的可变重结构域和可变轻结构域对(例如， 1D7B4[NKG2D]_H1和1D7B4[NKG2D]_L1)、KYK-1.0的可变重结构域和可变轻结构域对 (例如，KYK-1.0[NKG2D]_H1和KYK-1.0[NKG2D]_L1)、KYK-2.0的可变重结构域和可变轻结构域对(例如，KYK-2.0[NKG2D]_H0和KYK-2.0[NKG2D]_L0)、11B2D10的可变重结构域和可变轻结构域对(例如，11B2D10[NKG2D]_H0和11B2D10[NKG2D]_L0)、 6E5A7的可变重结构域和可变轻结构域对(例如，6E5A7[NKG2D]_H0和 6E5A7[NKG2D]_L0)、mAb E的可变重结构域和可变轻结构域对(例如，mAb E[NKG2D]_H1和mAb E[NKG2D]_L1)、16F31的可变重结构域和可变轻结构域对(例如， 16F31[NKG2D]_H1和16F31[NKG2D]_L1)、mAb D的可变重结构域和可变轻结构域对 (例如，mAb D[NKG2D]_H1和mAb D[NKG2D]_L1)，以及1D7B4的可变重结构域和可变轻结构域对(例如，1D7B4[NKG2D]_H1和1D7B4[NKG2D]_L1)，如图117A至图117B、对应的SEQ IDNO和序列标识符所示。在一些实施方式中，可变重结构域和可变轻结构域对是选自由mAbA_H1和mAb A_H2组成的组的可变重结构域，以及选自由mAb A_L1和 mAb A_L2组成的组的的可变轻结构域，如图117、对应的SEQ ID NO和序列标识符所示。在一些实施方式中，可变重结构域和可变轻结构域对选自mAb A_H1L1、mAb A_H1L2、 mAb A_H2L1或mAb A_H2L2。在各种实施方式中，可变重结构域和可变轻结构域对是选自由mAb B_H1、mAb B_H2和mAb B_H3组成的组的可变重结构域，以及选自由mAb B_L1、 mAb B_L1.1和mAb B_L2组成的组的可变轻结构域，如图117B、对应的SEQ ID NO和序列标识符所示。在一些实施方式中，可变重结构域和可变轻结构域对选自mAb B_H1L1、 mAb B_H1L1.1、mAb B_H1L2、mAb B_H2L1、mAb B_H2L1.1、mAb B_H2L2、mAb B_H3L1、mAb B_H3L1.1、或mAb B_H3L2。在某些实施方式中，可变重结构域和可变轻结构域对是选自由mAb C_H1和mAb C_H2组成的组的可变重结构域和选自由mAb C_L1和 mAb C_L2组成的组的可变轻结构域，如图117C、对应的SEQ ID NO和序列标识符所示。在一些实施方式中，可变重结构域和可变轻结构域对选自mAb C_H1L1、mAb C_H1L2、 mAb C_H2L1或mAb C_H2L2，如图117C、对应的SEQ ID NO和序列标识符所示。

如本文所示，存在多种可以用于共价连接所列举的结构域的适合的接头(用作结构域接头或scFv接头)，包括传统肽键，其通过重组技术来生成。在一些实施方式中，接头肽可能主要包含以下氨基酸残基：Gly、Ser、Ala或Thr。接头肽应该具有足以连接两个分子的长度，以便其相对于彼此呈现正确的构象，从而使其保留所期望的活性。在一个实施方式中，接头具有约1-50个氨基酸的长度，优选约1-30个氨基酸的长度。在一个实施方式中，可以使用长度为1-20个氨基酸的接头，在一些实施方式中可以使用约5个到约10个氨基酸。有用的接头包括甘氨酸-丝氨酸聚合物，包括例如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO: 8)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:9)和(GGGS)n(SEQ ID NO:10)，其中n是至少一(通常为3至4)的整数；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-丝氨酸聚合物和其它柔性接头。图6中描绘了说明性结构域接头。可替代地，可使用多种非蛋白质聚合物，包括但不限于聚乙二醇 (PEG)、聚丙二醇、聚环氧烷或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物作为接头。

其它连接序列可以包括具有任何长度的CL/CH1结构域的任何序列，但并非 CL/CH1结构域的所有残基；例如，CL/CH1结构域的前5-12个氨基酸残基。接头可以衍生自免疫球蛋白轻链，例如Cκ或Cλ。接头可以衍生自任何同种型的免疫球蛋白重链，包含例如Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cα1、Cα2、Cδ、Cε和Cμ。连接序列还可以衍生自其它蛋白质，例如Ig样蛋白(例如，TCR、FcR、KIR)、铰链区衍生序列以及来自其它蛋白质的其它天然序列。

在一些实施方式中，接头是“结构域接头”，其用于将如本文所概述的任何两个结构域连接在一起。举例来说，可存在将Fab的CH1结构域的C末端连接于scFv的N末端的结构域接头，并且另一任选的结构域接头将scFv的C末端连接于CH2结构域(尽管在许多实施方式中，使用铰链作为这个结构域接头)。虽然可以使用任何合适的接头，但许多实施方式利用甘氨酸-丝氨酸聚合物作为结构域接头，包括例如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:8)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:9)和(GGGS)n(SEQ ID NO:10)，其中n是为至少一的整数(并且通常为3到4到5)以及允许具有足够的长度和柔性的两个结构域重组连接的任何肽序列以允许每个结构域保留其生物学功能。在一些情况下，并且注意“链型”，如下所概述，可以使用如在scFv接头的一些实施方式中使用的带电荷的结构域接头。

在一些实施方式中，接头是scFv接头，其用于共价连接如本文所讨论的vh和 vl结构域。因此，本发明进一步提供带电荷的scFv接头，以促进第一单体与第二单体之间的pI分离。也就是说，通过并入带正或负(或两者，在不同单体上使用scFv的骨架的情况下) 电的scFv接头，由此允许包含带电接头的单体改变pI而不会在Fc结构域中产生进一步的变化。这些带电接头可以被取代到含有标准接头的任何scFv中。再次，如本领域技术人员将理解的，根据所期望的pI变化，在正确的“链”或单体上使用带电的scFv接头。举例来说，如本文所讨论，为了制备三F形式的异二聚体抗体，计算每个期望抗原结合结构域的Fv区域的原始pI，并且选择一个制备scFv，并且取决于pI，选择正或负接头。

带电荷的结构域接头也可以用来增加本发明的单体的pI分离，并且因此可以用于利用接头的本文中的任何实施方式中。特别地，图57A至图57K中描绘的形式包含抗原结合蛋白，通常称为“异二聚体Fc蛋白”，意指所述蛋白质具有自组装成异二聚体Fc结构域和至少两个Fv区(无论是作为Fab或作为scFv)的至少两个相关的Fc序列。

VI.本发明的有用实施方式

如图57A至图57K所示，有许多本发明的靶向的异二聚融合蛋白的有用形式。通常，本发明的异二聚融合蛋白具有三种功能组分：IL-15/IL-15Rα(sushi)组分、NKG2D抗原结合结构域组分和Fc组分，它们中的每一者可以采用本文所概述的不同的形式，并且每种形式可以以任何构型与其它组分组合。

第一Fc结构域和第二Fc结构域可具有选自由以下组成的组的氨基酸取代：根据EU编号，a)S267K/L368D/K370S:S267K/S364K/E357Q；b)S364K/E357Q:L368D/K370S； c)L368D/K370S:S364K；d)L368E/K370S:S364K；e)T411E/K360E/Q362E:D401K；f) L368D/K370S:S364K/E357L和g)K370S:S364K/E357Q。

在一些实施方式中，第一和/或第二Fc结构域具有另外一组包含根据EU编号的Q295E/N384D/Q418E/N421D的氨基酸取代。

任选地，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有另外一组由以下组成的氨基酸取代：根据EU编号，G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和E233P/L234V/L235A/G236del。

任选地，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有用于半衰期延长的428L/434S 变体。

A.scIL-15/Rαx scFv

一个实施方式示出于图57A中，并且包括两个单体。第一单体从N末端到C 末端包含sushi结构域-结构域接头-IL-15-结构域接头-CH2-CH3，并且第二单体包含vh-scFv 接头-vl-铰链-CH2-CH3或vl-scFv接头-vh-铰链-CH2-CH3，尽管在任一取向上，结构域接头可以取代铰链。这通常被称为“scIL-15/RαX scFv”，其中“sc”代表“单链”，是指使用共价接头接合IL-15和sushi结构域。

参看图57A，scIL-15/Rαx scFv形式包含通过可变长度的接头(称为“scIL- 15/Rα”)与IL-15融合的IL-15Rα(sushi)，然后将其与异二聚体Fc区的N末端融合，其中 scFv与异二聚Fc的另一侧融合。

在一些实施方式中，靶向的IL-15/Rα-Fc融合蛋白包含：(a)第一单体，其从N 末端至C末端包含：i)IL-15sushi结构域；ii)第一结构域接头；iii)变异IL-15结构域；iv)第二结构域接头；v)包含CH2-CH3的第一变异Fc结构域；和(b)第二单体，其从N末端至C 末端包含：i)scFv结构域；ii)第三结构域接头；iii)包含CH2-CH3的第二变异Fc结构域；其中scFv结构域包含第一可变重链结构域、scFv接头和第一可变轻链结构域，并且scFv结构域结合人NKG2D。在某些实施方式中，靶向的IL-15/Rα-Fc融合蛋白包含：(a)第一单体，其从N末端至C末端包含：i)IL-15sushi结构域；ii)第一结构域接头；iii)变异IL-15结构域； iv)第二结构域接头；v)包含CH2-CH3的第一变异Fc结构域；和(b)第二单体，其从N末端至C末端包含：i)scFv结构域；ii)第三结构域接头；iii)包含CH2-CH3的第二变异Fc结构域；其中scFv结构域包含第一可变重链结构域、scFv接头和第一可变轻链结构域，并且scFv结构域结合人NKG2D。

在scIL-15/RαX scFv形式中，一个优选的实施方式利用了抗NKG2D ABD，其具有如图117A至图117C所示的任何可变重和轻结构域对。

在scIL-15/RαX scFv形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自由以下项组成的组：MS[NKG2D]_H0L0、KYK- 1.0[NKG2D]_H1L1、KYK-2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、 6E5A7[NKG2D]_H0L0、6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、 16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAbB[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、 mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C 所示。

在scIL-15/RαX scFv形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自由以下项组成的组：MS[NKG2D]_H0L0、KYK- 1.0[NKG2D]_H1L1、KYK-2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、 6E5A7[NKG2D]_H0L0、6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、 16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAbB[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、 mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C 所示，以及偏斜变体对S364K/E357Q:L368D/K370S。

在scIL-15/RαX scFv形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自由以下项组成的组：MS[NKG2D]_H0L0、KYK- 1.0[NKG2D]_H1L1、KYK-2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、 6E5A7[NKG2D]_H0L0、6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、 16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAbB[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、 mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C 所示，以及带有IL-15N4D/N65D变异或IL-15D30N/N65D变异或IL-15D30N/E64Q/N65D 变异的偏斜变异对S364K/E357Q:L368D/K370S。

在scIL-15/RαX scFv形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，带有IL-15N4D/N65D变异或IL-15D30N/N65D变异或IL-15D30N/E64Q/N65D变异并带有适当的半胱氨酸取代基。

在scIL-15/RαX scFv形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，以及带有IL-15N4D/N65D变异或IL- 15D30N/N65D变异或IL-15D30N/E64Q/N65D变异的偏斜变体对 S364K/E357Q:L368D/K370S。

在scIL-15/RαX scFv形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自由以下项组成的组：MS[NKG2D]_H0L0、KYK- 1.0[NKG2D]_H1L1、KYK-2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、 6E5A7[NKG2D]_H0L0、6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、 16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAbB[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、 mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C 所示，具有图57A形式：例如，偏斜变体S364K/E357Q(在抗NKG2D单体上)和L368D/K370S(在IL-15复合单体上)、pI变体Q295E/N384D/Q418E/N421D(在IL-15复合侧上)、在两种单体上的消融变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，以及任选的在两侧上的428L/434S变体。在此类实施方式中，形式包括IL-15N4D/N65D变体或IL-15 D30N/N65D变体或IL-15D30N/E64Q/N65D变体。

在scIL-15/RαX scFv形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自由以下项组成的组：MS[NKG2D]_H0L0、KYK- 1.0[NKG2D]_H1L1、KYK-2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、 6E5A7[NKG2D]_H0L0、6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、 16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAbB[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、 mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C 所示，具有图57A形式：例如，偏斜变体S364K/E357Q(在IL-15复合单体上)和 L368D/K370S(在抗NKG2D单体上)、pI变体Q295E/N384D/Q418E/N421D(在IL-15复合侧上)、在两种单体上的消融变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，以及任选的在两侧上的428L/434S变体。在此类实施方式中，形式包括IL-15N4D/N65D变体或IL-15 D30N/N65D变体或IL-15D30N/E64Q/N65D变体。

B.scFv x ncIL-15/Rα

此实施方式示出于图57B中，并且包括三个单体。第一单体从N末端到C末端包含sushi结构域-结构域接头-CH2-CH3，并且第二单体包含vh-scFv接头-vl-铰链-CH2- CH3或vl-scFv接头-vh-铰链-CH2-CH3，尽管在任一取向上，结构域接头可以取代铰链。第三单体是IL-15结构域。这通常被称为“ncIL-15/RαX scFv”或“scFv X ncIL-15/Rα”，其中“nc”代表“非共价”，是指IL-15和sushi结构域的自组装非共价连接。

参看图57B，“scFv x ncIL-15/Rα”形式包含与异二聚Fc区的N末端融合的 scFv，其中IL-15Rα(sushi)与异二聚体Fc的另一侧融合，同时单独转染IL-15以使得形成非共价IL-15/Rα复合物。

在ncIL-15/RαX scFv形式中，一个优选实施方式利用偏斜变体对S364K/E357Q:L368D/K370S。在ncIL-15/RαX scFv形式中，一个优选实施方式利用偏斜变体S364K/E357Q(在scFv-Fc单体上)和L368D/K370S(在IL-15复合单体上)、pI变体 Q295E/N384D/Q418E/N421D(在IL-15复合侧上)、两种单体上的消融变体 E233P/L234V/L235A/G236_/S267K以及任选的两侧上的428L/434S变体。

在一些实施方式中，异二聚体蛋白包含：(a)第一单体，其从N末端到C末端包含：i)IL-15sushi结构域；ii)第一结构域接头；iii)包含CH2-CH3的第一变异Fc结构域； (b)第二单体，其从N末端到C末端包含：i)scFv结构域；ii)第二结构域接头；iii)包含CH2- CH3的第二变异Fc结构域；其中所述scFv结构域包含第一可变重链结构域、scFv接头和第一可变轻链结构域；和c)包含变异IL-15结构域的第三单体，其中所述scFv结构域结合人 NKG2D。

在ncIL-15/RαX scFv形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示。

在ncIL-15/RαX scFv形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，带有IL-15N4D/N65D变异或IL-15D30N/N65D变异或IL-15D30N/E64Q/N65D变异。

在ncIL-15/RαX scFv形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，带有IL-15N4D/N65D变异或IL-15D30N/N65D变异或IL-15D30N/E64Q/N65D变异并带有适当的半胱氨酸取代基。

在ncIL-15/RαX scFv形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，以及偏斜变体对 S364K/E357Q:L368D/K370S。

在ncIL-15/RαX scFv形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，以及带有IL-15N4D/N65D变异或IL- 15D30N/N65D变异或IL-15D30N/E64Q/N65D变异的偏斜变体对 S364K/E357Q:L368D/K370S。

在ncIL-15/RαX scFv形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，具有图57B形式：例如，偏斜变体S364K/E357Q(在scFv-Fc单体上)和L368D/K370S(在IL-15复合单体上)、pI变体 Q295E/N384D/Q418E/N421D(在IL-15复合侧上)、在两种单体上的消融变体 E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，以及任选的在两侧上的428L/434S变体。在此类实施方式中，形式包括IL-15N4D/N65D变体或IL-15D30N/N65D变体或IL-15D30N/E64Q/N65D 变体。

C.scFv x dsIL-15/Rα

此实施方式示出于图57C中，并且包括三个单体。第一单体从N末端到C末端包含sushi结构域-结构域接头-CH2-CH3，其中sushi结构域具有工程化的半胱氨酸残基，并且第二单体包含vh-scFv接头-vl-铰链-CH2-CH3或vl-scFv接头-vh-铰链-CH2-CH3，尽管在任一取向上，结构域接头可以取代铰链。第三单体是IL-15结构域，也被工程化成具有半胱氨酸变体氨基酸，因此允许在sushi结构域与IL-15结构域之间形成二硫桥键。这通常称为“scFvX dsIL-15/Rα”或dsIL-15/RαX scFv，其中“ds”代表“二硫键”。

参看图57C，scFv x dsIL-15/Rα形式包含与异二聚体Fc区的N末端融合的 scFv，其中IL-15Rα(sushi)与异二聚体Fc的另一侧融合，同时单独转染IL-15以使得由于工程化的半胱氨酸而形成共价IL-15/Rα复合物。

在scFv x dsIL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用偏斜变体对 S364K/E357Q:L368D/K370S。在scFv x dsIL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用偏斜变体 S364K/E357Q(在scFv-Fc单体上)和L368D/K370S(在IL-15复合单体上)、pI变体 Q295E/N384D/Q418E/N421D(在IL-15复合侧上)、两种单体上的消融变体 E233P/L234V/L235A/G236_/S267K以及任选的两侧上的428L/434S变体。

在一些实施方式中，异二聚体蛋白包含：(a)第一单体，其从N末端到C末端包含：i)具有半胱氨酸残基的变异IL-15sushi结构域；ii)第一结构域接头；iii)包含CH2-CH3 的第一变异Fc结构域；(b)第二单体，其从N末端到C末端包含：i)scFv结构域；ii)第二结构域接头；iii)包含CH2-CH3的第二变异Fc结构域；其中scFv结构域包含第一可变重链结构域、scFv接头和第一可变轻链结构域；和c)包含有包含半胱氨酸残基的IL-15结构域的第三单体；其中变异IL-15sushi结构域和变异IL-15结构域形成二硫键，并且scFv结构域结合人NKG2D。

在dsIL-15/RαX scFv形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示。

在dsIL-15/RαX scFv形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，带有IL-15N4D/N65D变异或IL-15D30N/N65D变异或IL-15D30N/E64Q/N65D变异。

在dsIL-15/RαX scFv形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，带有IL-15N4D/N65D变异或IL-15D30N/N65D变异或IL-15D30N/E64Q/N65D变异并带有适当的半胱氨酸取代基。

在dsIL-15/RαX scFv形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，以及偏斜变体对 S364K/E357Q:L368D/K370S。

在dsIL-15/RαX scFv形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，以及带有IL-15N4D/N65D变异或IL- 15D30N/N65D变异或IL-15D30N/E64Q/N65D变异的偏斜变体对 S364K/E357Q:L368D/K370S。

在dsIL-15/RαX scFv形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，具有图57C形式：例如，偏斜变体S364K/E357Q(在scFv-Fc单体上)和L368D/K370S(在IL-15复合单体上)、pI变体 Q295E/N384D/Q418E/N421D(在IL-15复合侧上)、在两种单体上的消融变体 E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，以及任选的在两侧上的428L/434S变体。在此类实施方式中，形式包括IL-15N4D/N65D变体或IL-15D30N/N65D变体或IL-15D30N/E64Q/N65D 变体。

D.scIL-15/Rαx Fab

此实施方式示出于图57D中，并且包括三个单体。第一单体从N末端到C末端包含sushi结构域-结构域接头-IL-15-结构域接头-CH2-CH3，并且第二单体包含重链VH- CH1-铰链-CH2-CH3。第三单体是轻链VL-CL。这通常称为“scIL-15/RαX Fab”，其中“sc”代表“单链”。

参看图57D，scIL-15/Rαx Fab(或Fab x scIL-15/Rα)形式包含通过可变长度的接头(称为“scIL-15/Rα”)与IL-15融合的IL-15Rα(sushi)，然后将其与异二聚Fc区的 N末端融合，其中可变重链(VH)与异二聚体Fc的另一侧融合，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab。

在scIL-15/RαX Fab形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1、对应的SEQID NO和本文在序列表中所述的序列标识符和图117A至图117C。

在scIL-15/RαX Fab形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1、对应的SEQID NO和本文在序列表中所述的序列标识符和图117A至图117C，具有IL-15N4D/N65D变异或IL-15D30N/N65D变异或IL-15D30N/E64Q/N65D变异。

在scIL-15/RαX Fab形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1、对应的SEQID NO和本文在序列表中所述的序列标识符和图117A至图117C，具有IL-15N4D/N65D变异或IL-15D30N/N65D变异或IL-15D30N/E64Q/N65D变异，并且具有合适的半胱氨酸取代。

在scIL-15/RαX Fab形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1、对应的SEQID NO和本文在序列表中所述的序列标识符和图117A至图117C，以及偏斜变体对 S364K/E357Q:L368D/K370S。

在scIL-15/RαX Fab形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1、对应的SEQID NO和本文在序列表中所述的序列标识符和图117A至图117C，以及具有IL-15N4D/N65D变异或IL-15D30N/N65D变异或IL-15D30N/E64Q/N65D变异的偏斜变体对 S364K/E357Q:L368D/K370S。

在scIL-15/RαX Fab形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1、对应的SEQID NO和在序列表中所述的序列标识符和图117A至图117C，具有图57D形式：例如，偏斜变体S364K/E357Q(在抗NKG2D单体上)和L368D/K370S(在IL-15复合单体上)、pI变体 Q295E/N384D/Q418E/N421D(在IL-15复合侧上)、在两种单体上的消融变体 E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，以及任选的在两侧上的428L/434S变体。在此类实施方式中，形式包括IL-15N4D/N65D变体或IL-15D30N/N65D变体或IL-15D30N/E64Q/N65D 变体。

在scIL-15/RαX Fab形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1、对应的SEQID NO和在序列表中所述的序列标识符和图117A至图117C所示，具有图57D形式：例如，偏斜变体S364K/E357Q(在IL-15复合单体上)和L368D/K370S(在抗NKG2D单体上)、pI 变体Q295E/N384D/Q418E/N421D(在IL-15复合侧上)、在两种单体上的消融变体 E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，以及任选的在两侧上的428L/434S变体。在此类实施方式中，形式包括IL-15N4D/N65D变体或IL-15D30N/N65D变体或IL-15D30N/E64Q/N65D 变体。

在一些实施方式中，本发明的靶向NKG2D的IL-15(N4D/N65D)/Rα-Fc融合蛋白选自由以下项组成的组：XENP27195、XENP27197、XENP27615、XENP27616、 XENP27617、XENP27618、XENP27619、XENP27620、XENP27621、XENP27622、 XENP27623、XENP27624、XENP27625、XENP27626、XENP27627、XENP27628、 XENP27629、XENP27630、XENP27631、XENP27632、XENP27633、XENP27634、 XENP27635、XENP27636、XENP27637、XENP27638、XENP30592和XENP31077，如在图 122A至图122N和对应的SEQ ID NO中所描绘的。

在一些实施方式中，本发明的靶向NKG2D的IL-15(N4D/N65D)/Rα-Fc融合蛋白选自由以下项组成的组：XENP27195、XENP27615、XENP27616、XENP27617、 XENP27618、XENP27619、XENP27620、XENP27621、XENP27622、XENP27623、 XENP27624、XENP27625、XENP27626、XENP27627、XENP27628、XENP27629、XENP27630、XENP27631、XENP27632、XENP27633、XENP27634、XENP27635、 XENP27636、XENP27637、XENP27638和XENP30592。在一些情况下，靶向NKG2D的 IL-15/Rα-Fc融合蛋白在Fc结构域变体中的每个Fc结构域变体中包含M428L/N434S取代。

在一些实施方式中，本发明的靶向NKG2D的IL-15(D30N/N65D)/Rα-Fc融合蛋白选自由以下项组成的组：XENP30453、XENP30593、XENP30595、XENP31078和 XENP31080，如在图138A至图138C和对应的SEQ ID NO中所描绘的。在各种情况下，靶向NKG2D的IL-15(D30N/N65D)/Rα-Fc融合蛋白在Fc结构域变体中的每个Fc结构域变体中包含M428L/N434S取代。

在一些实施方式中，本发明的靶向NKG2D的IL-15(D30N/E64Q/N65D)/Rα-Fc 融合蛋白选自由以下项组成的组：XENP30594、XENP30596、XENP31079、XENP31081、 XENP33332、XENP33334、XENP33336、XENP33338、XENP33340、XENP33342、 XENP33344、XENP33346、XENP33350、XENP33352、XENP33354、XENP33356、 XENP33358、XENP33360、XENP33362和XENP33364，如在图139A至图139J和对应的 SEQ ID NO中所提供的。

在各种情况下，靶向NKG2D的IL-15(D30N/E64Q/N65D)/Rα-Fc融合蛋白在Fc 结构域变体中的每个Fc结构域变体中包含M428L/N434S取代。此类蛋白质的示例性实施方式包括XENP31079、XENP31081、XENP33332、XENP33334、XENP33336、XENP33338、 XENP33340、XENP33342、XENP33344、XENP33346，如图139A至图139J和代表性的 SEQ ID NO中所提供的。

在scIL-15/Rαx Fab形式中，一个优选实施方式利用具有图61A中描绘的序列的抗NKG2D ABD。在一些实施方式中，scIL-15/Rαx Fab的IL-15复合物利用图61A中描绘的序列。在一些情况下，异二聚体蛋白是XENP24533。在一些实施方式中，靶向NKG2D 的IL-15/Rα-Fc融合蛋白是XENP24533的变体，使得该蛋白的IL-15变体具有氨基酸取代 D30N、N1D/D30N、N4D/D30N、N4D/N65D、D30N/E64Q、D30N/N65D或 D30N/E64Q/N65D。

在scIL-15/Rαx Fab形式中，一个优选实施方式利用具有图61A中描绘的序列的抗NKG2D ABD。在一些实施方式中，scIL-15/Rαx Fab的IL-15复合物利用图61A中描绘的序列。在一些情况下，异二聚体蛋白是XENP24534。在一些实施方式中，靶向NKG2D 的IL-15/Rα-Fc融合蛋白是XENP24534的变体，使得该蛋白的IL-15变体具有氨基酸取代D30N、N1D/D30N、N4D/D30N、N4D/N65D、D30N/E64Q、D30N/N65D或 D30N/E64Q/N65D。

在scIL-15/Rαx Fab形式中，一个优选实施方式利用具有图61B中描绘的序列的抗NKG2D ABD。在一些实施方式中，scIL-15/Rαx Fab的IL-15复合物利用具有图61B中描绘的序列。在一些情况下，异二聚体蛋白是XENP24535。在一些实施方式中，靶向 NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合蛋白是XENP24535的变体，使得该蛋白的IL-15变体具有氨基酸取代D30N、N1D/D30N、N4D/D30N、N4D/N65D、D30N/E64Q、D30N/N65D或 D30N/E64Q/N65D。

在scIL-15/Rαx Fab形式中，一个优选实施方式利用偏斜变体对 S364K/E357Q:L368D/K370S。

在scIL-15/Rαx Fab形式中，一个优选实施方式利用偏斜变体S364K/E357Q (在抗NKG2D单体上)和L368D/K370S(在IL-15复合单体上)、pI变体 Q295E/N384D/Q418E/N421D(在IL-15复合侧上)、两种单体上的消融变体 E233P/L234V/L235A/G236_/S267K以及任选的两侧上的428L/434S变体。

在一些实施方式中，异二聚体蛋白包含：(a)第一单体，其从N末端到C末端包含：i)IL-15sushi结构域；ii)第一结构域接头；iii)变体IL-15结构域；iv)第二结构域接头； v)包含CH2-CH3的第一变异Fc结构域；和(b)第二单体，其包含有包含VH-CH1-铰链-CH2- CH3的重链，其中CH2-CH3是第二变异Fc结构域；和c)包含VL-CL的轻链；其中VH和 VL形成结合人NKG2D的抗原结合结构域。

在一些示例中，本发明的异二聚体蛋白的抗NKG2A ABD具有如图61A和图 61B中所示的MS[NKG2D]_H0L0 Fab-Fc重链和MS[NKG2D]_H0L0轻链的序列。在一些实施方式中，本发明提供一种靶向的异二聚Fc融合蛋白，其包含与NKG2D结合的ABD和 IL-15/IL-15Rα融合蛋白，并且可以是图57A至图57F中所示的任何形式。在一个实施方式中，双功能异二聚Fc融合蛋白包含两种与NKG2D结合的抗原结合结构域和IL-15/IL-15Rα融合蛋白，并且可以是图57G至图57K中所示的任何形式。

E.Fab x ncIL-15/Rα

此实施方式示出于图57E中，并且包括四种单体。第一单体从N末端到C末端包含sushi结构域-结构域接头-CH2-CH3，并且第二单体包含重链VH-CH1-铰链-CH2-CH3。第三单体是IL-15结构域。第四单体是轻链VL-CL。这通常被称为“Fab X ncIL-15/Rα”，其中“nc”代表“非共价”，是指IL-15和sushi结构域的自组装非共价连接。对于本实施方式的变体的优选组合在图92C中找到。

参看图57E，Fab x ncIL-15/Rα(或ncIL-15/Rαx Fab)包含与异二聚体Fc区的 N末端融合的VH，IL-15Rα(sushi)与异二聚体Fc的另一侧融合，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab，并且同时单独转染IL-15以使得形成非共价IL-15/Rα复合物。在Fab x ncIL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用偏斜变体对S364K/E357Q:L368D/K370S。在Fab xncIL-15/Rα形式，一个优选实施方式利用偏斜变体S364K/E357Q(在抗NKG2D单体上) 和L368D/K370S(在IL-15复合单体上)、pI变体Q295E/N384D/Q418E/N421D(在IL-15 复合侧上)、两种单体上的消融变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K以及任选的两侧上的428L/434S变体。

在一些实施方式中，异二聚体蛋白包含：a)第一单体，其包含有包含VH-CH1- 铰链-CH2-CH3的重链，其中所述CH2-CH3是第一变异Fc结构域；b)第二单体，其从N末端到C末端包含：i)IL-15sushi结构域；ii)第一结构域接头；iii)包含CH2-CH3的第二变异Fc结构域；c)包含变体IL-15结构域的第三单体；和d)包含有包含VL-CL的轻链的第四单体；其中VH和VL形成结合人NKG2D的抗原结合结构域。

在ncIL-15/RαX Fab形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示。

在ncIL-15/RαX Fab形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，带有IL-15N4D/N65D变异或IL-15D30N/N65D变异或IL-15D30N/E64Q/N65D变异。

在ncIL-15/RαX Fab形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，带有IL-15N4D/N65D变异或IL-15D30N/N65D变异或IL-15D30N/E64Q/N65D变异并带有适当的半胱氨酸取代基。

在ncIL-15/RαX Fab格式中，一个优选实施方式利用具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自1D7B4_H1L1、6E5A7_H0L0、6H7E7_H0L0、mAb E_H1L1、 11B2D10_H0L0、16F31_H1L1、mAb D_H1L1、KYK1.0_H1L1、KYK2.0_H0L0、mAb A_H1L1、mAb A_H1L2、mAb A_H2L1、mAb A_H2L2、mAb B_H1L1、mAb B_H1L1.1、 mAb B_H1L2、mAb B_H2L1、mAb B_H2L1.1、mAb B_H2L2、mAb B_H3L1、mAb B_H3L1.1、mAb B_H3L2、mAb C_H1L1、mAb C_H1L2、mAb C_H2L1、and mAb C_H2L2，如图117A至图117C所示，以及偏斜变体对S364K/E357Q:L368D/K370S。

在ncIL-15/RαX Fab形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，以及带有IL-15N4D/N65D变异或IL- 15D30N/N65D变异或IL-15D30N/E64Q/N65D变异的偏斜变体对 S364K/E357Q:L368D/K370S。

在ncIL-15/RαX Fab形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，具有图57E形式：例如，偏斜变体S364K/E357Q(在scFv-Fc单体上)和L368D/K370S(在IL-15复合单体上)、pI变体 Q295E/N384D/Q418E/N421D(在IL-15复合侧上)、在两种单体上的消融变体 E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，以及任选的在两侧上的428L/434S变体。在此类实施方式中，形式包括IL-15N4D/N65D变体或IL-15D30N/N65D变体或IL-15D30N/E64Q/N65D 变体。

F.Fab x dsIL-15/Rα

此实施方式示出于图57F中，并且包括四个单体。第一单体从N末端到C末端包含sushi结构域-结构域接头-CH2-CH3，其中sushi结构域被工程化成含有半胱氨酸残基，并且第二单体包含重链VH-CH1-铰链-CH2-CH3。第三单体是IL-15结构域，也被工程化成具有半胱氨酸残基，使得在天然细胞条件下形成二硫桥键。第四单体是轻链VL-CL。这通常被称为“Fab X dsIL-15/Rα”，其中“ds”代表“二硫键”，是指IL-15和sushi结构域的自组装非共价连接。

参看图57F，Fab x dsIL-15/Rα(或dsIL-15/Rαx Fab)形式包含与异二聚Fc区的N末端融合的VH，IL-15Rα(sushi)与异二聚Fc的另一侧融合，同时单独转染对应轻链以形成具有VH的Fab，并且同时单独转染IL-15以使得由于工程化的半胱氨酸而形成共价IL- 15/Rα复合物。

在Fab x dsIL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用偏斜变体对 S364K/E357Q:L368D/K370S。在Fab x dsIL-15/Rα形式，一个优选实施方式利用偏斜变体 S364K/E357Q(在抗NKG2D单体上)和L368D/K370S(在IL-15复合单体上)、pI变体 Q295E/N384D/Q418E/N421D(在IL-15复合侧上)、两种单体上的消融变体 E233P/L234V/L235A/G236_/S267K以及任选的两侧上的428L/434S变体。

在一些实施方式中，异二聚体蛋白包含：a)第一单体，其包含有包含VH-CH1- 铰链-CH2-CH3的重链，其中所述CH2-CH3是第一变异Fc结构域；b)第二单体，其从N末端到C末端包含：i)具有半胱氨酸残基的IL-15sushi结构域；ii)第一结构域接头；和iii)包含 CH2-CH3的第二变异Fc结构域；c)第三单体，其包含有包含半胱氨酸残基的变异IL-15结构域；和d)第四单体，其包含有包含VL-CL的轻链；并且其中IL-15sushi结构域和变异IL- 15结构域形成二硫键，并且VH和VL形成结合人NKG2D的抗原结合结构域。

在dsIL-15/RαX Fab形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示。

在dsIL-15/RαX Fab形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，带有IL-15N4D/N65D变异或IL-15D30N/N65D变异或IL-15D30N/E64Q/N65D变异。

在dsIL-15/RαX Fab形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，带有IL-15N4D/N65D变异或IL-15D30N/N65D变异或IL-15D30N/E64Q/N65D变异并带有适当的半胱氨酸取代基。

在dsIL-15/RαX Fab形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，以及偏斜变体对 S364K/E357Q:L368D/K370S。

在dsIL-15/RαX Fab形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，以及带有IL-15N4D/N65D变异或IL- 15D30N/N65D变异或IL-15D30N/E64Q/N65D变异的偏斜变体对 S364K/E357Q:L368D/K370S。

在dsIL-15/RαX Fab形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，具有图57F形式：例如，偏斜变体S364K/E357Q(在scFv-Fc单体上)和L368D/K370S(在IL-15复合单体上)、pI变体 Q295E/N384D/Q418E/N421D(在IL-15复合侧上)、在两种单体上的消融变体 E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，以及任选的在两侧上的428L/434S变体。在此类实施方式中，形式包括IL-15N4D/N65D变体或IL-15D30N/N65D变体或IL-15D30N/E64Q/N65D 变体。

G.mAb-scIL-15/Rα

此实施方式示出于图57G中，并且包括三个单体(尽管融合蛋白是四聚体)。第一单体包含重链VH-CH1-铰链-CH2-CH3。第二单体包含具有scIL-15复合物的重链、VH- CH1-铰链-CH2-CH3-结构域接头-sushi结构域-结构域接头-IL-15。第三(和第四)单体是轻链，VL-CL。这通常被称为“mAb-scIL-15/Rα”，其中“sc”代表“单链”。

参看图57G，mAb-scIL-15/Rα形式包含与第一和第二异二聚体Fc的N末端融合的VH，IL-15与随后与异二聚体Fc区中的一个的C末端进一步融合的IL-15Rα(sushi)融合，同时单独转染对应轻链以形成具有VH的Fab。

在mAb-scIL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用偏斜变体对 S364K/E357Q:L368D/K370S。一个优选实施方式利用偏斜变体S364K/E357Q(在一个单体上)和L368D/K370S(在IL-15复合物单体上)、pI变体Q295E/N384D/Q418E/N421D(在 IL-15复合物侧上)、两种单体上的消融变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K以及任选地两侧上的428L/434S变体。

在一些实施方式中，异二聚蛋白包含：(a)第一单体，其包含有包含VH-CH1- 铰链-CH2-CH3的重链，其中所述CH2-CH3是第一变异Fc结构域；(b)第二单体，其包含 VH-CH1-铰链-CH2-CH3-结构域接头-IL-15sushi结构域-结构域接头-IL-15变体，其中CH2- CH3是第二变异Fc结构域；和(c)第三单体，其包含有包含VL-CL的轻链；其中VH和VL 结构域结合人NKG2D。

在mAb-scIL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示。

在mAb-scIL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，带有IL-15N4D/N65D变异或IL-15D30N/N65D变异或IL-15D30N/E64Q/N65D变异。

在mAb-scIL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，带有IL-15N4D/N65D变异或IL-15D30N/N65D变异或IL-15D30N/E64Q/N65D变异并带有适当的半胱氨酸取代基。

在mAb-scIL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，以及偏斜变体对 S364K/E357Q:L368D/K370S。

在mAb-scIL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，以及带有IL-15N4D/N65D变异或IL- 15D30N/N65D变异或IL-15D30N/E64Q/N65D变异的偏斜变体对 S364K/E357Q:L368D/K370S。

在mAb-scIL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，具有图57G形式：例如，偏斜变体S364K/E357Q(在scFv-Fc单体上)和L368D/K370S(在IL-15复合单体上)、pI变体 Q295E/N384D/Q418E/N421D(在IL-15复合侧上)、在两种单体上的消融变体 E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，以及任选的在两侧上的428L/434S变体。在此类实施方式中，形式包括IL-15N4D/N65D变体或IL-15D30N/N65D变体或IL-15D30N/E64Q/N65D 变体。

H.mAb-ncIL-15/Rα

此实施方式示出于图57H中，并且包括四个单体(虽然异二聚体融合蛋白是五聚体)。第一单体包含重链VH-CH1-铰链-CH2-CH3。第二单体包含具有IL-15Rα(sushi)结构域的重链、VH-CH1-铰链-CH2-CH3-结构域接头-sushi结构域。第三单体是IL-15结构域。第四(和第五)单体是轻链VL-CL。这通常被称为“mAb-ncIL-15/Rα”，其中“nc”代表“非共价”。

参看图57H，mAb-ncIL-15/Rα形式包含与第一和第二异二聚体Fc的N末端融合的VH，IL-15Rα(sushi)与异二聚体Fc区中的一个的C末端融合，同时单独转染对应轻链以形成具有VH的Fab，并且同时单独转染IL-15以使得形成非共价IL-15/Rα复合物。此类异二聚体蛋白的说明性实施方式可以是XENP24543。

在mAb-ncIL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用偏斜变体对 S364K/E357Q:L368D/K370S。一个优选实施方式利用偏斜变体S364K/E357Q(在一个单体上)和L368D/K370S(在IL-15复合物单体上)、pI变体Q295E/N384D/Q418E/N421D(在 IL-15复合物侧上)、两种单体上的消融变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K以及任选地两侧上的428L/434S变体。

在一些实施方式中，异二聚体蛋白包含：(a)第一单体，其包含有包含VH- CH1-铰链-CH2-CH3的重链，其中所述CH2-CH3是第一变异Fc结构域；(b)第二单体，其包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3-结构域接头-IL-15sushi结构域，其中CH2-CH3是第二变异Fc结构域；和(c)第三单体，其包含变异IL-15结构域；和(d)第四单体，其包含有包含VL-CL的轻链；其中VH和VL结构域结合人NKG2D。

在mAb-ncIL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示。

在mAb-ncIL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，带有IL-15N4D/N65D变异或IL-15D30N/N65D变异或IL-15D30N/E64Q/N65D变异。

在mAb-ncIL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，带有IL-15N4D/N65D变异或IL-15D30N/N65D变异或IL-15D30N/E64Q/N65D变异并带有适当的半胱氨酸取代基。

在mAb-ncIL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，以及偏斜变体对 S364K/E357Q:L368D/K370S。

在mab-ncIL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，以及带有IL-15N4D/N65D变异或IL- 15D30N/N65D变异或IL-15D30N/E64Q/N65D变异的偏斜变体对 S364K/E357Q:L368D/K370S。

在mAb-ncIL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，具有图57H形式：例如，偏斜变体S364K/E357Q(在scFv-Fc单体上)和L368D/K370S(在IL-15复合单体上)、pI变体 Q295E/N384D/Q418E/N421D(在IL-15复合侧上)、在两种单体上的消融变体 E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，以及任选的在两侧上的428L/434S变体。在此类实施方式中，形式包括IL-15N4D/N65D变体或IL-15D30N/N65D变体或IL-15D30N/E64Q/N65D 变体。

I.mAb-dsIL-15/Rα

此实施方式示出于图57I中，并且包括四个单体(虽然异二聚体融合蛋白是五聚体)。第一单体包含重链VH-CH1-铰链-CH2-CH3。第二单体包含具有IL-15Rα(sushi)结构域：VH-CH1-铰链-CH2-CH3-结构域接头-sushi结构域的重链，其中sushi结构域被工程化成含有半胱氨酸残基。第三单体是IL-15结构域，其已被工程化成含有半胱氨酸残基，使得 IL-15复合物在生理条件下形成。第四(和第五)单体是轻链VL-CL。这通常被称为“mAb- dsIL-15/Rα”，其中“ds”代表“二硫键”。

参看图57I，mAb-dsIL-15/Rα形式包含与第一和第二异二聚体Fc的N末端融合的VH，IL-15Rα(sushi)与异二聚体Fc区中的一个的C末端融合，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab，并且同时单独转染IL-15以使得由于工程化的半胱氨酸而形成共价连接的IL-15/Rα复合物。

在mAb-dsIL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用偏斜变体对 S364K/E357Q:L368D/K370S。一个优选实施方式利用偏斜变体S364K/E357Q(在一个单体上)和L368D/K370S(在IL-15复合物单体上)、pI变体Q295E/N384D/Q418E/N421D(在 IL-15复合物侧上)、两种单体上的消融变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K以及任选地两侧上的428L/434S变体。

在一些实施方式中，异二聚体蛋白包含：(a)第一单体，其包含有包含VH- CH1-铰链-CH2-CH3的重链，其中所述CH2-CH3是第一变异Fc结构域；(b)第二单体，其包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3-结构域接头-IL-15sushi结构域，其中所述变异IL-15sushi结构域包含半胱氨酸残基并且其中CH2-CH3是第二变异Fc结构域；(c)第三单体，其包含有包含半胱氨酸残基的变异IL-15结构域；和(d)第四单体，其包含有包含VL-CL的轻链；其中变异IL-15sushi结构域和变异IL-15结构域形成二硫键，并且VH和VL结构域结合人NKG2D。

在mAb-dsIL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示。

在mAb-dsIL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，带有IL-15N4D/N65D变异或IL-15D30N/N65D变异或IL-15D30N/E64Q/N65D变异。

在mAb-dsIL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，带有IL-15N4D/N65D变异或IL-15D30N/N65D变异或IL-15D30N/E64Q/N65D变异并带有适当的半胱氨酸取代基。

在mAb-dsIL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，以及偏斜变体对 S364K/E357Q:L368D/K370S。

在mAb-dsIL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，以及带有IL-15N4D/N65D变异或IL- 15D30N/N65D变异或IL-15D30N/E64Q/N65D变异的偏斜变体对 S364K/E357Q:L368D/K370S。

在mAb-dsIL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，具有图57I形式：例如，偏斜变体S364K/E357Q(在scFv-Fc单体上)和L368D/K370S(在IL-15复合单体上)、pI变体 Q295E/N384D/Q418E/N421D(在IL-15复合侧上)、在两种单体上的消融变体 E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，以及任选的在两侧上的428L/434S变体。在此类实施方式中，形式包括IL-15N4D/N65D变体或IL-15D30N/N65D变体或IL-15D30N/E64Q/N65D 变体。

J.中央-IL-15/Rα

此实施方式示出于图57J中，并且包含形成四聚体的四种单体。第一单体包含 VH-CH1-[任选的结构域接头]-IL-15-[任选的结构域接头]-CH2-CH3，其中第二任选的结构域接头有时是铰链结构域。第二单体包含VH-CH1-[任选的结构域接头]-sushi结构域-[任选的结构域接头]-CH2-CH3，其中第二任选的结构域接头有时是铰链结构域。第三(和第四)单体是轻链VL-CL。这通常被称为“中央-IL-15/Rα”。

参看图57J，中央-IL-15/Rα形式包含以重组方式与随后与异二聚体Fc的一侧进一步融合的IL-15的N末端融合的VH和以重组方式与随后与异二聚体Fc的另一侧进一步融合的IL-15Rα(sushi)的N末端融合的VH，同时单独转染对应轻链以形成具有VH的Fab。

在中央-IL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用偏斜变体对 S364K/E357Q:L368D/K370S。在scIL-15/RαX Fab形式中，一个优选实施方式利用偏斜变体 S364K/E357Q(在一个单体上)和L368D/K370S(在一个单体上)、pI变体 Q295E/N384D/Q418E/N421D(在一个单体上)、两种单体上的消融变体 E233P/L234V/L235A/G236_/S267K以及任选地两侧上的428L/434S变体。

在一些实施方式中，异二聚体蛋白包含：(a)第一单体，其从N末端到C末端包含VH-CH1-结构域接头-变异IL-15结构域-结构域接头-CH2-CH3，其中所述CH2-CH3是第一变异Fc结构域；(b)第二单体，其从N末端到C末端包含VH-CH1-结构域接头-变异IL- 15sushi结构域-结构域接头-CH2-CH3，其中所述CH2-CH3是第一变异Fc结构域；和(c)第三单体，其包含有包含VL-CL的轻链；其中VH和VL形成结合人NKG2D的抗原结合结构域。

在中央-IL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示。

在中央-IL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，带有IL-15N4D/N65D变异或IL-15D30N/N65D变异或IL-15D30N/E64Q/N65D变异。

在中央-IL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，带有IL-15N4D/N65D变异或IL-15D30N/N65D变异或IL-15D30N/E64Q/N65D变异并带有适当的半胱氨酸取代基。

在中央-IL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自1D7B4_H1L1、6E5A7_H0L0、6H7E7_H0L0、mAb E_H1L1、 11B2D10_H0L0、16F31_H1L1、mAb D_H1L1、KYK1.0_H1L1、KYK2.0_H0L0、mAb A_H1L1、mAb A_H1L2、mAb A_H2L1、mAb A_H2L2、mAb B_H1L1、mAb B_H1L1.1、 mAb B_H1L2、mAb B_H2L1、mAb B_H2L1.1、mAb B_H2L2、mAb B_H3L1、mAb B_H3L1.1、mAb B_H3L2、mAb C_H1L1、mAb C_H1L2、mAb C_H2L1、and mAb C_H2L2，如图117A至图117C所示，以及偏斜变体对S364K/E357Q:L368D/K370S。

在中央-IL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，以及带有IL-15N4D/N65D变异或IL- 15D30N/N65D变异或IL-15D30N/E64Q/N65D变异的偏斜变体对 S364K/E357Q:L368D/K370S。

在中央-IL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，具有图57J形式：例如，偏斜变体S364K/E357Q(在scFv-Fc单体上)和L368D/K370S(在IL-15复合单体上)、pI变体 Q295E/N384D/Q418E/N421D(在IL-15复合侧上)、在两种单体上的消融变体 E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，以及任选的在两侧上的428L/434S变体。在此类实施方式中，形式包括IL-15N4D/N65D变体或IL-15D30N/N65D变体或IL-15D30N/E64Q/N65D 变体。

K.中央-scIL-15/Rα

这个实施方式示出于图57K中，并且包含形成四聚体的四种单体。第一单体包含VH-CH1-[任选的结构域接头]-sushi结构域-结构域接头-IL-15-[任选的结构域接头]-CH2- CH3，其中第二任选的结构域接头有时是铰链结构域。第二单体包含VH-CH1-铰链-CH2- CH3。第三(和第四)单体是轻链VL-CL。这通常被称为“中央-scIL-15/Rα”，其中“sc”代表“单链”。

参看图57K，中央-scIL-15/Rα形式包含与IL-15Rα(sushi)的N末端融合的VH 和与异二聚体Fc的另一侧融合的VH，所述IL-15Rα(sushi)与随后与异二聚体Fc的一侧融合的IL-15进一步融合，同时单独转染对应轻链以形成具有VH的Fab。

在中央-scIL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用偏斜变体对 S364K/E357Q:L368D/K370S。

在一些实施方式中，异二聚体蛋白包含：(a)第一单体，其从N末端到C末端包含VH-CH1-结构域接头-IL-15sushi结构域-结构域接头-变体IL-15结构域-结构域接头- CH2-CH3，其中所述CH2-CH3是第一变异Fc结构域；(b)第二单体，其包含有包含VH- CH1-铰链-CH2-CH3的重链，其中CH2-CH3是第二变异Fc结构域；和(c)第三单体，其包含有包含VL-CL的轻链的；其中VH和VL形成结合人NKG2D的抗原结合结构域。

在中央-scIL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示。

在中央-scIL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自1D7B4_H1L1、6E5A7_H0L0、6H7E7_H0L0、mAb E_H1L1、 11B2D10_H0L0、16F31_H1L1、mAb D_H1L1、KYK1.0_H1L1、KYK2.0_H0L0、mAb A_H1L1、mAb A_H1L2、mAb A_H2L1、mAb A_H2L2、mAb B_H1L1、mAb B_H1L1.1、mAb B_H1L2、mAb B_H2L1、mAb B_H2L1.1、mAb B_H2L2、mAb B_H3L1、mAb B_H3L1.1、mAb B_H3L2、mAb C_H1L1、mAb C_H1L2、mAb C_H2L1、and mAb C_H2L2，如图117A至图117C所示，具有IL-15N4D/N65D变异或IL-15D30N/N65D变异或IL-15 D30N/E64Q/N65D变异。

在中央-scIL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，带有IL-15N4D/N65D变异或IL-15D30N/N65D变异或IL-15D30N/E64Q/N65D变异并带有适当的半胱氨酸取代基。

在中央-scIL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，以及偏斜变体对 S364K/E357Q:L368D/K370S。

在中央-scIL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，以及带有IL-15N4D/N65D变异或IL- 15D30N/N65D变异或IL-15D30N/E64Q/N65D变异的偏斜变体对 S364K/E357Q:L368D/K370S。

在中央-scIL-15/Rα形式中，一个优选实施方式利用了具有可变重和轻结构域对的抗NKG2D ABD，其选自：MS[NKG2D]_H0L0、KYK-1.0[NKG2D]_H1L1、KYK- 2.0[NKG2D]_H0L0、1D7B4[NKG2D]_H1L1、6E5A7[NKG2D]_H0L0、 6H7E7[NKG2D]_H0L0、11B2D10[NKG2D]_H0L0、16F31[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L1、mAb A[NKG2D]_H1L2、mAb A[NKG2D]_H2L1、mAb A[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H1L1、mAb B[NKG2D]_H1L1.1、mAb B[NKG2D]_H1L2、mAb B[NKG2D]_H2L1、mAb B[NKG2D]_H2L1.1、mAb B[NKG2D]_H2L2、mAb B[NKG2D]_H3L1、mAb B[NKG2D]_H3L1.1、mAb B[NKG2D]_H3L2、mAb C[NKG2D]_H1L1、mAb C[NKG2D]_H1L2、mAb C[NKG2D]_H2L1、 mAb C[NKG2D]_H2L2、mAb D[NKG2D]_H1L1、mAb E[NKG2D]_H1L1，如对应的SEQ ID NO、序列标识符、序列表和图117A至图117C所示，具有图57K形式：例如，偏斜变体S364K/E357Q(在scFv-Fc单体上)和L368D/K370S(在IL-15复合单体上)、pI变体 Q295E/N384D/Q418E/N421D(在IL-15复合侧上)、在两种单体上的消融变体 E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，以及任选的在两侧上的428L/434S变体。在此类实施方式中，形式包括IL-15N4D/N65D变体或IL-15D30N/N65D变体或IL-15D30N/E64Q/N65D 变体。

在一些实施方式中，本发明提供了一种异二聚Fc融合蛋白，其包含一种或多种结合NKG2D的ABD和IL-15/IL-15Rα融合蛋白，并且可以是图57A至图57F中所示的任何形式。在一个实施方式中，异二聚Fc融合蛋白包含两种与NKG2D结合的抗原结合结构域和IL-15/IL-15Rα融合蛋白，并且可以是图57G至图57K中所示的任何形式。

除了制备这些蛋白质和用其治疗患者的方法之外，还提供核酸、表达载体和宿主细胞。

VII.本发明的特别有用的实施方式

本发明提供了一种靶向NKG2D的IL-15/IL-15Rα异二聚体蛋白，其包含至少两个单体，其中一个单体包含抗NKG2D ABD，另一个单体包含IL-15/Rα复合物，它们使用异二聚Fc结构域连接。

在一些实施方式中，第一Fc结构域和第二Fc结构域具有一组选自由以下项组成的组的氨基酸取代：根据EU编号，S267K/L368D/K370S:S267K/S364K/E357Q； S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K； T411E/K360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L和K370S:S364K/E357Q。

在一些情况下，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有另外一组包含根据EU 编号的Q295E/N384D/Q418E/N421D的氨基酸取代。在一些情况下，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有另外一组由以下组成的氨基酸取代：根据EU编号，G236R/L328R、 E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、 E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和 E233P/L234V/L235A/G236del。

在一些实施方式中，第一Fc结构域和第二Fc结构域具有包含M428L/N434S 的氨基酸取代。

在一些实施方式中，IL-15蛋白具有选自由以下项组成的组的多肽序列：SEQ IDNO:1(全长人IL-15)和SEQ ID NO:2(截短的人IL-15或人IL-15成熟形式)，并且 IL-15Rα蛋白具有选自由以下项组成的组的多肽序列：SEQ ID NO:3(全长人IL-15Rα)和 SEQ ID NO:4(人IL-15Rα的(sushi结构域)。

在一些实施方式中，IL-15蛋白和IL-15Rα蛋白可以分别具有选自由以下项组成的组的一组氨基酸取代：E87C:D96/P97/C98；E87C:D96/C97/A98；V49C:S40C； L52C:S40C；E89C:K34C；Q48C:G38C；E53C:L42C；C42S:A37C；和L45C:A37C。

在一些实施方式中，IL-15蛋白是IL-15蛋白变体，其包含选自N1D、N4D、 D8N、D30N、D61N、E64Q、N65D或Q108E取代的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方式中，IL-15蛋白变体包含选自D30N、N1D/D30N、N1D/D61N、N1D/E64Q、N4D/D30N、N4D/D61N、N4D/E64Q、N4D/N65D、D8N/D61N、D8N/E64Q、D30N/E64Q、D30N/N65D、 D61N/E64Q、D61N/N65D、D61N/Q108E、E64Q/Q108E、N65D/Q108E、N1D/N4D/D8N、 D30N/E64Q/N65D、D61N/E64Q/N65D、D61N/N65D/Q108E、N1D/D61N/E64Q、 N1D/D61N/E64Q/Q108E或N4D/D61N/E64Q/Q108E的氨基酸取代。在特定实施方式中，IL- 15蛋白变体包含选自N4D/N65D、D30N/N65D或D30N/E64Q/N65D的氨基酸取代。

在一个方面中，本文所述的异二聚体蛋白包含(a)包含IL-15Rα蛋白、IL-15蛋白和第一Fc结构域的IL-15/IL-15Rα融合蛋白，其中IL-15Rα蛋白使用第一结构域接头共价附接至IL-15蛋白的N末端，并且IL-15蛋白使用第二结构域接头共价附接至第一Fc结构域的N末端，或其中IL-15蛋白使用第一结构域接头共价附接至IL-15Rα蛋白的N末端，并且 IL-15Rα蛋白使用第二结构域接头共价附接至第一Fc结构域的N末端；和(b)包含重链和轻链的抗原结合结构域单体，所述重链包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3单体，其中VH是可变重链并且CH2-CH3是第二Fc结构域，所述轻链包含可变轻链和轻链恒定结构域(例如，VL- CL)；其中第一Fc结构域和第二Fc结构域具有一组选自由以下组成的组的氨基酸取代：根据EU编号，S267K/L368D/K370S:S267K/S364K/E357Q；S364K/E357Q:L368D/K370S； L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411E/K360E/Q362E:D401K； L368D/K370S:S364K/E357L和K370S:S364K/E357Q。在一些实施方式中，第一Fc结构域和/ 或第二Fc结构域具有另外一组包含根据EU编号的Q295E/N384D/Q418E/N421D的氨基酸取代。在特定实施方式中，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有另外一组由以下组成的氨基酸取代：根据EU编号，G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和E233P/L234V/L235A/G236del。在一些情况下，本发明的IL-15蛋白是本文所述的IL-15蛋白变体中的任何一种IL-15蛋白变体。在一些实施方式中，IL-15蛋白变体具有本文图中所示的氨基酸序列。

在一些情况下，抗原结合结构域单体可以结合NKG2D。在一些实施方式中， NKG2D抗原结合结构域单体是抗NKG2D scFv或抗NKG2D Fab。在一些实施方式中，抗原结合结构域单体是抗NKG2D Fab。异二聚体蛋白在本文中可以称为“scIL-15/Rα(sushi)x抗 NKG2DFab”。

在一些实施方式中，本发明的靶向NKG2D的IL-15/IL-15Rα-Fc异二聚体融合蛋白是XENP27195、XENP27197、XENP27615、XENP27616、XENP27617、XENP27618、 XENP27619、XENP27620、XENP27621、XENP27622、XENP27623、XENP27624、XENP27625、XENP27626、XENP27627、XENP27628、XENP27629、XENP27630、 XENP27631、XENP27632、XENP27633、XENP27634、XENP27635、XENP27636、 XENP27637、XENP27638、XENP30592或XENP31077，其包括IL-15(N4D/N65D)变体。

在一些实施方式中，本发明的靶向NKG2D的IL-15/IL-15Rα-Fc异二聚体融合蛋白包含IL-15(N4D/N65D)变体。XENP27195，如图122A中所描绘，包含IL- 15(N4D/N65D)变体和具有可变重链和轻链对KYK2.0_H0L0的抗NKG2D ABD(如图117A 所示)。XENP27197，如图122A中所描绘，包含IL-15(N4D/N65D)变体和具有可变重链和轻链对1D7B4_H1L1的抗NKG2DABD(如图117A所示)和Xtend Fc变体。XENP27615，如图122B中所描绘，包含IL-15(N4D/N65D)变体和具有可变重链和轻链对11B2D10_H0L0 的抗NKG2D ABD(如图117A所示)。XENP27616，如图122B中所描绘，包含IL- 15(N4D/N65D)变体和具有可变重链和轻链对6E5A7_H0L0的抗NKG2D ABD(如图117A所示)。XENP27617，如图122C中所描绘，包含IL-15(N4D/N65D)变体和具有可变重链和轻链对6H7E7_H0L0的抗NKG2D ABD(如图117A所示)。XENP27618，如图122C中所描绘，包含IL-15(N4D/N65D)变体和具有可变重链和轻链对mAbE_H1L1的抗NKG2D ABD (如图117A所示)。XENP27619，如图122D中所描绘，包含IL-15(N4D/N65D)变体和具有可变重链和轻链对16F31_H1L1的抗NKG2D ABD(如图117A所示)和XtendFc变体。 XENP27620，如图122D中所描绘，包含IL-15(N4D/N65D)变体和具有可变重链和轻链对 mAb D_H1L1的抗NKG2D ABD(如图117B所示)。XENP27621，如图122E中所描绘，包含IL-15(N4D/N65D)变体和具有可变重链和轻链对KYK1.0_H1L1的抗NKG2D ABD(如图117A所示)。XENP27622，如图122E中所描绘，包含IL-15(N4D/N65D)变体和具有可变重链和轻链对mAbB_H1L1的抗NKG2D ABD(如图117B所示)。XENP27623，如图 122F中所描绘，包含IL-15(N4D/N65D)变体和具有可变重链和轻链对mAb B_H1L1.1的抗 NKG2D ABD(如图117B所示)。XENP27624，如图122F中所描绘，包含IL- 15(N4D/N65D)变体和具有可变重链和轻链对mAbB_H1L2的抗NKG2D ABD(如图117B所示)。XENP27625，如图122G中所描绘，包含IL-15(N4D/N65D)变体和具有可变重链和轻链对mAb B_H2L1的抗NKG2D ABD(如图117B所示)。XENP27626，如图122G中所描绘，包含IL-15(N4D/N65D)变体和具有可变重链和轻链对mAbB_H2L1.1的抗NKG2D ABD (如图117B所示)。XENP27627，如图122H中所描绘，包含IL-15(N4D/N65D)变体和具有可变重链和轻链对mAb B_H2L2的抗NKG2D ABD(如图117B所示)。XENP27628，如图122H中所描绘，包含IL-15(N4D/N65D)变体和具有可变重链和轻链对mAbB_H3L1的抗NKG2D ABD(如图117B所示)。XENP27629，如图122I中所描绘，包含IL- 15(N4D/N65D)变体和具有可变重链和轻链对mAb B_H3L1.1的抗NKG2D ABD(如图117B 所示)。XENP27630，如图122I中所描绘，包含IL-15(N4D/N65D)变体和具有可变重链和轻链对mAbB_H3L2的抗NKG2D ABD(如图117B所示)。XENP27631，如图122J中所描绘，包含IL-15(N4D/N65D)变体和具有可变重链和轻链对mAb C_H1L1的抗NKG2D ABD (如图117C所示)。XENP27632，如图122J中所描绘，包含IL-15(N4D/N65D)变体和具有可变重链和轻链对mAbC_H1L2的抗NKG2D ABD(如图117C所示)。XENP27633，如图 122K图122中所描绘，包含IL-15(N4D/N65D)变体和具有可变重链和轻链对mAb C_H2L1 的抗NKG2D ABD(如图117C所示)。XENP27634，如图122K中所描绘，包含IL- 15(N4D/N65D)变体和具有可变重链和轻链对mAbC_H2L2的抗NKG2D ABD(如图117C所示)。XENP27635，如图122L中所描绘，包含IL-15(N4D/N65D)变体和具有可变重链和轻链对mAb A_H1L1的抗NKG2D ABD(如图117B所示)。XENP27636，如图122L中所描绘，包含IL-15(N4D/N65D)变体和具有可变重链和轻链对mAbA_H1L2的抗NKG2D ABD (如图117B所示)。XENP27637，如图122M中所描绘，包含IL-15(N4D/N65D)变体和具有可变重链和轻链对mAb A_H2L1的抗NKG2D ABD(如图117B所示)。XENP27638，如图122M中所描绘，包含IL-15(N4D/N65D)变体和具有可变重链和轻链对mAbA_H2L2的抗 NKG2D ABD(如图117B所示)。XENP30592，如图122N中所描绘，包含IL- 15(N4D/N65D)变体和具有可变重链和轻链对1D7B4_H1L1的抗NKG2D ABD(如图117B所示)。XENP31077，如图122N中所描绘，包含IL-15(N4D/N65D)变体和具有可变重链和轻链对mAbA_H1L1的抗NKG2D ABD(如图117B所示)和Xtend Fc变体。

在一些实施方式中，本发明的靶向NKG2D的IL-15/IL-15Rα-Fc异二聚体融合蛋白是XILP30453、XENP30593、XENP30595、XENP31078或XENP31080，其包含IL- 15(D30N/N65D)变体。

在一些实施方式中，本发明的靶向NKG2D的IL-15/IL-15Rα-Fc异二聚体融合蛋白包含IL-15(D30N/N65D)变体。XENP30453，如图138A中所描绘，包含IL- 15(D30N/N65D)变体和具有可变重链和轻链对MS_H0L0的抗NKG2D ABD，如本文所述。 XENP30593，如图138A中所描绘，包含IL-15(D30N/N65D)变体和具有可变重链和轻链对 1D7B4_H1L1的抗NKG2D ABD(如图117B所示)。XENP30595，如图138B中所描绘，包含IL-15(D30N/N65D)变体和具有可变重链和轻链对mAb_A_H1L1的抗NKG2D ABD(如图117B所示)。XENP31078，如图138B至图138C中所描绘，包含IL-15(D30N/N65D)变体和具有可变重链和轻链对mAb_A_H1L1的抗NKG2DABD(如图117B所示)和Xtend Fc 变体。XENP31080，如图138C中所描绘，包含IL-15(D30N/N65D)变体和具有可变重链和轻链对1D7B4_H1L1的抗NKG2D ABD(如图117B所示)和XtendFc变体。

在一些实施方式中，本发明的靶向NKG2D的IL-15/IL-15Rα-Fc异二聚体融合蛋白是XENP30594、XENP30596、XENP31079、XENP31081、XENP33332、XENP33334、 XENP33336、XENP33338、XENP33340、XENP33342、XENP33344、XENP33346、 XENP33350、XENP33352、XENP33354、XENP33356、XENP33358、XENP33360、 XENP33362和XENP33364，其包含IL-15(D30N/E64Q/N65D)变体。

在一些实施方式中，本发明的靶向NKG2D的IL-15/IL-15Rα-Fc异二聚体融合蛋白包含IL-15(D30N/E64Q/N65D)变体。XENP30594，如图139A中所描绘，包含IL- 15(D30N/E64Q/N65D)变体和具有可变重链和轻链对1D7B4_H1L1的抗NKG2D ABD(如图 117B所示)。XENP30596，如图139A中所描绘，包含IL-15(D30N/E64Q/N65D)变体和具有可变重链和轻链对mAb_A_H1L1的抗NKG2D ABD(如图117B所示)。XENP31079，如图139B中所描绘，包含IL-15(D30N/E64Q/N65D)变体和具有可变重链和轻链对 mAb_A_H1L1的抗NKG2D ABD(如图117B所示)和Xtend Fc变体。XENP31081，如图 139B至图139C中所描绘，包含IL-15(D30N/E64Q/N65D)变体和具有可变重链和轻链对 1D7B4_H1L1的抗NKG2D ABD(如图117所示)和XtendFc变体。XENP33332，如图 139C中所描绘，包含IL-15(D30N/E64Q/N65D)变体和具有可变重链和轻链对 MS[NKG2D]_H0L0的抗NKG2D ABD和Xtend Fc变体。XENP33334，如图139C中所描绘，包含IL-15(D30N/E64Q/N65D)变体和具有可变重链和轻链对mAb C[NKG2D]_H2L1的抗NKG2D ABD(如图117C所示)和Xtend Fc变体。XENP33336，如图139D中所描绘，包含IL-15(D30N/E64Q/N65D)变体和具有可变重链和轻链对mAb E[NKG2D]_H1L1的抗 NKG2D ABD(如图117A所示)和Xtend Fc变体。XENP33338，如图139D中所描绘，包含IL-15(D30N/E64Q/N65D)变体和具有可变重链和轻链对16F31[NKG2D]_H1L1的抗 NKG2D ABD(如图117A所示)和Xtend Fc变体。XENP33340，如图139E中所描绘，包含IL-15(D30N/E64Q/N65D)变体和具有可变重链和轻链对KYK-1.0[NKG2D]_H1L1的抗 NKG2D ABD(如图117A所示)和Xtend Fc变体。XENP33342，如图139E中所描绘，包含IL-15(D30N/E64Q/N65D)变体和具有可变重链和轻链对KYK-2.0[NKG2D]_H0L0的抗 NKG2D ABD(如图117A所示)和Xtend Fc变体。XENP33344，如图139F中所描绘，包含IL-15(D30N/E64Q/N65D)变体和具有可变重链和轻链对mAb B[NKG2D]_H1L1的抗NKG2D ABD(如图117B所示)和Xtend Fc变体。XENP33346，如图139F中所描绘，包含 IL-15(D30N/E64Q/N65D)变体和具有可变重链和轻链对mAb D[NKG2D]_H1L1的抗NKG2D ABD(如图117B所示)和Xtend Fc变体。XENP33350，如图139G中所描绘，包含IL- 15(D30N/E64Q/N65D)变体和具有可变重链和轻链对MS[NKG2D]_H0L0的抗NKG2D ABD。XENP33352，如图139G中所描绘，包含IL-15(D30N/E64Q/N65D)变体和具有可变重链和轻链对mAb C[NKG2D]_H2L1的抗NKG2D ABD(如图117C所示)。XENP33352，如图 139H中所描绘，包含IL-15(D30N/E64Q/N65D)变体和具有可变重链和轻链对mAb E[NKG2D]_H1L1的抗NKG2DABD(如图117A所示)。XENP33356，如图139H中所描绘，包含IL-15(D30N/E64Q/N65D)变体和具有可变重链和轻链对16F31[NKG2D]_H1L1的抗 NKG2D ABD(如图117A所示)。XENP33358，如图139I中所描绘，包含IL- 15(D30N/E64Q/N65D)变体和具有可变重链和轻链对KYK-1.0[NKG2D]_H1L1的抗NKG2D ABD(如图117A所示)。XENP33360，如图139I中所描绘，包含IL-15(D30N/E64Q/N65D) 变体和具有可变重链和轻链对KYK-2.0[NKG2D]_H0L0的抗NKG2D ABD(如图117A所示)。XENP33362，如图139J中所描绘，包含IL-15(D30N/E64Q/N65D)变体和具有可变重链和轻链对mAb B[NKG2D]_H1L1的抗NKG2D ABD(如图117B所示)。XENP33364，如图139J中所描绘，包含IL-15(D30N/E64Q/N65D)变体和具有可变重链和轻链对mAb D[NKG2D]_H1L1的抗NKG2D ABD(如图117B所示)。

本文还提供一种核酸组合物，所述核酸组合物包含一种或多种编码本文所述的靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合异二聚体蛋白中的任一种靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合异二聚体蛋白的核酸。在另一方面中，本发明提供一种表达载体组合物，所述表达载体组合物包含一个或多个表达载体，每个载体包含核酸，使得一个或多个表达载体编码本文所述的异二聚体蛋白中的任何一种异二聚体蛋白。在其它方面中，提供包含核酸组合物或表达载体组合物中的任一者的宿主细胞。在另一方面中，本发明提供一种产生本文所述的异二聚体蛋白中的任何一种异二聚体蛋白的方法。所述方法包括(a)在表达异二聚体蛋白的合适条件下培养此类宿主细胞，以及(b)回收异二聚体蛋白。在又另一方面中，本发明提供一种治疗患者 (例如，人患者)的癌症的方法，所述方法包含向所述患者施用治疗有效量的本文公开的异二聚体蛋白中的任何一种异二聚体蛋白。在一些示例中，本文提供一种治疗有需要的患者的癌症的方法。

在一些实施方式中，靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体促进CD8⁺T细胞(包括CD8效应T细胞)的扩增。在一些实施方式中，靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体促进NK细胞的扩增。在一些实施方式中，靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体介导CD8效应T 细胞和NK细胞的扩增。在一些情况下，本文所述的靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体中的任何一种靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体均可诱导CD8⁺T细胞的增殖。

在一些实施方式中，靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体促进CD4⁺T细胞的扩增。在一些情况下，此类靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合蛋白可促进CD4⁺T细胞扩增至低于CD8⁺T细胞的程度。换句话说，与CD8⁺T细胞和/或NK细胞相比，示例性的靶向 NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合蛋白在诱导CD4⁺T细胞的增殖方面效力较低。在一些实施方式中，靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体稳健地并且选择性地使CD8⁺T细胞和NK细胞扩增超过CD4⁺T细胞。在一些情况下，施用本文概述的靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合蛋白诱导受试者中可用于治疗肿瘤的CD8/CD4T细胞比率。

在一些实施方式中，本文概述的靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体可以与检查点阻断疗法组合施用。在一些实施方式中，包含靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合蛋白和检查点阻断疗法的组合疗法增强了淋巴细胞群的扩增，所述淋巴细胞群包括但不限于 CD45+淋巴细胞、CD3⁺T细胞、CD8⁺T细胞和NK细胞。在一些实施方式中，与单一疗法相比，联合疗法增加了淋巴细胞群的扩增。在一些实施方式中，与单一疗法相比，联合疗法增加了CD4⁺T细胞的扩增。在一些实施方式中，靶向NKG2D的IL-15/IL-15RαFc融合蛋白和检查点阻断抗体同时或顺序地施用。

在一些实施方式中，将选自由XENP27195、XENP27197、XENP27615、 XENP27616、XENP27617、XENP27618、XENP27619、XENP27620、XENP27621、 XENP27622、XENP27623、XENP27624、XENP27625、XENP27626、XENP27627、 XENP27628、XENP27629、XENP27630、XENP27631、XENP27632、XENP27633、 XENP27634、XENP27635、XENP27636、XENP27637、XENP27638、XENP30592和 XENP31077组成的组的靶向NKG2D的IL-15(N4D/N65D)变体/IL-15Rα-Fc异二聚体融合蛋白与检查点阻断疗法组合施用于受试者，所述检查点阻断疗法包含选自由以下项组成的组中的一者：抗PD-1抗体、抗TIM3抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体、抗TIGIT抗体和抗 LAG3抗体。在一些实施方式中，抗PD-1抗体是纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗 (pembrolizumab)或匹地利珠单抗(pidilizumab)。在某些实施方式中，将选自由XENP27195、 XENP27197、XENP27615、XENP27616、XENP27617、XENP27618、XENP27619、XENP27620、XENP27621、XENP27622、XENP27623、XENP27624、XENP27625、 XENP27626、XENP27627、XENP27628、XENP27629、XENP27630、XENP27631、XENP27632、XENP27633、XENP27634、XENP27635、XENP27636、XENP27637、 XENP27638、XENP30592和XENP31077组成的组的靶向NKG2D的IL-15(N4D/N65D)变体 /IL-15Rα-Fc异二聚体融合蛋白与抗PD-1抗体组合施用于受试者，所述抗PD-1抗体为例如但不限于纳武单抗、派姆单抗或匹地利珠单抗。

在一些实施方式中，将选自由XENP30453、XENP30593、XENP30595、 XENP31078和XENP31080组成的组的靶向NKG2D的IL-15(D30N/N65D)变体/IL-15Rα-Fc 异二聚体融合蛋白与检查点阻断疗法组合施用于受试者，所述检查点阻断疗法包含选自由以下项组成的组中的一者：抗PD-1抗体、抗TIM3抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体、抗 TIGIT抗体和抗LAG3抗体。在一些实施方式中，抗PD-1抗体是纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)或匹地利珠单抗(pidilizumab)。

在某些实施方式中，将选自由XENP30453、XENP30593、XENP30595、 XENP31078和XENP31080组成的组的靶向NKG2D的IL-15(D30N/N65D)变体/IL-15Rα-Fc 异二聚体融合蛋白与抗PD-1抗体组合施用于受试者，所述抗PD-1抗体为例如但不限于纳武单抗、派姆单抗或匹地利珠单抗。

在一些实施方式中，将选自由XENP30594、XENP30596、XENP31079、 XENP31081、XENP33332、XENP33334、XENP33336、XENP33338、XENP33340、 XENP33342、XENP33344、XENP33346、XENP33350、XENP33352、XENP33354、 XENP33356、XENP33358、XENP33360、XENP33362和XENP33364组成的组的靶向 NKG2D的IL-15(D30N/E64Q/N65D)变体/IL-15Rα-Fc异二聚体融合蛋白与检查点阻断疗法组合施用于受试者，所述检查点阻断疗法包含选自由以下项组成的组中的一者：抗PD-1抗体、抗TIM3抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L1抗体、抗TIGIT抗体和抗LAG3抗体。在一些实施方式中，抗PD-1抗体是纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)或匹地利珠单抗 (pidilizumab)。在某些实施方式中，将选自由XENP30594、XENP30596、XENP31079、 XENP31081、XENP33332、XENP33334、XENP33336、XENP33338、XENP33340、 XENP33342、XENP33344、XENP33346、XENP33350、XENP33352、XENP33354、 XENP33356、XENP33358、XENP33360、XENP33362和XENP33364组成的组的靶向NKG2D的IL-15(D30N/E64Q/N65D)变体/IL-15Rα-Fc异二聚体融合蛋白与抗PD-1抗体组合施用于受试者，所述抗PD-1抗体为例如但不限于纳武单抗、派姆单抗或匹地利珠单抗。

VIII.本发明的附加实施方式

在一个方面中，本发明提供具有靶向的IL-15/IL-15Rα异二聚体蛋白，其包含：(a)第一单体，其从N末端到C末端包含：i)IL-15IL sushi结构域；ii)第一结构域接头；iii)变异IL-15结构域；iv)第二结构域接头；v)包含CH2-CH3的第一变异Fc结构域；和(b)第二单体，其从N末端到C末端包含：i)scFv结构域；ii)第三结构域接头；iii)包含CH2-CH3的第二变异Fc结构域；其中scFv结构域包含第一可变重结构域、scFv接头和第一可变轻结构域，其中scFv结构域结合人NKG2D。

在本发明的其它方面中，本文提供了一种靶向的IL-15/IL-15Rα异二聚体蛋白，其包含：(a)第一单体，其从N末端到C末端包含：i)IL-15sushi结构域；ii)第一结构域接头；iii)包含CH2-CH3的第一变异Fc结构域；(b)第二单体，其从N末端到C末端包含：i)scFv 结构域；ii)第三结构域接头；iii)包含CH2-CH3的第二变异Fc结构域；其中所述scFv结构域包含第一可变重结构域、scFv接头和第一可变轻结构域；和(c)第三单体，其包含变异IL- 15结构域，其中所述scFv结构域结合人NKG2D。在一些优选的实施方式中，此类靶向的 IL-15/IL-15Rα异二聚体蛋白结合人NKG2D。

在本发明的其它方面中，本文提供了一种靶向的IL-15/IL-15Rα异二聚体蛋白，其包含：(a)第一单体，其从N末端到C末端包含：i)具有半胱氨酸残基的变异IL-15sushi结构域；ii)第一结构域接头；iii)包含CH2-CH3的第一变异Fc结构域；(b)第二单体，其从N 末端到C末端包含：i)scFv结构域；ii)第三结构域接头；iii)包含CH2-CH3的第二变异Fc结构域；其中scFv结构域包含第一可变重链结构域、scFv接头和第一可变轻链结构域；和(c) 第三单体，其包含有包含半胱氨酸残基的IL-15结构域；其中变异IL-15sushi结构域和变异 IL-15结构域形成二硫键，并且scFv结构域结合人NKG2D。在一些优选的实施方式中，此类靶向的IL-15/IL-15Rα异二聚体蛋白结合人NKG2D。

在本发明的一些方面中，本文提供了一种靶向的IL-15/IL-15Rα异二聚体蛋白，其包含：(a)第一单体，其从N末端到C末端包含：i)IL-15sushi结构域；ii)第一结构域接头；iii)变异IL-15结构域；iv)第二结构域接头；v)包含CH2-CH3的第一变异Fc结构域；(b)第二单体，其包含有包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3的重链，其中CH2-CH3是第二变异Fc结构域；和(c)包含VL-CL的轻链；其中VH1和VL形成结合人NKG2D的抗原结合结构域。在一些优选的实施方式中，此类靶向的IL-15/IL-15Rα异二聚体蛋白结合人NKG2D。

在本发明的一些方面中，本文提供了一种靶向的IL-15/IL-15Rα异二聚体蛋白，其包含：(a)第一单体，其包含有包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3的重链，其中CH2-CH3是第一变异Fc结构域；(b)第二单体，其从N末端到C末端包含：i)IL-15sushi结构域；ii)第一结构域接头；iii)包含CH2-CH3的第一变异Fc结构域；(c)第三单体，其包含变异IL-15结构域，以及(d)第四单体，其包含有包含VL-CL的轻链；其中VH1和VL形成结合人NKG2D 的抗原结合结构域。在一些优选的实施方式中，此类靶向的IL-15/IL-15Rα异二聚体蛋白结合人NKG2D。

在本发明的其它方面中，本文提供了一种靶向的IL-15/IL-15Rα异二聚体蛋白，其包含：(a)第一单体，其包含有包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3的重链，其中所述CH2-CH3 是第一变异Fc结构域；(b)第二单体，其从N末端到C末端包含：i)具有半胱氨酸残基的变异IL-15sushi结构域；ii)第一结构域接头；和iii)包含CH2-CH3的第一变异Fc结构域；(c) 第三单体，其包含有包含半胱氨酸残基的变异IL-15结构域；和(d)第四单体，其包含有包含 VL-CL的轻链；其中变异IL-15sushi结构域和变异IL-15结构域形成二硫键，并且scFv结构域结合人NKG2D。在一些优选的实施方式中，此类靶向的IL-15/IL-15Rα异二聚体蛋白结合人NKG2D。

在本发明的一些方面中，本文提供了一种靶向的IL-15/IL-15Rα异二聚体蛋白，其包含：(a)第一单体，其包含有包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3的重链，其中所述CH2-CH3 是第一变异Fc结构域；(b)第二单体，其包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3-结构域接头-IL-15 sushi结构域-结构域接头-IL-15变体，其中所述CH2-CH3是第二变异Fc结构域；(c)第三单体，其包含有包含VL-CL的轻链；其中VH和VL结构域结合人NKG2D。在一些优选的实施方式中，此类靶向的IL-15/IL-15Rα异二聚体蛋白结合人NKG2D。

在本发明的一些方面中，本文提供了一种靶向的IL-15/IL-15Rα异二聚体蛋白，其包含：(a)第一单体，其包含有包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3的重链，其中所述CH2-CH3 是第一变异Fc结构域；(b)第二单体，其包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3-结构域接头-IL-15 sushi结构域，其中所述CH2-CH3是第二变异Fc结构域；(c)第三单体，其包含变异IL-15结构域；以及(d)第四单体，其包含有包含VL-CL的轻链；其中VH和VL结构域结合人 NKG2D。在一些优选的实施方式中，此类靶向的IL-15/IL-15Rα异二聚体蛋白结合人 NKG2D。

在本发明的一些方面中，本文提供了一种靶向的IL-15/IL-15Rα异二聚体蛋白，其包含：(a)第一单体，其包含有包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3的重链，其中所述CH2-CH3 是第一变异Fc结构域；(b)第二单体，其包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3-结构域接头-变异IL-15sushi结构域，其中所述变异IL-15sushi结构域包含半胱氨酸残基，其中所述CH2-CH3是第二变异Fc结构域；(c)第三单体，其包含有包含半胱氨酸残基的变异IL-15结构域；和(d)第四单体，其包含有包含VL-CL的轻链；其中所述变异IL-15sushi结构域和变异IL-15结构域形成二硫键，并且VH和VL结构域形成结合人NKG2D的抗原结合结构域。在一些优选的实施方式中，此类靶向的IL-15/IL-15Rα异二聚体蛋白结合人NKG2D。

在本发明的各种方面中，本文提供了一种靶向的IL-15/IL-15Rα异二聚体蛋白，其包含：(a)第一单体，其从N末端到C末端包含VH-CH1-结构域接头-变异IL-15结构域-结构域接头-CH2-CH3，其中所述CH2-CH3是第一变异Fc结构域；(b)第二单体，其从N末端到C末端包含VH-CH1-结构域接头-变异IL-15sushi结构域-结构域接头-CH2-CH3，其中所述CH2-CH3是第一变异Fc结构域；和(c)第三单体，其包含有包含VL-CL的轻链；其中 VH和VL形成结合人NKG2D的抗原结合结构域。在一些优选的实施方式中，此类靶向的 IL-15/IL-15Rα异二聚体蛋白结合人NKG2D。

在本发明的各种方面中，本文提供了一种靶向的IL-15/IL-15Rα异二聚体蛋白，其包含：(a)第一单体，其从N末端到C末端包含VH-CH1-结构域接头-IL-15sushi结构域-结构域接头-变异IL-15结构域-结构域接头-CH2-CH3，其中所述CH2-CH3是第一变异Fc结构域；(b)第二单体，其包含有包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3的重链，其中所述CH2-CH3是第二变异Fc结构域；和(c)第三单体，其包含有包含VL-CL的轻链；其中VH和VL形成结合人NKG2D的抗原结合结构域。

在一些实施方式中，本文所述的第一Fc结构域和第二Fc结构域具有一组选自由以下项组成的组的氨基酸取代：根据EU编号，S267K/L368D/K370S:S267K/S364K/E357Q；S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K； T411E/K360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L和K370S:S364K/E357Q。在一些实施方式中，第一和/或第二Fc结构域具有另外一组包含根据EU编号的 Q295E/N384D/Q418E/N421D的氨基酸取代。在其它例子中，第一Fc结构域和/或第二Fc结构域具有另外一组由以下组成的氨基酸取代：根据EU编号，G236R/L328R、 E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、 E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和 E233P/L234V/L235A/G236del。在一些实施方式中，第一Fc结构域和第二Fc结构域均具有 S364K/E357Q:L368D/K370S。在一些实施方式中，变异Fc结构域各自包含M428L/N434S。在一些实施方式中，变异Fc结构域各自包含E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。

在一些方面中，本文所述的靶向的IL-15/IL-15Rα异二聚体蛋白的IL-15蛋白具有一个或多个选自由以下项组成的组的氨基酸取代：N1D、N4D、D8N、D30N、D61N、E64Q、N65D和Q108E。在一些实施方式中，变异IL-15结构域包含选自由以下项组成的组的氨基酸取代：N1D、N4D、D8N、D30N、D61N、E64Q、N65D、Q108E、N1D/D61N、 N1D/E64Q、N4D/D61N、N4D/E64Q、N4D/N65D、D8N/D61N、D8N/E64Q、E64Q/Q108E、 N1D/N4D/D8N、D61N/E64Q/N65D、N1D/D61N/E64Q/Q108E、N4D/D61N/E64Q/Q108E、 N4D/N65D、D30N/N65D和D30N/E64Q/N65D。在某些实施方式中，变异IL-15结构域包含选自由以下项组成的组的氨基酸取代：N4D/N65D、D30N/N65D和D30N/E64Q/N65D。

在一些实施方式中，形成结合人NKG2D的抗原结合结构域的VH和VL选自 MS_H0L0、1D7B4_H1L1、6E5A7_H0L0、6H7E7_H0L0、mAb E_H1L1、11B2D10_H0L0、 16F31_H1L1、mAb D_H1L1、KYK1.0_H1L1、KYK2.0_H0L0、mAb A_H1L1、mAb A_H1L2、mAb A_H2L1、mAb A_H2L2、mAbB_H1L1、mAb B_H1L1.1、mAb B_H1L2、 mAb B_H2L1、mAb B_H2L1.1、mAb B_H2L2、mAb B_H3L1、mAb B_H3L1.1、mAb B_H3L2、mAb C_H1L1、mAb C_H1L2、mAb C_H2L1和mAb C_H2L2，如图117A至图 117C所示。

在一些实施方式中，本发明的靶向NKG2D的IL-15/IL-15Rα异二聚体蛋白选自由以下项组成的组：XENP27195、XENP27197、XENP27615、XENP27616、XENP27617、 XENP27618、XENP27619、XENP27620、XENP27621、XENP27622、XENP27623、 XENP27624、XENP27625、XENP27626、XENP27627、XENP27628、XENP27629、 XENP27630、XENP27631、XENP27632、XENP27633、XENP27634、XENP27635、 XENP27636、XENP27637、XENP27638、XENP30592和XENP31077。

在一些实施方式中，本文提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含选自由以下项组成的组的异二聚体蛋白：XENP27195、XENP27197、XENP27615、XENP27616、XENP27617、XENP27618、XENP27619、XENP27620、XENP27621、XENP27622、 XENP27623、XENP27624、XENP27625、XENP27626、XENP27627、XENP27628、XENP27629、XENP27630、XENP27631、XENP27632、XENP27633、XENP27634、 XENP27635、XENP27636、XENP27637、XENP27638、XENP30592和XENP31077，以及药学上可接受的载体。

IX.本发明的核酸

本发明还提供了编码本发明的靶向的异二聚体融合蛋白的核酸组合物(或者，在单体Fc结构域蛋白的情况下，也是编码单体Fc结构域蛋白的核酸)。

如本领域技术人员将理解，核酸组合物将取决于靶向的异二聚体融合蛋白的形式。因此，例如，当所述形式需要三个氨基酸序列时，可以将三个核酸序列并入一个或多个表达载体中以用于表达。类似地，一些形式仅需要两个核酸；同样，它们可以被放入一个或两个表达载体中，或4个或5个表达载体中。如本文所述，例如，一些构建体具有轻链的两个拷贝。

如所属领域已知，编码本发明的组分的核酸可以如本领域已知的那样并入表达载体中，并且取决于用于产生本发明的靶向的IL-15/Rα-Fc融合异二聚体蛋白的宿主细胞。通常，核酸可操作地连接到任何数量的调控元件(启动子、复制起点、可选择标记、核糖体结合位点、诱导剂等)。表达载体可以是染色体外的或整合载体。

然后将本发明的核酸和/或表达载体转化到本领域众所周知的任何数量的不同类型的宿主细胞中，包括哺乳动物、细菌、酵母、昆虫和/或真菌细胞，其中哺乳动物细胞 (例如CHO细胞)在许多实施方式中使用。

在一些实施方式中，编码每种单体的核酸(取决于形式适用)各自包含在单一表达载体内，通常在不同或相同的启动子控制下。在特别用于本发明的实施方式中，不同表达载体上都含有这两种或三种核酸中的每一种。如本文中和美国临时申请第62/025,931号、美国专利申请公开案第2015/0307629号和国际专利公开案第WO 2015/149077号(其所有以引用方式并入本文中)所示，不同载体比例可用于驱使异二聚体形成。也就是说，令人惊讶地，尽管蛋白质以1:1:2的比例包含第一单体:第二单体:轻链(例如具有三个包含异二聚抗体的多肽的实施方式)，但这些比例并不是产生最佳结果的比例。

如本领域所熟知的，通过培养包含表达载体的宿主细胞制备本发明的靶向的IL-15/Rα-Fc融合异二聚体蛋白。一旦产生，就进行传统的融合蛋白或抗体纯化步骤，包括离子交换色谱法步骤。如本文所论述，使两种单体的pI相差至少0.5可以允许通过离子交换色谱或等电点聚焦或对等电点敏感的其它方法来实现分离。也就是说，包含改变每个单体的等电点(pI)的pI取代使得每个单体具有不同的pI并且异二聚体也具有不同的pI，从而促进异二聚体的等电纯化(例如，阴离子交换色谱法、阳离子交换色谱法)。这些取代还有助于确定和监测纯化后的任何污染性同源二聚体(例如，IEF凝胶、cIEF和分析IEX柱)。

X.靶向的IL-15/IL-15Rαx抗原结合结构域异二聚体融合蛋白的生物学和生化功能

通常，向患有癌症的患者施用本发明的靶向的IL-15/IL-15Rαx抗原结合结构域异二聚体融合蛋白，并且以本文所述的多种方式评定功效。因此，虽然可以进行标准的功效测定，如癌症负荷、肿瘤尺寸、转移的存在或程度的评估等，但是也可以基于免疫状况评估来评估免疫肿瘤学治疗。这可以通过多种方式完成，包括体外和体内分析。举例来说，可以进行免疫状态(例如伊匹单抗(ipilimumab)治疗之后ICOS+CD4+ T细胞的存在)以及其它测量值(例如肿瘤负荷、尺寸、侵袭性、淋巴结(LN)受累、转移等)的变化的评估。因此，可以评估以下中的任一个或全部：PVRIG对CD4+ T细胞活化或增殖、CD8+ T(CTL) 细胞活化或增殖、CD8+ T细胞介导的细胞毒性活性和/或CTL介导的细胞耗竭、NK细胞活性和NK介导的细胞耗竭的抑制效应；检查点对Treg细胞分化和增殖和Treg或骨髓来源的抑制细胞(MDSC)介导的免疫抑制或免疫耐受性的增强作用；和/或检查点对由免疫细胞进行的促炎性细胞因子生产的影响，例如通过T细胞或其它免疫细胞产生的IL-2、IFN-γ或 TNF-α。

在一些实施方式中，通过使用例如CFSE稀释法、免疫效应细胞的Ki67细胞内染色以及3H-胸苷并入法评估免疫细胞增殖来评定治疗。

在一些实施方式中，通过评估基因表达的增加或活化相关标志物的蛋白质含量的增加来进行治疗的评定，所述标志物包括以下中的一个或多个：CD25、CD69、CD137、 ICOS、PD1、GITR、OX40以及通过CD107A的表面表达测量的细胞脱粒。

通常，如本领域已知的那样进行基因表达测定。

通常，也如本领域已知的那样类似地执行蛋白质表达测量。

在一些实施方式中，通过估计众多细胞参数来评定通过靶细胞活力检测测量的细胞毒性活性，从而进行治疗的评定，所述细胞参数例如酶活性(包括蛋白酶活性)、细胞膜渗透性、细胞粘附、ATP产生、辅酶产生以及核苷酸吸收活性。这些分析的具体示例包括但不限于台盼蓝(Trypan Blue)或PI染色、51Cr或35S释放法、LDH活性、MTT和/或 WST分析、钙黄绿素-AM分析、基于发光的分析以及其它分析。

在一些实施方式中，通过使用众所周知的技术评估通过细胞因子产生测量的T 细胞活性、使用包括但不限于IFNγ、TNFα、GM-CSF、IL2、IL6、IL4、IL5、IL10、IL13 的细胞因子的培养物上清液中的细胞内度量，来进行处理的评估。

因此，可以使用评估以下中的一个或多个的分析来评定治疗：(i)免疫反应的增加；(ii)αβ和/或γδT细胞活化的增加；(iii)细胞毒性T细胞活性的增加；(iv)NK和/或NKT细胞活性的增加；(v)αβ和/或γδT细胞抑制的缓解；(vi)促炎性细胞因子分泌的增加；(vii) IL-2分泌的增加；(viii)干扰素γ产生的增加；(ix)Th1反应的增加；(x)Th2反应的减少；(xi) 减少或消除调节性T细胞(Treg)中的至少一种的细胞数量和/或活性。。

A.测量功效和效力的测定

在一些实施方式中，使用如本领域已知的混合淋巴细胞反应(MLR)测定来评定 T细胞活化。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方式中，信号传导通路测定测量免疫应答的增加或减少，如例如通过不同因子的磷酸化或去磷酸化或通过测量其它翻译后修饰所测量的。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方式中，信号传导通路分析测量αβ和/或γδT细胞活化的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方式中，信号传导通路分析测量细胞毒性T细胞活性的增加或减少，如例如通过直接杀伤靶细胞(例如癌细胞)或通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方式中，信号传导通路分析测量NK和/或NKT细胞活性的增加或减少，如通过直接杀伤靶细胞(例如癌细胞)或通过细胞因子分泌或通过如例如CD107a等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方式中，信号传导途径测定测量αβ和/或γδT细胞抑制的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量的。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方式中，信号传导途径测定测量促炎性细胞因子分泌的增加或减少，如例如通过ELISA或通过Luminex或通过基于微珠的多重方法或通过细胞内染色和FACS 分析或通过Alispot等所测量的。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方式中，信号传导通路分析测量IL-2分泌的增加或减少，如例如通过ELISA或通过Luminex或通过基于珠粒的多重方法或通过细胞内染色和FACS分析或通过Alispot等所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方式中，信号传导通路分析测量干扰素γ产生的增加或减少，如例如通过ELISA或通过Luminex或通过基于珠粒的多重方法或通过细胞内染色和FACS分析或通过Alispot等所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方式中，信号传导途径测定测量Th1反应的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化所测量的。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方式中，信号传导途径测定测量Th2反应的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化所测量的。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方式中，信号传导途径测定测量至少一种调控T细胞(Treg)的细胞数量和/或活性的增加或减少，如例如通过流式细胞术或通过IHC所测量的。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。

在一个实施方式中，信号传导途径测定测量M2巨噬细胞细胞数量的增加或减少，如例如通过流式细胞术或通过IHC所测量的。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。

在一个实施方式中，信号传导途径测定测量M2巨噬细胞促肿瘤发生活性的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化所测量的。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。

在一个实施方式中，信号传导途径测定测量N2嗜中性粒细胞增量的增加或减少，如例如通过流式细胞术或通过IHC所测量的。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。

在一个实施方式中，信号传导途径测定测量N2嗜中性粒细胞促肿瘤发生活性的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化所测量的。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。

在一个实施方式中，信号传导途径测定测量T细胞活化抑制的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量的。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方式中，信号传导途径测定测量CTL活化抑制的增加或减少，如例如通过直接杀伤靶细胞如例如癌细胞或通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量的。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方式中，信号传导途径测定测量αβ和/或γδT细胞耗尽的增加或减少，如例如通过活化标志物的表达变化所测量的。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。

在一个实施方式中，信号传导途径测定测量αβ和/或γδT细胞反应的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量的。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方式中，信号传导通路分析测量抗原特异性记忆反应的刺激的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD45RA、CCR7等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。。

在一个实施方式中，信号传导路径分析测量癌细胞的凋亡或溶解的增加或减少，如例如通过细胞毒性分析(如例如MTT、¹⁵Cr释放、钙黄绿素AM)或通过基于流式细胞术的分析(如例如CFSE稀释或碘化丙啶染色等)所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方式中，信号传导通路分析测量对癌细胞的细胞毒性或细胞抑制作用的刺激的增加或减少，如例如通过细胞毒性分析(如例如MTT、¹⁵Cr释放、钙黄绿素AM) 或通过基于流式细胞仪的分析(如例如CFSE稀释或碘化丙啶染色等)所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方式中，信号传导通路分析测量癌细胞的直接杀伤的增加或减少，如例如通过细胞毒性分析(如例如MTT、¹⁵Cr释放、钙黄绿素AM)或通过基于流式细胞仪的分析(如例如CFSE稀释或碘化丙啶染色等)所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方式中，信号传导途径测定测量Th17活性的增加或减小，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过活化标志物的表达变化所测量的。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方式中，信号传导通路分析测量补体依赖性细胞毒性和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的诱导的增加或减少，如例如通过细胞毒性分析(如例如MTT、¹⁵Cr释放、钙黄绿素AM)或通过基于流式细胞仪的分析(如例如CFSE稀释或碘化丙啶染色等)所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方式中，例如通过直接杀伤靶细胞(例如癌细胞)或通过细胞因子分泌或通过增殖或活化标志物(例如CD137、CD107a、PD1等)的表达变化来测量T细胞活化。对于T细胞，增殖、细胞表面活化标志物(例如CD25、CD69、CD137、PD1)、细胞毒性(杀伤靶细胞的能力)和细胞因子产生(例如IL-2、IL-4、IL-6、IFNγ、TNF-a、IL- 10、IL-17A)的增加将指示免疫调节，这将符合癌细胞的杀伤增强。

在一个实施方式中，例如通过直接杀伤靶细胞(例如癌细胞)或通过细胞因子分泌或通过活化标志物(例如CD107a等)的表达变化来测量NK细胞活化。对于NK细胞，增殖、细胞毒性(杀伤靶细胞并且增加CD107a、颗粒酶和穿孔素表达的能力)、细胞因子产生(例如IFNγ和TNF)和细胞表面受体表达(例如CD25)的增加将指示免疫调节，这将符合癌细胞的杀伤增强。

在一个实施方式中，例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过活化标志物的表达变化来测量γδT细胞活化。

在一个实施方式中，例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化来测量Th1细胞活化。

相比参考样品或对照样品，例如不含本发明的IL-15/IL-15Rαx抗原结合结构域异二聚体融合蛋白的测试样品中的信号，活性或反应的适当增加(或如上所述适当减少) 是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％到99％的增加。类似地，与参考或对照样品相比，增加至少一倍、两倍、三倍、四倍或五倍显示功效。

XI.检查点阻断抗体

在一些实施方式中，将本文所述的靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合蛋白与其它治疗剂组合，所述其它治疗剂包括检查点阻断抗体，例如但不限于PD-1抑制剂、TIM3抑制剂、CTLA4抑制剂、PD-L1抑制剂、TIGIT抑制剂、LAG3抑制剂或其组合。

A.抗PD1抗体

在一些实施方式中，本文所述的IL-15/Rα-Fc融合蛋白可以与检查点阻断抗体例如抗PD-1抗体联合施用给患有癌症的受试者。在一些情况下，抗PD-1抗体包括 XENP13432(一种基于纳武单抗的二价抗PD-1mAb，期具有消融的效应子功能； XENP13432的氨基酸序列如图160所示)。

示例性非限制性抗PD-1抗体分子公开于2015年7月30日公开的标题为“PD- 1的抗体分子及其用途(Antibody Molecules to PD-1and Uses Thereof)”的US 2015/0210769中，所述文献以引用方式以其全文并入。

在一个实施方式中，抗PD-1抗体分子包括至少一个或两个重链可变结构域 (任选地包括恒定区)、至少一个或两个轻链可变结构域(任选地包括恒定区)或两者，包含BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D或BAP049-克隆-E 的氨基酸序列；或如US 2015/0210769的表1中所述，或由表1中的核苷酸序列编码；或与任何上述序列基本相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。抗PD-1抗体分子任选地包含来自重链、轻链或两者的前导序列，如US 2015/0210769的表4中所示；或与其基本相同的序列。

在另一个实施方式中，抗PD-1抗体分子包括来自本文所述抗体的重链可变区和/或轻链可变区的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)，例如，抗体选自BAP049- hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049- hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049- hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049- hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D或BAP049- 克隆-E的任一种；或如表1中所述，或由表1中的核苷酸序列编码；或与任何上述序列基本相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。

在又一个实施方式中，抗PD-1抗体分子包含来自重链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或总体地所有CDR)，所述重链可变区包含US 2015/0210769的表1中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方式中，相对于表1所示或由表1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，CDR(或总体地所有CDR)中的一个或多个具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如，氨基酸取代或缺失。

在又另一个实施方式中，抗PD-1抗体分子包含来自轻链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或总体地所有CDR)，所述轻链可变区包括US 2015/0210769的表1中所示或由表1中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施方式中，相对于表1所示或由表1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，CDR(或总体地所有CDR)中的一个或多个具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如，氨基酸取代或缺失。在某些实施方式中，抗PD-1抗体分子在轻链CDR中包括取代，例如在轻链的CDR1、CDR2 和/或CDR3中的一个或多个取代。在一个实施方式中，抗PD-1抗体分子在轻链可变区的 102位的轻链CDR3中包括取代，例如在根据表1的轻可变区的102位的半胱氨酸取代为酪氨酸或半胱氨酸取代为丝氨酸残基(例如，对于鼠或嵌合的、未修饰的，为SEQ ID NO:16 或SEQ ID NO:24；或对于修饰的序列，为SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:46、 SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:58、SEQ IDNO:62、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:74、或SEQ ID NO:78的任一者)。

在又一个实施方式中，抗PD-1抗体分子包含来自重和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(或总体地所有CDR)，所述重和轻链可变区包含US 2015/0210769的表1中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方式中，相对于表1所示或由表1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，CDR(或总体地所有CDR)中的一个或多个具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如，氨基酸取代或缺失。

在一个实施方式中，抗PD-1抗体分子包括：

(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：4的VHCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO：5的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：3的VHCDR3氨基酸序列；和轻链可变区 (VL)，其包含SEQID NO：13的VLCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO：14的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：33的VLCDR3氨基酸序列，各自公开于US 2015/0210769的表1中；

(b)VH，其包含选自SEQ ID NO:1的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:2的 VHCDR2氨基酸序列；SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，其包含SEQ ID NO:10的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:11的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:32 的VLCDR3氨基酸序列，其各自公开于US 2015/0210769的表1中；

(c)VH，其包含SEQ ID NO:224的VHCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:5的 VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，其包含SEQ ID NO:13的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:14的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:33 的VLCDR3氨基酸序列，其各自公开于US 2015/0210769的表1中；或者

(d)VH，其包含SEQ ID NO:224的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:2的 VHCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，其包含SEQ ID NO:10的VLCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:11的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:32的 VLCDR3氨基酸序列，各自公开于US 2015/0210769的表1中。

在另一个实施方式中，抗PD-1抗体分子包含(i)重链可变区(VH)，其包含选自 SEQID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:224的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:2或 SEQ ID NO:5的VHCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列；和(ii)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:13的VLCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:14的VLCDR2氨基酸序列，和SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33的 VLCDR3氨基酸序列，各自公开在US2015/0210769的表1中。

在其它实施方式中，PD-1抑制剂是选自纳武单抗、派姆单抗或匹地珠单抗的抗PD-1抗体。

在一些实施方式中，抗PD-1抗体是纳武单抗。纳武单抗的替代名称包含 MDX-1106、MDX-1106-04、ONO-4538或BMS-936558。在一些实施方式中，抗PD-1抗体是纳武单抗(CAS注册号：946414-94-4)。纳武单抗是一种完全人IgG4单克隆抗体，其可特异性阻断PD1。在US 8,008,449和WO2006/121168中公开了纳武单抗(克隆5C4)和特异性结合PD1的其它人单克隆抗体。在一个实施方式中，PD-1的抑制剂是纳武单抗，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列具有至少85％、90％、 95％或更高的同一性的序列)。在一些实施方式中，抗PD-1抗体是派姆单抗。派姆单抗 (也被称为兰洛利珠单抗(lambrolizumab)、MK-3475、MK03475、SCH-900475或Merck)是结合PD-1的人源化的IgG4单克隆抗体。派姆单抗和其它人源化抗PD-1抗体公开于Hamid,O.等人(2013)New England Journal of Medicine 369(2):134–44、 US 8,354,509和WO2009/114335中。

在一个实施方式中，PD-1的抑制剂是派姆单抗，其公开于例如US 8,354,509 和WO2009/114335中，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列)。

在一些实施方式中，抗PD-1抗体是匹地利珠单抗。匹地利珠单抗(CT-011； CureTech)是与PD1结合的人源化IgG1k单克隆抗体。匹地利珠单抗和其它人源化抗PD-1 单克隆抗体在US 8,747,847和WO2009/101611中公开。

其它抗PD1抗体包括AMP 514(Amplimmune)等等，例如US 8,609,089、US2010028330和/或US 20120114649中公开的抗PD1抗体。

在一些实施方式中，PD-1抑制剂是免疫粘附素(例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PD-Ll或PD-L2的细胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在一些实施方式中，PD-1抑制剂是AMP-224(B7-DCIg；Amplimmune；例如，公开于 WO2010/027827和WO2011/066342中)，其是阻断PD-1和B7-H1之间相互作用的PD-L2 Fc融合可溶性受体。

在一些实施方式中，抗PD-1抗体可以与本发明的IL-15/RαFc融合蛋白组合使用。存在若干种抗PD-1抗体，包含但不限于目前经FDA批准的两种抗体，派姆单抗和纳武单抗，以及目前正在临床测试中的抗体，包含但不限于替雷利珠单抗(tislelizumab)、Sym021、(由Rengeneron开发)、JNJ-63723283(由J和J开发)、SHR-1210、匹地利珠单抗、 AMP-224、MEDIo680、和CT-001以及Liu等人，J.Hemat.&Oncol.10:136中概述的其它抗体，其中的抗体通过引用明确并入。

在一些实施方式中，本文所述的靶向NKG2D的IL-15/RαFc融合蛋白可以与PD-1抑制剂(例如，抗PD-1抗体)组合使用。在某些实施方式中，本文所述的IL-15/RαFc 融合蛋白(例如，XENP24113、XENP24306、XENP23557或XENP24045)与抗PD-1抗体组合施用。

B.抗TIM3抗体

示例性的非限制性抗TIM-3抗体分子公开于2015年8月6日公开的标题为“Antibody Molecules to TIM-3and Uses Thereof(TIM-3的抗体分子及其用途)”的美国2015/0218274中，该专利以引用方式整体并入本文。

在一个实施方式中，抗TIM-3抗体分子包括至少一个或两个重链可变结构域 (任选地包括恒定区)、至少一个或两个轻链可变结构域(任选地包括恒定区)或两者，其包含ABTIM3、ABTIM3-hum01、ABTIM3-hum02、ABTIM3-hum03、ABTIM3-hum04、 ABTIM3-hum05、ABTIM3-hum06、ABTIM3-hum07、ABTIM3-hum08、ABTIM3-hum09、 ABTIM3-hum10、ABTIM3-hum11、ABTIM3-hum12、ABTIM3-hum13、ABTIM3-hum14、 ABTIM3-hum15、ABTIM3-hum16、ABTIM3-hum17、ABTIM3-hum18、ABTIM3-hum19、 ABTIM3-hum20、ABTIM3-hum21、ABTIM3-hum22、ABTIM3-hum23的氨基酸序列；或如 US 2015/0218274的表1至表4中所述；或由表1至表4中的核苷酸序列编码；或与任何上述序列基本相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。抗TIM-3抗体分子任选地包含来自重链、轻链或两者的前导序列，如US 2015/0218274中所示的；或与其基本相同的序列。

在又一个实施方式中，抗TIM-3抗体分子包括来自本文所述抗体的重链可变区和/或轻链可变区的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)，例如选自ABTIM3、ABTIM3-hum01、ABTIM3-hum02、ABTIM3-hum03、ABTIM3-hum04、ABTIM3-hum05、ABTIM3- hum06、ABTIM3-hum07、ABTIM3-hum08、ABTIM3-hum09、ABTIM3-hum10、ABTIM3- hum11、ABTIM3-hum12、ABTIM3-hum13、ABTIM3-hum14、ABTIM3-hum15、ABTIM3- hum16、ABTIM3-hum17、ABTIM3-hum18、ABTIM3-hum19、ABTIM3-hum20、ABTIM3- hum21、ABTIM3-hum22、ABTIM3-hum23中任一种；或如US 2015/0218274的表1至表4 中所述；或由表1至表4中的核苷酸序列编码；或与任何上述序列基本相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)的抗体。

在又一个实施方式中，抗TIM-3抗体分子包括来自重链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或总体地所有CDR)，所述重链可变区包含US 2015/0218274的表1至表4 中所示的，或由表1至表4中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施方式中，相对于表1至表4中所示的或由表1至表4所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，一个或多个CDR(或总体地所有CDR)具有一个、二个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如氨基酸取代或缺失。

在又一个实施方式中，抗TIM-3抗体分子包括来自轻链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或总体地所有CDR)，所述轻链可变区包含US 2015/0218274的表1至表4 中所示的，或由表1至表4中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施方式中，相对于表1至表4中所示的或由表1至表4中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，一个或多个CDR(或总体地所有CDR)具有一个、二个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如氨基酸取代或缺失。在某些实施方式中，抗TIM-3抗体分子在轻链CDR中包括取代，例如在轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3中的一个或多个取代。

在又一个实施方式中，抗TIM-3抗体分子包括来自重链和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(或总体地所有CDR)，所述重链和轻链可变区包含US2015/0218274的表1至表4中所示的，或由表1至表4中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施方式中，相对于表1至表4中所示的或由表1至表4中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，一个或多个CDR(或总体地所有CDR)具有一个、二个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如氨基酸取代或缺失。

在一个实施方式中，抗TIM-3抗体分子包含：

(a)重链可变区(VH)，其包含选自SEQ ID NO:9的VHCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:10的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:5的VHCDR3氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:12的VLCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:13的VLCDR2氨基酸序列和 SEQ ID NO:14的VLCDR3氨基酸序列，各自公开于US 2015/0218274的表1至表4中；

(b)VH，其包含选自SEQ ID NO:3的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:4的VHCDR2 氨基酸序列；SEQ ID NO:5的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，其包含SEQ ID NO:6的 VLCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:7的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8的VLCDR3 氨基酸序列，其各自公开于US 2015/0218274的表1至表4中；

(c)VH，其包含选自SEQ ID NO:9的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:25的 VHCDR2氨基酸序列；SEQ ID NO:5的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，其包含SEQ ID NO:12的VLCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:13的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:14 的VLCDR3氨基酸序列，其各自公开于US 2015/0218274的表1至表4中；

(d)VH，其包含选自SEQ ID NO:3的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:24的 VHCDR2氨基酸序列；SEQ ID NO:5的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，其包含SEQ ID NO:6的VLCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:7的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8的 VLCDR3氨基酸序列，其各自公开于US 2015/0218274的表1至表4中；

(e)VH，其包含选自SEQ ID NO:9的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:31的 VHCDR2氨基酸序列；SEQ ID NO:5的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，其包含SEQ ID NO:12的VLCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:13的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:14 的VLCDR3氨基酸序列，其各自公开于US 2015/0218274的表1至表4中；或

(f)VH，其包含选自SEQ ID NO:3的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:30的 VHCDR2氨基酸序列；SEQ ID NO:5的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，其包含SEQ ID NO:6的VLCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:7的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8的 VLCDR3氨基酸序列，其各自公开于US 2015/0218274的表1至表4中。

示例性的抗TIM-3抗体在美国专利号：8,552,156、WO 2011/155607、EP 2581113和美国公开号：2014/044728中公开，并且包括Sym023(在Symphogen的临床开发中)、TSR-22(在Tesaro的临床开发中)、LY3321367(在Eli Lilly的临床开发中)、 BGTB-A425(在BeiGene的临床开发中)、MBG453(在Novartis的临床开发中)和 INCAGN02390(在Incyte的临床开发中)。

在一些实施方式中，抗TIM-3抗体可以与本发明的IL-15/RαFc融合蛋白组合使用。在临床开发中有几种TIM-3抗体，包括但不限于MBG453和TSR-022。

在一些实施方式中，本文所述的IL-15/RαFc融合蛋白可以与TIM-3抑制剂 (例如，抗TIM3抗体)组合使用。在某些实施方式中，本文所述的IL-15/RαFc融合蛋白 (例如，XENP24113、XENP24306、XENP23557或XENP24045)与抗TIM3抗体组合施用。

C.抗CTLA4抗体

示例性抗CTLA4抗体包括替西木单抗(tremelimumab)(可从Pfizer获得的 IgG2单克隆抗体，前称ticilimumab，CP-675,206)；和伊匹单抗(ipilimumab)(CTLA-4抗体，也称为MDX-010，CAS编号477202-00-9)。其它示例性的抗CTLA-4抗体公开于例如美国专利第5,811,097号中。

在一个实施方式中，抗CTLA4抗体是伊匹单抗，其公开于例如US 5,811,097、 US7,605,238、WO00/32231和WO97/20574中，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％或更高同一性的序列)。

在一个实施方式中，抗CTLA4抗体是替西木单抗，例如在US 6,682,736和 WO00/37504中公开，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列)。

在一些实施方式中，抗CTLA-4抗体可以与本发明的IL-15/RαFc融合蛋白组合使用。因此，用于本文概述的联合疗法的合适的抗CTLA-4抗体包括但不限于一种当前FDA 批准的抗体依匹单抗，以及另外几种正在开发中的抗体，包括CP-675,206和AGEN-1884。

在一些实施方式中，本文所述的IL-15/RαFc融合蛋白可以与CTLA-4抑制剂 (例如，抗CTLA-4抗体)组合使用。在某些实施方式中，本文所述的IL-15/RαFc融合蛋白 (例如，XENP24113、XENP24306、XENP23557或XENP24045)与抗CTLA-4抗体组合施用。

D.抗PD-L1抗体

示例性的非限制性抗PD-L1抗体分子公开于2016年4月21日公开的标题为“Antibody Molecules to PD-L1 and Uses Thereof(PD-L1的抗体分子及其用途)”的US2016/0108123中，该专利以引用方式整体并入本文。

在一个实施方式中，抗PD-L1抗体分子包括至少一个或两个重链可变结构域 (任选地包括恒定区)、至少一个或两个轻链可变结构域(任选地包括恒定区)或两者，其包含BAP058-hum01、BAP058-hum02、BAP058-hum03、BAP058-hum04、BAP058-hum05、 BAP058-hum06、BAP058-hum07、BAP058-hum08、BAP058-hum09、BAP058-hum10、 BAP058-hum11、BAP058-hum12、BAP058-hum13、BAP058-hum14、BAP058-hum15、 BAP058-hum16、BAP058-hum17、BAP058-克隆-K、BAP058-克隆-L、BAP058-克隆-M、 BAP058-克隆-N或BAP058-克隆-O中任一种；或如US 2016/0108123的表1中所述，或由表 1中的核苷酸序列编码的氨基酸序列；或与任何上述序列基本相同的序列(例如，至少80％、 85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。

在又一个实施方式中，抗PD-L1抗体分子包括来自本文所述抗体的重链可变区和/或轻链可变区的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)，例如，抗体选自BAP058- hum01、BAP058-hum02、BAP058-hum03、BAP058-hum04、BAP058-hum05、BAP058- hum06、BAP058-hum07、BAP058-hum08、BAP058-hum09、BAP058-hum10、BAP058- hum11、BAP058-hum12、BAP058-hum13、BAP058-hum14、BAP058-hum15、BAP058- hum16、BAP058-hum17、BAP058-Clone-K、BAP058-克隆-L、BAP058-克隆-M、BAP058-克隆-N或BAP058-克隆-O的任一个；或如US 2016/0108123的表1中所述，或由表1中的核苷酸序列编码；或与任何上述序列基本相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、 95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。

在又一个实施方式中，抗PD-L1抗体分子包含来自重链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或总体地所有CDR)，所述重链可变区包含US 2016/0108123的表1中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方式中，相对于表1所示或由表1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，CDR(或总体地所有CDR)中的一个或多个具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如，氨基酸取代或缺失。

在又一个实施方式中，抗PD-L1抗体分子包含来自轻链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或总体地所有CDR)，所述轻链可变区包含US 2016/0108123的表1中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方式中，相对于表1所示或由表1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，CDR(或总体地所有CDR)中的一个或多个具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如，氨基酸取代或缺失。在某些实施方式中，抗PD-L1抗体分子在轻链CDR中包括取代，例如在轻链的CDR1、 CDR2和/或CDR3中的一个或多个取代。

在又一个实施方式中，抗PD-L1抗体分子包含来自重和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(或总体地所有CDR)，所述重和轻链可变区包含US 2016/0108123的表1中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方式中，相对于表1所示或由表1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，CDR(或总体地所有CDR)中的一个或多个具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如，氨基酸取代或缺失。

在一个实施方式中，抗PD-L1抗体分子包含：

(i)重链可变区(VH)，其包括选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:195的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:2的VHCDR2氨基酸序列；SEQ ID NO:3的VHCDR3 氨基酸序列，其各自在US 2016/0108123的表1中公开；和

(ii)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:9的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:10的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:11的VLCDR3氨基酸序列，其各自在US 2016/0108123 的表1中公开。

在另一个实施方式中，抗PD-L1抗体分子包含：

(i)重链可变区(VH)，其包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:195的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:5的VHCDR2氨基酸序列；SEQ ID NO:3的VHCDR3 氨基酸序列，其各自在US 2016/0108123的表1中公开；和

(ii)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:12的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:13的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:14的VLCDR3氨基酸序列，其各自在US 2016/0108123的表1中公开。

在一个实施方式中，抗PD-L1抗体分子包含SEQ ID NO:1的VHCDR1氨基酸序列。在另一个实施方式中，抗PD-L1抗体分子包含SEQ ID NO:4的VHCDR1氨基酸序列。在又一个实施方式中，抗PD-L1抗体分子包含SEQ ID NO:195的VHCDR1氨基酸序列，每个在US 2016/0108123的表1中公开。

在一些实施方式中，PD-L1抑制剂是抗体分子。在一些实施方式中，抗PD-Ll 抑制剂选自YW243.55.S70、MPDL3280A、MEDI-4736、MSB-0010718C、MDX-1105、阿特珠单抗、德巴鲁单抗(durbalumab)、阿维鲁单抗或BMS936559。

在一些实施方式中，抗PD-L1抗体是阿特珠单抗。阿特珠单抗(也称为 MPDL3280A和Roche)是与PD-L1结合的单克隆抗体。阿特珠单抗和其它人源化抗PD-L1抗体在US 8,217,149中公开，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列具有至少85％、90％、95％或更高同一性的序列)。

在一些实施方式中，抗PD-L1抗体是阿维鲁单抗。阿维鲁单抗(也称为A09- 246-2；Merck Serono)是与PD-L1结合的单克隆抗体。阿维鲁单抗和其它人源化抗PD-L1 抗体在US9,324,298和WO2013/079174中公开，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列具有至少85％、90％、95％或更高同一性的序列)。

在一些实施方式中，抗PD-L1抗体是德瓦鲁单抗(durvalumab)。德瓦鲁单抗 (也称为MEDI4736；AstraZeneca)是与PD-L1结合的单克隆抗体。德瓦鲁单抗和其它人源化抗PD-L1抗体在US 8,779,108中公开，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列具有至少85％、90％、95％或更高同一性的序列)。

在一些实施方式中，抗PD-L1抗体是BMS-936559。BMS-936559(也称为 MDX-1105；BMS)是与PD-L1结合的单克隆抗体。BMS-936559和其它人源化抗PD-L1抗体在US 7,943,743和WO2007005874中公开，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列)。

在一些实施方式中，抗PD-L1抗体可以与本发明的IL-15/RαFc融合蛋白组合使用。存在若干种抗PD-L1抗体，包含目前经FDA批准的三种抗体，阿特朱单抗、阿维鲁单抗和德瓦鲁单抗，以及目前正在临床测试中的抗体，包含但不限于LY33000054和 CS1001，以及Liu等人，J.Hemat.&Oncol.10:136中概述的其它抗体，其中的抗体通过引用明确并入。

在一些实施方式中，本文所述的IL-15/Rα异二聚体融合蛋白可以与PD-L1或 PD-L2抑制剂(例如，抗PD-L1抗体)组合使用。

E.抗TIGIT抗体

在一些实施方式中，抗TIGIT抗体是OMP-313M32。OMP-313M32(OncoMedPharmaceuticals)是与TIGIT结合的单克隆抗体。OMP-313M32和其它人源化抗TIGIT抗体公开于US20160376365和WO2016191643中，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列具有至少85％、90％、95％或更高同一性的序列)。

在一些实施方式中，抗TIGIT抗体是BMS-986207。BMS-986207(也称为 ONO-4686；Bristol-Myers Squibb)是与TIGIT结合的单克隆抗体。BMS-986207和其它人源化抗TIGIT抗体公开于US20160176963和WO2016106302中，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列具有至少85％、90％、95％或更高同一性的序列)。

在一些实施方式中，抗TIGIT抗体是MTIG7192。MTIG7192(Genentech)是与 TIGIT结合的单克隆抗体。MTIG7192和其它人源化抗TIGIT抗体在US2017088613、 WO2017053748和WO2016011264中公开，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列)。

在一些实施方式中，抗TIGIT抗体可以与本发明的IL-15/RαFc融合蛋白组合使用。TIGIT抗体在临床开发中有几种，BMS-986207(在BMS进行临床开发)、OMP- 313M32(在OncoMed进行临床开发)、MTIG7192A(在Genentech进行临床开发)和 AB154(在ArcusBiosciences进行临床开发)。

在一些实施方式中，本文所述的IL-15/RαFc融合蛋白可以与TIGIT抑制剂 (例如，抗TIGIT抗体)组合使用。在某些实施方式中，本文所述的IL-15/RαFc融合蛋白 (例如，XENP24113、XENP24306、XENP23557或XENP24045)与抗TIGIT抗体组合施用。

在某些情况下，抗TIGIT抗体可与XENP24306结合使用，包括但不限于 BMS-986207(在BMS进行临床开发)、OMP-313M32(在OncoMed进行临床开发)、 MTIG7192A(在Genentech进行临床开发)和AB154(在Arcus Biosciences进行临床开发)。

F.抗LAG3抗体

示例性的非限制性抗LAG-3抗体分子公开于2015年9月17日公开的标题为“Antibody Molecules to LAG-3and Uses Thereof(LAG-3的抗体分子及其用途)”的US2015/0259420中，该专利以引用方式整体并入本文。

在一个实施方式中，抗LAG-3抗体分子包括至少一个或两个重链可变结构域 (任选地包括恒定区)、至少一个或两个轻链可变结构域(任选地包括恒定区)或两者，其包含BAP050-hum01、BAP050-hum02、BAP050-hum03、BAP050-hum04、BAP050-hum05、BAP050-hum06、BAP050-hum07、BAP050-hum08、BAP050-hum09、BAP050-hum10、 BAP050-hum11、BAP050-hum12、BAP050-hum13、BAP050-hum14、BAP050-hum15、 BAP050-hum16、BAP050-hum17、BAP050-hum18、BAP050-hum19、BAP050-hum20、 huBAP050(Ser)(例如，BAP050-hum01-Ser、BAP050-hum02-Ser、BAP050-hum03-Ser、 BAP050-hum04-Ser、BAP050-hum05-Ser、BAP050-hum06-Ser、BAP050-hum07-Ser、 BAP050-hum08-Ser、BAP050-hum09-Ser、BAP050-hum10-Ser、BAP050-hum11-Ser、 BAP050-hum12-Ser、BAP050-hum13-Ser、BAP050-hum14-Ser、BAP050-hum15-Ser、 BAP050-hum18-Ser、BAP050-hum19-Ser或BAP050-hum20-Ser)、BAP050-克隆-F、 BAP050-克隆-G、BAP050-克隆-H、BAP050-克隆-I或BAP050-克隆-J中任一种的；或如US 2015/0259420的表1中所述，或由表1中的核苷酸序列编码的氨基酸序列；或与任何上述序列基本相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。

在又一个实施方式中，抗LAG-3抗体分子包括来自本文所述抗体的重链可变区和/或轻链可变区的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)，例如，抗体选自BAP050- hum01、BAP050-hum02、BAP050-hum03、BAP050-hum04、BAP050-hum05、BAP050- hum06、BAP050-hum07、BAP050-hum08、BAP050-hum09、BAP050-hum10、BAP050- hum11、BAP050-hum12、BAP050-hum13、BAP050-hum14、BAP050-hum15、BAP050- hum16、BAP050-hum17、BAP050-hum18、BAP050-hum19、BAP050-hum20、huBAP050(Ser) (例如，BAP050-hum01-Ser、BAP050-hum02-Ser、BAP050-hum03-Ser、BAP050-hum04-Ser、 BAP050-hum05-Ser、BAP050-hum06-Ser、BAP050-hum07-Ser、BAP050-hum08-Ser、BAP050-hum09-Ser、BAP050-hum10-Ser、BAP050-hum11-Ser、BAP050-hum12-Ser、 BAP050-hum13-Ser、BAP050-hum14-Ser、BAP050-hum15-Ser、BAP050-hum18-Ser、 BAP050-hum19-Ser或BAP050-hum20-Ser)、BAP050-克隆-F、BAP050-克隆-G、BAP050- 克隆-H、BAP050-克隆-I或BAP050-克隆-J的任一种；或如US2015/0259420的表1中所述，或由表1中的核苷酸序列编码；或与任何上述序列基本相同的序列(例如，至少80％、85％、 90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。

在又一个实施方式中，抗LAG-3抗体分子包含来自重链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或总体地所有CDR)，所述重链可变区包含US 2015/0259420的表1中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方式中，相对于表1所示或由表1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，CDR(或总体地所有CDR)中的一个或多个具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如，氨基酸取代或缺失。

在又另一个实施方式中，抗LAG-3抗体分子包含来自轻链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或总体地所有CDR)，所述轻链可变区包括US 2015/0259420的表1中所示或由表1中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一个实施方式中，相对于表1所示或由表1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，CDR(或总体地所有CDR)中的一个或多个具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如，氨基酸取代或缺失。在某些实施方式中，抗PD-L1抗体分子在轻链CDR中包括取代，例如在轻链的CDR1、CDR2 和/或CDR3中的一个或多个取代。

在又一个实施方式中，抗LAG-3抗体分子包含来自重和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(或总体地所有CDR)，所述重和轻链可变区包含 US 2015/0259420的表1中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方式中，相对于表1所示或由表1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，CDR(或总体地所有CDR)中的一个或多个具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个改变，例如，氨基酸取代或缺失。

在一个实施方式中，抗LAG-3抗体分子包含：

(i)重链可变区(VH)，其包括选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:286的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:2的VHCDR2氨基酸序列；SEQ ID NO:3的VHCDR3 氨基酸序列，其各自在US 2015/0259420的表1中公开；和

(ii)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:10的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:11的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:12的VLCDR3氨基酸序列，其各自在US 2015/0259420的表1中公开。

在另一个实施方式中，抗LAG-3抗体分子包含：

(i)重链可变区(VH)，其包括选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:286的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:5的VHCDR2氨基酸序列；SEQ ID NO:3的VHCDR3 氨基酸序列，其各自在US 2015/0259420的表1中公开；和

(ii)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:13的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:14的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:15的VLCDR3氨基酸序列，其各自在US 2015/0259420的表1中公开。

在一个实施方式中，抗LAG-3抗体分子包含SEQ ID NO:1的VHCDR1氨基酸序列。在另一个实施方式中，抗LAG-3抗体分子包含SEQ ID NO:4的VHCDR1氨基酸序列。在又一个实施方式中，抗LAG-3抗体分子包含SEQ ID NO:286的VHCDR1氨基酸序列，其各自公开于US2015/0259420的表1中。

在一些实施方式中，抗LAG-3抗体是BMS-986016。BMS-986016(也称为 BMS986016；Bristol-Myers Squibb)是与LAG-3结合的单克隆抗体。BMS-986016和其它人源化的抗LAG-3抗体公开于US 2011/0150892、WO2010/019570和WO2014/008218中。

在一些实施方式中，抗LAG3抗体是LAG525。LAG525(也称为IMP701； Novartis)是与LAG3结合的单克隆抗体。LAG525和其它人源化抗LAG3抗体在US 9,244,059和WO2008132601中公开，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列)。

其它示例性抗LAG3抗体公开于例如US2011150892和US2018066054中。

在一些实施方式中，抗LAG-3抗体可以与本发明的IL-15/RαFc融合蛋白组合使用。在临床开发中有几种抗LAG-3抗体，包括Regeneron的REGN3767、TSR-033 (Tesaro)、BMS-986016(BMS)和Sym022(Symphogen)。

在一些实施方式中，本文所述的IL-15/RαFc融合蛋白可以与LAG3抑制剂 (例如，抗LAG3抗体)组合使用。在某些实施方式中，本文所述的IL-15/RαFc融合蛋白 (例如，XENP24113、XENP24306、XENP23557或XENP24045)与抗LAG3抗体组合施用。

在一些实施方式中，抗LAG-3抗体可以与XENP24306组合使用，包括但不限于Regeneron的REGN3767、TSR-033(Tesaro)、BMS-986016(BMS)和Sym022(Symphogen)。

XII.联合疗法

在一些方面，本文所述的NKG2D靶向的IL-15/RαFc融合蛋白中的任何一种 (例如，图122A至图122N、图138A至图138C、和图139A至图139J中的那些)与另一种治疗剂组合施用。如本文所用，“组合”施用意味着在受试者患有病症的过程期间向受试者递送两种(或更多种)不同的治疗，例如，在受试者已经被诊断为患有所述病症之后并且在所述病症已经治愈或消除或治疗由于其它原因已经停止之前递送所述两种或更多种治疗。在一些实施方式中，对一种治疗的递送在对第二治疗的递送开始时仍然发生，使得在施用方面存在重叠。在本文中有时将其称为“同时”或“并发递送”。在其它实施方式中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一种情况的一些实施方式中，由于组合施用，治疗更有效。例如，第二种治疗更有效，例如，与在不存在第一种治疗的情况下给予第二种治疗相比，利用更少的第二种治疗可以看到等效的效果，或者第二种治疗在更大程度上减轻了症状，或利用第一种治疗看到类似的情况。在一些实施方式中，递送使得病症有关的症状或与其它参数的减少大于在不存在另一种治疗的情况下递送一种治疗所观察到的减少。两种治疗的效果可以是部分累加、完全累加或大于累加。递送可以使得当递送第二种时仍然可以检测到递送的第一种治疗的效果。

本文所述的靶向NKG2D的IL-15/RαFc融合蛋白和至少一种另外的治疗剂可以同时以相同或分开的组合物或顺序施用。对于顺序施用，可以首先施用本文所述的靶向 NKG2D的IL-15/RαFc融合蛋白，然后可以施用另外的药剂，或者可以颠倒施用顺序。

本文概述的靶向NKG2D的IL-15/RαFc融合蛋白和/或其它治疗剂、程序或方式可在活性病症期间或缓解或较不活性疾病期间内施用。靶向NKG2D的IL-15/RαFc融合蛋白可以在其它治疗之前、与治疗同时、在治疗之后或在疾病缓解期间施用。

当组合施用时，靶向NKG2D的IL-15/RαFc融合蛋白和其它药剂(例如，第二种或第三种药剂)或全部可以以低于或等于单独使用(例如，作为单一治疗)的每种药剂的量或剂量的量或剂量施用。在一些实施方式中，靶向NKG2D的IL-15/RαFc融合蛋白、其它药剂(例如，第二种或第三种药剂)或全部的施用量或剂量比单独使用(例如，作为单一治疗)的每种药剂的量或剂量低(例如至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。在其它实施方式中，靶向NKG2D的IL-15/RαFc融合蛋白、其它药剂(例如，第二种或第三种药剂)或全部的导致期望效果(例如，癌症治疗)的量或剂量比单独使用(例如，作为单一治疗)的每种药剂的实现相同治疗效果所需的量或剂量低(例如低至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。

在进一步方面中，本文所述的靶向NKG2D的IL-15/RαFc融合蛋白可用于与以下联合的治疗方案中：化学疗法、放射、免疫抑制剂(例如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506)、针对检查点抑制剂的抗体，或其它免疫消融剂例如CAMPATH、其它抗体疗法、癌得星(cytoxan)、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR90165、细胞因子、和照射、肽疫苗，如Izumoto等人，2008J Neurosurg 108:963-971 中所述。

在某些情况下，本发明的化合物与其它治疗剂例如其它抗癌剂、抗过敏剂、抗恶心剂(或止吐药)、止痛药、细胞保护剂及其组合结合。

在一个实施方式中，本文所述的靶向NKG2D的IL-15/RαFc融合蛋白中的任何靶向NKG2D的IL-15/RαFc融合蛋白可以与化学治疗剂组合使用。示例性化学治疗剂包括蒽环类(例如，阿达比星、柔红霉素、阿霉素(例如，脂质体阿霉素))、蒽二酮衍生物 (例如，米托蒽醌)、长春花生物碱(例如，长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨)、烷基化剂(例如，环磷酰胺、达卡巴嗪、美法仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)、免疫细胞抗体 (例如，阿仑单抗、吉妥珠单抗、利妥昔单抗、奥法木单抗、托西莫单抗、brentuximab)、抗代谢药(包括，例如叶酸拮抗剂、阿糖胞苷、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂(例如氟达拉滨))、mTOR抑制剂、TNFR糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂、蛋白酶体抑制剂(例如阿克拉霉素A、胶体毒素或硼替佐米)、免疫调节剂例如沙利度胺或沙利度胺衍生物(如来那度胺)、激酶抑制剂例如依鲁替尼(如Imbruvica)、皮质类固醇(如地塞米松、泼尼松)和CVP(环磷酰胺、长春新碱和泼尼松的组合)、含或不含依托泊苷(例如VP-16)的CHOP(环磷酰胺、羟基柔红霉素、(长春新碱)和泼尼松的组合)、环磷酰胺和喷妥他汀的组合、苯丁酸氮芥和泼尼松的组合、氟达拉滨和环磷酰胺的组合、或另一种药剂，如盐酸氮芥(例如Mustargen)、阿霉素甲氨蝶呤、奥沙利铂或阿糖胞苷(ara-C)。

考虑用于联合疗法的一般化学治疗剂包括阿那曲唑比卡鲁胺硫酸博来霉素白消安白消安注射液卡培他滨N4-戊氧羰基5-脱氧5-氟胞苷、卡铂卡莫司汀苯丁酸氮芥顺铂克拉屈滨环磷酰胺(或)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷阿糖胞苷脂质体注射液达卡巴嗪放线菌素(Actinomycin D、Cosmegan)、盐酸柔红霉素柠檬酸柔红霉素脂质体注射液地塞米松、多西他赛盐酸阿霉素依托泊苷磷酸氟达拉滨5-氟尿嘧啶氟他胺替扎西他滨、吉西他滨(二氟脱氧胞苷)、羟基脲依达比星异环磷酰胺伊立替康L-天冬酰胺酶亚叶酸钙、美法仑6-巯基嘌呤甲氨蝶呤米托蒽醌mylotarg、紫杉醇phoenix(Yttrium90/MX-DTPA)、喷妥他汀、带有卡莫司汀植入物的聚苯丙生20柠檬酸他莫昔芬替尼泊苷6-硫鸟嘌呤、硫替太帕、替拉帕明注射用盐酸托泊替康长春碱长春新碱和长春瑞滨

XIII.治疗

一旦制备，通过治疗癌症，通常通过利用本发明的异二聚体Fc融合蛋白的结合促进T细胞活化(例如，T细胞不再被抑制)，本发明的组合物可用于许多肿瘤学应用中。

因此，本发明的靶向的IL-15/Rα-Fc融合异二聚体蛋白组合物可用于治疗这些癌症。

A.用于体内施用的靶向的异二聚体蛋白组合物

在一些实施方式中，本发明的靶向的异二聚体蛋白与单独的抗体共同施用。如本领域技术人员将理解，共同施用可以同时或依序进行。

通过将具有期望纯度的抗体与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备根据本发明使用的抗体的配制物(如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版, Osol,A.编[1980]中通常概述的)，用于以冻干配制物或水溶液形式储存。可接受的载体、缓冲剂、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属配合物(例如锌-蛋白质配合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEEN^TM、 PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

B.施用方式

向个体施用根据已知方法将本发明的靶向的异二聚体蛋白，例如以推注静脉内施用或通过在一段时间内连续输注。如本领域技术人员将理解，双功能异二聚体蛋白和化学治疗剂的施用可以同时或依序进行。

C.治疗方式

在本发明的方法中，用疗法来提供对疾病或病症的阳性治疗应答。“阳性治疗应答”旨在改善疾病或病症和/或改善与疾病或病症相关联的症状。例如，阳性治疗应答将指对疾病的以下改善中的一种或多种：(1)减少赘生性细胞的数量；(2)增加赘生性细胞死亡；(3)抑制赘生性细胞存活；(5)抑制(即减慢到某种程度并且优选地停止)肿瘤生长；(6)增加患者存活率；以及(7)与疾病或病症相关联的一个或多个症状的一些缓解。

可以通过对那个疾病或病症具有特异性的标准化应答标准来确定任何给定疾病或病症的阳性治疗应答。可以使用筛选技术如磁共振成像(MRI)扫描、x-射线成像、计算机断层(CT)扫描、骨扫描成像、内窥镜检查和肿瘤活检取样，包含骨髓吸出(BMA)和对循环中的肿瘤细胞计数来估计针对肿瘤形态(即总体肿瘤负荷、肿瘤大小等)改变的肿瘤应答。

除了这些阳性治疗应答之外，正经受疗法的受试者可能经历与疾病相关联的症状的改善的有益效果。

根据本发明的治疗包含所使用的“治疗有效量的”药物。“治疗有效量”是指以剂量计并且持续所需的时间段以实现所希望的治疗结果的有效的量。

治疗有效量可以根据因素而变化，如个体的疾病状态、年龄、性别、以及体重、以及药物在个体中引发希望的应答的能力。治疗有效量还是靶向的IL-15/Rα-Fc融合异二聚体蛋白、抗原结合结构域或其部分的任何毒性或有害效果被治疗有益效果超过的量。

肿瘤疗法的“治疗有效量”还可以通过其稳定疾病的进展的能力测量。可以在预示人类肿瘤的功效的动物模型系统中评估化合物抑制癌症的能力。

可替代地，组合物的这种特性可以通过有经验的医师所知的体外分析检查化合物或组合物的抑制细胞生长或诱导凋亡的能力来评估。治疗有效量的治疗化合物或组合物能减小肿瘤尺寸，或以其它方式改善个体的症状。所属领域普通技术人员将能够基于诸如个体的大小、个体症状的严重性和所选择的特定组合物或给药途径等因素来确定这样的量。

调整剂量方案以提供最佳的期望应答(例如，治疗应答)。例如，可以施用单个团注物，或者可以随时间施用若干分次剂量，或者可以按治疗状况的紧急情况所表明的成比例地减少或增加剂量。为了方便施用和剂量的均匀性，肠胃外组合物可以按剂量单位调配。如本文使用的剂量单位是指作为针对要治疗受试者的单一剂量适合的物理上离散的单位；每个单位含有与所需药物载体缔合的、经计算产生所期望的治疗效果的预定量的活性化合物。

针对本发明的剂量单位形式的规格受制于并直接取决于：(a)活性化合物的独特特性和要实现的特定治疗效果，和(b)个体敏感性对复合用于治疗的此类活性化合物造成的本领域固有限制。

用于本发明的靶向的IL-15/Rα-Fc融合异二聚体蛋白的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病症并且可以由本领域的技术人员确定。

所有引用的参考文献均明确地以引用方式整体并入本文中。

尽管以上为了说明的目的描述本发明的特定实施方式，但是所属领域技术人员将理解，在不脱离所附权利要求中描述的本发明的情况下，可以进行细节的许多变化。

实施例

以下提供实施例以说明本发明。这些实施例不旨在将本发明限制于任何特定的应用或操作理论。对于本发明中所讨论的所有恒定区位置，根据如Kabat(Kabat等,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,贝塞斯达美国国家卫生研究院公共卫生服务部(United States Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda)，其以引用方式整体并入本文中)中的EU索引进行编号。抗体领域中的技术人员将理解，这个规约由免疫球蛋白序列的特定区域中的非顺序编号组成，所述非顺序编号使得能够对免疫球蛋白家族中的保守位置进行标准化的引用。因此，如通过EU索引定义的任何给定免疫球蛋白的位置不一定对应于其顺序序列。

在美国专利申请公开第2015/0307629号和第2014/0288275号以及国际专利公开案第WO2014/145806号中概述了一般和具体的科学技术，所有这些技术都以全文引用的方式明确地并入，并且尤其是其中概述的技术。

实施例1：IL-15/IL-15RαFc融合蛋白

1A：工程化IL-15/Rα-Fc融合蛋白

为了解决IL-15/IL-15Rα异二聚体的短半衰期，生成IL-15/IL-15Rα(sushi)复合物作为Fc融合体(本文中称为IL-15/Rα-Fc融合蛋白)，旨在促进生产和促进FcRn介导的复合物循环和延长半衰期。

通过标准基因合成构筑编码IL-15或IL-15Rαsushi结构域的质粒，然后将其亚克隆到含有Fc融合配偶体(例如，如图8中描绘的恒定区)的pTT5表达载体中。图16A 至图16G中描绘说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白形式的卡通示意图。

IL-15/Rα-异二聚Fc形式的说明性蛋白质(图16A)包括XENP20818和 XENP21475，其序列描绘于图17中。scIL-15/Rα-Fc形式的说明性蛋白质(图16B)包括 XENP21478和XENP21993，其序列描绘于图18中。ncIL-15/Rα-Fc形式的说明性蛋白质 (图16C)包括XENP21479、XENP22366和XENP24348，其序列描绘于图19中。二价 ncIL-15/Rα-Fc形式的说明性蛋白质(图16D)是XENP21978，其序列描绘于图20中。图 21中描绘二价scIL-15/Rα-Fc形式的说明性蛋白质的序列(图16E)。Fc-ncIL-15/Rα形式的说明性蛋白质(图16F)是XENP22637和XENP22638，其序列描绘于图22中。Fc-scIL- 15/Rα形式的说明性蛋白质的序列(图16G)描绘于图23中。

蛋白质通过在HEK293E细胞中瞬时转染产生，并且通过两步纯化方法纯化，所述纯化方法包含蛋白A色谱(GE Healthcare)和阴离子交换色谱(HiTrapQ 5mL柱，具有5-40％梯度的50mM Tris pH 8.5和50mM Tris pH 8.5，具有1M NaCl)。

在细胞增殖分析中测试如上所述的各种形式的IL-15/Rα-Fc融合蛋白。用指定浓度的测试品处理人PBMC。处理4天后，PBMC用抗CD8-FITC(RPA-T8)、抗CD4- PerCP/Cy5.5(OKT4)、抗CD27-PE(M-T271)、抗CD56-BV421(5.1H11)、抗CD16-BV421(3G8) 和抗CD45RA-BV605(Hi100)染色以便对以下细胞类型进行门控：CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和NK细胞(CD56+/CD16+)。Ki67是与细胞增殖严格相关的蛋白质，并且使用抗Ki67- APC(Ki-67)和Foxp3/转录因子染色缓冲液组(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技 (Thermo FisherScientific,Waltham,Mass.))进行细胞内Ki67的染色。使用FACS测量上述细胞类型上的Ki67的百分比(描绘于图24A至图24C和图25A至图25C中)。各种IL- 15/Rα-Fc融合蛋白诱导CD8+ T细胞和NK细胞的强烈增殖。值得注意的是，增殖活性的差异取决于IL-15-Fc侧的接头长度。特别地，没有接头(仅铰链)的构建体，包括 XENP21471、XENP21474和XENP21475，表现出较弱的增殖活性。

1B：具有工程化的二硫键的IL-15/Rα-Fc融合蛋白

为了进一步提高稳定性并且延长IL-15/Rα-Fc融合蛋白的半衰期，将二硫键工程化到IL-15/Rα界面。通过检查IL-15/Rα复合物的晶体结构，以及通过使用分子操作环境(Molecular Operating Environment(MOE)；加拿大魁北克省蒙特利尔化学计算集团(Chemical Computing Group,Montreal,Quebec,Canada))软件建模，预测IL-15/Rα界面处的残基可以被半胱氨酸取代以形成共价二硫键，如图26中所描绘。另外，在IL-15Rα中的sushi结构域后多达三个氨基酸被添加到IL-15Rα(sushi)的C末端，作为工程化的半胱氨酸的骨架(其说明性序列在图27中描绘)。图28和图29中分别描绘用半胱氨酸工程化的说明性IL-15和IL-15Rα(sushi)变体的序列。

通过标准基因合成构筑编码IL-15或IL-15Rα(sushi)的质粒，然后亚克隆到含有Fc融合配偶体(例如，如图8中所描绘的恒定区)的pTT5表达载体中。通过标准诱变技术将如上所述鉴定的残基被半胱氨酸取代。图30A至图30D中描绘具有工程化二硫键的IL- 15/Rα-Fc融合蛋白的卡通示意图。

dsIL-15/Rα-异二聚Fc形式的说明性蛋白质(图30A)包括XENP22013、 XENP22014、XENP22015和XENP22017，其序列描绘于图31中。dsIL-15/Rα-Fc形式的说明性蛋白质(图30B)包括XENP22357、XENP22358、XENP22359、XENP22684和 XENP22361，其序列描绘于图32中。dsIL-15/Rα-Fc形式的说明性蛋白质(图30C)包括 XENP22634、XENP22635、XENP22636和XENP22687，其序列描绘于图33中。Fc-dsIL- 15/Rα形式的说明性蛋白质(图30D)包括XENP22639和XENP22640，其序列描绘于图34 中。

蛋白质通过在HEK293E细胞中瞬时转染产生，并且通过两步纯化方法纯化，所述纯化方法包含蛋白A色谱(GE Healthcare)和阴离子交换色谱(HiTrapQ 5mL柱，具有5-40％梯度的50mM Tris pH 8.5和50mM Tris pH 8.5，具有1M NaCl)。

在纯化蛋白质后，通过毛细管等电聚焦(CEF)表征其纯度和均一性。使用LabChipGXII Touch HT(PerkinElmer,Waltham,Mass.)，使用Protein Express Assay LabChip 和Protein Express Assay Reagent Kit，使用制造商的说明书进行CEF。样品一式两份进行，一次在还原条件下(用二硫苏糖醇)，另一次在非还原条件下。正如变性非还原性CEF所示，正确形成了许多二硫键，其中与没有工程化二硫键的对照相比，可以看到共价复合物的较大分子量(图35)。

然后在细胞增殖分析中测试蛋白质。将IL-15/Rα-Fc融合蛋白(具有或不具有工程化的二硫键)或对照与PBMC一起孵育4天。孵育后，PBMC用抗CD4-PerCP/Cy5.5 (RPA-T4)、抗CD8-FITC(RPA-T8)、抗CD45RA-BV510(HI100)、抗CD16-BV421 (3G8)、抗CD56-BV421(HCD56)、抗CD27-PE(O323)和抗Ki67-APC(Ki-67)染色以标记各种细胞群，并且通过FACS加以分析。图36A至图36C中描绘如Ki67表达所指示的NK细胞、CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的增殖。每种IL-15/Rα-Fc融合蛋白和IL-15对照都诱导NK细胞、CD8+ T细胞和CD4+ T细胞的强烈增殖。

1C：为降低效力并且增加PK和半衰期而工程化的IL-15/Rα-Fc融合蛋白

为了进一步改善PK并且延长半衰期，推断降低IL-15的效力会降低抗原沉降，并且因此增加半衰期。通过检查IL-15:IL-2Rβ和IL-15:共同γ链界面的晶体结构，以及通过使用MOE软体建模，预测这些界面处的残基可以被取代以降低效力。图37描绘展示预测残基的位置的IL-15:受体复合物的结构模型，其中工程化同配取代(以降低免疫原性风险)。图3中描绘为降低效力而设计的说明性IL-15变体的序列。

通过标准基因合成构筑编码IL-15或IL-15Rα(sushi)的质粒，然后亚克隆到含有Fc融合配偶体(例如，如图8A至图8D中描绘的恒定区)的pTT5表达载体中。通过标准诱变技并入如上所述鉴定的取代。图39A至图39E中描绘为降低效力而工程化的“IL- 15/Rα-异二聚Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白的序列。图40A至图40D中描绘为降低效力而工程化的“scIL-15/Rα-Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白的序列。图41A至图41B中描绘为降低效力而工程化的“ncIL-15/Rα-Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白的序列。图42中描绘为降低效力而工程化的说明性ncIL-15/Rα异二聚体的序列。图43中描绘为降低效力而工程化的“二价ncIL-15/Rα-Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白的序列。图44中描绘为降低效力而工程化的“dsIL-15/Rα-Fc”形式的说明性IL-15/Rα-Fc融合蛋白的序列。

蛋白质通过在HEK293E细胞中瞬时转染产生，并且通过两步纯化方法纯化，所述纯化方法包含蛋白A色谱(GE Healthcare)和阴离子交换色谱(HiTrapQ 5mL柱，具有5-40％梯度的50mM Tris pH 8.5和50mM Tris pH 8.5，具有1M NaCl)。

1C(a)：为降低效力而工程化的变异IL-15/Rα-Fc融合蛋白的体外活性

在许多细胞增殖分析中测试变异IL-15/Rα-Fc融合蛋白。

在第一次细胞增殖分析中，将IL-15/Rα-Fc融合蛋白(具有或不具有工程化取代)或对照与PBMC一起孵育4天。孵育后，PBMC用抗CD4-Evolve605(SK-3)、抗CD8-PerCP/Cy5.5(RPA-T8)、抗CD45RA-APC/Cy7(HI100)、抗CD16-eFluor450 (CB16)、抗CD56-eFluor450(TULY56)、抗CD3-FITC(OKT3)和抗Ki67-APC(Ki-67) 染色以标记各种细胞群并且通过FACS分析。图45至图46中描绘如Ki67表达所指示的NK 细胞、CD8+ T细胞和CD4+ T细胞的增殖。大多数IL-15/Rα-Fc融合蛋白诱导每个细胞群的增殖；然而，活性根据特定的工程取代而变化。

在第二次细胞增殖分析中，将IL-15/Rα-Fc融合蛋白(具有或不具有工程化取代)与PBMC一起孵育3天。孵育后，PBMC用抗CD3-FITC(OKT3)、抗CD4-Evolve604 (SK-3)、抗CD8-PerCP/Cy5.5(RPA-T8)、抗CD16-eFluor450(CB16)、抗CD56- eFluor450(TULY56)、抗CD27-PE(O323)、抗CD45RA-APC/Cy7(HI100)和抗Ki67- APC(20Raj1)抗体染色以标记各种细胞群。首先基于侧向散射(SSC)和前向散射(FSC) 对淋巴细胞进行门控。然后基于CD3表达对淋巴细胞进行门控。基于CD16表达进一步门控CD3表达阴性的细胞以鉴定NK细胞(CD16+)。基于CD4和CD8表达进一步门控 CD3+ T细胞以鉴定CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和γδT细胞(CD3+CD4-CD8-)。针对 CD45RA表达对CD4+ T细胞和CD8+ T细胞进行门控。最后，基于Ki67表达百分比确定各种细胞群的增殖，并且数据示于图47A至图47D中。NK和CD8+ T细胞比CD4+ T细胞对 IL-15/Rα-Fc融合蛋白更敏感，并且如上所述，增殖活性根据特定的工程化取代而变化。图 47D示出各种IL-15/Rα-Fc融合蛋白相对于对照XENP20818的EC50倍数变化。图48A和图 48B进一步描绘在PBEN与XENP22821一起孵育之前和之后，通过针对CD69和CD25(T细胞活化标记物)的表达进行门控，用IL-15/Rα-Fc融合蛋白处理后淋巴细胞的活化。

在第三个实验中，在37℃下将额外变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白与人PBMC一起孵育3天。孵育后，PBMC用抗CD3-FITC(OKT3)、抗CD4-SB600(SK-3)、抗CD8- PerCP/Cy5.5(RPA-T8)、抗CD45RA-APC/Cy7(HI100)、抗CD16-eFluor450(CB16)、抗CD25-PE(M-A251)和抗Ki67-APC(Ki-67)染色以标记各种细胞群并且通过FACS分析。图49A至图49D中描绘如Ki67表达所指示的CD8+(CD45RA-)T细胞、CD4+ (CD45RA-)T细胞、γδT细胞和NK细胞的增殖。

在第四个实验中，将人PBMC与指定浓度的额外IL-15/Rα-Fc变体一起孵育3 天。孵育后，PBMC用抗CD3-FITC(OKT3)、抗CD4(SB600)、抗CD8-PerCP/Cy5.5 (RPA-T8)、抗CD16-eFluor450(CB16)、抗CD25-PE(M-A251)、抗CD45RA- APC/Cy7(HI100)和抗Ki67-APC(Ki67)染色，并且通过FACS分析。处理后CD8+ T细胞、CD4+ T细胞和NK细胞上Ki67的百分比描绘于图50中。

在第五个实验中，在37℃下将变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白与人PBMC一起孵育 3天。孵育后，细胞用抗CD3-PE(OKT3)、抗CD4-FITC(RPA-T4)、抗CD8α-BV510 (SK1)、抗CD8β-APC(2ST8.5H7)、抗CD16-BV421(3G8)、抗CD25-PerCP/Cy5.5 (M-A251)、抗CD45RA-APC/Cy7(HI100)、抗CD56-BV605(NCAM16.2)和抗Ki67- PE/Cy7(Ki-67)染色并且通过FACS分析。图51A至图51E中描绘CD8+ T细胞、CD4+ T 细胞、γδT细胞和NK细胞上Ki67的百分比。

在第六个实验中，在37℃下将变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白与人PBMC一起孵育 3天。孵育后，细胞用抗CD3-PE(OKT3)、抗CD4-FITC(RPA-T4)、抗CD8α-BV510 (SK1)、抗CD8β-APC(SIDI8BEE)、抗CD16-BV421(3G8)、抗CD25-PerCP/Cy5.5 (M-A251)、抗CD45RA-APC/Cy7(HI100)、抗CD56-BV605(NCAM16.2)和抗Ki67- PE/Cy7(Ki-67)染色并且通过FACS分析。图52A至图52E中描绘CD8+ T细胞、CD4+ T 细胞、γδT细胞和NK细胞上Ki67的百分比。

在第七个实验中，在37℃下将变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白与指定浓度的人 PBMC一起孵育3天。孵育后，PBMC用抗CD3-PE(OKT3)、抗CD4-FITC(RPA-T4)、抗CD8-APC(RPA-T8)、抗CD16-BV605(3G8)、抗CD25-PerCP/Cy5.5(M-A251)、抗 CD45RA-APC/Fire750(HI100)和抗Ki67-PE/Cy7(Ki-67)染色，并且通过FACS分析。图 53A至图53D中描绘CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、γδT细胞和NK(CD16+)细胞上的 Ki67百分比。数据显示，ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白XENP21479是CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、NK(CD16+)细胞和γδT细胞增殖中最有效的诱导物。每种scIL-15/Rα-Fc融合蛋白在诱导增殖方面都不如XENP21479有效，但差异取决于接头长度以及特定的工程化取代。

在第八个实验中，在37℃下将变体IL-15/Rα-Fc融合蛋白与指定浓度的人 PBMC一起孵育3天。孵育后，PBMC用抗CD3-PE(OKT3)、抗CD4-FITC(RPA-T4)、抗CD8-APC(RPA-T8)、抗CD16-BV605(3G8)、抗CD25-PerCP/Cy5.5(M-A251)、抗 CD45RA-APC/Fire750(HI100)和抗Ki67-PE/Cy7(Ki-67)染色，并且通过FACS分析。图 54A至图54D中分别描绘CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、γδT细胞和NK(CD16+)细胞上的 Ki67百分比。如上所述，数据显示ncIL-15/Rα-Fc融合蛋白XENP21479是CD8+ T细胞、 CD4+ T细胞、NK(CD16+)细胞和γδT细胞增殖中最有效的诱导物。值得注意的是，与野生型(XENP21479)相比，将Q108E取代引入ncIL-15/Rα-Fc形式(XENP24349)显著降低其增殖活性。

1C(b)：为降低效力而工程化的IL-15/Rα-Fc融合蛋白的PK

为了研究为降低效力而工程化的IL-15/Rα-Fc融合蛋白是否具有改善的半衰期和PK，在C57BL/6小鼠的PK研究中检查了这些变体。在第0天，通过IV-TV向两组小鼠 (每组测试品5只小鼠)投配0.1mg/kg指定的测试品。在投配后60分钟收集血清，然后在第2天、第4天和第7天收集血清用于同期群1，并且在第1天、第3天和第8天用于同期群2。在夹心ELISA中使用抗IL-15和抗IL-15Rα抗体测定IL-15/Rα-Fc融合蛋白的血清含量。结果描绘于图55中。图56描绘测试品的效力与半衰期之间的相关性。如预测的那样，效力降低的变体显示出显著更长的半衰期。值得注意的是，与野生型对照XENP20818的0.5 天相比，半衰期延长到近9天(参见XENP22821和XENP22822)。

实施例2：工程化的靶向NKG2A和NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体

肿瘤逃避免疫消除的一种策略是通过下调MHC I类以避免T细胞识别 (Garrido,F等人，2016)。作为备用，NK细胞可以在不存在MHC I的情况下识别癌细胞，并且实际上可能被肿瘤细胞敏化MHC I类的下调(Zamai,L等人，2007)。然而，已经发现癌症患者的NK细胞计数降低(Levy,EM等人，2011)。因此，产生了靶向NKG2A和 NKG2D的构建体，其目的不仅是使IL-15/Rα-Fc融合体偏离Treg，而且还选择性地靶向和扩增NK细胞。

2A：工程化靶向NKG2A和NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体

莫纳珠单抗的VH和VL序列(如2014年12月2日发布的美国专利第 8,901,283号中所公开)以Fab形式被人源化和工程化，用作靶向NKG2A的IL-15/Rα-Fc融合体的概念证明的组分。二价形式的莫纳珠单抗(嵌合和人源化的序列)在图58中描绘为 XENP24541和XENP24542。

抗NKG2D的VH和VL序列(如在2011年2月1日发布的美国专利第 7,879,985号中公开)以Fab形式被工程化，用作靶向原型NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体的组分。二价mAb形式的序列在图59中描绘为XENP24365。

以如图57D中所描绘的scIL-15/Rα×Fab形式产生靶向NKG2A和NKG2D的 IL-15/Rα-Fc融合体，所述形式包含与异二聚Fc区的N末端融合的VH，另一侧包含通过可变长度的接头(称为“scIL-15/Rα”)与IL-15融合的IL-15Rα(sushi)，其与异二聚体Fc区另一侧的N末端融合，而单独转染相应轻链以与VH形成Fab。图60中描绘用于说明性的靶向NKG2A的IL-15/Rα-Fc融合体XENP24531、XENP24532和XENP27146的序列，并且图61A至图61B中描绘用于说明性的靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体XENP24533、 XENP24534和XENP27145的序列。

通过吉布森(Gibson)组装构筑如上所述的编码VH和VL序列的质粒、IL-15 和IL-15Rα(sushi)结构域、轻链恒定区和异二聚体恒定区(如图9中所描绘)。通过在 HEK293E细胞中进行瞬时转染来产生蛋白质，并且通过两步纯化方法进行纯化，所述方法包含蛋白A色谱，然后是离子交换色谱。

2B：具有IL-15效力变体的靶向NKG2A的IL-15/Rα-Fc融合体的活性

在细胞增殖测定中测试单臂scIL-15/RαFc融合体(XENP21993)、靶向 NKG2A的效力降低的scIL-15(N65D)/Rα(XENP24531)和靶向NKG2A的效力降低的scIL- 15(Q108E)/Rα(XENP24532)，其具有基于莫纳珠单抗的抗NKG2A Fab臂。

用指定浓度的测试品处理人PBMC。处理后3天，通过FACS分析PBMC。针对每个测试品，图62A至图62C中描绘CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和NK细胞上Ki67的百分比。数据显示，与XENP21993相比，XENP24531和XENP24532在增殖CD4+ T细胞、 CD8+ T细胞和NK细胞中显示出降低的效力。值得注意的是，与XENP24531相比， XENP24532在增殖CD4+ T细胞方面显示出降低的功效，同时保持了在增殖CD8+ T细胞方面的功效。这表明，即使具有相同的靶向NKG2A的Fab臂，scIL-15/Rα侧的效力也会影响扩增各种细胞类型的效力。

2C：靶向NKG2A和NKG2D的效力降低的IL-15/Rα-Fc融合体显示NK细胞的选择性增 殖

用指定浓度的测试品处理人PBMC。处理后3天，PBMC首先用抗CD3- PerCP/Cy5.5(OKT3)、抗CD4-BV786(RPA-T4)、抗CD8-PE/Cy7(SIDI8BEE)、抗 CD16-BV421(3G8)、抗CD56-BV605和抗CD45RA-APC/Cy7(HI100)染色。再次洗涤细胞，并且使用eBioscience^TMFoxp3/转录因子染色缓冲液组(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技)用抗FoxP3-AF488(259D)和抗Ki67-APC染色。首先通过基于SSC和FSC的门控来鉴定淋巴细胞。然后根据CD3表达对淋巴细胞进行门控，以鉴定NK细胞(CD3- CD16+)和CD3+ T细胞。然后基于CD4和CD8对CD3+ T细胞进行门控，以鉴定CD4+ T 细胞和CD8+ T细胞。然后通过基于CD45RA的进一步门控来鉴定CD4+和CD8+记忆T细胞亚群。最后，确定在CD4+ T细胞(CD3+CD4+CD45RA-)、CD8+ T细胞(CD3+CD8+CD45RA-)和NK细胞上与细胞增殖严格相关的蛋白Ki67的百分比(分别描绘于图63A至图63C中)。数据显示，与XENP20818(WT IL-15/Rα-Fc)相比，对照“靶向RSV的”效力降低的单臂scIL-15(N4D/N65D)/Rα-Fc XENP26007在CD8+ T细胞和CD4+ T细胞以及NK细胞的增殖方面具有显著降低的效力。用抗NKG2A或抗NKG2D Fab臂靶向 (如XENP27145和XENP27146中)选择性诱导NK细胞增殖，而对增殖CD8+ T细胞和 CD4+ T细胞的效力没有增强。

细胞因子与其受体结合后，与受体相关的Janus激酶(JAK)使STAT蛋白磷酸化，然后将STAT蛋白转运到细胞核中以调节进一步的下游过程。因此，STAT蛋白(特别是STAT5，其包括STAT5a和STAT5b)的磷酸化是由IL-15与其受体结合触发的最早的信号事件之一。

因此，在另一个实验中，研究了通过靶向NKG2A和NKG2D的IL-15/Rα-Fc 融合体对各种淋巴细胞群的STAT5磷酸化的诱导。在37℃下将人PBMC与以下测试产品在指定浓度下一起孵育15分钟：XENP20818(WT IL-15/Rα-Fc)、XENP24050、XENP27145 和XENP27146。为了在孵育后门控各种细胞群，在室温下PBMC用抗CD3-BUV395 (UCHT1)、抗CD4-BV605(RPA-T4)和抗CD8-Alexa700(SK1)染色30-45分钟。洗涤细胞，并且与预冷(-20℃)90％甲醇一起孵育20-60分钟。甲醇孵育后，再次洗涤细胞，并且用抗CD25-BV421(M-A251)、抗CD45RA-BV510(HI100)、抗FoxP3-AF488 (249D)、抗CD56-PE和抗pSTAT5-Alexa647(pY687)染色以标记各种细胞群和STAT5 磷酸化。图64中描绘在CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、Treg和NK细胞群上描绘诱导STAT5 磷酸化的数据。与上述描述Ki67表达的数据一致，本文中的数据表明与XENP20818相比， XENP26007在CD8+和CD4+ T细胞以及Treg和NK细胞上诱导STAT5磷酸化的效力大大降低，并且用抗NKG2A或抗NKG2D Fab(如XENP27145和XENP27146中)靶向选择性地靶向NK细胞，而没有表现出对CD8+ T细胞、CD4+ T细胞或Treg的优选靶向。

实施例3：靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合体

3A：工程化靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合体

鼠类抗CD8抗体的亲本可变区(在图65中描绘为XENP15076)被人源化(如先前在2010年2月2日发布的美国专利第7,657,380号中所描述)，并且以Fab形式进行工程化以用作靶向原型CD8的IL-15/Rα-Fc融合体的组分。人源化抗CD8的序列在图65中描绘为二价抗体(XENP15251)和Fab(XENP23647)，以及人源化变体描绘为单臂mAb (XENP24317)。

靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合体以如图57D中所描绘的scIL-15/Rαx Fab形式产生，其包含通过可变长度的接头(称为“scIL-15/Rα”)与IL-15融合的IL-15Rα(sushi)，然后将其与异二聚体Fc区的N末端融合，其中可变重链(VH)与异二聚体Fc的另一侧融合，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab。这种形式的说明性靶向CD8的IL- 15/Rα-Fc融合体包括XENP24114、XENP24115和XENP24116，其序列描绘于图66中。

靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合体也以以下形式产生：如图57E中所描绘的Fab xncIL-15/Rα形式，其包含与异二聚体Fc区的N末端融合的VH，其中IL-15Rα(sushi)与异二聚体Fc的另一侧融合，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab，并且同时单独转染 IL-15以使得形成非共价IL-15/Rα复合物；如图57G中所描绘的mAb-scIL-15/Rα形式，其包含与第一异二聚体Fc和第二异二聚体Fc的N末端融合的VH，其中IL-15与随后与异二聚体Fc区中的一个的C末端进一步融合的IL-15Rα(sushi)融合，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab；如图57H中所描绘的mAb-ncIL-15/Rα形式，其包含与第一异二聚体Fc 和第二异二聚体Fc的N末端融合的VH，其中IL-15Rα(sushi)与异二聚体Fc区中的一个的C 末端融合，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab，并且同时单独转染IL-15以使得形成非共价IL-15/Rα复合物；如图57J中所描绘的中央-IL-15/Rα，其包含以重组方式与随后与异二聚体Fc的一侧进一步融合的IL-15的N末端融合的VH以及以重组方式与随后与异二聚体Fc的另一侧进一步融合的IL-15Rα(sushi)的N末端融合的VH，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab；和如图57K中所描绘的中央-scIL-15/Rα形式，其包含与的IL- 15Rα(sushi)的N末端融合的VH，所述IL-15Rα(sushi)与随后与异二聚体Fc的一侧进一步融合的IL-15融合，以及与异二聚体Fc的另一侧融合的VH，同时单独转染相应轻链以形成具有VH的Fab。这些替代形式的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合体的说明性序列描绘于图79中。

通过吉布森组装构筑如上所述的编码VH和VL序列的质粒、IL-15和IL- 15Rα(sushi)结构域、轻链恒定区和异二聚体恒定区(如图9中所描绘)。通过在HEK293E 细胞中进行瞬时转染来产生蛋白质，并且通过两步纯化方法进行纯化，所述方法包含蛋白A 色谱，然后是离子交换色谱。

3B：通过靶向CD8的IL-15 Fc融合体原型诱导细胞增殖

在细胞增殖试验中测试二价抗CD8抗体(XENP15251)、单臂scIL-15/Rα-Fc 融合体(XENP21993)、靶向CD8的scIL-15/Rα-Fc(XENP24114)，其具有基于 XENP15251的抗CD8 Fab臂。

用指定浓度的测试品处理人PBMC。处理后3天，PBMC用抗CD3-PE (OKT3)、抗CD4-FITC(RPA-T4)、抗CD8-APC(RPA-T8)、抗CD16-BV605(3G8)、抗CD45RA-APC/Fire750(HI100)和抗Ki67-PE/Cy7(Ki-67)染色，并且通过FACS分析。首先通过基于SSC和FSC的门控来鉴定淋巴细胞。然后根据CD3表达对淋巴细胞进行门控，以鉴定NK细胞(CD3-CD16+)和CD3+ T细胞。然后，基于CD4和CD8对CD3+ T细胞进行门控，以鉴定CD4+、CD8+和γδT细胞(CD3+CD4-CD8-)。然后通过基于CD45RA 的进一步门控来鉴定CD4+和CD8+记忆T细胞亚群。最后，确定在CD4+ T细胞 (CD3+CD4+CD45RA-)、CD8+ T细胞(CD3+CD8+CD45RA-)和NK细胞上与细胞增殖严格相关的蛋白Ki67的百分比(分别如图67A至图67C所示)。数据显示，与单臂IL- 15/Rα-Fc融合体相比，靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合体在诱导CD8+ T细胞增殖方面更有效。值得注意的是，靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合体在诱导CD4+ T细胞增殖方面比单臂IL- 15/Rα-Fc融合体的效力低，这是由于包括Fab臂而导致IL-15活性减弱。

3C：通过靶向CD8的效力降低的IL-15 Fc融合体原型诱导细胞增殖

在细胞增殖试验中测试单臂scIL-15/RαFc融合体(XENP21993)、单臂效力降低的scIL-15/RαFc融合体(XENP24014)和靶向CD8的效力降低的scIL-15/Rα-Fc融合体(XENP24116)，其具有基于XENP15251的抗CD8 Fab臂。用指定浓度的测试品处理人 PBMC。处理后3天，通过FACS分析PBMC。图68A至图68C中描绘CD8+ T细胞、 CD4+ T细胞、γδT细胞和NK细胞上Ki67的百分比。

数据表明，与XENP21993相比，XENP24014在增殖NK细胞、CD4+ T细胞和CD8+ T细胞中显示出降低的效力。与XENP24014相比，XENP24116在增殖CD8+ T细胞(与XENP21993相比)中显示出增强的效力，在CD4+ T细胞上具有降低的效力，并且在NK细胞上具有相似的效力。

3D：靶向CD8的效力降低的IL-15Fc融合体原型对Treg的效应

研究靶向CD8的效力降低的scIL-15(N65D)/Rα-Fc(XENP24116)以及单臂的效力降低的scIL-15(N65D)/RαFc融合体(XENP24014)、效力降低的IL-15(Q108E)/Rα-Fc 异二聚体(XENP22822)和重组人类IL-15(rhIL-15)对Treg增殖(如由CD4+ T细胞上Ki67 表达的百分比表示)的作用。

雷帕霉素体外扩增的Treg用于研究靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合体的作用。先前已有报道雷帕霉素在体外促进CD4+CD25+FOXP3+T reg的增殖，并且由此产生的扩增的Treg抑制CD4+和CD8+ T细胞的增殖(参见，例如Battaglia等人(2006)，Rapamycin promotesexpansion of functional CD4+CD25+FOXP3+regulatory T cells of both healthysubjects and type 1diabetic patients.J Immunol.177(12)8338-8347；以及Strauss等人,(2007),Selective survival of naturally occurring human CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells cultured with rapamycin.J Immunol.178(1)320-329)。因此，使用EasySep^TM人类CD4+ T细胞富集试剂盒 (STEMCELL Technologies，加拿大温哥华(Vancouver,Canada))，通过阴性选择从来自两个供体(供体21和23)的人PBMC中富集CD4+T细胞。使用Dynabeads^TM人类Treg膨胀剂(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技)在RPMI1640+10％胎牛血清+0.1μg/ml雷帕霉素+500U/ml IL-2中扩增Treg 1-4天。将Treg转移到涂覆有0.5μg/ml抗CD3(OKT3， Biolegend公司，加利福尼亚州圣地亚哥)的T75烧瓶中，并且用RPMI1640+10％胎牛血清+ 0.1μg/ml雷帕霉素+100U/ml IL-2+0.5μg/ml抗CD28 mAb进行孵育。在最初从PBMC富集CD4+ T细胞后至少8天进行实验。将1.5×10⁵个雷帕霉素培养的Treg与指定浓度的指定测试品在37℃的抗CD3涂布的平板(0.5μg/mL OKT3)上一起孵育4天。在第4天，通过 FACS分析细胞。图69A至图69B中分别描绘供体21和23的CD4+ T上Ki67的百分比。图 70A至图70B中分别描绘供体21和23的CD4+细胞计数。图71A至图71B中分别描绘供体 21和23的CD25 MFI。

数据显示重组人类IL-15诱导最强的Treg增殖。尽管与rhIL-15相比， XENP22822和XENP24014诱导的Treg增殖较少，但靶向CD8的效力降低的scIL- 15(N65D)/Rα-Fc融合XENP24116是Treg增殖的最弱诱导剂。

3E：在抑制试验中，通过靶向CD8的效力降低的IL-15 Fc融合体诱导CD8+ T细胞增 殖。

研究靶向CD8的效力降低的scIL-15(N61D)/Rα-Fc融合体(XENP24115)以及单臂的效力降低的scIL-15(N61D)/RαFc融合体(XENP24013)在Treg存在下对CD8+反应性T细胞、CD4+应答T细胞和NK细胞增殖的影响。

将CFSE标记的PBMC与500ng/mL的所示测试品和指定浓度的Tag-it紫色标记Treg(如实施例2C中所述进行扩增)在抗CD3涂布的平板(OKT3；100ng/mL)上孵育。在37℃下孵育4天后，通过FACS分析细胞，并且通过CFSE测量增殖。图72A至图72C 中分别描绘增殖CD8T细胞、CD4T细胞和NK细胞的百分比数据。图73描绘使用不同 Treg:PBMC比例进行的类似实验中的Treg计数。

数据显示，靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合体可增加CD8+应答性T细胞的增殖，并且需要更多的Treg抑制增殖。数据还表明，XENP24115和XENP24013都不影响CD4+应答性T细胞增殖；然而，两者都诱导NK细胞增殖。值得注意的是，图73显示，靶向CD8 的IL-15/Rα-Fc融合体仍能诱导Treg增殖(与未处理的对照组相比)，但其诱导程度明显少于单臂scIL-15/Rα-Fc。

在进一步的实验中，研究了在存在Treg的情况下，用靶向CD8的IL-15/Rα-Fc 融合体处理后，CD8+记忆T细胞、CD4+记忆T细胞和Treg增殖的剂量反应。将1×10⁵个 CFSE标记的PBMC和5×10⁴个Tag-it紫色标记的Treg(如实施例3D中所述扩增；1：2 Treg：PBMC比例)与指定浓度的包括抗RSV二价mAb(XENP15074)作为对照的指定测试品在抗CD3涂布的平板上(OKT3；100ng/mL)一起孵育4天。通过CFSE或Tag-it紫色稀释物来测量增殖。图74A至图74C中分别描绘CD8+记忆T细胞、CD4+记忆T细胞和 Treg的数据。最后，研究了用靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合体处理后，在不存在PBMC的情况下，Treg增殖的剂量反应。将1×10⁵个Tag-it紫色标记的Treg与指定浓度的指定测试品在抗CD3涂布的平板(OKT3；100ng/mL)上一起孵育4天。通过Tag-it Violet稀释测量如图75中描绘的细胞计数。

数据显示，在所有测试浓度下，靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合体均比单臂 scIL-15/Rα-Fc诱导更大的CD8+记忆T细胞增殖。值得注意的是，与单臂scIL-15/Rα-Fc相比，靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合诱导的CD4+记忆T细胞和Treg增殖较少。

3F：GVHD模型中靶向CD8的效力降低的IL-15 Fc融合体的活性

在雌性NSG(NOD-SCID-γ)免疫缺陷小鼠中进行的移植物抗宿主病(GVHD) 模型中评估了靶向CD8的效力降低的IL-15/Rα-Fc融合体(XENP24116)和其它效力降低的 IL-15变体。当向NSG小鼠注射人PBMC时，人PBMC发展出针对小鼠细胞的自身免疫应答。注射人PBMC的NSG小鼠，随后靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合和IL-15变体的处理可以增强植入的T细胞的增殖。

在第-7天通过IV-OSP将1000万个人PBMC植入NSG小鼠中，然后在第0天用指定浓度的指定测试品(0.3mg/kg)给药。在第4天和第7天收集全血，并且针对其脾脏在第11天处死小鼠，以使用FACS测量CD4+ T细胞和CD8+ T细胞计数。图76A至图76D 中分别描绘第4天全血中的CD4+ T细胞事件、CD8+ T细胞事件、CD8+ T细胞和CD4+ T 细胞事件之间的相关性以及CD8+ T细胞/CD4+ T细胞的比率。图77A至图77D中分别描绘第7天全血中的CD4+ T细胞事件、CD8 T细胞事件、CD8+ T细胞和CD4+ T细胞事件之间的相关性以及CD8+ T细胞/CD4+ T细胞的比率。图78A至图78D中分别描绘第8天脾脏中的CD4+ T细胞事件、CD8T细胞事件、CD8+ T细胞和CD4+ T细胞事件之间的相关性以及 CD8+ T细胞/CD4+ T细胞的比率。每个点代表一只雌性NSG小鼠。数据显示，与同时扩增 CD4+和CD8+ T细胞的IL-15变体相比，XENP24116选择性扩增CD8+ T细胞。

3G：替代形式的靶向CD8的IL-15 Fc融合体

在细胞增殖试验中测试了图57(卡通)和图79(序列)中所描绘的多种替代形式的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合体。用XENP24114、XENP24116、XENP24546、XENP24543、XENP24547和XENP24548处理人PBMC。处理后3天，通过FACS分析 PBMC。图80中描绘处理后CD8+ T细胞、CD4+ T细胞和NK细胞上Ki67的百分比。

实施例4：靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合体(非阻断CD8结合结构域)

4A：噬菌体展示文库和CD8结合剂的筛选

内部产生重组人类CD8α和食蟹猴CD8α用于噬菌体淘选。通过吉布森装配在 pTT5载体中构筑编码抗原的质粒。在瞬时转染HEK293E细胞后，分泌的抗原通过蛋白A 亲和色谱纯化。

建立了新的内部噬菌体文库，在噬菌体外壳蛋白pIII上展示Fab变体，并且淘选4轮。在第一轮之前和每一轮之后，将噬菌体添加到对数期XL1-Blue细胞(Agilent,Wilmington,Del.)中，并且在37℃，250rpm下孵育过夜。对Fab克隆的VH和VL身份进行测序，然后通过吉布森组装从中构筑质粒，并且将其亚克隆到包含IgG1恒定区编码序列的pTT5表达载体中。在HEK293E中转染DNA以表达，并且使用A蛋白亲和色谱从上清液中纯化得到的二价mAb。例示性克隆1C11B3的氨基酸序列描绘于图81中的二价mAb (XENP24025)和单臂mAb(XENP24321)。

4B：噬菌体展示文库和CD8结合剂的筛选

测试重组为单臂Fab-Fc抗体的噬菌体克隆1C11B3(分别为XENP24321)与 CD4+和CD8+ T细胞的结合。基于XENP15251的变体的单臂Fab-Fc抗体(XENP24317；图65中描绘的序列)用作对照。

使用EasySep^TM人类T细胞分离试剂盒(STEMCELL Technologies，加拿大温哥华)从人PBMC中纯化的T细胞与测试品在指定浓度下在冰上一起孵育1小时。离心细胞以去除过量的测试品，重悬于抗CD3-FITC(HIT3a)、抗CD4-PE(OKT4)和与APC偶联的二抗，并且在冰上孵育45分钟。将细胞洗涤两次，用染色缓冲液重悬并且用FACS分析。图82描绘CD4+ T细胞和CD8+ T细胞上的MFI。数据显示，XENP24321与CD8+ T细胞的结合优于XENP24317。

4B：鉴定不阻止CD8与pMHCI相互作用的抗CD8 mAb

肿瘤细胞表现出主要的组织相容性复合体I类分子(MHCI)，所述分子显示出被TCR(对肽具有特异性)和CD8+ T细胞上的CD8识别的肽片段(如图83A中所描绘)。CD8与pMHCI的结合触发T细胞的增殖和活化。抗CD8抗体可能会结合CD8上的一个抗原决定簇，从而对其进行定位，因此阻止CD8与pMHCI的结合，进而阻止CD8+ T 细胞的活化(图83B)。为了保留活化，有必要在靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合体中使用抗 CD8臂，所述臂不阻断CD8-MHCI相互作用。

4C(a)：MHC四聚体分析

使用MHC四聚体分析法研究上述抗CD8 mAb克隆是否阻断了CD8与pMHCI 的相互作用。将对HLA-A2*0201限制的CMV pp65(NLVPMVATV)肽(SEQ ID NO:6) (供体153，来自Astarte Biologics,Bothell,Wash.)具有特异性的约200k T细胞与指定浓度的指定测试品在冰上一起预孵育30分钟。还使用在没有抗CD8抗体的情况下孵育的对照样品。孵育后，将样品用iTAg四聚体/PE-HLA2:01CMV pp65(NLVPMVATV)(SEQ ID NO: 6)(MBL,Woburn,Mass.)、抗CD3-BUV395(UCTH-1)和抗CD4-APC/Fire750(OKT4) 染色1.5小时，并且通过FACS分析。首先基于CD3和CD4表达门控细胞以鉴定CD8+细胞。 MHC四聚体在CD3+细胞上的结合以PE MFI测量。数据在图84中描绘为相对于对照样品的结合分数。

数据显示，与商业OKT8 mAb(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技，内部生产为XENP15075)一起预孵育后，MHC四聚体的结合可与对照样品相当，而与其它商业 mAb SK-1(BioLegend,加利福尼亚州圣地亚哥)、32-M4(Santa Cruz Biotechnology,德克萨斯州达拉斯(Dallas,Tex.))和DK25(Dako,加利福尼亚州卡平特里亚(Carpinteria, Calif.))的结合减少了15-80％，这与Clement等人报道的结果一致。与XENP15251一起预孵育使MHC四聚体结合降低了超过50％。值得注意的是，与XENP24025(1C11B3)一起预孵育使MHC四聚体结合降低了约4％，这表明克隆1C11B3是非封闭的。

4C(b)：细胞因子释放测定

如上所述，CD8+ T细胞上的TCR和CD8与pMHCI的结合活化了T细胞，导致细胞因子释放。因此，还研究了在细胞因子释放试验中，抗CD8 mAb克隆是否阻断了 CD8与pMHCI的相互作用。

在室温下，T2细胞负载有50ng/ml HLA-A2*0201限制的CMV pp65 (NLVPMVATV)肽(SEQ ID NO:6)过夜。作为阴性对照，T2细胞负载有NY-ESO-1肽。过夜负载后，将T2细胞用丝裂霉素-C(密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司)在37℃处理30分钟。将对HLA-A2*0201限制的CMV pp65(NLVPMVATV)肽(SEQ ID NO:6) 具有特异性的50k T细胞与100μg/ml的所示测试品进行预孵育(一式两份)。然后将负载有10k肽的T2细胞添加到样品中，并且在37℃下孵育18小时。未进行抗CD8预孵育的对照如下：A)负载有pp65肽的T2细胞与CMV特异性T细胞一起孵育，B)负载有NY-ESO-1 肽的T2细胞与CMV特异性T细胞一起孵育，C)未负载的T2细胞与CMV特异性T细胞一起孵育的，以及D)仅CMV特异性T细胞。收集上清液并且用IFNγMSD分析(Meso Scale Discovery,Rockville,Md.)进行分析。

如图85中所描绘的数据展示没有抗CD8抗体预孵育的情况下，与OKT8和XENP24025预孵育的CMV特异性T细胞释放的IFNγ与CMV特异性T细胞的IFNγ释放相当，而IFNγ降低在与商业抗体SK-1、32-M4和DK25以及XENP15251预孵育的CMV特异性T细胞中观察到释放。此外，与XENP24025一起预孵育的CMV特异性T细胞释放的 IFNγ与不存在抗CD8抗体预孵育的CMV特异性T细胞释放的相当。图86中描绘IFNγ释放与四聚体结合MFI之间的相关性。

4D：具有1C11B3的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc选择性诱导CD8⁺T细胞的增殖超过CD4⁺T 细胞的增殖

人PBMC用XENP24736(具有1C11B3的靶向CD8的效力降低的IL- 15(N4D/N65D)/Rα-Fc；图87中描绘的序列)、XENP24050(单臂的效力降低的IL- 15(N4D/N65D)/Rα-Fc)、XENP24321(基于1C11B3的单臂的抗CD8 mAb)和XENP20818 (WT IL-15/Rα-Fc)在37℃下按指定浓度使用3天。接下来，PBMC用抗CD3-PE (OKT3)、抗CD4-FITC(RPA-T4)、抗CD8α-BV510(RPAT8或SK1)、抗CD8β- eF660(SIDI8BEE)、抗CD16-BV421(3G8)、抗CD25-PerCP/Cy5.5(M-A251)、抗 CD45RA-APC/Fire750(HI100)和抗CD56-BV605(5.1H1)在冰上染色45分钟。用前述面板染色后，将细胞在室温下用抗Ki67-PE/Cy7(Ki-67)染色30分钟，并且通过FACS分析各种细胞群和其Ki67的表达。在图88中描绘描述表达Ki67的CD8+CD45RA-T细胞和 CD4+CD45RA-T细胞的百分比的数据。数据显示，与单臂效力降低的IL15/Rα- FcXENP24050相比，具有1C11B3的靶向CD8可以增强CD8+ T细胞的增殖。

实施例5：靶向CD8的IL-15 Fc融合体(基于OKT8)

5A：OKT8的人源化

现有技术抗CD8抗体OKT8(在图89中描绘为OKT8_H0.1和OKT8_L0.1的可变区序列)是在Fab的上下文中工程化的，以用于靶向CD8的IL-15分子。OKT8使用字符串内容优化进行人源化(参见例如，2010年2月2日发布的美国专利第7,657,380号)。图89中描绘说明性人源化OKT8克隆的可变重链和轻链序列。如上所述，使用吉布森构筑的如上所述编码VH和VL序列以及异二聚体恒定区的编码序列的质粒产生靶向CD8的IL- 15/Rα-Fc融合体(如图9中所描绘)。通过在HEK293E细胞中进行瞬时转染来产生蛋白质，并且通过两步纯化方法进行纯化，所述方法包含蛋白A色谱，然后是离子交换色谱。图92 中描绘基于鼠类或人源化OKT8可变区的具有抗CD8 Fab臂的说明性靶向CD8的IL-15/Rα- Fc融合体的序列。

5A(a)：基于OKT-8的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合体选择性地增殖CD8⁺T细胞超过 CD4⁺T细胞

人PBMC用具有基于鼠类OKT8或两个版本的人源化OKT8(H1L1和H2L1) 的CD8结合结构域的靶向CD8的效力降低的IL-15/Rα-Fc(N4D/N65D双重突变和 D30N/E64Q/N65D三重突变)在37℃下在指定浓度下处理3天。处理后，PBMC用抗CD3- PE(OKT3)、抗CD4-FITC(RPA-T4)、抗CD8α-BV510(RPAT8或SK1)、抗CD8β- eF660(SIDI8BEE)、抗CD16-BV421(3G8)、抗CD25-PerCP/Cy5.5(M-A251)、抗 CD45RA-APC/Cy7(HI100)和抗CD56-BV605(NCAM16.2)在冰上染色45分钟。用面板染色后，将细胞在室温下用抗Ki67-PE/Cy7(Ki-67)染色30分钟，并且通过FACS分析各种细胞群和其Ki67的表达。图93中描绘描述表达Ki67的CD8+CD45RA-T细胞和 CD4+CD45RA-T细胞百分比的数据。数据显示，与对照XENP20818相比，每种靶向CD8 的IL-15/Rα-Fc融合体相对于CD4+ T细胞对CD8+ T细胞具有选择性。出乎意料的是，与XENP24919(鼠类OKT8)相比，XENP24917(OKT8_H1L1)在诱导CD8+ T细胞增殖方面的效力较低。值得注意的是，XENP24918(具有替代的人源化OKT8_H2L1)已恢复了与 XENP24917相似的效力。此外，虽然具有三重突变和OKT_H2L1抗CD8 Fab臂的IL-15/Rα- Fc效力降低的XENP25137在诱导CD8+ T细胞增殖方面比XENP24918更有效，但 XENP25137在诱导CD4+ T细胞增殖方面也比XENP24918更有效。

5A(b)：基于OKT8的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合体在植入PBMC的NSG小鼠体内增殖 T细胞并且增强体内细胞因子的分泌

在第-8天通过IV-OSP将1000万个人PBMC植入NSG小鼠中，然后在第0天用指定浓度的指定测试品给药。图94A至图94B中分别描绘第7天的CD8+ T细胞和CD4+ T细胞计数。数据表明，靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合体选择性增殖CD8+ T细胞超过CD4+ T细胞，如CD8+/CD4+T细胞比例所描绘。值得注意的是，数据显示CD8+ T细胞的选择性是由于靶向IL-15/Rα-Fc融合体，而不是由于IL-15/Rα-Fc融合体和抗CD8的组合作用(如 XENP24050和XENP24920的组合所示)。

5B：针对食蟹猴CD8亲和力工程化OKT8

为便于临床开发，评估食蟹猴中靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合蛋白的各种参数 (如药效学、药代动力学和毒性)非常有用。然而，与对人类CD8的12nM KD亲和力相比，一种例示性的人源化OKT8变体(H2L1)对食蟹猴CD8仅具有200nM KD亲和力。因此，将基于OKT8_H2L1的变体文库(在本文中称为HuCy OKT8)工程化成对人类和食蟹猴 CD8具有相似的亲和力。这个文库是通过定点诱变(QuikChange,Stratagene,Cedar Creek, Tx.)或标准基因合成构筑的。图95中描绘可变重链可变区和可变轻链可变区的序列。产生基于变体可变区的单臂mAb，其具有附接至异二聚体Fc区的重链可变区和分子的另一侧为“仅Fc”，以及附接至恒定轻区的轻链可变区。图91中描绘这种单臂mAb的说明性序列。

在基于生物层干涉法(BLI)的Octet中评估了基于HuCy OKT8变体的单臂 mAb对人类和食蟹猴CD8的亲和力。Octet的实验步骤通常包括以下内容：固定化(将配体捕获到生物传感器上)；缔合(将配体涂布的生物传感器浸入含有分析物的连续稀释液的孔中)；和解离(将生物传感器返回到含有缓冲液的孔中)以确定测试品的亲和力。在数据处理期间用于背景校正的方法中还包括仅含有缓冲液的参考孔。特别地，捕获人或食蟹猴CD8，并且将其浸入多种浓度的OKT8变体中。得到的解离常数(K_D)、结合速率(k_a)和解离速率(k_d)描绘于图96中。数据显示，尽管与OKT_H2L1相比，许多变体对食蟹猴CD8的亲和力有所改善，但只有几个变体对人类和食蟹猴CD8的亲和力相似。

5C：靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合体(HuCy OKT8)在人T细胞的增殖中具有活性

如实施例5A中一般所述产生基于HuCy OKT8可变区的具有抗CD8 Fab臂的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合体，图97和图102中描绘说明性分子的序列。

5C(a)：靶向CD8的IL-15/Rα-Fc与HuCy OKT8融合在体外具有活性

将人PBMC用指示性浓度的靶向CD8的效力降低的IL-15/Rα-Fc与说明性的 HuCyOKT8结合结构域和单臂效力降低的IL-15/Rα-FcXENP24050(作为对照)在37℃下在指定浓度下处理3天。处理后，PBMC用抗CD3-PE(OKT3)、抗CD4-FITC(RPA-T4)、抗CD8α-BV510(SK1)、抗CD8β-PE/Cy7(SIDI8BEE)、抗CD16-BV421(3G8)、抗 CD25-PerCP/Cy5.5(M-A251)、抗CD45RA-APC/Cy7(HI100)和抗CD56-BV605 (NCAM16.2)在冰上染色45分钟。用面板染色后，将细胞在室温下用抗Ki67-PE/Cy7 (Ki-67)染色30分钟，并且通过FACS分析各种细胞群和其Ki67的表达。图98中描绘描述表达Ki67的CD8+CD45RA-T细胞和CD4+CD45RA-T细胞百分比的数据。数据显示，每个靶向CD8的分子(包括具有HuCy OKT8结合结构域的分子)在诱导CD8+ T细胞增殖方面比XENP24050更有效。

在另一个实验中，将新鲜的PBMC与指定浓度的指定测试品一起孵育15分钟。孵育后，PBMC在室温下用抗CD3-BUV395(UCHT1)、抗CD4-BV605(RPA-T4)和抗 CD8-Alexa700(SK1)染色30-45分钟。洗涤细胞，并且与预冷(-20℃)90％甲醇一起孵育 20-60分钟。甲醇孵育后，再次洗涤细胞，并且用抗CD25-BV421(M-A251)、抗 CD45RA-BV510(HI100)、抗FOXP3-Alexa488(259D)、抗CD56-PE和抗pSTAT5- Alexa647(pY694)在室温下染色1小时，以标记各种细胞群和STAT5磷酸化。首先基于侧向散射(SSC)和前向散射(FSC)对淋巴细胞进行门控。然后基于CD3和CD4表达对 CD4+ T细胞进行门控。基于CD45RA表达以及Treg的FoxP3和CD25表达，进一步对 CD4+ T细胞亚群进行门控。根据CD3和CD8表达对CD8+ T细胞进行门控，并且根据 CD45RA表达进一步对亚群进行门控。图99中示出CD8+CD45RA-T细胞和CD4+CD45RA- T细胞上STAT5磷酸化的数据。与以上描述表达Ki67的细胞百分比的数据一致，基于 HuCy OKT8的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合体对CD8+ T细胞的选择性高于CD4+ T细胞。

5C(b)：靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合体(HuCy OKT8)在植入PBMC的NSG小鼠体内选 择性扩增CD8⁺T细胞

在第-8天通过IV-OSP将1000万个人PBMC植入NSG小鼠中，然后在第0天用指定浓度的指定测试品给药。图100描绘第7天小鼠血液中的CD45+细胞、CD8+ T细胞和CD4+ T细胞计数(以及CD8+/CD4+ T细胞比例)。数据显示具有HuCy OKT8的靶向 CD8的IL-15/Rα-Fc融合体在扩增CD45+细胞和T细胞方面具有与具有OKT8_H2L1的靶向 CD8的IL-15/Rα-Fc相似的活性。重要的是，具有HuCy OKT8的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合体保留了CD8+ T细胞在CD4+T细胞上的选择性扩增。

5D：基于OKT8的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合体在食蟹猴T细胞的增殖中具有活性

接下来，研究了上述具有HuCy OKT8结合结构域的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc 融合体是否能够增殖食蟹猴淋巴细胞。食蟹猴PBMC与指定测试品一起孵育4天。孵育后， PBMC用抗CD3-PE(OKT3)、抗CD4-FITC(RPA-T4)、抗CD8α-BV510(SK1)、抗 CD8β-PE/Cy7(SIDI8BEE)、抗CD16-BV421(3G8)、抗CD25-PerCP/Cy5.5(M-A251)、抗CD45RA-APC/Cy7(HI100)和抗CD56-BV605(NCAM16.2)在冰上染色45分钟。用面板染色后，将细胞在室温下用抗Ki67-APC(Ki-67)染色30分钟，并且通过FACS分析各种细胞群和其Ki67的表达。图101描绘了描绘表达Ki67的CD8+CD45RA-T细胞和CD4+CD45RA-T细胞百分比的数据。数据表明，每个靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合体都能增殖食蟹猴T细胞。与实施例5A(a)中描述的数据一致，靶向CD8的分子对CD8+ T细胞的选择性高于对CD4+ T细胞的选择性。

实施例6：靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合体对CD8⁺T细胞的选择性高于CD4⁺T细胞和 Treg

6A：靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合体在体外选择性地使CD8⁺T细胞超过CD4⁺T细胞和 Treg

将人PBMC与指定的测试品在37℃孵育2、5、10、15、30、60、180和360 分钟。通过在不同时间添加测试品以使所有反应同时停止来实现计时。孵育后，PBMC在室温下用抗CD3-BUV395(UCHT1)、抗CD4-BV605(RPA-T4)和抗CD8-Alexa700(SK1) 染色30-45分钟。洗涤细胞，并且与预冷(-20℃)90％甲醇一起孵育20-60分钟。甲醇孵育后，再次洗涤细胞，并且用抗CD25-BV510(M-A251)、抗CD45RA-BV510(HI100)、抗 FOXP3-Alexa488(259D)和抗pSTAT5-Alexa647染色以标记各种细胞群和STAT5磷酸化。首先基于侧向散射(SSC)和前向散射(FSC)对淋巴细胞进行门控。然后基于CD3和CD4 表达对CD4+ T细胞进行门控。基于CD45RA表达以及Treg的FoxP3和CD25表达，进一步对CD4+ T细胞亚群进行门控。根据CD3和CD8表达对CD8+ T细胞进行门控，并且根据CD45RA表达进一步对亚群进行门控。图103描绘各种种群上STAT5磷酸化的数据。数据显示，靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合体活化了CD8+ T细胞，同时避免了CD4+ T细胞 (包括Treg)，这表明与WT IL-15以及IL-15/Rα-Fc融合体相比，靶向CD8的分子对 CD8+ T细胞也具有选择性。值得注意的是，与重组IL-15和WT IL-15/Rα-Fc融合体 XENP20818相比，以靶向CD8的IL-15/Rα-Fc(XENP26585)浓度更高的浓度刺激了CD4+ T细胞和Treg中STAT5磷酸化的基线水平。

6B：在食蟹猴中，靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合体选择性扩增CD8⁺T细胞超过CD4⁺T细 胞

接下来，在食蟹猴中扩增T细胞时研究了靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合体的体内作用。在第0天给食蟹猴(每组3只动物)给药指定测试品并且监测3周。图104中描绘了描绘CD8+ T细胞和CD4+ T细胞倍数变化的数据。图105描绘了描绘Ki67表达阳性的外周血中CD4+CD45RA-T细胞和CD8+CD45RA-T细胞百分比的数据。图106中描绘了描绘淋巴结中CD8+CD45RA-T细胞上Ki67百分比的数据。与实施例5D中所述的食蟹猴PBMC 的体外扩增数据以及移植PBMC的小鼠中人PBMC的体内扩增数据一致，此处的数据表明，靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合体选择性扩增CD8+ T细胞超过CD4+ T细胞。

实施例7：靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合体演示了增强的药效学

在食蟹猴的后续研究中，研究具有Xtend的单臂scIL-15(N4D/N65D)/Rα-Fc(XENP24294；序列如图40所示)和具有Xtend的靶向CD8的IL-15(N4D/N65D)/Rα-Fc(XENP26585；序列描绘于图102中)。在第1天和第16天给食蟹猴(每组3只)配以测试品，并且随时间抽血以研究T细胞扩增。图107中描绘描述CD8+ T细胞和CD4+ T细胞计数以及CD8+/CD4+ T细胞比例的数据。与实施例6B中描述的研究一致，靶向CD8的IL- 15/Rα-Fc融合体选择性地扩增CD8+ T细胞超过CD4+ T细胞，从而提高了CD8+/CD4+ T细胞的比例。值得注意的是，靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合体比单臂分子具有更高的药效学，如CD8+ T细胞扩增的持续时间更长。

实施例8：靶向CD8的IL-15 Fc融合体增强CD8⁺T细胞的同种异体抗肿瘤活性(体 外)

根据制造商的说明，使用EasySep^TM人T细胞富集试剂盒(STEMCELL Technologies，加拿大温哥华)从人PBMC(CMV+HLA-A0201)中纯化T细胞。将纯化的T细胞与CFSE标记的亲本MCF-7肿瘤细胞(在此实施例中指定为第1组)或CFSE标记的表达 pp65的MCF-7肿瘤细胞(在此实施例中指定为第1组)以19:1E:T比和指定测试品一起孵育4天。在第3天，将布雷菲德菌素A(BioLegend,加利福尼亚州圣地亚哥)和抗CD107a- PerCP/Cy5.5(LAMP-1)加入细胞中。孵育后，将细胞与Zombie Aqua^TM固定活力试剂盒 (BioLegend,加利福尼亚州圣地亚哥)一起孵育30分钟。洗涤细胞并且用抗CD4- APC/eFluor780(RPA-T4)、抗CD8b-PE/Cy7(SIDI8BEE)、抗CD25-PE(M-A251)和抗CD69- BV605(FN50)在冰上染色1小时。再次洗涤细胞，并且使用eBioscience^TMFoxp3/转录因子染色缓冲液组(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技)用抗IFNγ-BV421(4S.B3)和抗Ki67-APC 染色。通过流式细胞术分析各种细胞群的细胞。基于CFSE染色鉴定靶细胞，并且基于 Zombie染色鉴定死亡的靶细胞。基于CD4和CD8表达对效应细胞(CFSE-)进行门控。

Ki67是一种与蛋白质增殖严格相关的蛋白质，而T细胞产生的IFNγ则表明细胞溶解活性。图108A至图108B分别描绘两组中CD8+ T细胞中的IFNγ+级分。图109A至图109B分别描绘两组中CD8+ T细胞的Ki-67+级分。图110A至图110B分别描绘两组中 CD8+ T细胞的Ki-67+/IFNγ+级分。图111A至图111B分别描绘两组中CD4+ T细胞中的 IFNγ+级分。图112A至图112B分别描绘两组中的CD4+ T细胞的Ki-67+级分。图113A至图113B分别描绘两组中CD4+ T细胞的Ki-67+/IFNγ+级分。图114A至图114B分别描绘两组中剩余的靶细胞(pp65转导的MCF-7或亲本MCF-7)。总体而言，数据表明，本发明的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合体不仅增强了肿瘤细胞的同种异体杀伤，而且靶向CD8的IL- 15/Rα-Fc融合体选择性地扩增CD8+ T细胞超过CD4+ T细胞。

实施例9：靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合体增强T细胞在体内的同种异体抗肿瘤作 用，并且与检查点阻断协同结合

接下来，研究了本发明的靶向CD8的IL-15/Rα-Fc融合蛋白的体内抗肿瘤作用，以及其是否适合与检查点阻断堆叠。使用的检查点阻断抗体是XENP16432(一种基于纳武单抗的二价抗PD-1mAb，具有消融的效应子功能；序列描绘于图12中)。在第-14天，将 NOD SCIDγ(NSG)小鼠(每组10只)皮下植入3×10⁶个表达pp65的MCF-7细胞。在第0 天，将来自HLA匹配的CMV+供体的5×10⁶个人PBMC腹膜内植入小鼠，所述供体对T细胞pp65反应性(或对照小鼠的PBS)筛选呈阳性。每周用指定测试品或PBS(对于对照小鼠)处理小鼠达4周(总共4次剂量)。通过卡尺测量监测肿瘤体积，图115A至图115B 中展示其数据(第1次投配后的天数)。如图116A至图116E中所描绘，在第7天、第12 天、第19天和第26天抽血，并且通过流式细胞术分析以计数各种淋巴细胞的数量。

实施例10：噬菌体来源的NKG2D抗原结合结构域

在此，我们描述了在本发明的以NKG2D为靶标的IL-15/Rα-Fc融合体中使用的噬菌体来源的NKG2D ABD(称为1D7B4)的生成和表征。1D7B4的可变重和可变轻结构域序列描绘于图117A至图117C中，并且基于1D7B4的二价mAb(具有 E233P/L234V/L235A/G236del/S67K消融变体的IgG1)的序列在图118描绘为XENP27055。

10A：噬菌体展示文库和NKG2D抗原结合结构域的筛选

内部生产重组人NKG2D(XENP25379；图119中描绘的序列)和食蟹猴 NKG2D(XENP25380；图119中描绘的序列)，以用于噬菌体淘选。通过吉布森装配在 pTT5载体中构筑编码抗原的质粒。在瞬时转染HEK293E细胞后，分泌的抗原通过蛋白A 亲和色谱纯化。

建立在噬菌体外壳蛋白pIII上展示Fab和scFv变体的内部从头噬菌体文库 (在此分别称为“Fab文库”和“scFv文库”)。Fab文库和scFv文库都在以下五个轮次中进行淘选：1)人NKG2D，2)食蟹猴NKG2D，3)人NKG2D，4)食蟹猴NKG2D，和5)具有不断增加的严格水平的人NKG2D(均根据抗原浓度和洗涤严格性)。在每一轮之后，将洗脱的噬菌体添加到对数期XL1-Blue细胞(Agilent,Wilmington,Del.)中并且在37℃、250 rpm下扩增过夜。

对来自Fab文库和scFv文库两者的淘选第3轮、第4轮和第5轮中的每一者的 192个克隆进行测序，从而产生1,152个克隆。然后，我们使用酶联免疫吸附测定(ELISA)对这些克隆对人和食蟹猴NKG2D的结合进行排名，一般地描述如下。首先将ELISA平板包被中性抗生物素蛋白并用牛血清白蛋白封闭。接下来，将平板用XENP25379、XENP25380或 XENP22490(IgG1 Fc；在图119中描述了其序列)在室温下包被30分钟。然后将平板与生物素一起在室温下孵育10分钟。将稀释的噬菌体上清液加入平板中，并在室温下孵育1小时。洗涤平板并与缀合有HRP的抗M13抗体一起孵育30分钟。最后，加入TMB底物5分钟，猝灭反应，并在SpectraMax(Molecular Devices,San Jose,Calif.)上在450nm下读平板。图120描绘了来自Fab文库第四轮淘选的12个克隆的说明性ELISA结果，显示了与人和食蟹猴NKG2D的相对结合的范围。

通过Gibson装配构建包含在与人和食蟹猴NKG2D结合方面排名高(如通过 ELISA测定的)的选定克隆的可变重和可变轻结构域的质粒，并将所述质粒亚克隆到含有 IgG1恒定区的编码序列的pTT5表达载体中(使用E233P/L234V/L235A/G236del/S67K消融变体)。在HEK293E中转染DNA以进行表达，并且使用A蛋白色谱从上清液中纯化得到的二价mAb。

接下来，我们使用NKG2D转染的T-Rex^TM-293细胞(以下称为TREX293- NKG2D细胞)研究了二价mAb与细胞表面NKG2D的结合。将TREX293-NKG2D细胞与指定浓度的XENP27055和其它噬菌体来源的抗NKG2D mAb以及对照商售APC缀合的抗 NKG2D mAb(Biolegend,SanDiego,Calif.)一起在4℃孵育1小时。然后将细胞用Alexa 647AffiniPure F(ab')₂片段山羊抗人IgG、Fcγ片段特异性二抗(Jackson ImmunoResearch,West Grove,Penn.)在4℃染色1小时，并通过流式细胞术进行分析。说明 XENP27055与4种其它噬菌体来源的mAb的结合的数据描绘于图121中，并且显示每个噬菌体来源的mAb都能以不同的效力结合至TREX293-NKG2D细胞。

10B：基于噬菌体来源的ABD的靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合蛋白

如实施例2A中一般描述的那样工程化并生产基于噬菌体来源的NKG2D ABD 并包含IL-15(N4D/N65D)变体的靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体，其示例性序列在图122 描绘为XENP27197。

我们首先使用Octet确认靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合蛋白与NKG2D的结合，如上文所一般描述的。具体地，使用HIS1K生物传感器捕获带有HIS标签的人NKG2D 或带有HIS标签的食蟹猴NKG2D，并浸入多种浓度的靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体中。通过用1:1Langmuir结合模型对结合数据进行全局拟合来进行动力学分析。XENP27197(基于1D7B4和IL-15(N4D/N65D)变体的靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体)和4种另外的基于噬菌体来源的NKG2D ABD的靶向NKG2D的IL-15(N4D/N65D)/Rα-Fc融合体的得到的解离常数(K_D)、缔合速率(k_a)和解离速率(k_d)描绘于图123中。

接下来，我们研究了NK细胞上STAT5磷酸化的诱导。对于该实验，使用了新鲜的和活化的PBMC两者。通过用100ng/mL平板结合的抗CD3(OKT3)刺激新鲜的 PBMC 2天来制备用作肿瘤环境中活化淋巴细胞替代物的活化PBMC。在37℃下将新鲜的和活化的PBMC与以下测试品在指定浓度下一起孵育15分钟：XENP20818(非靶向的IL- 15/Rα-Fc)、XENP27055(基于1D7B4并且具有IL-15(N4D/N65D)变体的靶向NKG2D的 IL-15/Rα-Fc融合体)、另外4个基于噬菌体来源的NKG2D ABD和IL-15(N4D/N65D)变体的靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc，以及XENP27145和XENP27195(基于现有技术NKG2D ABD的另外的靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体)。为了在孵育后门控各种细胞群，在室温下PBMC用抗CD3-BUV395(UCHT1)、抗CD4-BV605(RPA-T4)和抗CD8-Alexa700 (SK1)染色30-45分钟。将细胞用预冷(-20℃)的90％的甲醇洗涤和孵育20-60分钟。甲醇孵育后，再次洗涤细胞，并用抗CD25-BV421(M-A251)、抗CD45RA-BV510(HI100)和抗 pSTAT5-Alexa647(pY687)染色以标记各种细胞群和STAT5磷酸化。图124中描绘了描绘 CD56⁺NK细胞群上的STAT5磷酸化的诱导的数据。值得注意的是，数据表明，靶向 NKG2D的融合蛋白选择性地诱导了来自活化的PBMC的NK细胞上的STAT5磷酸化。这表明，在临床情况下，靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体将对肿瘤环境中活化的肿瘤浸润淋巴细胞具有选择性。另外，似乎靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体诱导STAT5的效力跟踪抗NKG2D臂的亲和力(如图123中所描绘)。

实施例11：另外的抗NKG2D抗原结合结构域

预期用于本文的另外的抗NKG2D结合结构域描绘于图117A至图117C中(作为可变重和可变轻结构域)和图125中(为具有E233P/L234V/L235A/G236_/S267K消融变体的二价IgG1形式)。

此外，我们使用字符串内容优化使鼠类抗NKG2D结合域人源化(参见，例如， 2010年2月2日发布的美国专利第7,657,380号)，该人源化的鼠类抗NKG2D结合域的序列描绘于图117A至图117C中(作为可变重和可变轻结构域，其中克隆名称为mAb A、 mAb B和mAb C)和图126中(为具有E233P/L234V/L235A/G236_/S267K消融变体的二价 IgG1形式)。

如上文一般描述的，在Octet上对作为二价mAb的另外抗NKG2D ABD进行亲和力筛选。具体地，使用HIS1K生物传感器捕获带有His标签的人NKG2D，并浸入100 nM的每种二价mAb中。描绘解离常数(K_D)、缔合速率(k_a)和解离速率(k_d)的数据示出于图 127中。

如实施例2A中一般描述的那样工程化并生产基于上述NKG2D ABD并包含 IL-15(N4D/N65D)变体的靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体，其示例性序列描绘于图122中。

实施例12：包含IL-15(N4D/N65D)变体的IL-15-Fc融合体表现出降低的药代动力 学

在一项研究具有Xtend的IL-15-Fc效力变体的药代动力学的研究中，以不同浓度向食蟹猴施用第一单次静脉内((i.v.)剂量的XENP22853(具有Xtend的WT IL-15/Rα-异二聚Fc)、XENP24306(具有Xtend的IL-15(D30N/E64Q/N65D)/Rα-异二聚Fc)、 XENP24113(具有Xtend的IL-15(N4D/N65D)/Rα-异二聚Fc)和XENP24294(具有Xtend 的scIL-15(N4D/N65D)/Rα-Fc)。

图134描绘了第一剂量后随时间变化的测试品的血清浓度。如预期的那样，在Xtend取代之外并入功效变体(如XENP24306和XENP24113中)大大改善了IL-15-Fc融合蛋白的药代动力学(与XENP22583相比)。然而，出乎意料的是，与XENP24306相比， IL-15/Rα-异二聚Fc融合蛋白XENP24113和scIL-15/Rα-Fc融合蛋白XENP24294(其具有相同的IL-15(N4D/N65D)功效变体)显示出降低的药代动力学。这表明降低的药代动力学是由于特定的IL-15效力变体而不是IL-15-Fc融合蛋白的形式。先前的发现表明具有IL- 15(N4D/N65D)变体的IL-15-Fc融合蛋白比具有IL-15(D30N/E64Q/N65D)变体的IL-15-Fc融合蛋白具有更高的体外效力，尽管根据这种先前的发现预期XENP24113和XENP24294的药代动力学会降低，但是药代动力学的下降出乎意料地与药效的增加不成比例。因此，我们试图确定在本发明的靶向NKG2D的IL-15-Fc融合蛋白中使用的替代性IL-15效力变体。

12B：工程化效力进一步降低的IL-15变体，包括在IL-15:CD132界面处的修饰

我们注意到IL-15(N4D/N65D)在负责与CD122结合的IL-15界面上有两个取代基，而IL-15(D30N/E64Q/N65D)在IL-15：CD122界面上有两个取代基(E64Q和N65D)；并且在IL-15界面上的一个取代基(D30N)负责与CD132的结合。因此，我们认为IL-15:CD132 界面处的修饰可有助于对于XENP24306观察到的增强的药代动力学。

鉴于上述情况，我们生成了包含D30N取代的IL-15效力变体的其它文库。在图135中描绘了用于说明性此类IL-15变体的序列，并在细胞增殖测定中产生和研究了包含这些变体的说明性scIL-15/Rα-Fc融合体(其序列描绘于图136中)。

将人PBMC以指定浓度与指定测试品一起孵育3天。孵育后，将PBMC用抗 CD3-PE(OKT3)、抗CD4-FITC(RPA-T4)、抗CD8-eF660(SIDI8BEE)、抗CD16-BV421 (3G8)、抗CD45RA-APC/Fire750(HI100)、抗CD56-BV605(5.1H11)和抗Ki67-PE/Cy7(Ki-67) 染色，并通过流式细胞术进行分析。图137描绘了指示增殖的表达Ki67的各种淋巴细胞群的百分比。

数据显示，与包含相同IL-15变体的IL-15/Rα-异二聚Fc，以及包含IL- 15(N4D/N65D)变体的scIL-15/Rα-Fc融合体相比，包含IL-15(D30N/E64Q/N65D)变体的scIL- 15/Rα-Fc融合体在各种淋巴细胞群的增殖中具有急剧降低的活性。然而，许多具有包含 D30N取代的IL-15变体的scIL-15/Rα-Fc融合蛋白显示出与WT scIL-15/Rα-Fc XENP21993 相似的活性。值得注意的是，我们确定了一个特定的IL-15(D30N/N65D)变体，它不仅包含 IL-15:CD132界面修饰，而且具有与IL-15(N4D/N65D)变体相似的效力(在scIL-15/Rα-Fc融合蛋白的背景下)。

包含IL-15(D30N/N65D)变体的说明性的靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体的序列描绘于图138中。此外，我们构建了XENP29481，它是一种包含IL-15(D30N/N65D)变体的靶向RSV的IL-15/Rα-Fc融合体(其序列描绘于图140中。

12C：包含IL-15(D30N/E64Q/N65D)的靶向NKG2D的IL-15-Fc融合体

鉴于实施例10B中描绘的数据，预期靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体将对肿瘤环境中的淋巴细胞具有选择性；然而，细胞因子部分仍然能够在到达肿瘤部位之前进行信号传导并且可能导致全身毒性。因此，我们寻求通过构建具有IL-15(D30N/E64Q/N65D)变体的靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体进一步降低IL-15的效力，其如实施例12B中所述具有急剧降低的活性。图139中描绘了包含IL-15(D30N/E64Q/N65D)变体的说明性靶向 NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体的序列。另外，我们构建了XENP30432，它是一种包含IL- 15(D30N/E64Q/N65D)变体的靶向RSV的IL-15/Rα-Fc融合体(其序列描绘于图140中)，以用作替代物来研究包含IL-15(D30N/E64Q/N65D)变体的靶向ICOS的IL-15/Rα-Fc融合体在肿瘤环境之外的行为。

实施例13：靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体选择性地扩增CD8⁺T细胞和NK细胞

如上所述，与可能导致毒性细胞因子释放综合征的CD8效应物相比，认为 CD4效应T细胞有助于大量的细胞因子释放。此外，CD4 T细胞亚群包括调节性T细胞，该调节性T细胞的扩增可能会导致免疫抑制并对长期肿瘤抑制具有负面影响。

13A：NKG2D在CD8 T细胞和NK细胞中选择性表达

用500ng/ml平板结合的抗CD3(OKT3)刺激人PBMC 48小时。用以下抗体对细胞进行染色：抗CD3-BUV496(UCHT1)、抗CD8-PE-Cy7、抗CD4-BUV395(SK3)、抗 CD16-BV605(3G8)、抗CD56-BV605(HCD56)、抗CD45RA-BV785(HI100)、抗CD45RO- APC-Fire750(UCHL1)、抗CCR7-BV711(G043H7)、抗CD28-BV650(CD28.2)、抗-CD95- BUV737(DX2)和抗PD-1-Alexa647(内部标记为XENP16432)，并通过流式细胞术进行分析。如图141至142中所描绘的数据表明，NKG2D在CD8⁺T细胞、NK细胞以及 CD3⁺CD8^-CD4^-T细胞中选择性表达。相反，如图143中所描绘的数据表明PD-1在CD4⁺T 细胞和CD8⁺T细胞上表达。因此，如果CD8⁺T细胞(和NK细胞)的选择性扩增是优选的，则表面标志物(例如NKG2D)对于靶向IL-15/Rα-Fc融合体是优选的。应注意，数据还表明在刺激CD8⁺T细胞和NK细胞时NKG2D被上调，表明靶向NKG2D还可使肿瘤环境中活化的CD8⁺细胞和NK细胞的选择性增殖超过外周T细胞。

13B：靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体使得能够体外稳健且选择性地扩增CD8效应 记忆T细胞和NK细胞

用500ng/ml平板结合的抗CD3(OKT3)或100ng/ml平板结合的抗CD3(OKT) +1μg/ml平板结合的CD80-Fc刺激人PBMC 48小时。将经刺激的PBMC用CFSE标记，并在37℃下与测试品一起孵育4天。所使用的测试品品为带有基于MS(XENP27145)、mAb A (XENP27635)或1D7B4(XENP30592)的靶向臂的靶向NKG2D的IL-15(N4D/N65D)/Rα-Fc融合体。所使用的对照是具有IL-15(N4D/N65D)或IL-15(D30N/E64Q/N65D)变体的靶向RSV 的IL-15/Rα-Fc。在与测试品一起孵育后，将细胞用以下抗体染色：抗CD3-BUV496 (UCHT1)、抗CD8-PE-Cy7、抗CD4-BUV395(SK3)、抗CD16-BV605(3G8)、抗CD56- BV605(HCD56)、抗CD45RA-BV785(HI100)、抗CD45RO-APC-Fire750(UCHL1)、抗 CCR7-BV711(G043H7)、抗CD28-BV650(CD28.2)和、抗CD95-BUV737(DX2)，并通过流式细胞术分析各种细胞群的增殖。

基于CFSE稀释(Zombie Aqua以排除死细胞)测定了各种淋巴细胞群的增殖，其数据描绘于图144至图145中。数据显示，与对照靶向RSV的IL-15/Rα-Fc融合体相比，靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体中的每种靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体在诱导 CD8⁺T细胞(特别地，CD8效应记忆T细胞)和NK细胞增殖方面均更有效。与具有基于 mAb A和1D7B4的靶向臂的靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体相比，具有基于MS的靶向臂的靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体使得能够更有效地增殖CD8 T细胞和NK细胞。值得注意的是，靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体中的每种靶向靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc 融合体在诱导CD4⁺T细胞增殖方面均与具有相同IL-15变体的靶向RSV的IL-15/Rα-Fc融合体具有同等的低效力。

13B(a)：各种NKG2D臂展示出独特的结合特性

为了进一步研究在上述靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体中使用的NKG2D 臂，如上文在实施例5B中一般描述的，在Octet上评定融合体对人和食蟹猴NKG2D的亲和力。特别地，捕获生物素化的人或食蟹猴NKG2D，并将其浸入多种浓度的靶向NKG2D的 IL-15/Rα-Fc融合体中。所得传感图和解离常数(K_D)描绘于图146中。数据显示，三个靶向 NKG2D的臂中的每一个靶向NKG2D的臂对NKG2D有不同的亲和力结合。值得注意的是，在未显示的数据中，MS被与mAb A相似地分箱为表位(以及KYK-2.0、ULBP1、ULBP3，并且MICA表明它们是NKG2D配体的阻断剂)；然而，MS和mAb A都被分箱至与1D7B4 不同的单独表位。总体而言，这表明调谐靶向NKG2D的臂(例如通过亲和力调谐或通过使用结合不同表位的靶向NKG2D的臂)可用于调谐IL-15/Rα-Fc融合体的效力以优化治疗指数。参考以下亲和力阶梯可能是有用的：MS(1nMK_D)>KYK-2.0并且mAb D>mAb B>mAb E>1D7B4>mAb C>mAb A>KYK-1.0(170nM)，其中MS对NKG2D的亲和力最强，而KYK- 1.0对NKG2D的亲和力最弱。因此，如果需要中等效力，则mAb A是合适的靶向臂；而如果需要额外的效力，则mAb D和mab E可为优先的靶向臂。

13C：包含IL-15[D30N/E64Q/N65D]变体的靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc表现出降低的 效力，与此同时保持CD8⁺T细胞和NK细胞选择性

用500ng/ml平板结合的抗CD3(OKT3)刺激人PBMC 48小时。将经刺激的PBMC用CFSE标记，并在37℃下与测试品一起孵育4天。所使用的测试品是具有基于 mAb A(XENP31077)的靶向臂的靶向NKG2D的IL-15(N4D/N65D)/Rα-Fc融合体，以及具有基于mAb A(XENP31079)或1D7B4(XENP31081)的靶向臂的靶向NKG2D的IL- 15(D30N/E64Q/N65D)/Rα-Fc融合体。所使用的对照是具有IL-15(N4D/N65D)或IL- 15(D30N/E64Q/N65D)变体的靶向RSV的IL-15/Rα-Fc。基于CFSE稀释(Zombie Aqua以排除死细胞)测定了各种淋巴细胞群的增殖，其数据描绘于图147中。数据显示，与对应的具有更有效的IL-15[N4D/N65D]变异的靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体相比，具有有效性较低的IL-15[D30N/E64Q/N65D]变异的靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体在诱导CD8⁺T细胞、CD4⁺T细胞和NK细胞增殖方面的效力较低。应注意的是，具有IL- 15[D30N/E64Q/N65D]变异的靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体在诱导CD8⁺T细胞和NK 细胞增殖方面仍然比效力较低和和效力较高的靶向RSV的对照两者更有效；然而，具有IL- 15[D30N/E64Q/N65D]变异的靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体比效力较高的靶向RSV的对照的效力更低(并且效力与效力较低的靶向RSV的对照一样低)。总体而言，这表明调谐IL-15臂的效力也可为用于调谐靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体的治疗指标的有用方法。

13D：靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体使得能够在小鼠肿瘤模型中稳健且选择性 地扩增CD8⁺T细胞和NK细胞，并有效地与PD-1阻断剂结合

在研究靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体的体内活性的第一项研究中，在第- 18天对为MHC I/II-DKO(NSG-DKO)并因此抗GVHD的NSG小鼠(每组10只)皮内接种 3×106个pp65转导的MCF-7细胞。然后向小鼠腹膜内注射2.5×106个人PBMC，并在第0 天用以下测试品进行处理：XENP27635(具有IL-15(N4D/N65D)变体和基于mAb A的靶向臂的靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体，其序列描绘于图122L中；1mg/kg)； 4XENP30362(具有IL-15(N4D/N65D)变体的对照靶向RSV的IL-15/Rα-Fc融合体；0.3 mg/kg)；XENP30518(具有IL-15(D30N/E64Q/N65D)变体的对照靶向RSV的IL-15IL- 15/Rα-Fc融合体；1mg/kg)；XENP16432(基于纳武单抗的二价抗PD-1mAb；3mg/kg) 和XENP31123(单价抗PD-1mAb；0.82mg/kg)。在第7天、第14天和第21天用指定的测试品进一步处理小鼠，并每周抽血一次。

在图148至图149中描绘了描绘各种人淋巴细胞群的扩增的数据(使用不成对的t检验对经对数转化的数据执行细胞扩增统计学分析；p<0.05表明显著的差异)。到第14 天，与PD-1阻断剂或对照靶向RSV的IL-15/Rα-Fc融合体相比，靶向NKG2D的IL-15/Rα- Fc融合体XENP27635使得能够显著增强CD45+淋巴细胞、CD3+ T细胞、CD8+ T细胞和 NK细胞的扩增。应注意的是，与XENP16432相比，XENP27635没有增强CD4+ T细胞的扩增。到第21天，用XENP27635处理与用XENP16432处理相比保持了增强的NK细胞扩增，并且与用XENP16432处理导致了显著减少的CD4+ T细胞扩增。应注意的是，在第14 天和第21天，用XENP27635处理产生的CD8/CD4 T细胞比率均显著大于用其它测试品处理时。图151中描绘人淋巴细胞的活化(如CD25表达所指示)的数据显示，通过靶向 NK42D的IL-15/Rα-Fc融合体，与CD4+ T细胞相比，CD8+ T细胞也被选择性活化。

在研究靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体PD-1阻断剂的组合的第二项研究中，在第-19天，向NSG-DKO小鼠(每组10只)腹膜内接种3×106个pp65转导的MCF-7细胞。然后向小鼠腹膜内注射2.5×106个人PBMC，并在第0天用以下测试品/测试品组合处理：单独的XENP16432(二价抗PD-1)；XENP16432与XENP31077的组合(具有IL- 15(N4D/N65D)变体、基于mAb A的靶向臂和Xtend M428L/N434S Fc变体的靶向NKG2D的 IL-15/Rα-Fc融合体，其序列描绘于图122N中；1mg/kg)；或XENP16432与XENP30518 的组合(具有IL-15(D30N/E64Q/N65D)变体的的对照靶向RSV的IL-15/Rα-Fc融合体；1 mg/kg)。在第7天、第14天和第21天用指定的测试品进一步处理小鼠，并每周抽血一次。

在图150中描绘了描绘各种人淋巴细胞群的扩增的数据(使用不成对的t检验对经对数转化的数据执行细胞扩增统计学分析；p<0.05表明显著的差异)。到第14天，与使用单独的XENP16432处理相比(以及与使用XENP30518与XENP16432的组合处理相比)，用靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体XENP31077与XENP16432的组合处理使得能够显著增强所有淋巴细胞群的扩增，表明了靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体与PD-1阻断剂的有效组合。尽管XENP31077+XENP16432组合也显著增强了CD4+ T细胞群的扩增，但应注意的是，由XENP31077+XENP16432组合产生的CD8/CD4 T细胞比率比没有 XENP31077时要大得多。

总体而言，数据表明，在体外和体内，靶向NKG2D的IL-15/Rα-Fc融合体均稳健且选择性地扩增CD8 T细胞和NK细胞超过CD4 T细胞。高CD8/CD4 T细胞比率应能够使得肿瘤疗法更安全且更有效。