阅读说明：本技术 一种全基因组甲基化单链dna建库方法 (Whole genome methylation single-stranded DNA library building method ) 是由 曹振 秦雪梅 曹欣茹 任静 宋东亮 于 2021-08-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种全基因组甲基化单链DNA建库方法,其步骤包括：重亚硫酸盐处理待建库的基因组DNA,获得单链DNA；加入引物1,引物1的随机引物与单链DNA互补,在DNA聚合酶1的作用下合成第一链；产物纯化后先高温解链,然后在新合成的第一链的3’端添加2～4个ATP,形成一个核糖核苷酸的尾巴；RNA连接酶催化下,在第一链的核糖核苷酸的尾巴后连接上引物2；加入与引物2互补的引物3,在DNA聚合酶2的作用下合成第二链,获得双链DNA；文库扩增。本发明的单链DNA建库方法,可以有效利用重亚硫酸盐处理后的DNA样本,将处理后的单链DNA顺利扩增,文库转化率比传统方法高,要求的初始DNA用量可低至1ng。(The invention discloses a whole genome methylation single-stranded DNA library building method, which comprises the following steps: treating genome DNA of a library to be built by bisulfite to obtain single-stranded DNA; adding a primer 1, wherein a random primer of the primer 1 is complementary to the single-stranded DNA, and synthesizing a first strand under the action of DNA polymerase 1; after the product is purified, firstly melting at high temperature, and then adding 2-4 ATP at the 3' end of a newly synthesized first chain to form a tail of ribonucleotide; under the catalysis of RNA ligase, connecting a primer 2 behind the tail of the ribonucleotide of the first strand; adding a primer 3 which is complementary to the primer 2, and synthesizing a second strand under the action of DNA polymerase 2 to obtain double-stranded DNA; and (4) amplifying the library. The single-stranded DNA library building method can effectively utilize the DNA sample treated by the bisulfite to smoothly amplify the treated single-stranded DNA, the conversion rate of the library is higher than that of the traditional method, and the required initial DNA dosage can be as low as 1 ng.)

一种全基因组甲基化单链DNA建库方法

技术领域

本发明涉及一种全基因组甲基化单链DNA建库方法，属于生物技术领域。

背景技术

DNA甲基化（DNA methylation）为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。

DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶（DNMT）的作用下，基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳原子共价键结合一个甲基基团。CpG二核苷酸序列在基因组中出现的比例远低于基因组中其他二核苷酸序列。但是在基因组中有一些长度约0.5-4 kb的区域，这些区域CpG密度很高，称其为CpG岛。56%基因的邻近启动子区域带有CpG岛。在正常的细胞中CpG岛通常是处于非甲基化状态。但是，在许多类型的癌症中，癌细胞中的某些基因会被甲基化，从而无法正常表达。因此，已经有研究人员开始研究利用基因甲基化来预测癌症。

目前，基于第二代高通量测序的文库被用于进行甲基化DNA的研究工作，常见的方法是BS-seq(重亚硫酸盐转化测序)，以及RRBS(酶切-重亚硫酸盐转化测序)，其工作原理是将样品片段化后进行重亚硫酸盐处理，重亚硫酸盐可将DNA中未甲基化的胞嘧啶残基转换为尿嘧啶残基，在后续扩增中会被替换为胸腺嘧啶残基。而5-甲基胞嘧啶(5-mC)和5羟甲基胞嘧啶(5-hmC)会以胞嘧啶残基的状态保留。再通过单碱基分辨率的二代测序，可以评估DNA甲基化状态。常用的DNA建库方案都是基于双链DNA（dsDNA）样本，无法直接对单链DNA（ssDNA）进行建库，目前的甲基化文库构建大多在完成接头连接后再进行重亚硫酸盐处理，而重亚硫酸盐（BS）处理会导致DNA分子断裂、形成单链，从而导致处理后的文库损伤严重，能被扩增的模板数大概只剩10%，最终的文库转化率差、测序样本的复杂度低。如果要提高文库转化率，则需要提高扩增循环数来弥补，导致测序的重复数据变多，变相的提高了应用成本。现有技术为了避免连接后的接头中的胞嘧啶也被重亚硫酸盐转换为尿嘧啶，需要连接特殊的甲基化修饰接头，该接头是将普通接头中的胞嘧啶替换为5-甲基胞嘧啶，而这种甲基化修饰的接头价格比较高，提高了应用成本。

发明内容

本发明的目的是提供一种全基因组甲基化单链DNA建库方法，可以有效地利用重亚硫酸盐处理后产生的单链DNA，进行接头连接，文库产量远高于常规的全基因组甲基化建库方案。

本发明采用的技术方案为：

一种全基因组甲基化单链DNA建库方法，其步骤包括：

（1）重亚硫酸盐处理待建库的基因组DNA，获得单链DNA；

（2）加入引物1，引物1的随机引物与单链DNA互补，在DNA聚合酶1的作用下合成第一链；

（3）步骤（2）产物纯化后先高温解链，然后在TdT酶和ATP的作用下，在新合成的第一链的3’端添加2~4个ATP，形成一个核糖核苷酸的尾巴；

（4）RNA连接酶催化下，在第一链的核糖核苷酸的尾巴后连接上引物2；

（5）加入与引物2互补的引物3，在DNA聚合酶2的作用下合成第二链，获得双链DNA；

（6）以上述合成的双链DNA为模板进行PCR文库扩增；

其中引物1的序列为：5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNN -3’；

引物2的序列为：5’-[phosphate]AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT[phosphate] -3’；

引物3的序列为：5’- ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’。

优选的，所述DNA聚合酶1为Klenow 3’-5’ exo-、Taq DNA聚合酶、phi 29 DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶大片段或Bsu DNA聚合酶。

优选的，所述DNA聚合酶1为Klenow 3’-5’ exo-。

优选的，所述RNA连接酶为TS2126 RNA连接酶、circligase II、T4 RNA 连接酶1、5’ AppDNA/RNA 热稳定连接酶。

优选的，所述RNA连接酶为TS2126 RNA连接酶。

优选的，所述DNA聚合酶2为Taq DNA聚合酶、或KAPA HiFi Uracil+高保真DNA聚合酶。

优选的，所述DNA聚合酶2为KAPA HiFi Uracil+高保真DNA聚合酶。

优选的，步骤（6）中采用引物4和引物5进行文库扩增，引物4的序列为：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[Barcode Sequence]GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-3’；引物5的序列为：5’- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’。

本发明的有益效果：

本发明的单链DNA建库方法，可以有效利用重亚硫酸盐处理后的DNA样本，将处理后的单链DNA顺利扩增，文库转化率比传统方法高，要求的初始DNA用量可低至1ng，而传统的方案至少要100 ng以上。而且本发明的单链DNA建库可以采用普通接头，而不需要采用昂贵的甲基化修饰接头，同时高通量测序的数据重复率低，整个建库测序的成本比常规方案低。

具体实施方式

通过以下详细说明可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

预准备工作：合成表1中的引物序列。

表1：引物序列

名称	序列5’-3’
		引物1	ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNN
引物2	[phosphate]AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT[phosphate]
		引物3	ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
引物4	CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[Barcode Sequence]GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC
		引物5	AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT

实施例1：

全基因组甲基化单链DNA建库方法，其步骤包括：

（1）采用天根的血液基因组提取试剂盒，从5 ml全血中提取人gDNA。ZYMO公司的EZDNA Methylation-Glod Kit亚硫酸盐试剂处理待人gDNA，获得单链DNA；

（2）加入引物1，引物1的随机引物与单链DNA互补，在DNA聚合酶1的作用下合成第一链，反应体系为：

组分	体积
		10×NEB Buffer 2	5 ul
10 mM dNTP	1.25 ul
		引物1 (100 µM)	4 ul
重亚硫酸盐处理gDNA	50 ng
		H2O	To 40 ul

反应程序为：

步骤	时间
		94 ℃（解链）	5 min
4 ℃	5 min
		4 ℃	加入klenow（3’-5’exo<sup>-</sup>）
4 ℃	3 min
		37 ℃（延伸）	30 min
70 ℃（失活）	10 min
		4 ℃	--

反应产物1.0×AMPure XP磁珠纯化，用12 μl ddH₂O洗脱；

（3）步骤（2）产物纯化后先高温解链，然后在TdT酶和ATP的作用下，在新合成的第一链的3’端添加2~4个ATP，形成一个核糖核苷酸的尾巴；

（4）RNA连接酶催化下，在第一链的核糖核苷酸的尾巴后连接上引物2，步骤（3）和步骤（4）在同一反应体系中进行，反应体系如下：

组分	体积
		上一步纯化产物	10 µl
2.5×RNA连接酶反应buffer	10 µl
		10 mM ATP	1 µl
引物2	0.3 µl
		H2O	To 23 μl

反应程序如下：

步骤	时间
		94 ℃（解链）	3 min
4 ℃	5 min
		4 ℃	加入1μl TS2126 RNA连接酶和1μl TDT DNA聚合酶
37 ℃	30 min
		65 ℃	30 min
95 ℃	5 min
		4 ℃	--

反应产物1.0×AMPure XP磁珠纯化，用14 μl ddH₂O洗脱；

（5）加入与引物2互补的引物3，在DNA聚合酶2的作用下合成第二链，获得双链DNA，反应体系如下：

组分	体积
		上述连接产物	12.5 µl
10× PCR buffer	5 µl
		10 mM dNTPs	1 µl
引物3	1.5 µl
		KAPA HiFi Uracil+高保真DNA聚合酶	1 µl
H2O	To 50 µl

反应程序如下：

组分	体积
		94 ℃	3 min
45 ℃	5 min
		72 ℃	30 min
4 ℃	--

反应产物1.0×AMPure XP磁珠纯化，用22 μl ddH₂O洗脱；

（6）以上述合成的双链DNA为模板进行PCR文库扩增，文库扩增的反应体系如下：

组分	体积
		上一步纯化产物	20 µl
2× KAPA HiFi Readymix	25 µl
		引物4	2.5 µl
引物5	2.5 µl

反应产物0.8×AMPure XP磁珠纯化，用22 μl ddH₂O洗脱。文库使用Qubit 4.0进行定量，用Agilent 2100核酸分析仪查看文库大小，最后进行高通量测序。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。