一种以罗汉果醇为底物生物合成罗汉果糖苷v的工程菌株的构建及其应用
阅读说明：本技术 一种以罗汉果醇为底物生物合成罗汉果糖苷v的工程菌株的构建及其应用 (Construction and application of engineering strain for biosynthesizing mogroside V by taking mogrol as substrate ) 是由 赵云现 舒柔 杨志彬 胡江林 崔金旺 赵凯 于 2021-08-11 设计创作，主要内容包括：生物本发明涉及一种以罗汉果醇为底物生物合成罗汉果糖苷V的工程菌株的构建及其应用。由包含糖基转移酶基因的重组细胞,或包含糖基转移酶基因和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组细胞转化底物罗汉果醇得到罗汉果糖苷V,所述的重组细胞表达葡萄糖糖基转移酶基因和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因,产UGT酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶。本发明通过基因重组技术引入外源物种UGT酶基因和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因,将其转化到基因工程菌中进行表达,重新构建了新的罗汉果糖苷V的生物合成路径,通过UGT酶基因和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因的过表达,实现了以罗汉果醇为底物生物合成罗汉果糖苷V,合成产量高。(The invention relates to construction and application of an engineering strain for biosynthesizing mogroside V by taking mogrol as a substrate. Converting a substrate mogrol by a recombinant cell containing a glycosyltransferase gene or a recombinant cell containing the glycosyltransferase gene and a UDP-glucose pyrophosphorylase gene to obtain the mogroside V, and expressing the glucose glycosyltransferase gene and the UDP-glucose pyrophosphorylase gene by the recombinant cell to produce UGT enzyme and UDP-glucose pyrophosphorylase. According to the invention, exogenous species UGT enzyme gene and UDP-glucose pyrophosphorylase gene are introduced through a gene recombination technology and are transformed into genetic engineering bacteria for expression, a new biosynthesis path of the momordica grosvenori glycoside V is reconstructed, and the momordica grosvenori glycoside V is biosynthesized by taking momordica grosvenori alcohol as a substrate through overexpression of the UGT enzyme gene and the UDP-glucose pyrophosphorylase gene, so that the synthesis yield is high.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种以罗汉果醇为底物生物合成罗汉果糖苷V的工程菌株的构建及其应用。
背景技术
甜食是一类生活调味品，其独特的味道赋予我们生活无尽的乐趣。甜味主要来源于传统甜味料：蔗糖。蔗糖在满足人类甜味需求的同时，还能提供一定的热量。然而，对于肥胖症、高血脂症、高血糖症等病人来说，蔗糖的摄入量需受到严格的控制。糖分摄入量的减少意味着甜味享受趣的减少。如何在减少糖分摄入的同时又满足甜味的需求呢？合成甜味剂为人们提供了一种可能，然而最近的研究指出合成甜味剂会影响肠道正常菌群，更甚者会导致代谢综合症和葡萄糖不耐受。兼顾了天然糖的安全及合成甜味剂无热量优点的天然无糖甜味剂步入了人们的视野，开发天然无糖甜味剂以满足人类对甜味的“需求”这一主题俨然吸引了广大食品从业者的极大兴趣。
罗汉果糖苷是一种直接从葫芦科植物罗汉果(Siraitiagrosvenorii)提取的、不经化学合成的天然甜味剂。它几乎不含能量，但甜度却约是蔗糖的300倍，是一种理想的蔗糖替代品。同时，罗汉果糖苷还具有调节血糖、抗氧化、止咳祛痰、护肝、润肠通便与抗菌消炎等功能。罗汉果糖苷是一种葫芦烷三萜甙类化合物，包括罗汉果苷Ⅰ(MogrosideⅠ)、罗汉果苷ⅡE(MogrosideⅡE)、罗汉果苷Ⅲ(MogrosideⅢ)、罗汉果苷ⅢE(MogrosideⅢE)、罗汉果苷Ⅳ(MogrosideⅣ)、罗汉果苷Ⅴ(MogrosideⅤ)、11-氧化-罗汉果苷Ⅴ(11-Oxo-mogroside V)、罗汉果新苷(Neomogroside)和赛门苷Ⅰ(SiamenosideⅠ)等多种成分，其中的罗汉果糖苷V(M5)是主要的甜味成分，具有高甜度、低能量、安全无毒等优点，具有广阔的应用前景。
然而罗汉果糖苷V在罗汉果中的含量仅为0.8％～1.3％(W/W)，仅依靠从果实中提取，难以实现高产量、高纯度罗汉果糖苷V的大规模生产。加之罗汉果种植环境及要求的苛刻，传统的通过杂交育种改良提高罗汉果糖苷V产方面的研究进展有限。因此通过生物合成罗汉果糖苷V成为规模化生产的必然趋势，然而目前少有利用生物合成罗汉果糖苷V的报道，故在此提供一种利用天然罗汉果糖苷V合成所需关键酶重组构建工程菌进行罗汉果糖苷V生产的方法。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明的目的在于提供了一种以罗汉果醇为底物生物合成罗汉果糖苷V的工程菌株及其应用，该工程菌株可以一步将罗汉果醇转化为罗汉果糖苷V，无需利用操作繁杂的化学方法，且产量高、纯度高、对人体和环境友好，为罗汉果糖苷V的大规模工业化生产提供依据。
一种合成罗汉果糖苷V的方法，由包含糖基转移酶(UDP-glucosyltransferase，UGT)基因的重组细胞，或包含糖基转移酶(UDP-glucosyltransferase，UGT)基因和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组细胞转化底物罗汉果醇得到罗汉果糖苷V，所述的重组细胞表达葡萄糖糖基转移酶(UDP-glucosyltransferase，UGT)基因和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因，产UGT酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶。
按上述方案，所述的糖基转移酶基因序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.9所示；所示的UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因序列如SEQ IDNO.11或SEQ ID NO.13所示。
按上述方案，上述方法具体步骤为：步骤(1)：以包含糖基转移酶(UDP-glucosyltransferase，UGT)基因和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组细胞，获得粗酶液；步骤(2)：以罗汉果醇为底物，加入粗酶液，在UDP葡萄糖的存在下，转化合成罗汉果糖苷V。
按上述方案，所述粗酶液的制备方法为：将包含糖基转移酶(UDP-glucosyltransferase，UGT)基因和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因的重组细胞接种到LB液体培养基中，获得种子液，将种子液接种到LB液体培养基中，培养条件可为：37℃，200rpm，培养至菌体OD600＝0.4-1.0，然后添加IPTG诱导培养，诱导目的蛋白进行表达；诱导完成后离心收集菌体，并将菌体重悬，在液氮中通过超声/冷冻循环破碎细胞，随后将细胞破碎液离心，收集上清液获得粗酶液。
按上述方案，所述步骤(2)的步骤(2)中的反应条件为25-45℃，反应时间为1-48h。
一种重组载体，包含糖基转移酶(UDP-glucosyltransferase，UGT)基因，或包含糖基转移酶(UDP-glucosyltransferase，UGT)基因和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因。
一种重组载体的制备方法，步骤为：(1)以载体为模板，利用特定引物进行PCR扩增，得到线性化载体反扩片段；(2)以糖基转移酶基因为模板，PCR扩增，得到UGT正扩片段，回收后与载体反扩连接，得到第一重组载体；以及进一步地，以第一重组载体为模板，进行PCR扩增，得到线性化载体反扩片段；以UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因基因为模板，进行PCR扩增，得到UDPase扩增片段，回收后与前述载体反扩片段链接，得到第二重组载体。
一种以罗汉果醇为底物生物合成罗汉果糖苷V的基因工程菌，所述基因工程菌表达糖基转移酶(UDP-glucosyltransferase，UGT)基因和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因，产UGT酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶。
上述基因工程菌的构建方法，将上述重组载体转化宿主细胞，培养转化体，获得以罗汉果醇为底物生物合成罗汉果糖苷V的工程菌株。
按上述方案，所述的宿主细胞为大肠杆菌。
提供上述重组载体或基因工程菌在生物合成罗汉果糖苷V中的应用。
罗汉果糖苷V是三萜皂苷类化合物，其合成前体是异戊烯焦磷酸(Isopentenylpyrophosphate，IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(Dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP)。IPP和DMAPP由乙酰辅酶A经甲羟戊酸途径(Mevalonic acid pathway，MVA途径)生成后，再经牻牛儿基焦磷酸合酶(Geranyl pyrophosphate synthase，PS)、法尼基焦磷酸合酶(Farnesylpyrophosphate synthase，FPPS)、角鲨烯合酶(Squalene synthase，SQS)、环化酶及葫芦二烯醇合酶(Cucurbitadienol synthase，CDS)催化合成24,25-环氧葫芦二烯醇，随后24,25-环氧葫芦二烯醇在环氧化物水解酶(Epoxide hydrolase，EPH)和细胞色素P450酶(CYP450)的作用下生成罗汉果醇，最后以罗汉果醇为底物经糖基转移酶(UDP-glucosyltransferase，UGT)逐步的糖基化修饰后合成罗汉果糖苷V。UGT是罗汉果醇向罗汉果糖苷V转化过程中的决定性酶，它以罗汉果醇为底物，UDP-葡萄糖为糖基供体，催化罗汉果醇C24、C3位以及C3、C24位葡萄糖分支链的糖基化反应，经四糖基化中间物合成罗汉果糖苷V。同时，UDP-葡萄糖作为糖基供体，其在催化过程中的供给量也影响着罗汉果醇的糖基化效率，当糖基供给不足时，罗汉果醇糖基化反应将会受到限制，因此提高UDP-葡萄糖含量或许可明显的促进罗汉果醇的糖苷化效率。
为此本发明选取UGT和UDPase酶基因，创建了UGT和UDPase共表达的基因工程菌株，通过在宿主菌株中高度表达，并辅以添加罗汉果醇作为底物用于合成罗汉果糖V。该方法操作简单，不污染环境，且产量高、纯度高、成本低，并为工业化生产罗汉果糖苷V提供了参考依据。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过基因重组技术引入外源物种UGT酶基因和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因，将其转化到基因工程菌中进行表达，重新构建了新的罗汉果糖苷V的生物合成路径，通过UGT酶基因和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因的过表达，实现了以罗汉果醇为底物生物合成罗汉果糖苷V，合成产量高。
该方法操作简单，不污染环境，且产量高、纯度高、成本低，为工业化生产罗汉果糖苷V提供了依据。
附图说明
图1为表达UGT、UGT-UDPase的工程菌株的构建示意图。
图2为工程菌罗汉果糖苷V产量。
具体实施方式
实施例1pET28a-UGT质粒及大肠杆菌重组菌株的构建
pET28a-UGT质粒的构建方法：
(1)以pET28a载体为模板，利用特定引物进行PCR扩增。所述pET28a载体为商业化载体，购于Novagen；所述引物序列见表1；PCR产物回收后得到线性化载体pET28a-反扩，所述线性化载体片段大小为5369bp；
(2)根据NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库公布的鲑鱼海虱(Lepeophtheirussalmonis)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、棉花(Gossypiumhirsutum)、萝卜(Raphanussativus)、果蝇(Drosophila simulans)5种生物体的UGT蛋白质序列，蛋白质序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.10所示，根据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化，人工合成核酸序列，LsUGT、AtUGT、GhUGT、RsUGT、DsUGT基因序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.9所示所示，设计6对特异性引物对其进行扩增。所述UGT氨基酸序列、核酸序列见SEQ Listing，所述引物序列见表1。
表1引物序列
(3)上述PCR扩增程序为95℃预变性5min，94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸1.5min，35个循环，72℃延伸10min。
(4)将上述UGT正扩片段回收后，分别与回收后的pET28a反扩连接，得到重组质粒，将其命名为pET28a-UGT，经测序验证正确，获得成功构建的pET28a-UGT质粒。
大肠杆菌重组菌株的构建方法：
利用热激转化方法将pET28a-UGT质粒转化到大肠杆菌克隆宿主中，获得阳性转化子，然后将测序正确的转化子质粒转到大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)中，并涂布到含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，LB平板在37℃培养至长出转化子，挑取阳性转化子，获得预期工程菌。
表2 5种pET28a-UGT工程菌类型
实施例2目的蛋白的诱导表达
将5种工程菌接种到5mL LB液体培养基中，于37℃，200rpm条件下培养过夜。然后，取0.8mL过夜培养物接种至20mL LB液体培养基中，37℃，200rpm培养至菌体OD600＝0.6。然后添加IPTG至终浓度为1mM，在室温下培养16h诱导目的蛋白进行表达。诱导完成后，10,000×g离心5min收集菌体，并将菌体重悬于1.5mL混合液(50mMTris·HCl(pH 7.0)、15％(vol/vol)甘油、0.1mM EDTA和5mMβ-巯基乙醇)中，超声3min破碎细胞。随后将大肠杆菌细胞破碎液以20,000×g离心10min，收集上清液获得粗酶液用于酶的表征。粗酶液储存在-20℃的条件下，直至进行进一步分析。
实施例3罗汉果糖苷V含量测定
将罗汉果醇用50％DMSO溶解至20mM。添加50mMTris·HCl(pH 7.0，含有5mMβ-巯基乙醇)，25μL粗酶液、8mM UDP-葡萄糖和2mM罗汉果醇配制成体积为100μL的反应体系用于测定UGT酶活。将反应液在37℃孵化24h后，加入300μL甲醇溶液终止反应，然后短暂涡旋。随后，将反应液以20,000×g离心10min，并收集上清液，后续产物含量分析如下：
(1)向1mL上述反应液中加入1mL色谱级甲醇溶液，得到产物溶解物；
(2)产物溶解物5000rpm离心10min后，收集上清液；
(3)上清液用0.22μm滤膜过滤于棕色液相瓶中，得到待测样品；
(4)采用液相质谱核磁连用技术IC-MS-NMR分析新产物：LC-MS分析采用Agilent260HPLC系统和Bruker-microtof-II电喷雾质谱仪。高效液相中使用反相C18柱(4.6×250mm，5um，Welch，上海)，进样量为10μL，流速为0.5mL/min，紫外检测波长为210nm。流动相A为水(0.1％甲酸)，流动相B为乙腈(0.1％甲酸)，采用梯度洗脱法：0.00-15.00min，20％-26％B；15.00-15.01min，26％-100％B；15.01-25.00min，100％B；
(5)根据罗汉果糖苷V标准品的峰面积，最终计算出5种工程菌的罗汉果糖苷V的产量，具体产量见表3。经计算菌株1即pET28a-LsUGT工程菌的罗汉果糖苷V产量最高可达1.175g/L。
表3 5种工程菌罗汉果糖苷V产量
实施例4pET28a-UGT-UDPase质粒和大肠杆菌重组菌株的构建
以罗汉果糖苷V产量较高的转入LsUGT和AtUGT的工程菌为基础，将UGT与UDPase进行串联表达。
pET28a-UGT-UDPGase质粒的构建方法：
(1)以pET28a-UGT载体为模板，利用特定引物进行PCR扩增。所述pET28a载体为商业化载体，购于Novagen；所述引物序列见表4；PCR产物回收后得到线性化载体pET28a-UGT反扩片段；
(2)根据NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库公布的拟南芥(Arabidopsis thaliana)和黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的UDPase蛋白质序列，如SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14所示，根据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化，人工合成核酸序列，核酸序列如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13所示，并设计2对特异性引物对其进行扩增。所述引物序列见表4。
表4 UDPase引物序列
(3)上述PCR扩增程序为95℃预变性5min，94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸1.5min，35个循环，72℃延伸10min。
(4)将AtUDPase正扩片段、DmUDPase正扩片段、pET28a-LsUGT反扩片段及pET28a-RsUGT反扩片段分别两两组合进行连接，得到重组质粒，将其命名为pET28a-UGT-UDPase，经测序验证正确，获得成功构建的4种pET28a-UGT-UDPase质粒。
大肠杆菌重组菌株的构建方法：
利用热激转化方法将4种pET28a-UGT-UDPase质粒转化到大肠杆菌克隆宿主中，获得阳性转化子，然后将测序正确的转化子质粒转到大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)中，并涂布到含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，LB平板在37℃培养至长出转化子，挑取阳性转化子，获得预期工程菌。
表5 pET28a-UGT-UDPase工程菌类型
实施例5pET28a-UGT-UDPase工程菌的罗汉果糖苷V产量
根据上述实例2-3的方法，进行工程菌目的蛋白的诱导表达及罗汉果糖苷V产量的测定。
根据罗汉果糖苷V标准品的峰面积，最终计算出4种pET28a-UGT-UDPase工程菌的罗汉果糖苷V的产量，具体产量见表6。经计算菌株6即pET28a-LsUGT-AtUDPase工程菌的罗汉果V产量最高，可达1.583g/L。
表6 2种pET28a-UGT-UDPGase工程菌的罗汉果糖苷V的产量
说明书核苷酸和氨基酸序列表
＜110＞ 河北维达康生物科技有限公司
＜120＞ 一种以罗汉果醇为底物微生物合成罗汉果糖苷V的工程菌株的构建及其应用
＜160＞ 14
＜210＞ 1
＜211＞1542bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 人工合成
＜400＞ 1
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＜210＞ 2
＜211＞ 513
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ctggcggatg aaagcaaccc gaaaattctg gtgaacacct ttgatgcgct ggaacaggaa 660
gcgctgaacg cgattgaaaa ctttaacatg gtgggcattg gcccgctgat tccgagcagc 720
tttctgaaca gcaacgatag cctggataac agcctgcgca ccgatctgtt tcagagcgat 780
agcaaagatt atattcagtg gctggatagc aaaccgaaaa gcgcggtggt gtatgtgagc 840
tttggcagca ttgcggtgct gaccaaacag caggtggaag aaattgcgcg cgcgctgatt 900
agcagccgcc gcccgtttct gtgggtggtg cgcaactgga aagatggcgt ggaagaagaa 960
aaagaagaag ataaactgac ctggcgcgaa gaactggaac gctttggcat ggtggtgccg 1020
tggtgcagcc aggtggaagt gctgagccat ccgagcctgg gctgctttgt gacccattgc 1080
ggctggaaca gcaccctgga aagcatggtg gcgggcgtgc cggtggtggc gtttccgcag 1140
tggaccgatc agggcaccaa cgcgaaactg attgaagatg tgtggggcaa cggcgtgcgc 1200
gtgagcgcga acgaagaagg catggtggaa cgcgatgaaa ttgtgcgctg cctggatctg 1260
gtgatgggcg atgatgaaaa aggcatggaa gtgaaaaaaa acgtggaaaa atgggaaggc 1320
ctggcgcgcg aagcgagcat ggaaggcggc agcatggata tgaacctgaa agcgtttgtg 1380
gatgatgtgg cgcagggctg ctggaaataa 1410
＜210＞ 6
＜211＞ 469
＜212＞ PRT
＜213＞ 人工合成
＜400＞ 1
MSQPHFLLVT FPAQGHINPT LQFAKHLIRI GVRVTFITCI SARRRMTKVP TAQGLTFLPF 60
SDGYDDGFQP GDDIEHYLSE LRRRGKEAIS EFITSSEYEG KPVTCIVYTL FIHWASEVAR 120
KHHIPAALLW IQPATVFDIY YFYFNGYEST IKVPVDETNP KRSIKLPGLP LLATRDLPSF 180
VTASNVYRWA LSLFQEQMDI LADESNPKIL VNTFDALEQE ALNAIENFNM VGIGPLIPSS 240
FLNSNDSLDN SLRTDLFQSD SKDYIQWLDS KPKSAVVYVS FGSIAVLTKQ QVEEIARALI 300
SSRRPFLWVV RNWKDGVEEE KEEDKLTWRE ELERFGMVVP WCSQVEVLSH PSLGCFVTHC 360
GWNSTLESMV AGVPVVAFPQ WTDQGTNAKL IEDVWGNGVR VSANEEGMVE RDEIVRCLDL 420
VMGDDEKGME VKKNVEKWEG LAREASMEGG SMDMNLKAFV DDVAQGCWK 469
＜210＞ 7
＜211＞ 1395bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 人工合成
＜400＞ 1
atggcgccgc cgccgccgca ttttctgctg gtgacctttc cggcgcaggg ccatgtgaac 60
ccgagcctgc gctttgcgta tcgcctgatt cgcaccaccg gcgcgcgcgt gacctttgtg 120
acctgcgcga gcgtgtttca tcgcagcatg attagcaacc atagcgatct ggataacctg 180
agctttctga cctttagcga tggctttgat cagggcggcc tgaccaccgc ggaagatcat 240
aaaaaacgca gcgcgaacct ggaaattaac ggcgataaag cgctgagcga atttattaaa 300
gcgaacgaaa acggcgatag cccggtgacc tgcctggtgt ataccatttt tctgaactgg 360
gcgccgaaag tggcgagccg ctttcagctg ccgagcgcgc tgctgtggat tcagccggcg 420
ctggtgtttg atatttatta taaccatttt aacggcgata acaacaacag ctatctggaa 480
tttaaaaacc tgccgagcct ggcgattcgc gatctgccga gctttctgac cccgaccaac 540
accaaccagg cggcgtatgc gagctttcag gaactgatgg aactgctgaa aaaagaaacc 600
aacccgaaaa ttctggtgaa cacctttgat agcctggaac aggaagcgct gaaagcgatt 660
ccgagcgtgg gcatggtggc ggtgggcccg ctgctgccga gcgatatgtt taccggcagc 720
gaaccggtga aagatctgag caaagaacag accggcagca gctatagccg ctggctggaa 780
agcaaaaccg aaagcagcgt gatttatgtg agctttggca ccatggtgga actgagcaaa 840
aaacagattg aagaactggc gcgcgcgctg attgaaggca aacgcccgtt tctgtgggtg 900
attaccgata aaagcaaccg cgaagcgaaa accgaaggcg aagatgaaac cgaaattgaa 960
aaaattgcgg gctttcgcca tgaactggaa gaagtgggca tgattgtgag ctggtgcagc 1020
caggtggaag tgctgaaaca tcgcgcggtg ggctgctttg tgacccattg cggctggagc 1080
agcaccctgg aaagcctggt gctgggcgtg ccggtggtgg cgtttccgat gtggagcgat 1140
cagccgacca gcgcgaaact gctggaagaa ctgtggcgca ccggcgtgcg cgtgcgcgaa 1200
aacgaagaag gcctggtgga acgcgaagaa attcgccgct gcctggaagc ggtgatggat 1260
gaacgcctgg tggaactgcg cgaaaacgcg gtgaaatgga aacgcctggc ggtggaagcg 1320
ggccgcgaag gcggcctgag cgataaaaac atggaagcgt ttgtggaaga aatttgcgaa 1380
gatagcgtgc tgtaa 1395
＜210＞ 8
＜211＞ 464
＜212＞ PRT
＜213＞ 人工合成
＜400＞ 1
MAPPPPHFLLVTFPAQGHVNPSLRFAYRLIRTTGARVTFVTCASVFHRSMISNHSDLDNL 60
SFLTFSDGFD QGGLTTAEDH KKRSANLEIN GDKALSEFIK ANENGDSPVT CLVYTIFLNW 120
APKVASRFQL PSALLWIQPA LVFDIYYNHF NGDNNNSYLE FKNLPSLAIR DLPSFLTPTN 180
TNQAAYASFQ ELMELLKKET NPKILVNTFD SLEQEALKAI PSVGMVAVGP LLPSDMFTGS 240
EPVKDLSKEQ TGSSYSRWLE SKTESSVIYV SFGTMVELSK KQIEELARAL IEGKRPFLWV 300
ITDKSNREAK TEGEDETEIE KIAGFRHELE EVGMIVSWCS QVEVLKHRAV GCFVTHCGWS 360
STLESLVLGV PVVAFPMWSD QPTSAKLLEE LWRTGVRVRE NEEGLVEREE IRRCLEAVMD 420
ERLVELRENA VKWKRLAVEA GREGGLSDKN MEAFVEEICE DSVL 464
＜210＞ 9
＜211＞ 1647bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 人工合成
＜400＞ 1
atgcgcagct tttatggcta tcgcggcatt ccgattcgct ttgtgcagct gtggagcgaa 60
ctgcagcatg aacgcaccga aagcgtgaaa atgtgcctgg gctattgctg gctgaccgtg 120
tttctgtgcc tgctgctgca gcaggatctg catcaggatc aggcggaagc ggcgaacatt 180
ctgggcattt ttccgtatcg ccatattagc ccgttttttg tgatgcagcc gctggtgcgc 240
accctggcgg aacgcggcca taacgtgacc ctgattaccc cgagcggcct gccgaacgat 300
attgaaggcg tgcgccatat tcgcgtggcg cagctgaacg aacgcattaa agatcaggtg 360
ctggattttc tgattaacaa atggaccgaa agcgcgctga ccgcgaaagc gctgtataac 420
gcgagcaacg atattctgag cgatccgggc gtgcagcgca tgctgcatga taaaagcgaa 480
cgctttgatc tgattattat ggaaccgagc agcctggatg cgctgtatgg cctggtggaa 540
ttttataacg cgaccctgat tggcctgagc agcattcgca ttaactggca gaccgatgaa 600
ctggcgggca acccggcgcc gagcatttat gaaccgatta gcccggtggg ctttagcctg 660
gaaaccagcc tgtttagccg cgtgtataac tggattcata ttatggaaga aaaactggtg 720
gattatctga ttctgcgccc ggcgcagctg catctgtttc agaaattttt tggctatagc 780
gcgcagaaaa tgaacgaact gcgcaaccgc tttagcctga tgctgattaa cagccattat 840
agcatgggca aagtgcgcgc gaacgcgccg aacattattg aagtgggcgg cctgcatctg 900
agcgaaccgc cggaaccgag cgatgaagaa ctgcagaaat ttctggataa agcgaaccat 960
ggcgtgattt attttagcat gggcaacgat gtgctgatta aatttctgcc ggcgaacatt 1020
caggaactgc tgctgcagac ctttgcgaaa ctgaaagaaa gcattatttg gaaaagcgaa 1080
ctgctgtgca tgccgaacaa aagcgataac gtgtatgtga ttgaacaggc gccgcagcgc 1140
catattctga accatccgaa cgtgcgcctg tttattacca acggcggcct gctgagcgtg 1200
attgaagcgg tggatagcgg cgtgccgatg ctgggcctgc cgatgttttt tgatcagttt 1260
gcgaacatgc gctgggtgca gctgagcggc atggcggaag tgatggatat taacattctg 1320
aacaaagata ccctgaccga aaccattaaa catatgctgg cgagcgatag ctattatctg 1380
aaagcgaaag aaatgagcca gttttttaaa gatcgcccga tgagcccgct ggataccgcg 1440
gtgtggtgga ccgaatatgc gctgcgcaac cgcaacatta cccgcatgcg cctgaacctg 1500
gaagaaattc cgctgattga atattatcgc attgatagca ttctggcgtt tagcctgcgc 1560
tttggcctgg tggcggcgag cctgattttt ctggtgtata ccctgtttct gaaatatcgc 1620
attcgcctgc gccgcctgca tccgtaa 1647
＜210＞ 10
＜211＞ 548
＜212＞ PRT
＜213＞ 人工合成
＜400＞ 1
MRSFYGYRGI PIRFVQLWSE LQHERTESVK MCLGYCWLTV FLCLLLQQDL HQDQAEAANI 60
LGIFPYRHIS PFFVMQPLVR TLAERGHNVT LITPSGLPND IEGVRHIRVA QLNERIKDQV 120
LDFLINKWTE SALTAKALYN ASNDILSDPG VQRMLHDKSE RFDLIIMEPS SLDALYGLVE 180
FYNATLIGLS SIRINWQTDE LAGNPAPSIY EPISPVGFSL ETSLFSRVYN WIHIMEEKLV 240
DYLILRPAQL HLFQKFFGYS AQKMNELRNR FSLMLINSHY SMGKVRANAP NIIEVGGLHL 300
SEPPEPSDEE LQKFLDKANH GVIYFSMGND VLIKFLPANI QELLLQTFAK LKESIIWKSE 360
LLCMPNKSDN VYVIEQAPQR HILNHPNVRL FITNGGLLSV IEAVDSGVPM LGLPMFFDQF 420
ANMRWVQLSG MAEVMDINIL NKDTLTETIK HMLASDSYYL KAKEMSQFFK DRPMSPLDTA 480
VWWTEYALRN RNITRMRLNL EEIPLIEYYR IDSILAFSLR FGLVAASLIF LVYTLFLKYR 540
IRLRRLHP 548
＜210＞ 11
＜211＞ 1437bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 人工合成
＜400＞ 1
atggcggcga ccaccgaaaa cctgccgcag ctgaaaagcg cggtggatgg cctgaccgaa 60
atgagcgaaa gcgaaaaaag cggctttatt agcctggtga gccgctatct gagcggcgaa 120
gcgcagcata ttgaatggag caaaattcag accccgaccg atgaaattgt ggtgccgtat 180
gaaaaaatga ccccggtgag ccaggatgtg gcggaaacca aaaacctgct ggataaactg 240
gtggtgctga aactgaacgg cggcctgggc accaccatgg gctgcaccgg cccgaaaagc 300
gtgattgaag tgcgcgatgg cctgaccttt ctggatctga ttgtgattca gattgaaaac 360
ctgaacaaca aatatggctg caaagtgccg ctggtgctga tgaacagctt taacacccat 420
gatgataccc ataaaattgt ggaaaaatat accaacagca acgtggatat tcataccttt 480
aaccagagca aatatccgcg cgtggtggcg gatgaatttg tgccgtggcc gagcaaaggc 540
aaaaccgata aagaaggctg gtatccgccg ggccatggcg atgtgtttcc ggcgctgatg 600
aacagcggca aactggatac ctttctgagc cagggcaaag aatatgtgtt tgtggcgaac 660
agcgataacc tgggcgcgat tgtggatctg accattctga aacatctgat tcagaacaaa 720
aacgaatatt gcatggaagt gaccccgaaa accctggcgg atgtgaaagg cggcaccctg 780
attagctatg aaggcaaagt gcagctgctg gaaattgcgc aggtgccgga tgaacatgtg 840
aacgaattta aaagcattga aaaatttaaa atttttaaca ccaacaacct gtgggtgaac 900
ctgaaagcga ttaaaaaact ggtggaagcg gatgcgctga aaatggaaat tattccgaac 960
ccgaaagaag tggatggcgt gaaagtgctg cagctggaaa ccgcggcggg cgcggcgatt 1020
cgcttttttg ataacgcgat tggcgtgaac gtgccgcgca gccgctttct gccggtgaaa 1080
gcgagcagcg atctgctgct ggtgcagagc gatctgtata ccctggtgga tggctttgtg 1140
acccgcaaca aagcgcgcac caacccgagc aacccgagca ttgaactggg cccggaattt 1200
aaaaaagtgg cgacctttct gagccgcttt aaaagcattc cgagcattgt ggaactggat 1260
agcctgaaag tgagcggcga tgtgtggttt ggcagcagca ttgtgctgaa aggcaaagtg 1320
accgtggcgg cgaaaagcgg cgtgaaactg gaaattccgg atcgcgcggt ggtggaaaac 1380
aaagcggtga tgattctggt gcaggatttt cagagcaacc atcagaacga aaactaa 1437
＜210＞ 12
＜211＞ 478
＜212＞ PRT
＜213＞ 人工合成
＜400＞ 1
MAATTENLPQ LKSAVDGLTE MSESEKSGFI SLVSRYLSGE AQHIEWSKIQ TPTDEIVVPY 60
EKMTPVSQDV AETKNLLDKL VVLKLNGGLG TTMGCTGPKS VIEVRDGLTF LDLIVIQIEN 120
LNNKYGCKVP LVLMNSFNTH DDTHKIVEKY TNSNVDIHTF NQSKYPRVVA DEFVPWPSKG 180
KTDKEGWYPP GHGDVFPALM NSGKLDTFLS QGKEYVFVAN SDNLGAIVDL TILKHLIQNK 240
NEYCMEVTPK TLADVKGGTL ISYEGKVQLL EIAQVPDEHV NEFKSIEKFK IFNTNNLWVN 300
LKAIKKLVEA DALKMEIIPN PKEVDGVKVL QLETAAGAAI RFFDNAIGVN VPRSRFLPVK 360
ASSDLLLVQS DLYTLVDGFV TRNKARTNPS NPSIELGPEF KKVATFLSRF KSIPSIVELD 420
SLKVSGDVWF GSSIVLKGKV TVAAKSGVKL EIPDRAVVEN KAVMILVQDF QSNHQNEN 478
＜210＞ 13
＜211＞1542bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 人工合成
＜400＞ 1
atgctggatg tgccgcatga agcgaaagtg cgcggccatc agcgcgcgcc gagcgatagc 60
aaagaatttc atgaagtgac caaacgcgat gcgctgcgcc tgctggaaca tgatgtggat 120
cgcctgctgg aaaccaccga aaaagcgcgc cagccggcgc tgaaagcgga aatgggccgc 180
tttgcggatc tgtttggccg ctttattcag gaagaaggcc cggcgctgga ttggaacaaa 240
attcagaaac tgccggaaaa cgcggtgatg aactatagca acctgaaaag cccgaaaaac 300
gaacagaacg aaattcgcaa catgctggat aaactggtgg tgattaaact gaacggcggc 360
ctgggcacca gcatgggctg ccatggcccg aaaagcgtga ttccggtgcg cagcgatctg 420
acctttctgg atctgaccgt gcagcagatt gaacatctga acaaaaccta tgatgcgaac 480
gtgccgctgg tgctgatgaa cagctttaac accgatgaag ataccgaaaa aattgtgcgc 540
aaatataaag gctttcgcgt gcagattcat acctttaacc agagctgctt tccgcgcatt 600
agccgcgaac attatctgcc ggtggcgaaa gattttgatg tggaaaaaga tatggaagcg 660
tggtatccgc cgggccatgg cgatttttat gatacctttc gcaacagcgg cctgctgaaa 720
aaatttattg aagaaggccg cgaatattgc tttctgagca acattgataa cctgggcgcg 780
accgtggatc tgaacattct gaacaaactg gtgggcgaag aacgcgcgac caccccggtg 840
gaatttgtga tggaagtgac cgataaaacc cgcgcggatg tgaaaggcgg caccctgatt 900
cagatggaaa acaaactgcg cctgctggaa attgcgcagg tgccgccgga acatgtggat 960
gattttaaaa gcgtgaaaac ctttaaattt tttaacacca acaacatttg ggcgaacctg 1020
gcggcgattg atcgcgtgct gcgcgaacgc accctgaaca tggaaattat tgtgaacaac 1080
aaaaccctgg aaaacggcac ccgcgtgatt cagctggaaa ccgcggtggg cgcggcgatg 1140
aaatgctttg atggcgcgat tggcattaac gtgccgcgca gccgctttct gccggtgaaa 1200
aaaagcagcg atctgctgct ggtgatgagc aacctgtata ccctgaaaaa cggcagcctg 1260
gtgatgagcc cgcagcgcat gtttccgacc accccgctgg tgaaactggg cgaaaaccat 1320
tttagcaaag tgaaagaatt tctgggccgc tttgcgaaca ttccggatat tattgaactg 1380
gatcatctga ccgtgagcgg cgatgtgacc tttggccgcg gcgtgagcct gcgcggcacc 1440
gtgattatta ttgcgaacca tggcgatcgc attgatattc cggcgggcgc gattctggaa 1500
aacaaaattg tgagcggcaa catgcgcatt ctggatcatt aa 1542
＜210＞ 14
＜211＞ 513
＜212＞ PRT
＜213＞ 人工合成
＜400＞ 1
MLDVPHEAKV RGHQRAPSDS KEFHEVTKRD ALRLLEHDVD RLLETTEKAR QPALKAEMGR 60
FADLFGRFIQ EEGPALDWNK IQKLPENAVM NYSNLKSPKN EQNEIRNMLD KLVVIKLNGG 120
LGTSMGCHGP KSVIPVRSDL TFLDLTVQQI EHLNKTYDAN VPLVLMNSFN TDEDTEKIVR 180
KYKGFRVQIH TFNQSCFPRI SREHYLPVAK DFDVEKDMEA WYPPGHGDFY DTFRNSGLLK 240
KFIEEGREYC FLSNIDNLGA TVDLNILNKL VGEERATTPV EFVMEVTDKT RADVKGGTLI 300
QMENKLRLLE IAQVPPEHVD DFKSVKTFKF FNTNNIWANL AAIDRVLRER TLNMEIIVNN 360
KTLENGTRVI QLETAVGAAM KCFDGAIGIN VPRSRFLPVK KSSDLLLVMS NLYTLKNGSL 420
VMSPQRMFPT TPLVKLGENH FSKVKEFLGR FANIPDIIEL DHLTVSGDVT FGRGVSLRGT 480
VIIIANHGDR IDIPAGAILE NKIVSGNMRI LDH 513
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