一种修复肝脏损伤的组氨酸二肽组合物及其应用
阅读说明：本技术 一种修复肝脏损伤的组氨酸二肽组合物及其应用 (Histidine dipeptide composition for repairing liver injury and application thereof ) 是由 吉宏武 陈铭 张迪 宋文奎 苏伟明 刘书成 于 2021-10-08 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物医药领域,涉及一种修复肝脏损伤的组氨酸二肽组合物,该组合物有效组分包括肌肽、鹅肌肽、河蚬提取物、葛根提取物、黄芪提取物,所述肌肽、鹅肌肽、河蚬提取物、葛根提取物、黄芪提取物在该组合物中的质量配比为50～60:20～25:5～10:5～10:5～10。本发明提供的组氨酸二肽组合物,在一定配比范围内,能有效预防和/或治疗肝脏损伤,特别在修复肝细胞损伤、预防和/或治疗高尿酸引起的肝脏损伤、治疗临床肝细胞损伤型肝病方面表现出优异的效果,且原材料便宜,制备方法简单,无毒害作用。(The invention belongs to the field of biological medicine, and relates to a histidine dipeptide composition for repairing liver injury, which comprises active components of carnosine, anserine, corbicula fluminea extract, a kudzu vine root extract and an astragalus extract, wherein the mass ratio of the carnosine, the anserine, the corbicula fluminea extract, the kudzu vine root extract and the astragalus extract in the composition is 50-60: 20-25: 5-10. The histidine dipeptide composition provided by the invention can effectively prevent and/or treat liver injury within a certain proportion range, particularly has excellent effects on repairing liver cell injury, preventing and/or treating liver injury caused by high uric acid and treating clinical liver cell injury type liver diseases, and has the advantages of cheap raw materials, simple preparation method and no toxic or side effect.)
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种组氨酸二肽组合物，具体涉及一种修复肝脏损伤的组氨酸二肽组合物。
背景技术
药物性肝损害（Drug-induced Liver Injury DILI）是指药物在治疗过程中，由于药物或者其代谢产物引起的肝细胞毒性损害或肝脏对药物及其代谢产物的过敏反应所致的疾病，也称为药物性肝炎。随着临床各种新药的不断增加、联合使用多种药物，及广泛应用中草药及中成药类制剂，药物性肝损害的发病率逐年升高。同时，病毒性肝炎、肝硬化及肝癌等肝脏疾病的发病率较高，已经严重危害到人民群众的身体健康。肝损伤是多种肝疾病共有的一种病理状态，会促进肝脏疾病的进一步恶化，因此肝损伤的治疗与预防尤为重要。
组氨酸二肽（Histidine-containing dipeptides，HCDPs）是一类天然水溶性二肽，包括肌肽（Carnosine，β-alanyl-L-histidine，Car）、鹅肌肽（Anserine，β-alanyl-L-1-methylhistidine，Ans）、鲸肌肽（Balenine，β-alanyl-L-3-methylhistidine）及N-乙酰-肌肽等。组氨酸二肽具有缓冲生理pH、螯合金属离子、抗氧化、抗衰老、神经调节等能力。相关研究发现，肌肽和鹅肌肽在治疗高尿酸血症以及痛风、阿尔兹海默症的体外及体内治疗中有明显作用。
河蚬（Corbicula fluminea）又称黄蚬、金蚶、扁螺等，其作为中药药材，具有去湿毒、治疗肝病、麻疹、退热、止咳化痰、解酒等功效。相关研究表明，河蚬提取物能明显抑制肝损伤小鼠丙氨酸氨基转移酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、谷氨酰转肽酶（GGT）和碱性磷酸酶（ALP）活性升高，降低增加的肝脏指数。进一步研究表明，河蚬提取物通过抑制脂质过氧化反应对酒精性肝损伤有保护作用。
葛根是从中药材豆科植物野葛根中提取的有效成分，其含异黄酮成分葛根素（Puerarin）、葛根素木糖甙（Puerarin-xyloside）、大豆黄酮（Daidzein）、大豆黄酮甙（Daidzin）、β-谷甾醇（β-SitosteIrol）、花生酸（Arachidic acid），又含多量淀粉（新鲜葛根中含量为19~20%）。葛根被认为是一种很有潜力的天然抗癌药物，进一步的机理研究表明葛根抗肿瘤作用与其激活巨噬细胞功能及诱导巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子有一定关系。葛根提取物也发现可在体外抑制人肝癌细胞系7721细胞的增殖，并可引起明显的细胞凋亡。
黄芪是豆科多年生草本植物内蒙黄芪或膜荚黄芪的干燥根，首载于《五十二病方》。参照2015年版《中国药典》，黄芪味甘，性温，归脾，肺经，具有补气升阳，固表止汗，利水消肿，生津养血等功效。现代医学研究表明，黄芪含皂苷、蔗糖、多糖、黄酮、多种氨基酸、叶酸及硒、锌、铜等多种微量元素，有增强机体免疫功能、双相调节血压和血糖、护心、护肾、保肝、利尿、抗衰老、抗应激、抗肿瘤、抗氧化及抗菌等作用。
当前研究中，关于肌肽与鹅肌肽组合功效多集中在降尿酸、有抗氧化、抑制炎症反应、减少脂质氧化、抑制端粒缩短、减少线粒体损伤、抗糖基化、抗肿瘤等功能研究上。对于肌肽与鹅肌肽组合对肝功能损伤修复尤其是高尿酸诱导的肝功能损伤修复的研究尚未有报导。本发明人将肌肽、鹅肌肽、河蚬提取物、葛根提取物、黄芪提取物组合复配使用，制备的组合物能有效预防和/或治疗肝脏损伤，从而为预防和/或治疗肝脏损伤的药物制备提供新思路。
发明内容
本发明目的在于为肝脏损伤的预防和治疗中更深入地研发高效、低成本的药物原料，提供组氨酸二肽在肝脏损伤治疗预防中的新应用。
基于上述目的，本申请通过提供一种修复肝脏损伤的组氨酸二肽组合物来解决所属领域中的这种需要。
一方面，本发明涉及一种组氨酸二肽组合物，所述组合物有效组分包括肌肽、鹅肌肽、河蚬提取物、葛根提取物、黄芪提取物，所述肌肽、鹅肌肽、河蚬提取物、葛根提取物、黄芪提取物在所述组合物中的质量配比为50~60:20~25:5~10:5~10:5~10。
根据实际应用需要，本发明组合物按照本领域技术人员公知的方法，根据药学相关要求和临床需要可制备成片剂、胶囊剂、口服液体制剂、颗粒剂、粉剂等；优选地，本发明组合物制备成粉剂。
另一方面，本发明提供了一种组氨酸二肽组合物在预防和/或治疗肝脏损伤药物中的应用。
进一步地，本发明提供了一种组氨酸二肽组合物在修复肝细胞损伤药物中的应用。
进一步地，本发明提供了一种组氨酸二肽组合物在预防和/或治疗高尿酸引起的肝脏损伤药物中的应用。
进一步地，本发明提供了一种组氨酸二肽组合物在治疗临床肝细胞损伤型肝病药物中的应用。
另一方面，本发明提供了所述肌肽和鹅肌肽的分离提取方法，具体包括：扁舵鲣鱼取肉、绞碎，匀浆，按木瓜蛋白酶添加量500U/g、风味蛋白酶添加量200U/g、pH6.5的酶解条件酶解3h；酶解产物经水浴灭酶后离心15min（3500g，4℃），所得上清液经管式离心机脱油(18000r/m，20min)，珍珠岩脱色（添加量为3%）；使用陶瓷膜与多级超滤膜进行初步分离与低分子肽的富集，然后通过反向高效液相色谱（Hydro-RP LC column 150*10mm 4μm，飞诺美）对低分子肽进一步分离纯化得到肌肽与鹅肌肽（上样条件：50mg/mL，1mL/min，0.5%磷酸盐溶液:乙腈=98.5:1.5），收集样品，冷冻干燥（预冻温度为-40℃，压力为10Pa，冷阱温度为-70℃），得到肌肽与鹅肌肽干粉。
另一方面，本发明提供了所述河蚬提取物的制备方法，具体包括：冷冻河蚬肉解冻后，按料水比1:3加水匀浆，调整pH=7.5，按料质量1%~5%加入碱性蛋白酶与中性蛋白酶，于50~60℃恒温摇床中酶解，然后沸水浴灭酶10min，置冰浴中冷却后以5000r/min离心，收集上清液，采用200nm孔径的无机陶瓷膜对河蚬酶解液进行过滤，真空浓缩后-30℃的预冻处理，恒压15Pa冷冻干燥至恒重得到河蚬肉提取物干粉。
另一方面，本发明提供了所述葛根提取物的制备方法，具体包括：葛根晒干粉碎，过100目筛，称取干燥粉末，以40%~70%乙醇为提取溶剂，回流提取3次，每次1~2h，合并滤液，40~50℃减压浓缩，得葛根提取物浸膏，加入等体积的乙酸乙酯混匀萃取，萃取操作重复3~4次，合并收集乙酸乙酯层萃取液，减压浓缩，干燥至恒重，即得葛根提取物。
另一方面，本发明提供了所述黄芪提取物的制备方法，具体包括：挑选黄芪清洗、晾干、粉碎过100目筛，加入纯化水水浴回流提取2次，每次2h，合并滤液并减压浓缩，加入60~90%乙醇萃取，离心后按照乙醇萃取液:氯仿:正丁醇体积比为20~30:5~8:1~3加入氯仿、正丁醇进行萃取、离心，取上清液，按上述方法重复5次，合并上清液，加入活性炭超声并过滤，-30℃的预冻处理后，恒压15Pa冷冻干燥至恒重，得黄芪提取物。
另一方面，本发明提供了所述组氨酸二肽组合物的制备方法，具体包括：将制备得到的各种干粉依照肌肽、鹅肌肽、河蚬提取物、葛根提取物、黄芪提取物重量比为50~60:20~25:5~10:5~10:5~10进行混合均匀，组成组氨酸二肽与河蚬、中药的组合物，简称为组氨酸二肽组合物。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果或者优点：
（1）本发明提供的组氨酸二肽组合物在抑制高尿酸引起的碱性磷酸酶（ALP）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）的酶活性增加方面表现出优异的效果；
（2）本发明提供的组氨酸二肽组合物在降低肝脏指数方面表现出优异的效果；
（3）本发明提供的组氨酸二肽组合物在修复肝细胞损伤方面表现出优异的效果；
（4）本发明提供的组氨酸二肽组合物在降低丙二醛（MDA）含量和提高超氧化物歧化酶（SOD）活力，抑制肝脏脂质过氧化方面表现出优异的效果。
附图说明
图1为大鼠血清中碱性磷酸酶（ALP）活性；
图2为大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性；
图3为大鼠肝脏中丙二醛（MDA）含量；
图4为大鼠肝脏中超氧化物歧化酶（SOD）活力；
图5为大鼠肝脏切片HE染色结果。
图中a、b、c、d、e、f表示各组间的显著性差异。
具体实施方式
下面，结合实施例对本发明的技术方案进行说明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例提供了一种组氨酸二肽组合物对高尿酸大鼠肝功能损伤的修复作用的动物试验。
（1）建立实验模型
将135只雄性SD大鼠（200±20g）随机分成9组（空白组、模型组、组氨酸二肽组合物低剂量组、组氨酸二肽组合物中剂量组、组氨酸二肽组合物高剂量组、鹅肌肽组、肌肽组、肌肽+鹅肌肽组、河蚬、黄芪、葛根三元提取物组），每组15只。组合物低剂量组依照质量配比分为3组，其中肌肽、鹅肌肽、河蚬提取物、葛根提取物、黄芪提取物在这3组中的质量配比分别为50:20:5:5:5、55:22.5:7.5:7.5:7.5、60:25:10:10:10；组合物中剂量组和组合物高剂量组同组合物低剂量组依照质量配比分为3组处理。实验组（模型组、组氨酸二肽组合物低剂量组、组氨酸二肽组合物中剂量组、组氨酸二肽组合物高剂量组、鹅肌肽组、肌肽组、组氨酸二肽组、河蚬、黄芪、葛根三元提取物组）连续灌胃给予750mg/kg氧嗪酸钾7天，建立高尿酸大鼠模型，空白组同时灌胃给予等量的0.5%羧甲基纤维素钠作为对照。高尿酸大鼠模型建立后，低、中、高剂量组分别灌胃给予20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg的组氨酸二肽组合物，鹅肌肽组灌胃给予20mg/kg鹅肌肽，肌肽组灌胃给予40mg/kg肌肽，组氨酸二肽组灌胃给予60mg/kg肌肽和鹅肌肽，模型组和空白组灌胃给予等量的0.5%羧甲基纤维素钠，每天灌胃一次，连续给药21天后，CO2处死大鼠，收集血清和肝脏。后续试验各指标测量中，肌肽、鹅肌肽、河蚬提取物、葛根提取物、黄芪提取物在所述组合物中的质量配比范围为50~60:20~25:5~10:5~10:5~10时，同剂量组的3组数据间无显著性差异。
（2）肝脏损伤修复指标测定
称量肝脏重量，根据公式肝脏指数=（肝重/体重）×100%计算肝指数。测定大鼠血清碱性磷酸酶（ALP）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）的活力，以及肝脏中超氧化物歧化酶（SOD）活力和丙二醛（MDA）含量，测定方法按检测试剂盒说明书操作。其中，大鼠血清中碱性磷酸酶（ALP）活性见图1；大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性见图2；大鼠肝脏中丙二醛（MDA）含量见图3；大鼠肝脏中超氧化物歧化酶（SOD）活力见图4。
（3）大鼠肝脏病理学观察
取大鼠肝脏最大叶同一部位，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，取最大面切片，HE染色，在光学显微镜（×400）下进行组织形态观察。大鼠肝脏切片HE染色结果见图5。
（4）实验结论
上述实验结果表明，组氨酸二肽组合物能有效降低高尿酸大鼠的肝脏指数，显著抑制高尿酸大鼠碱性磷酸酶（ALP）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）酶活性的增加（图1、图2），有效修复肝细胞损伤，同时亦可降低丙二醛（MDA）含量和提高超氧化物歧化酶（SOD）活力（图3、图4），有效抑制肝脏脂质过氧化。
与三元提取物相比，肌肽、鹅肌肽、肌肽+鹅肌肽与组氨酸二肽组合物的肝细胞损伤修复能力更强。其中，高剂量的组氨酸二肽组合物表现出最高的修复能力，治疗后大鼠的ALP酶活力和ALT酶活力分别下降了40.2%和41.5%；肌肽+鹅肌肽也表现出较好的肝细胞损伤修复能力，治疗后大鼠的ALP酶活力和ALT酶活力分别下降了28.1%和33.4%。结果表明，对于肝细胞损伤修复，组氨酸二肽与三元提取物的组合具有协同增效作用。
相对于模型组，三元提取物组、肌肽组、鹅肌肽组、肌肽+鹅肌肽与组氨酸二肽组合物组大鼠的的丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活力均有所减少和提高，但三元提取物组的差异不显著。与模型组相比，组氨酸二肽组合物高剂量组大鼠的MDA含量和SOD活力分别减少了47.6%和提高了52.8%，组氨酸二肽组大鼠的MDA含量和SOD活力分别减少了36.2%和提高了43.3%，三元提取物对照组的MDA含量和SOD活力分别减少了9.9%和提高了11.3%。由此结果可以看出，与组氨酸二肽或三元提取物相比，组氨酸二肽与三元提取物的组合显著提高了抗脂质氧化效果，且表现出较好的增益效果。
病理学观察表明（图5），空白组大鼠的肝细胞排列紧实，结构完整；模型组小鼠的肝细胞排列疏松、肿胀，存在气球样变性。组合物干预后，大鼠肝脏有不同程度的恢复。
实施例2
本实施例提供了一种组氨酸二肽组合物对肝炎患者的肝脏修复作用的临床试验。
（1）研究对象与治疗方法
按照国际医学组织理事会建立和中华医学会肝病学分会修订的分类标准，丙氨酸氨基转移酶（ALT）≥3参考值上限（ULN），且R[R=（ALT实测值/ALT ULN）/（ALP实测值/ALPULN）]≥5，选取2020年3月至2021年1月于广东医附属医院接受治疗的临床肝细胞损伤型患者138名，随机分为组氨酸二肽组合物治疗组和安慰剂组，每组69人，两组性别比例、平均年龄、平均病程等人口学、基线资料比较均无统计学差异。两组患者均进行常规治疗，另分别给予组氨酸二肽组合物和安慰剂（主要成分：丙氨酸、组氨酸、葡萄糖）进行治疗2个星期，3g/次，2次/d，于早、晚饭后使用温水冲服。
（2）血清指标检测
抽取两组患者治疗前后清晨空腹静脉血5mL，4000r/min离心10min，取上层血清，于-80℃环境中保存待检。
采用全自动生化分析仪对两组患者肝功能指标丙氨酸转氨酶（ALT）和碱性磷酸酶（ALP）水平进行检测。
（3）检测结果
对2组病人进行2个星期的跟踪治疗发现，治疗1个星期后，服用肌肽、葛根提取物和黄芪提取物药剂组患者的ALP和ALT水平明显低于安慰剂组患者，服用药剂组患者的ALP水平比服用前降低了23%，ALT水平降低18%；治疗两个星期后，药剂组患者的ALP和ALT水平基本恢复正常，而安慰剂组患者的ALT和ALP水平依然高于正常水平。
（4）实验结论
上述结果说明本发明的组氨酸二肽组合物能有效恢复患者肝细胞损伤，相对于其他纯中药治疗，本发明药剂具有更优越的治疗效果。
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。
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