噬菌体展示新冠病毒衣壳蛋白及应用
阅读说明：本技术 噬菌体展示新冠病毒衣壳蛋白及应用 (Phage display new coronavirus capsid protein and application ) 是由 白晓康 叶其壮 肖利群 于 2021-08-09 设计创作，主要内容包括：本发明通过噬菌体展示技术,将动物病毒的衣壳蛋白通过融合蛋白的方式展示在细菌病毒(即噬菌体)表面,提供一种安全有效地研究动物病毒衣壳蛋白结构与功能的工具。具体实例是将新冠病毒的衣壳S蛋白的受体结合结构域与M13噬菌体衣壳P9蛋白融合,展示在M13噬菌体表面,并且显示了与其特异抗体的结合能力。本发明的有益效果是可以用无致病性的噬菌体替代有致病性的动物病毒(如当前的新冠病毒),用于检测试剂、诊断方法、疫苗、和治疗药物的研发。(The invention displays the capsid protein of animal virus on the surface of bacterial virus (i.e. bacteriophage) by means of fusion protein through the bacteriophage display technology, and provides a tool for safely and effectively researching the structure and function of the capsid protein of animal virus. A specific example is the fusion of the receptor binding domain of capsid S protein of the novel coronavirus with the capsid P9 protein of M13 bacteriophage, displayed on the surface of M13 bacteriophage and shown to bind to its specific antibody. The invention has the advantages that the non-pathogenic phage can be used for replacing pathogenic animal viruses (such as the current novel coronavirus) and is used for developing detection reagents, diagnostic methods, vaccines and therapeutic drugs.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及用细菌病毒展示动物病毒表面抗原的方法，尤其是展示新冠病毒的RBD受体结合结构域。
背景技术
新冠肺炎（COVID-19）是由新冠病毒（SARS-CoV-2）引起的烈性传染病，目前仍然是非常严峻的全球性公共健康问题。为了掌握病毒的增殖和传播规律、开发快速可靠的检测和诊断方法、开发有效的治疗药物，需要多领域、大范围的科学家同病毒专家的大力协作、携手共进。虽然直接用新冠病毒进行研究测试，具有无可比拟的真实性，但必要的生物安全等级要求限制了很多实验，将大量的科研人员拒之门外。
在新冠病毒的表面，S蛋白（spike glycoprotein，刺突糖蛋白）是主要的衣壳蛋白。新冠病毒通过S蛋白的受体结合结构域（receptor binding domain，RBD）识别并结合宿主细胞表面受体（angiotensin converting enzyme 2，ACE2），介导病毒包膜与宿主细胞膜的融合过程。因而，S蛋白成为中和抗体和疫苗研发的主要靶点。目前，S蛋白和S蛋白的RBD受体结合结构域可以在大肠杆菌或真核细胞中重组表达，作为病毒的替代品。但是重组蛋白的制备需要较大量的人力成本，并且重组后蛋白分子的状态与S蛋白在病毒表面的真实情况会有较大差异，可能造成误导。
噬菌体是细菌的病毒。与动物病毒结构相似，噬菌体颗粒表面也是由衣壳蛋白构成，但噬菌体不感染动物细胞。噬菌体的安全性有多个实例为证。加州大学在2016年使用噬菌体疗法成功治愈了感染鲍曼不动杆菌的病人，并且美国FDA在2019年批准了一个静脉注射噬菌体治疗的临床试验。
M13噬菌体是一种常用的噬菌体，由大约2800多个P8蛋白组成的圆柱形衣壳包围住环状的单链DNA，在噬菌体的两端分别由P3蛋白和P6蛋白、P7蛋白和P9蛋白排布，这些衣壳蛋白不仅保护着噬菌体本身遗传信息的传递，还在噬菌体的组装、感染宿主菌等方面扮演着重要角色。噬菌体展示技术可以用M13噬菌体，将外源蛋白的基因与噬菌体衣壳蛋白（如P3蛋白）的基因融合，通过噬菌体衣壳蛋白，将外源蛋白展示在噬菌体表面。最常见的是用衣壳蛋白P3，也有用衣壳蛋白P7、P8或P9展示外源蛋白的成功案例。经过三十多年的发展，噬菌体展示技术已经广泛用于多肽和蛋白质的展示，用于抗体的淘选，具有操作简单、效率高、成本低等优点。
发明内容
本发明提供了一种将细菌病毒（如M13噬菌体）作为动物病毒（如新冠病毒）的替代物的技术方案。技术方案的原理是细菌病毒和动物病毒的构造相似，都有衣壳蛋白暴露于病毒颗粒表面；通过噬菌体展示技术，可以将动物病毒的衣壳蛋白通过融合蛋白的方式展示在细菌病毒表面。我们通过一个实例验证了该技术方案的可行性。具体的是将新冠病毒的衣壳蛋白（S蛋白）的RBD结构域与M13噬菌体衣壳蛋白（P9蛋白）融合，展示在M13噬菌体表面，并且显示了与其特异抗体的结合能力。
本发明提供的技术方案是如下。
（1）选取动物病毒衣壳蛋白的顺序
该顺序的选取要根据需要展示的抗原表位，和能够展示该抗原表位的三维结构的相对独立完整来决定。通过对动物病毒衣壳蛋白一级结构（氨基酸顺序）的同类蛋白比对和三级结构（冷冻电镜结构和晶体结构）的细致观察分析，选取合适的片段，作为融合蛋白中动物病毒衣壳蛋白的片段顺序。新冠病毒的S蛋白是典型的动物病毒衣壳蛋白，分为S1亚基和S2亚基两个相连的部分，S1部分中又分为N端区域（NTD）和C端区域（CTD）。受体结合结构域（RBD）位于C端区域内。S蛋白的冷冻电镜结构已经公开，可以从蛋白结构数据库（proteindata bank，PDB）中得到，代码为：7e7d和7e7b。本发明的实例选取结构相对独立完整、参与受体结合的受体结合结构域的蛋白顺序，具体为R319-K528。
（2）构建动物病毒衣壳蛋白与噬菌体衣壳蛋白融合的融合蛋白
M13噬菌体的衣壳蛋白有五个，分别是P3、P6、P7、P8 和P9，各有特点。在融合蛋白的构建中，P3常用，P6、P7、P8和P9也有报道。融合的方式上，P3和P8可以在N端和C端融合，P6在C端融合，P7和P9都是在N端融合。本发明的实例是采用P9来构建融合蛋白，是将动物病毒衣壳蛋白顺序放在P9蛋白的N端融合，两者用一个短肽相连。短肽的要求是有较好的亲水性，不参与蛋白的二级结构、长短合适，因此，常用甘氨酸（Gly）与丝氨酸（Ser）的组合，如GGSGG的顺序。实例中，融合蛋白的顺序如SEQ ID NO: 1所示。类似的，P3、P6、P7和P8可以按同样的原理用来构建融合蛋白。
（3）构建表达融合蛋白的噬菌体质粒
融合蛋白的顺序确定后，需要构建能够表达融合蛋白的噬菌体质粒。所述的噬菌体质粒上的两个必须的特征是：第一，有融合蛋白的基因，并能够表达融合蛋白；其次，含有噬菌体复制起点。融合蛋白基因的表达需要相应的启动子，常见的有乳糖启动子（lacpromoter）、T7启动子（T7 promoter）、等。所述噬菌体质粒的结构如图1所示。
（4）产生展示动物病毒衣壳蛋白的噬菌体
融合蛋白是通过噬菌体的衣壳蛋白展示在噬菌体颗粒表面。用构建好的噬菌体质粒转化大肠杆菌，适时诱导表达融合蛋白，加入辅助噬菌体产生展示动物病毒衣壳蛋白的M13噬菌体。所述噬菌体是本发明的一个重要目标产物。
（5）确认噬菌体展示的动物病毒衣壳蛋白的生物活性
最好的方式确认动物病毒衣壳蛋白在噬菌体上展示的效果是功能测试。本发明构建了新冠病毒受体结合结构域与M13衣壳P9蛋白的融合蛋白，其生物活性可以用能与受体结合结构域特异性结合的抗体，采用酶联免疫法来验证。实施例中，实验验证了抗RBD抗体与展示衣壳蛋白受体结合结构域的噬菌体的结合能力，实验结果如图2所示。
衣壳蛋白位于病毒颗粒的表面，是中和抗体的靶点，是开发检测与诊断试剂以及疫苗的靶点。本发明技术方案产生的衣壳蛋白融合蛋白和展示融合蛋白的M13噬菌体，在病毒检测、疫苗研发、或诊断试剂和治疗药物的研发中有广泛的应用前景。
以新冠病毒为例，本发明提供的M13噬菌体受体结合结构域展示系统已经通过实验确认了展示的受体结合结构域具有特异抗体的结合能力，为研究受体结合结构域的结构与功能、受体结合结构域的突变对其结构与功能的影响等，提供了方便。本发明技术方案的一个优点是在动物病毒衣壳蛋白片段基因的两端加上了限制性内切酶的位点，可以快速置换插入噬菌体衣壳蛋白的动物病毒衣壳蛋白片段。新冠状病毒自2019年初爆发以来，病毒在变异。本发明的一个应用是可以快速置换变异病毒的受体结合结构域片段，确定病毒变异对该蛋白片段功能的影响、研发适应变异病毒的对策。同样，本技术方案也适用于研究其他冠状病毒，如导致重症急性呼吸综合征（SARS）、中东呼吸综合症（MERS）的病毒。更进一步，可以适用于其他有类似暴露衣壳蛋白的各种病毒。
表达出的蛋白具有正确的三维结构和预期的生物功能至关重要，通过噬菌体展示得到具有生物活性的重组蛋白也是本发明的一个应用。本发明显示了通过M13噬菌体展示，可以得到具有生物功能的融合蛋白。展示的融合蛋白可以分离纯化，得到有生物活性的融合蛋白，或融合蛋白中的片段。
在病毒检测和诊断试剂开发方面，噬菌体可以展示检测的目标抗原，用该噬菌体替代新冠病毒颗粒作为阳性标本。噬菌体还可以通过化学偶联的方式或融合蛋白的方式引入信号基团或蛋白（如：颜色标记物、荧光基团、化学发光基团、绿色荧光蛋白GFP、等）、或产信号基团或蛋白（如：碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、荧光素酶等）。如此修饰的噬菌体展示的动物病毒衣壳蛋白片段与其受体（如受体结合结构域与ACE2蛋白的结合）或抗体（包括中和抗体）的结合，可以通过检测相应的信号来检测、来定性或定量。
在疫苗开发方面，该噬菌体可以作为抗原，用于在动物体内诱导产生抗体。也可以通过点突变、多点突变等方式改变展示的蛋白片段，优化产生抗体的抗原表位。
在用噬菌体展示技术的抗体筛选中，本发明描述的融合蛋白、含有融合蛋白的噬菌体可以作为抗原，用于淘选特异抗体，淘选中和抗体。筛选出的抗体可以用于研发和生产新冠肺炎的诊断试剂、靶向新冠病毒的药物。
这里列举的仅是可能的一些应用，并不构成对本发明应用的限制。
本发明的最大益处是可以在不受动物病毒感染威胁的实验室条件下，用无害的噬菌体研究动物病毒衣壳蛋白的结构与生物活性。在当前新冠流行的情况下，本发明的有益效果是可以用无致病性的噬菌体替代有致病性的新冠病毒，用于检测试剂和诊断方法的研发，用于治疗药物的研发，达到安全、有效、快速的目的。
附图说明
图1，构建的噬菌体质粒的示意图。所示的融合蛋白为新冠病毒衣壳S蛋白的受体结合结构域（RBD）与M13噬菌体的衣壳P9蛋白的融合。融合蛋白基因的两端分别有限制性内切酶的位点（SacI和KpnI）。该融合蛋白的表达由乳糖启动子（Plac）启动。Ori为噬菌体质粒的复制起点，F1 Ori为噬菌体复制起点。Amp为青霉素抗性基因。
图2，噬菌体与RBD抗体的ELISA结合曲线。实验描述见实施例四。
具体实施方式
本发明是将无致病性的细菌病毒作为致病性的动物病毒的替代物。技术方案将以用M13噬菌体展示新冠病毒的衣壳S蛋白的受体结合结构域为实例，说明所述融合蛋白和噬菌体的制备方法。
实施步骤如下：根据对S蛋白的三维结构分析，选取受体结合结构域的氨基酸序列R319-K528，用于构建融合蛋白。以融合的方式，将此受体结合结构域融合于噬菌体P9蛋白的N端，命名为RBDP9融合蛋白。通过全基因合成的方式构建RBDP9融合蛋白基因，制备可以在大肠杆菌中表达融合蛋白的噬菌体质粒。将噬菌体质粒转化至宿主大肠杆菌，培养转化后的大肠杆菌。辅助噬菌体感染大肠杆菌，收集表面展示有融合蛋白RBDP9的噬菌体颗粒。验证噬菌体颗粒展示的RBDP9融合蛋白的生物活性。
实施例一，噬菌体质粒转化至宿主大肠杆菌
取50 μl E. coli XL1-Blue感受态细胞，冰上融化后加入1 μl 图1 所述噬菌体质粒样品，混匀后冰浴20分钟，42℃水浴热激90秒后继续冰浴2分钟，在混合物中加入0.5mL无抗性LB液体培养基，摇床37℃，在200 rpm 震荡复苏培养1小时后，6000 rpm离心5分钟；去除部分上清后留100 μl混匀沉淀，均匀涂布在含有Amp抗性的LB固体培养基上，在37℃细菌培养箱中倒置培养12～16小时，得到含有噬菌体质粒的宿主菌。
实施例二，辅助噬菌体的感染扩增及诱导表达RBDP9融合蛋白
向对数期的含有图1 所示质粒的菌液中加入辅助噬菌体，37℃感染1小时后，6000rpm离心5分钟弃去上清；将菌体沉淀重悬于含有Amp、Kan抗性的2YT培养基中并加入IPTG，混匀后37℃ 200 rpm过夜震荡诱导培养。
实施例三，噬菌体颗粒的确认
取收集的噬菌体颗粒加入到新制备的处于对数生长期的宿主菌中，以PBS作为对照，37℃感染1小时；取感染过的菌液以及对照涂布在含有Amp抗性的固体培养基上，在37℃细菌培养箱中倒置培养12～16小时，通过噬菌体感染的样品过夜培养后得到的大量菌落确认收集的噬菌体颗粒的情况。
实施例四，噬菌体颗粒展示受体结合结构域的生物活性的验证
对确认无误的噬菌体颗粒使用PBS进行3倍梯度稀释；取各个稀释浓度的噬菌体样品进行包被、封闭；向完成封闭的样品中加入生物素化的能够特异性识别S蛋白受体结合域RBD的抗体，室温80 rpm孵育1小时；弃去完成孵育后的残余液体，经过清洗后加入能够特异性结合生物素的链霉素亲和素偶联辣根过氧化物酶（SA-HRP），室温80 rpm孵育0.5小时；弃去完成孵育后的残余液体，经过清洗后加入SA-HRP对应的显色液，完成显色后加入终止液并读取450 nm处的吸光度，得到与噬菌体颗粒包被浓度对应的作用曲线，如图2所示。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州明药科技有限公司
<120> 噬菌体展示新冠病毒衣壳蛋白及应用
<130> 2021
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 237
<212> PRT
<213> Artificial
<223> Fusion protein
<400> 1
Gly Gly Ser Gly Gly Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala
1 5 10 15
Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn
20 25 30
Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr
35 40 45
Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe
50 55 60
Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg
65 70 75 80
Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys
85 90 95
Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn
100 105 110
Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe
115 120 125
Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile
130 135 140
Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys
145 150 155 160
Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly
165 170 175
Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala
180 185 190
Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Gly Gly Ser Gly Gly Met Ser Val
195 200 205
Leu Val Tyr Ser Phe Ala Ser Phe Val Leu Gly Trp Cys Leu Arg Ser
210 215 220
Gly Ile Thr Tyr Phe Thr Arg Leu Met Glu Thr Ser Ser
225 230 235