具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容容易地了解本申请发明的其他优点及功效。

本发明发明人经过大量实践研究，发现将胚胎干细胞整合HLA-G1片段和/或HLA-G5片段以后，可以使细胞不被CD8⁺T细胞识别，避免CD8⁺T的排斥，还可以抑制NK细胞、抗原递呈细胞等淋巴细胞参与的免疫排斥作用，从而更加高效的抑制同种异体免疫排斥反应，在此基础上完成了本发明。

本发明第一方面提供一种人胚胎干细胞的构建方法，所述构建方法包括：将人胚胎干细胞的基因组中整合外源的编码B2M-HLA-G1融合蛋白的多核苷酸，所述B2M-HLA-G1融合蛋白包括B2M片段和HLA-G1片段，整合获得的人胚胎干细胞不表达游离的B2M蛋白。通过将胚胎干细胞整合HLA-G1片段以后，能够成功表达B2M-HLA-G1融合蛋白，且不表达游离的B2M蛋白(即单独地、未进行融合的B2M蛋白)，B2M-HLA-G1融合蛋白质可以到达细胞膜表面，且该蛋白地表达受到内源性B2M基因启动子调控，从而可以使细胞不被CD8⁺T细胞识别，避免CD8⁺T的排斥，从而可以有效阻止同种异体细胞免疫排斥。

本申请中，所使用的人胚胎干细胞可以是利用未经过体内发育的受精14天以内的人类胚胎分离或者获取的，例如，可以是商用的H9 hESC细胞系。

本发明所提供的构建方法中，所述HLA-G1片段的编码基因可以包括HLA-G1的重链阅读框的编码序列，所述HLA-G1片段可以包括：

a)氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的多肽片段；或，

b)氨基酸序列与SEQ ID No.1具有90％以上序列一致性且具有a)限定的多肽片段的功能的多肽片段。具体的，所述b)中的氨基酸序列具体指：如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)氨基酸而得到的，或者在N-末端和/或C-末端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)氨基酸而得到的，且具有氨基酸如SEQ ID No.1所示的多肽片段的功能的多肽片段。例如，所述HLA-G1片段通常具有完整的α重链结构，与经典型HLA I分子不同，其主要具有免疫抑制的功能(例如，可以与抑制性受体相结合从而可以调控B细胞、T细胞、NK细胞和APC细胞介导的免疫反应等，这些抑制性受体主要包括ILT2/CD85j/LILRB1，ILT4/CD85d/LILRB2，和KIR2DL4/CD158d等)。所述b)中的氨基酸序列可与SEQ ID No.1具有90％、93％、95％、97％、或99％以上的一致性(Sequence identity)。所述HLA-G1片段通常来源于人。

本申请中，序列一致性(sequence identity)指参与对比的序列中相同残基的百分比。可采用本领域周知的计算软件计算两条或多条目的序列的序列一致性，这些软件可获自如NCBI。

本发明所提供的构建方法中，所述第一B2M片段可以包括：

c)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的多肽片段；或，

d)氨基酸序列与SEQ ID No.2具有90％以上序列一致性且具有c)限定的多肽片段的功能的多肽片段。具体的，所述d)中的氨基酸序列具体指：如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)氨基酸而得到的，或者在N-末端和/或C-末端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)氨基酸而得到的，且具有氨基酸如SEQ ID No.2所示的多肽片段的功能的多肽片段。例如，所述第一B2M片段通常具有β折叠的片状结构，其主要具有与主要组织相容性复合物(MHC)I类重链通过非共价键结合的功能。所述d)中的氨基酸序列可与SEQ ID No.2具有90％、93％、95％、97％、或99％以上的一致性(Sequence identity)。所述第一B2M片段通常来源于人。

本发明所提供的构建方法中，所述B2M-HLA-G1融合蛋白还可以包括第一柔性连接肽段，所述第一柔性连接肽段通常位于HLA-G1片段和第一B2M片段之间。所述第一柔性连接肽段通常可以为一段长度合适的由甘氨酸(G)、丝氨酸(S)和/或丙氨酸(A)构成的柔性多肽，从而使相邻的蛋白质结构域可相对于彼此自由移动，例如，所述第一柔性连接肽段的氨基酸序列可以包括如(GS)n、(GGS)n、(GGSG)n、(GGGS)nA、(GGGGS)nA、(GGGGA)nA、(GGGGG)nA等序列，其中，n选自1-10之间的整数。在本发明一具体实施例中，所述第一柔性连接肽段的氨基酸序列的长度可以为5-26。在本发明一具体实施例中，所述第一柔性连接肽段可以包括氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的多肽片段。在本发明另一具体实施例中，所述B2M-HLA-G1融合蛋白自N端至C端依次包括第一B2M片段和HLA-G1片段，所述B2M-HLA-G1融合蛋白包括氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的多肽片段。

GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer(SEQ IDNO.3)

本发明所提供的构建方法中，将人胚胎干细胞的基因组中整合外源的编码B2M-HLA-G1融合蛋白的多核苷酸的方法具体可以包括：将HLA-G1片段的编码基因与人胚胎干细胞中内源性的B2M基因融合。所述内源性的B2M基因的具体信息可以参照chr15:44,715,509-44,717,171GRCh38/hg38 human assembly。在本发明一具体实施例中，可以将HLA-G1片段的编码基因替换位于内源B2M基因外显子3中的终止密码子。

本发明所提供的构建方法中，所述构建方法还可以包括：将人胚胎干细胞的基因组中整合外源的编码B2M-HLA-G5融合蛋白的多核苷酸，所述B2M-HLA-G5融合蛋白包括第二B2M片段和HLA-G5片段。构建获得的人胚胎干细胞可以成功表达分泌型B2M-HLA-G5融合蛋白，从而可以在有效避免CD8+T排斥的同时，还可以抑制NK细胞，抗原递呈细胞等淋巴细胞参与的免疫排斥作用，从而更加高效的抑制同种异体免疫排斥反应。

本发明所提供的构建方法中，所述第二B2M片段可以包括：

e)氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的多肽片段；或，

f)氨基酸序列与SEQ ID No.5具有90％以上序列一致性且具有e)限定的多肽片段的功能的多肽片段。具体的，所述f)中的氨基酸序列具体指：如SEQ ID No.5所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)氨基酸而得到的，或者在N-末端和/或C-末端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)氨基酸而得到的，且具有氨基酸如SEQ ID No.5所示的多肽片段的功能的多肽片段。例如，所述第二B2M片段通常具有β折叠的片状结构，其主要具有与主要组织相容性复合物(MHC)I类重链通过非共价键结合的功能。所述f)中的氨基酸序列可与SEQ ID No.5具有90％、93％、95％、97％、或99％以上的一致性(Sequence identity)。所述第二B2M片段通常来源于人。

本发明所提供的构建方法中，所述HLA-G5片段包括：

g)氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的多肽片段；或，

h)氨基酸序列与SEQ ID No.6具有90％以上序列一致性且具有g)限定的多肽片段的功能的多肽片段。具体的，所述h)中的氨基酸序列具体指：如SEQ ID No.6所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)氨基酸而得到的，或者在N-末端和/或C-末端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、1-3个、1个、2个、或3个)氨基酸而得到的，且具有氨基酸如SEQ ID No.6所示的多肽片段的功能的多肽片段。例如，所述HLA-G5片段通常具有完整的α重链胞外结构，与经典型HLA I分子不同，其主要具有免疫抑制的功能(例如，可以与抑制性受体相结合从而可以调控B细胞、T细胞、NK细胞和APC细胞介导的免疫反应等，这些抑制性受体主要包括ILT2/CD85j/LILRB1，ILT4/CD85d/LILRB2，和KIR2DL4/CD158d等)。所述h)中的氨基酸序列可与SEQ ID No.6具有90％、93％、95％、97％、或99％以上的一致性(Sequence identity)。所述HLA-G5片段通常来源于人。

本发明所提供的构建方法中，所述B2M-HLA-G5融合蛋白还可以包括第二柔性连接肽段，所述第二柔性连接肽段通常位于HLA-G5片段和第二B2M片段之间。所述第二柔性连接肽段通常可以为一段长度合适的由甘氨酸(G)、丝氨酸(S)和/或丙氨酸(A)构成的柔性多肽，从而使相邻的蛋白质结构域可相对于彼此自由移动，例如，所述第二柔性连接肽段的氨基酸序列可以包括如(GS)n、(GGS)n、(GGSG)n、(GGGS)nA、(GGGGS)nA、(GGGGA)nA、(GGGGG)nA等序列，其中，n选自1-10之间的整数。在本发明一具体实施例中，所述第二柔性连接肽段的氨基酸序列的长度可以为5-26。在本发明一具体实施例中，所述第二柔性连接肽段可以包括氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的多肽片段。在本发明另一具体实施例中，所述B2M-HLA-G5融合蛋白自N端至C端依次包括第二B2M片段和HLA-G5片段，所述B2M-HLA-G5融合蛋白包括氨基酸序列如SEQ ID No.8所示的多肽片段。

GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer(SEQ IDNO.7)

本发明所提供的构建方法中，将人胚胎干细胞的基因组中整合外源的编码B2M-HLA-G5融合蛋白的多核苷酸的方法具体可以包括：通过慢病毒载体将编码B2M-HLA-G5融合蛋白的多核苷酸整合入人胚胎干细胞的基因组，使其可以表达B2M-HLA-G5融合蛋白。

本发明第二方面提供一种人胚胎干细胞，由本发明第一方面所提供的人胚胎干细胞的构建方法构建获得。

本发明所提供的人胚胎干细胞的构建方法可以构建成功地在人类胚胎干细胞地两个内源性B2M位点整合了HLA-G1片段序列，并且通过慢病毒载体将编码B2M-HLA-G5融合蛋白的序列整合入了人胚胎干细胞的基因组中。构建获得的人胚胎干细胞细胞系内源性HLA-A，B，C蛋白无法到达细胞膜表面，因此该细胞系不能被CD8⁺T细胞识别，可以有效阻止同种异体细胞免疫排斥，且胚胎干细胞的多能性以及增殖的能力并未受到影响，依然可以作为未来细胞移植的目的细胞来源。此外，细胞系可以成功表达B2M-HLA-G1融合蛋白，该蛋白质可以到达细胞膜表面，且该蛋白地表达受到内源性B2M基因启动子调控。此外，能够进一步成功表达分泌型B2M-HLA-G5融合蛋白的细胞系可以在有效避免CD8⁺T排斥的同时，还可以抑制NK细胞，抗原递呈细胞等淋巴细胞参与的免疫排斥作用，从而更加高效的抑制同种异体免疫排斥反应。

下面通过实施例对本申请的发明予以进一步说明，但并不因此而限制本申请的范围。

实施例1

通过双gRNA基因编辑系统构建双等位B2M基因缺失的hESCs细胞系

双gRNA基因编辑策略能够高效、特异性地敲除双等位基因，并且被切断的DNA主要通过直接末端连接进行修复而不会引入核苷酸地插入或缺失(Liu et al.,2016)。为了敲除人类胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)中的B2M基因，设计两个相邻的gRNA，一个位于B2M基因外显子2的上游，另一个位于外显子3的下游(图1A和图1B)，具体序列分别如表1中的B2M gRNA 1、B2M gRNA 2所示。绝大部分成熟的B2M蛋白由该靶向序列编码。

表1

将两个gRNA载体(Addgene#41824)，CAG启动子驱动的Cas9-P2A-GFP载体(Addgene#44719)与瞬时表达嘌呤霉素的载体(SEQ ID NO.14)一起共同电转到H9 hESC(由美国威斯康星大学张素春教授实验室提供)中。经过嘌呤霉素筛选后，挑选抗性细胞克隆并扩增以进行基因组DNA PCR分析，在被挑选出来的克隆中有28.6％(2/7)是双等位基因DNA缺失(B2M^nullhESCs)，而选择的克隆中有57.1％(4/7)是单等位基因DNA缺失(图1C)。为了检验这两条gRNA诱发的潜在脱靶作用，使用Sanger测序分析了由张锋教授实验室设计的在线程序(http://crispr.mit.edu/)预测的潜在脱靶位点的DNA完整性。结果显示，B2MnullhESC中每条gRNA的五个主要可疑脱靶位点DNA均保持完整(图2A)。

实施例2

构建表达HLA-G1，HLA-G5 hESCs细胞系

设计了两种表达HLA-G蛋白质的hESCs细胞系(图1A)。在B2MmHLAG hESCs中，HLA-G1重链通过柔性(G₄S)₄连接肽段与内源性B2M蛋白质融合。为了用编码HLA-G1重链阅读框和柔性(G₄S)₄连接肽段的序列替换位于内源B2M基因外显子3中的终止密码子，设计跨越B2M终止密码子的B2M gRNA3(参见表1)，这样成功实现敲入的基因位点将不能被B2M gRNA3结合，从而提高了建立纯合子敲入细胞系的效率。将CAG启动子驱动的Cas9载体(同实施例1)，重组供体(SEQ ID No.9)，B2M gRNA3载体(Addgene#41824)与瞬时表达嘌呤霉素载体(同实施例1)一起共同电转到H9 hESC中。通过这种方法，(G₄S)₄-HLA-G1将连接到B2M蛋白的末端，并在B2M启动子的调控下与内源B2M一起表达(图1D)。药物筛选后，挑取存活细胞克隆并扩增以进行基因组DNA PCR分析。获得了5个抗嘌呤霉素的细胞克隆，基因组PCR分析显示挑选出来的细胞克隆中，20.0％(1/5)为双拷贝敲入(B2M^mHLAG)，40.0％(2/5)为单拷贝敲入(图1E)。通过Southern Blot实验进一步分析纯合子敲入克隆，结果显示在该细胞克隆中，(G₄S)₄-HLA-G1仅仅被整合进了预定的B2M基因位置(图1F)。

为了获得另一种同时表达膜蛋白HLA-G1与分泌蛋白HLA-G5的hESCs，B2M^{m/ sHLAG}hESCs，我们将无终止密码子的B2M CDS序列，(G₄S)₄柔性连接肽序列和HLA-G5重链编码序列整合到具有嘌呤霉素抗性的慢病毒载体(pLVX-CAG-Puro质粒，插入位点为BamHI、MluI)中，使用该病毒感染B2M^mHLAGhESCs细胞系，然后进行药物筛选和抗药性hESCs的扩增(图1A)。此外，与B2M^nullhESCs中观察到的情况类似，B2M^mHLAGhESCs中的5个B2M gRNA3疑似脱靶位点DNA保持完整，说明基因编辑过程中没有脱靶现象产生(图2B)。

HLA-G1重链序列(HLA-G1片段)的氨基酸序列：

GSHSMRYFSAAVSRPGRGEPRFIAMGYVDDTQFVRFDSDSACPRMEPRAPWVEQEGPEYWEEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRGYYNQSEASSHTLQWMIGCDLGSDGRLLRGYEQYAYDGKDYLALNEDLRSWTAADTAAQISKRKCEAANVAEQRRAYLEGTCVEWLHRYLENGKEMLQRADPPKTHVTHHPVFDYEATLRCWALGFYPAEIILTWQRDGEDQTQDVELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLMLRWKQSSLPTIPIMGIVAGLVVLAAVVTGAAVAAVLWRKKSSD*(SEQ ID No.1)

内源性B2M蛋白质(第一B2M片段)的氨基酸序列：

MSRSVALAVLALLSLSGLEAIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM(SEQ ID No.2)

柔性(G₄S)₄连接肽段(第一柔性连接肽段)的氨基酸序列：

GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer(SEQ IDNo.3)

B2M-HLA-G1融合蛋白的氨基酸序列：

MSRSVALAVLALLSLSGLEAIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSMRYFSAAVSRPGRGEPRFIAMGYVDDTQFVRFDSDSACPRMEPRAPWVEQEGPEYWEEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRGYYNQSEASSHTLQWMIGCDLGSDGRLLRGYEQYAYDGKDYLALNEDLRSWTAADTAAQISKRKCEAANVAEQRRAYLEGTCVEWLHRYLENGKEMLQRADPPKTHVTHHPVFDYEATLRCWALGFYPAEIILTWQRDGEDQTQDVELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLMLRWKQSSLPTIPIMGIVAGLVVLAAVVTGAAVAAVLWRKKSSD*(SEQ ID No.4)

B2M-HLA-G1融合蛋白的编码序列如下：

其中，内源性B2M基因外显子DNA序列加粗，内含子DNA序列加下划线

HLA-G5重链序列(第二B2M片段)的氨基酸序列：

GSHSMRYFSAAVSRPGRGEPRFIAMGYVDDTQFVRFDSDSACPRMEPRAPWVEQEGPEYWEEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRGYYNQSEASSHTLQWMIGCDLGSDGRLLRGYEQYAYDGKDYLALNEDLRSWTAADTAAQISKRKCEAANVAEQRRAYLEGTCVEWLHRYLENGKEMLQRADPPKTHVTHHPVFDYEATLRCWALGFYPAEIILTWQRDGEDQTQDVELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLMLRWSKEGDGGIMSVRESRSLSEDL*(SEQ ID No.6)

第二B2M片段的氨基酸序列：

MSRSVALAVLALLSLSGLEAIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM(SEQ ID No.5)

柔性(G₄S)₄连接肽段(第二柔性连接肽段)的氨基酸序列：

GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer(SEQ IDNo.7)

B2M-HLA-G5融合蛋白的氨基酸序列：

MSRSVALAVLALLSLSGLEAIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSHSMRYFSAAVSRPGRGEPRFIAMGYVDDTQFVRFDSDSACPRMEPRAPWVEQEGPEYWEEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRGYYNQSEASSHTLQWMIGCDLGSDGRLLRGYEQYAYDGKDYLALNEDLRSWTAADTAAQISKRKCEAANVAEQRRAYLEGTCVEWLHRYLENGKEMLQRADPPKTHVTHHPVFDYEATLRCWALGFYPAEIILTWQRDGEDQTQDVELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLMLRWSKEGDGGIMSVRESRSLSEDL*(SEQ ID No.8)

B2M-HLA-G5融合蛋白的编码序列：

ATGTCTCGCtccgtggccttagctgtgctcgcgctactctctctttctggcctggaggctatccagcg tactccaaagattcaggtttactcacgtcatccagcagagaatggaaagtcaaatttcctgaattgctatgtgtct gggtttcatccatccgacattgaagttgacttactgaagaatggagagagaattgaaaaagtggagcattcagact tgtctttcagcaaggactggtctttctatctcttgtactacactgaattcacccccactgaaaaagatgagtatgc ctgccgtgtgaaccatgtgactttgtcacagcccaagATAGTTAAGTGGGATCGAGACATGGGTGGAGGTGGAAGTGGTGGAGGTGGAAGTGGTGGAGGTGGAAGTGGTGGAGGTGGaagtGGCTCCCACTCCATGAGGTATttcagcgccgccgtgtcccggcccggccgcggggagccccgcttcatcgccatgggctacgtggacgacacgcagttcgtgcggttcgacagcgactcggcgtgtccgaggatggagccgcgggcgccgtgggtggagcaggaggggccggagtattgggaagaggagacacggaacaccaaggcccacgcacagactgacagaatgaacctgcagaccctgcgcggctactacaaccagagcgaggccagttctcacaccctccagtggatgattggctgcgacctggggtccgacggacgcctcctccgcgggtatgaacagtatgcctacgatggcaaggattacctcgccctgaacgaggacctgcgctcctggaccgcagcggacactgcggctcagatctccaagcgcaagtgtgaggcggccaatgtggctgaacaaaggagagcctacctggagggcacgtgcgtggagtggctccacagatacctggagaacgggaaggagatgctgcagcgcgcggacccccccaagacacacgtgacccaccaccctgtctttgactatgaggccaccctgaggtgctgggccctgggcttctaccctgcggagatcatactgacctggcagcgggatggggaggaccagacccaggacgtggagctcgtggagaccaggcctgcaggggatggaaccttccagaagtgggcagctgtggtggtgccttctggagaggagcagagatacacgtgccatgtgcagcatgaggggctgccggagcccctcatgctgagatggagtaaggagggagatggaggcatcatgtctgttagggaaagcaggagcctctctgaagacCTTTAA(SEQ ID No.10)

实施例3

基因修饰细胞系中HLA I蛋白表达情况检测

为了研究β2m和HLA I类蛋白质在野生型(WT)，B2M^null，B2M^mHLAG和B2M^m/sHLAGhESCs细胞系中的表达情况，进行Western Blot和流式细胞分析(FACS)实验。进行流式细胞实验之前，向hESCs细胞培养液中加入IFN-γ至终浓度25ng/ml，培养48小时后，进行流式细胞实验。IFN-γ刺激情况下，野生型，B2M^mHLAG和B2M^m/sHLAGhESCs在加入IFN-γ处理后，细胞中β2m蛋白质在细胞膜表面的表达显著增加(图3A)，证明HLA-G1在B2M基因中的整合不会影响内源性B2M的表达。然而，即使在IFN-γ刺激的情况下，在B2M^nullhESCs中也无法检测到β2m蛋白的细胞膜表面表达(图3A)。因此表明，已经成功地通过双gRNA基因编辑策略敲除了B2M^nullhESCs中的B2M基因。另外，由于将HLA-G1重链阅读框与内源性B2M基因融合在一起，因此B2M^mHLAG和B2M^m/sHLAG细胞系中的HLA-G1表达水平也应该受到IFN-γ的影响。在IFN-γ存在的情况下，B2M^mHLAG和B2M^m/sHLAG细胞系中HLA-G1的细胞膜表面表达量增加，而在无IFN-γ刺激的条件下，B2M^mHLAG和B2M^m/sHLAG细胞系中HLA-G的表达水平均比较低(图3A)。然而，在WT和B2M^nullhESCs中均未检测到HLA-G的细胞膜表面表达(图3A)。至于经典型HLA I分子的表达情况，即便在IFN-γ刺激的情况下，在B2M^null，B2M^mHLAG和B2M^m/sHLAGhESCs的细胞膜表面未检测到HLA-A，-B或-C(图3A)。表明与野生型hESCs相比，这些细胞中没有可供经典型HLA I重链连接的游离β2m蛋白，而在B2M^mHLAG和B2M^m/sHLAGhESCs中，内源B2M基因位点仅表达B2M-HLA-G1融合蛋白。

对于cell lysate组，WT，B2M^mHLAGB2M^m/sHLAGhESC在RIPA⁺缓冲液中裂解，收集裂解产物用于Western Blot。对于Medium组，将WT，B2M^mHLAGB2M^m/sHLAGhESC培养至长满孔板，吸弃培养基，加入新鲜的DMEM/F12。24小时后，收集每组的上清液，加入1×loading buffer，加入β-巯基乙醇使蛋白质变性，用于Western Blot，检测HLA-G5的抗体为5A6G7(Abcam，ab76869)。Western blot进一步证实B2M^m/sHLAGhESCs表达分泌型蛋白质HLA-G5，而WT或B2M^mHLAGhESCs中没有HLA-G5蛋白表达或分泌(图3B)。

实施例4

表达HLA-G1，HLA-G5 hESCs细胞系具有低免疫原性

进一步研究B2M^null，B2M^mHLAG和B2M^m/sHLAGhESCs细胞系的同种免疫原性。已有研究结果表示，未分化的hESCs与PBMC共培养时不能诱发PBMC增殖(Li et al.,2004；Riolobos etal.,2013)。因此，本实施例中参照Lian et al.,2013中的方法将WT，B2M^null，B2M^mHLAG和B2M^{m /sHLAG}hESCs定向分化为心肌细胞，具体方法如下：

1.在消化前一个小时向hESCs培养液中加入Y27632至终浓度10μM。取提前准备好预备接种hESCs细胞的滋养层MEF，吸弃6孔板中的MEF培养液，然后用2ml的DMEM/F12清洗一次，吸弃DMEM/F12，然后加入2ml含有终浓度为10μM的Y27632和bFGF(4ng/ml)的hESCs培养液，放入培养箱中待用。

2.吸弃含Y27632的hESCs培养液，加入1ml 0.05％的胰酶，吸弃胰酶后，再加入1ml37℃水浴锅预热过的0.05％胰酶，放入37℃培养箱消化3min，吸弃胰酶，放入37℃培养箱继续消化3min，显微镜下观察hESCs克隆边缘开始出现游离的单个细胞时，停止消化。

3.用5ml的DMEM/F12将细胞吹起，使用移液器反复吹打细胞，将消化后的克隆尽可能地都吹成单细胞，将细胞悬液转移到15ml离心管中。

4.将离心管800rpm离心30s，细胞团块留在离心管底部，将单细胞悬液转移到一个新的15ml离心管中，2500rpm离心1.5min。

5.吸弃上清液，加入1ml hESCs培养液重悬细胞，细胞计数，此时大约每个6孔板孔可以收到1-1.5百万细胞，补加hESCs培养液至10ml，2500rpm离心1.5min。

6.将细胞加入到准备好的6孔板中，依次向各个孔中加入1，1.5，2.0，2.5，3million细胞。放入37℃培养箱中继续培养。

7.按照培养hESCs的方案正常换液3天。

8.吸弃旧培养基，加入含有CHIR99021(终浓度12μM)的RPMI/B-27withoutinsulin溶液，每孔4ml。

9. 24小时后，吸弃旧培养基，加入RPMI/B-27without insulin溶液，每孔4ml。

10. 48小时后，从每个孔中吸出2ml培养液，补上等体积新RPMI/B-27withoutinsulin培养液，加入IWP2至终浓度5μM。吸弃孔中剩余的培养基，加入配好的培养基。

11. 2天后，吸弃旧培养基，加入新的RPMI/B-27without insulin培养液，每孔4ml。

12. 2天后，吸弃旧培养基，加入新的RPMI/B-27培养液，每孔4ml。以后每3天换一次液。大概开始分化后5天后，可以看到跳动的心肌细胞。

针对心肌特异性基因的qPCR检验和针对TNNT2的染色结果都表明，以上所有细胞系均具有高效分化为心肌细胞的能力(图4B和6C)。

同时，使用IFN-γ对心肌细胞进行刺激的具体方法如下：混合培养开始之前，向心肌细胞培养液中加入IFN-γ至终浓度25ng/ml，培养48小时后，收集心肌细胞进行混合培养。仅B2M^mHLAG和B2M^m/sHLAGhESCs分化的心肌细胞表现出在IFN-γ刺激下的HLA-G1表达量升高，同时缺失位于细胞膜表面的经典型HLA I类分子表达，与未分化的hESCs相似(图4A)。

从健康志愿者处收集到的外周血单个核细胞(PBMC)进行了HLA-A，-B，-C配型检测(n＝4)。然后，将供体#01，#02，#03来源的PBMC与分化的心肌细胞共培养，以进行基于羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)的细胞增殖检测。在混合淋巴细胞反应(MLR)实验中，PBMC在与HLA I不匹配的WT心肌细胞以及PHA(Phytohemagglutinin-L，invitrogen，00-4977)(阳性对照)共培养时，出现增殖现象，而PBMC与B2M^null，B2M^mHLAG和B2M^m/sHLAG分化的心肌细胞共培养时，其增殖现象明显减弱(图5A)，共培养实验方案具体如下：

1.取3.5x10⁶分化15天以上的心肌细胞(部分心肌细胞进行此步骤前，体外培养过程中加入IFN-γ处理48小时，最终MLR实验中作为+IFN-γ组的靶细胞，MLR实验即图5A所示实验中，+IFN-γ组的心肌细胞进行了IFN-γ处理，no IFN-γ组的心肌细胞，未进行相关处理)，加入胰蛋白酶消化3min，加入等体积RPMI-5中和胰蛋白酶，移液管吹打成单细胞，2500rpm离心1.5min。

2.吸弃上清后加入5ml RPMI-5培养液重悬细胞，离心管缠上封口膜后放入X射线辐照仪中进行辐照，辐照剂量为20Gy。

3.辐照后的细胞用5ml RPMI清洗两次，每次洗完后2500rpm离心1.5min。

4.使用1ml RPMI-5重悬心肌细胞，计数，加入RPMI-5将细胞密度调整为1×10⁶cells/ml备用。

5.300g，10min离心收集好的PBMC，使用PBS/0.1％HSA重悬PBMC，将细胞密度调整为1-10×10⁶cells/ml。

6.在避光条件下，将CFSE溶液用PBS稀释成6μM终浓度。

7.向PBMC溶液中加入等体积CFSE溶液，混匀后避光放入37℃培养箱，孵育10min。

8.孵育结束后，向PBMC溶液中加入6倍体积的4℃预冷的RPMI-1640/10％HSA溶液，混匀后室温静置5min。

9.21℃800g离心15min。

10.弃上清，使用RPMI-5重悬PBMC，将细胞密度调整为1×10⁶cells/ml。

11.将PBMC混匀后，加入到圆底96孔板孔中，每孔加100μl。

12.将辐照过的心肌细胞加入到已加入PBMC的96孔板孔内，每孔加100μl，此时靶细胞与效应细胞的比例为1：1。混匀孔内细胞。阳性对照组的孔内加入1μg/ml终浓度的PHA。

13.将96孔板放入37℃培养箱内，培养7天。

14.培养结束后，收集96孔板孔内的细胞，每孔细胞加入1ml PBS混匀，300g离心10min。

15.吸弃上清，加入100μl流式细胞检测固定液重悬细胞，加入对应浓度的HumanFc Block抗体冰上孵育10min，加入对应浓度的anti-human CD45抗体，冰上孵育30min。

16.加入2ml PBS重悬细胞，300g离心10min。

17.吸弃上清液，加入500μl PBS重悬细胞，流式细胞仪检测PBMC增殖情况。

进一步进行ELISA实验，以检测与WT，B2M^null，B2M^mHLAG和B2M^m/sHLAG心肌细胞体外共培养48小时后PBMC(供体#01，#02，#04)的IFN-γ分泌情况。如图5B所示，WT心肌细胞刺激PBMC大量分泌IFN-γ，尤其是在测定IFN-γ之前，用IFN-γ刺激WT心肌48h时的情况下，当PBMC与B2M^null，B2M^mHLAG和B2M^m/sHLAG心肌细胞共培养时，几乎无法检测到分泌的IFN-γ。

由于HLA-G是表达在NK细胞上的LILRB1和KIR2DL4抑制型受体的配体，所以HLA-G表达应该可以抑制NK的活化。将NK-92细胞与WT，B2M^null，B2M^mHLAG和B2M^m/sHLAGhESCs孵育，以评估IFN-γ的释放。结果显示，B2M^nullhESCs可以诱发最大量的IFN-γ释放(图5C)，表明细胞表面缺失HLA I类分子会引起NK细胞攻击。与B2M^mHLAG和B2M^m/sHLAGhESCs共培养的NK-92细胞明显减少了IFN-γ的分泌，而同时表达HLA-G1和HLA-G5的B2M^m/sHLAGhESCs诱发的IFN-γ释放量甚至低于B2M^mHLAGhESCs的结果(图5C)，这些结果证明HLA-G表达可抑制NK细胞活化。

由于HLA-G5是可分泌的蛋白质，所以进一步研究B2M^m/sHLAGhESCs来源的条件培养基的免疫抑制特性。将B2M^m/sHLAG细胞传代后收集，使用RPMI-1640重悬后调整细胞密度为10⁷cells/ml，37℃培养24小时，然后收集来自B2M^m/sHLAGhESCs的上清液作为条件培养基，并将NK-92细胞，WT hESCs分别在RPMI-1640或B2M^m/sHLAGhESCs条件培养基中共培养，以评估在各自环境中IFN-γ的释放。实验结果显示，B2M^m/sHLAGhESCs条件培养基中的IFN-γ浓度要低得多(图5D)，这表明B2M^m/sHLAGhESCs分泌的HLA-G5可溶性蛋白质可抑制NK细胞介导的IFN-γ分泌。

综上所述，HLA I类分子缺失细胞诱发的同种异体MLR反应减弱，这些结果还表明，表达HLA-G蛋白质的细胞在体外实验中表现出低免疫原性。

使用体内模型检验PBMCs介导的针对B2M^null，B2M^mHLAG，B2M^m/sHLAG细胞的同种异体免疫反应。将WT和基因编辑过的hESCs(WT和B2M^null，B2M^mHLAG和B2M^m/sHLAGhESCs)注射到M-NSG小鼠皮下以形成畸胎瘤(M-NSG小鼠购买自上海南方模式生物科技股份有限公司)。将人PBMC与由野生型H9 ESC分化得来的拟胚体共培养14天。然后，通过尾静脉注射将被H9 ESC抗原激活过的同种异体PBMC转移进小鼠体内，具体方案如下：预激活的3.4×10⁶PBMCs使用100μl PBS重悬，使用胰岛素针将细胞悬液通过尾静脉注射到每只小鼠体内，给对照组小鼠注射等体积PBS。20天后，处死小鼠并收集畸胎瘤用于免疫染色(图6A)。免疫荧光染色结果分析表明，浸润到由B2M^null，B2M^mHLAG和B2M^m/sHLAGhESC分化产生畸胎瘤的人类T细胞数量相比起野生型组大大减少(图6B，图6C)。针对畸胎瘤内人IL-2的qPCR分析反映了相同的结论(图6D)，表明B2M^null，B2M^mHLAG和B2M^m/sHLAGhESCs分化产生的畸胎瘤受到保护，免受同种异体T细胞介导的免疫排斥。然而，尽管在野生型，B2M^mHLAG和B2M^m/sHLAGhESC来源的畸胎瘤中检测到很少的NK细胞浸润，但在源自B2M^nullhESC的畸胎瘤中却检测到显着增强的NK细胞浸润(图6B，图6C)。这些结果表明，B2M^nullhESC来源的畸胎瘤细胞膜表面HLAI分子表达的丧失引发了NK细胞的攻击。但是，B2M^mHLAG和B2M^m/sHLAG来源的细胞畸胎瘤表达的HLA-G蛋白有效地阻断了同种异体NK细胞介导的排斥。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

序列表

<110> 同济大学

<120> 一种人胚胎干细胞的构建方法

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 314

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Gly

1 5 10 15

Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln

20 25 30

Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ser Ala Cys Pro Arg Met Glu Pro Arg

35 40 45

Ala Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Glu Thr

50 55 60

Arg Asn Thr Lys Ala His Ala Gln Thr Asp Arg Met Asn Leu Gln Thr

65 70 75 80

Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Ser Ser His Thr Leu Gln

85 90 95

Trp Met Ile Gly Cys Asp Leu Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly

100 105 110

Tyr Glu Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Ala Leu Asn Glu

115 120 125

Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Lys

130 135 140

Arg Lys Cys Glu Ala Ala Asn Val Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr Leu

145 150 155 160

Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu His Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys

165 170 175

Glu Met Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His

180 185 190

Pro Val Phe Asp Tyr Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe

195 200 205

Tyr Pro Ala Glu Ile Ile Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln

210 215 220

Thr Gln Asp Val Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr

225 230 235 240

Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg

245 250 255

Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Met Leu

260 265 270

Arg Trp Lys Gln Ser Ser Leu Pro Thr Ile Pro Ile Met Gly Ile Val

275 280 285

Ala Gly Leu Val Val Leu Ala Ala Val Val Thr Gly Ala Ala Val Ala

290 295 300

Ala Val Leu Trp Arg Lys Lys Ser Ser Asp

305 310

<210> 2

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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1 5 10 15

Gly Leu Glu Ala Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg

20 25 30

His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser

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50 55 60

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65 70 75 80

Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp

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115

<210> 3

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 4

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser

1 5 10 15

Gly Leu Glu Ala Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg

20 25 30

His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser

35 40 45

Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu

50 55 60

Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp

65 70 75 80

Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp

85 90 95

Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile

100 105 110

Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser His Ser Met

130 135 140

Arg Tyr Phe Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg

145 150 155 160

Phe Ile Ala Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp

165 170 175

Ser Asp Ser Ala Cys Pro Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Val Glu

180 185 190

Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Glu Thr Arg Asn Thr Lys Ala

195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

Asp Leu Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr Glu Gln Tyr Ala

245 250 255

Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Ala Leu Asn Glu Asp Leu Arg Ser Trp

260 265 270

Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Lys Arg Lys Cys Glu Ala

275 280 285

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405 410 415

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<210> 5

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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100 105 110

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115

<210> 6

<211> 295

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Gly

1 5 10 15

Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln

20 25 30

Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ser Ala Cys Pro Arg Met Glu Pro Arg

35 40 45

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50 55 60

Arg Asn Thr Lys Ala His Ala Gln Thr Asp Arg Met Asn Leu Gln Thr

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Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Ser Ser His Thr Leu Gln

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Trp Met Ile Gly Cys Asp Leu Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly

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<210> 7

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

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1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 8

<211> 434

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser

1 5 10 15

Gly Leu Glu Ala Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg

20 25 30

His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser

35 40 45

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Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp

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Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp

85 90 95

Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile

100 105 110

Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser His Ser Met

130 135 140

Arg Tyr Phe Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg

145 150 155 160

Phe Ile Ala Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp

165 170 175

Ser Asp Ser Ala Cys Pro Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Val Glu

180 185 190

Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Glu Thr Arg Asn Thr Lys Ala

195 200 205

His Ala Gln Thr Asp Arg Met Asn Leu Gln Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr

210 215 220

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Asp Leu Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr Glu Gln Tyr Ala

245 250 255

Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Ala Leu Asn Glu Asp Leu Arg Ser Trp

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Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Lys Arg Lys Cys Glu Ala

275 280 285

Ala Asn Val Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val

290 295 300

Glu Trp Leu His Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Met Leu Gln Arg

305 310 315 320

Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro Val Phe Asp Tyr

325 330 335

Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile

340 345 350

Ile Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Val Glu

355 360 365

Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala

370 375 380

Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val

385 390 395 400

Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Met Leu Arg Trp Ser Lys Glu

405 410 415

Gly Asp Gly Gly Ile Met Ser Val Arg Glu Ser Arg Ser Leu Ser Glu

420 425 430

Asp Leu

<210> 9

<211> 5798

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgtctcgct ccgtggcctt agctgtgctc gcgctactct ctctttctgg cctggaggct 60

atccagcgtg agtctctcct accctcccgc tctggtcctt cctctcccgc tctgcaccct 120

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agggcttttg cgggagcgca tgccttttgg ctgtaattcg tgcatttttt tttaagaaaa 1020

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ttgcatttaa tttgaataca atttatttac aacataaagg ataatgtata tatcaccacc 1740

attactggta tttgctggtt atgttagatg tcattttaaa aaataacaat ctgatattta 1800

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atcatgtacc ctgaatataa gtgtatttaa aagaatttta tacacatata tttagtgtca 2460

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

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<210> 12

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

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<210> 13

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

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<210> 14

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<212> DNA

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