具体实施方式

本发明提供了酶组合物及其在柚皮素生物合成中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

LB液体培养基：10g/LNaCl、10g/L蛋白胨和5g/L酵母粉，余量为水，0.1Mpa压力121℃下灭菌20min。加1.5g/100mL琼脂粉可制备固体培养基。

M9液体培养基：无水Na₂HPO₄6.78 g/L，KH₂PO₄3 g/L，NH₄Cl 1g/L，NaCl 0.5g/L，酵母粉1g/L，余量为水，0.1Mpa压力121℃下灭菌20min。灭菌后加入灭菌的MgSO₄0.24 g/L，CaCl₂11.1 mg/L，葡萄糖5g/L。抗生素浓度分别为，氨苄青霉素100μg/L；链霉素50μg/L。母液1M MgSO₄、1MCaCl₂以及20％葡萄糖均需在115℃高压灭菌30min。

实施例中涉及的检测方法：

发酵结束后，取5mL发酵液于15mL离心管中，加入等体积的乙酸乙酯，在MIX-2500迷你混合仪上振荡30min，8000rpm离心10min，取上清进行旋蒸，重复萃取旋蒸一次。用1mL无水乙醇溶解，0.22μm有机系微孔滤膜过滤后进行HPLC检测。检测条件4.6×150mm C18色谱柱；流动相组成为30％乙腈-70％水-0.5％乙酸，流速1mL/min；紫外检测器，检测波长290nm；进样量10μL；柱温30℃。

本发明中，涉及片段及来源如下：

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1构建CHSs的表达载体

根据细枝真杆菌(Eubacterium ramulus)的查尔酮异构酶ErCHI(4D06_A)的氨基酸序列，结合大肠杆菌对密码子的偏好性，并去除常用酶切位点，设计全长Erchi基因，将Erchi基因连接在pETDuet-1质粒的的BamHI/HindIII酶切位点之间，全人工合成，得到载体质粒pNR1。

根据大豆(Glycine max)的查尔酮合成酶GmCHS(NP_001340309.1)的氨基酸序列，结合大肠杆菌对密码子的偏好性，并去除常用酶切位点，设计全长Gmchs基因，将Gmchs基因连接在pNR1质粒的NdeI/XhoI酶切位点之间，全人工合成，得到载体质粒pNR2。

根据苹果(Malus x domestica)的查尔酮合成酶MdCHS(NP_001315914.1)的氨基酸序列，结合大肠杆菌对密码子的偏好性，并去除常用酶切位点，设计全长Mdchs基因，将Mdchs基因连接在pNR1质粒的NdeI/XhoI酶切位点之间，全人工合成，得到载体质粒pNR3。

根据金丝桃(Hypericum androsaemum)的查尔酮合成酶HaCHS(AAG30295.1)的氨基酸序列，结合大肠杆菌对密码子的偏好性，并去除常用酶切位点，设计全长Hachs基因，将Hachs基因连接在pNR1质粒的NdeI/XhoI酶切位点之间，全人工合成，得到载体质粒pNR4。

根据矮牵牛(Petuniahybrida)的查尔酮合成酶PhCHS(AAF60297.1)的氨基酸序列，结合大肠杆菌对密码子的偏好性，并去除常用酶切位点，设计全长Phchs基因，将Phchs基因连接在pNR1质粒的NdeI/XhoI酶切位点之间，全人工合成，得到载体质粒pNR5。

根据高粱(Sorghum bicolor)的查尔酮合成酶SbCHS(XP_002450870.1)的氨基酸序列，结合大肠杆菌对密码子的偏好性，并去除常用酶切位点，设计全长Sbchs基因，将Sbchs基因连接在pNR1质粒的NdeI/XhoI酶切位点之间，全人工合成，得到载体质粒pNR6。

根据灯盏花(Erigeronbreviscapus)的查尔酮合成酶EbCHS(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，结合大肠杆菌对密码子的偏好性，并去除常用酶切位点，设计全长Ebchs基因，将Ebchs基因连接在pNR1质粒的NdeI/XhoI酶切位点之间，全人工合成，得到载体质粒pNR7。

实施例2构建CHILs的表达载体

根据拟南芥(Arabidopsis thaliana)的4-香豆酰辅酶A连接酶At4CL(U18675)的氨基酸序列，结合大肠杆菌对密码子的偏好性，并去除常用酶切位点，设计全长At4cl基因，将At4cl基因连接在pCDFDuet-1质粒的NdeI/XhoI酶切位点之间，全人工合成，得到载体质粒pNR8。

根据矮牵牛的查尔酮异构酶样蛋白PhCHIL(BAJ10400.1)的氨基酸序列，结合大肠杆菌对密码子的偏好性，并去除常用酶切位点，设计全长Phchil基因，将Phchil基因连接在pNR8质粒的NcoI/BamHI酶切位点之间，全人工合成，得到载体质粒pNR9。

根据苹果的查尔酮异构酶样蛋白MdCHIL(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列，结合大肠杆菌对密码子的偏好性，并去除常用酶切位点，设计全长Mdchil基因，将Mdchil基因连接在pNR8质粒的NcoI/BamHI酶切位点之间，全人工合成，得到载体质粒pNR10。

根据大豆的查尔酮异构酶样蛋白GmCHIL(NP_001236782.1)的氨基酸序列，结合大肠杆菌对密码子的偏好性，并去除常用酶切位点，设计全长Gmchil基因，将Gmchil基因连接在pNR8质粒的NcoI/BamHI酶切位点之间，全人工合成，得到载体质粒pNR11。

根据拟南芥的查尔酮异构酶样蛋白AtCHIL(NP_568154.1)的氨基酸序列，结合大肠杆菌对密码子的偏好性，并去除常用酶切位点，设计全长Atchil基因，将Atchil基因连接在pNR8质粒的NcoI/BamHI酶切位点之间，全人工合成，得到载体质粒pNR12。

实施例3构建表达CHILs和CHSs的重组菌株

将质粒pNR2-pNR7分别和pNR8同时电击转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态中，感受态在含链霉和氨苄双抗的LB固体培养基上培养过夜，筛选阳性克隆，构建对照菌株BNR1-BNR6，保存备用。

将质粒pNR2-pNR7分别和pNR9-pNR12同时电击转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态中，感受态在含链霉和氨苄双抗的LB固体培养基上培养过夜，筛选阳性克隆，构建发酵菌株BNR7-BNR30，保存备用。

实施例4重组菌株生物合成柚皮素

将重组菌株BNR1-BNR30按1％接种比例分别接种在LB液体培养基中，加链霉和氨苄抗生素，37℃，220rpm，震荡培养12h，然后转接到含抗生素的M9发酵培养基中，0.1mMIPTG，添加200mg/L对香豆酸底物，30℃，220rpm，震荡发酵48h后进行HPLC检测。液相检测图见图1，发酵产量图见图2。

根据图1，菌株BNR1-BNR6的发酵液中均检测到了柚皮素，表明六种CHSs均具有催化合成柚皮素的能力。其中，GmCHS和MdCHS的功能最弱，分别合成3.88mg/L和6.58mg/L柚皮素。HaCHS、PhCHS和SbCHS活性较强，柚皮素产量依次是22.69mg/L、33.09mg/L和97.11mg/L，分别比GmCHS高出4.84倍、7.52倍和24.03倍。而EbCHS表现最为优秀，柚皮素产量为148.54mg/L，是GmCHS的38.28倍。与此同时，发酵液中还检测到了CHS的两种脱轨产物CTAL和BNY。

根据图2，GmCHS在与不同CHILs组合后对柚皮素产量影响甚微。对于MdCHS，四种CHILs均产生正效应，其中MdCHS与同物种的MdCHIL合成20.18mg/L柚皮素，与对照相比产量提高2.07倍。对于HaCHS，与异物种CHIL的组合HaCHS+MdCHIL和HaCHS+GmCHIL使柚皮素产量分别增加42.35％和27.32％，为32.30mg/L和28.89mg/L。对于PhCHS，四种CHILs也都增强了PhCHS的催化效率，其中异物种的MdCHIL使柚皮素提升至126.29mg/L，提升2.82倍。对于SbCHS，除AtCHIL作用不明显外，其他三种物种的CHILs均有效，SbCHS+MdCHIL的组合使柚皮素产量提高90.76％，产量为185.31mg/L。至于EbCHS，不同种的CHILs对EbCHS的活性均有促进作用，EbCHS+PhCHIL的组合效果最优，合成了高达187.10mg/L的柚皮素，相比对照提高了25.95％。

实施例5对柚皮素水平提高的组合的发酵脱轨产物进行分析

CTAL和BNY是重组菌株发酵生成的主要脱轨产物。由于CTAL和BNY没有商业化标准品，利用峰面积间接表示其相对生成量，结果分别列于图3和图4。

本实施方案主要对柚皮素水平提高的组合进行分析。首先分析CTAL脱轨产物的变化。根据图3所示，MdCHS与不同CHILs的组合中，CTAL含量均降低，范围为46.98％-79.37％。组合HaCHS+MdCHIL、HaCHS+GmCHIL的CTAL含量也分别下降74.82％和75.77％。PhCHS、SbCHS和EbCHS与CHILs产生的组合，也均减少了CTAL生成，其中柚皮素水平更高的组合PhCHS+MdCHIL、SbCHS+MdCHIL、EbCHS+PhCHIL分别使CTAL含量减少了39.76％、26.47％、69.80％。由此可见，CHILs是通过减少脱轨产物CTAL的含量来增强CHS的催化效率的。

对于BNY脱轨产物的变化，根据图4，MdCHS与不同CHILs产生的组合中，MdCHS+PhCHIL、MdCHS+GmCHIL、MdCHS+AtCHIL使BNY含量分别降低22.39％、76.93％、56.47％，而MdCHS+MdCHIL使BNY增加1.06倍。HaCHS+MdCHIL、HaCHS+GmCHIL的组合起到了增加BNY含量的作用，增加幅度分别是87.06％、60.31％。PhCHS+PhCHIL、PhCHS+MdCHIL、PhCHS+GmCHIL的BNY积累量分别提高0.39倍、5.03倍、3.80倍，而PhCHS+AtCHIL的BNY积累几乎不变。SbCHS+MdCHIL、SbCHS+GmCHIL的BNY含量分别增加了76.67％、190.18％，而SbCHS+PhCHIL的BNY降低37.19％。对于EbCHS与四种CHILs的组合，BNY变化相对不明显。由此可见，CHSs与不同物种CHILs的组合对脱轨产物BNY的积累没有规律的作用。结论：在四种CHILs和六种CHSs产生的24种组合中，矮牵牛PhCHIL和灯盏花EbCHS的组合效果最优，合成了187.10mg/L柚皮素，较无CHIL情况下，柚皮素产量提高25.95％，同时发酵脱轨产物CTAL的含量降低69.80％，适用于柚皮素的生物合成。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 天津大学佐治亚理工深圳学院

<120> 酶组合物及其在柚皮素生物合成中的应用

<130> MP21017999

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 398

<212> PRT

<213> 灯盏花(Erigeron breviscapus)

<400> 1

Met Ala Ser Ser Ile Asp Ile Ala Ala Ile Arg Glu Ala Gln Arg Ala

1 5 10 15

Gln Gly Pro Ala Thr Ile Leu Ala Ile Gly Thr Ala Thr Pro Ser Asn

20 25 30

Cys Val Tyr Gln Ala Asp Tyr Pro Asp Tyr Tyr Phe Arg Ile Thr Lys

35 40 45

Ser Glu His Met Val Asp Leu Lys Glu Lys Phe Lys Arg Met Cys Asp

50 55 60

Lys Ser Met Ile Arg Lys Arg Tyr Met His Leu Thr Glu Glu Tyr Leu

65 70 75 80

Lys Glu Asn Pro Ser Leu Cys Glu Tyr Met Ala Pro Ser Leu Asp Ala

85 90 95

Arg Gln Asp Val Val Val Val Glu Val Pro Lys Leu Gly Lys Glu Ala

100 105 110

Ala Thr Lys Ala Ile Lys Glu Trp Gly Gln Pro Lys Ser Lys Ile Thr

115 120 125

His Leu Ile Phe Cys Thr Thr Ser Gly Val Asp Met Pro Gly Ala Asp

130 135 140

Tyr Gln Leu Thr Lys Leu Leu Gly Leu Arg Pro Ser Val Lys Arg Phe

145 150 155 160

Met Met Tyr Gln Gln Gly Cys Phe Ala Gly Gly Thr Val Leu Arg Leu

165 170 175

Ala Lys Asp Leu Ala Glu Asn Asn Lys Gly Ala Arg Val Leu Val Val

180 185 190

Cys Ser Glu Ile Thr Ala Val Thr Phe Arg Gly Pro Asn Asp Thr His

195 200 205

Leu Asp Ser Leu Val Gly Gln Ala Leu Phe Gly Asp Gly Ala Ala Ala

210 215 220

Val Ile Val Gly Ser Asp Pro Asp Leu Thr Thr Glu Arg Pro Leu Phe

225 230 235 240

Glu Met Ile Ser Ala Ala Gln Thr Ile Leu Pro Asp Ser Glu Gly Ala

245 250 255

Ile Asp Gly His Leu Arg Glu Val Gly Leu Thr Phe His Leu Leu Lys

260 265 270

Asp Val Pro Gly Leu Ile Ser Lys Asn Ile Glu Lys Ala Leu Thr Gln

275 280 285

Ala Phe Ser Pro Leu Gly Ile Ser Asp Trp Asn Ser Leu Phe Trp Ile

290 295 300

Ala His Pro Gly Gly Pro Ala Ile Leu Asp Gln Val Glu Leu Lys Leu

305 310 315 320

Gly Leu Lys Glu Glu Lys Met Arg Ala Thr Arg His Val Leu Ser Glu

325 330 335

Tyr Gly Asn Met Ser Ser Ala Cys Val Leu Phe Ile Ile Asp Glu Met

340 345 350

Arg Lys Lys Ser Ala Glu Asp Gly Ala Ala Thr Thr Gly Glu Gly Leu

355 360 365

Asp Trp Gly Val Leu Phe Gly Phe Gly Pro Gly Leu Thr Val Glu Thr

370 375 380

Val Val Leu His Ser Leu Pro Thr Thr Thr Ala Ile Ala Thr

385 390 395

<210> 2

<211> 209

<212> PRT

<213> 苹果(Malus x domestica)

<400> 2

Met Gly Thr Glu Val Val Leu Val Asp Glu Val Pro Phe Pro Ser Lys

1 5 10 15

Ile Thr Thr Thr Lys Pro Leu Ser Leu Leu Gly Gln Gly Ile Thr Asp

20 25 30

Ile Glu Ile His Phe Leu Gln Ile Lys Phe Thr Ala Ile Gly Val Tyr

35 40 45

Leu Asp Ala Lys Ile Val Ser His Leu Gln Gln Trp Lys Ala Lys Lys

50 55 60

Ala Asn Glu Leu Ala Glu Asp Asp Asp Phe Phe Asp Ala Leu Val Ser

65 70 75 80

Ala Pro Val Glu Lys Phe Ile Arg Val Val Val Ile Lys Glu Ile Lys

85 90 95

Gly Ser Gln Tyr Gly Val Gln Leu Glu Ser Ala Val Arg Asp Arg Leu

100 105 110

Ala Ala Asp Asp Lys Tyr Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Leu Glu Lys

115 120 125

Val Val Glu Phe Phe Gln Ser Lys Tyr Phe Lys Lys Asp Ser Val Ile

130 135 140

Thr Phe His Phe Pro Ala Thr Ser Asn Thr Ala Glu Ile Val Phe Ser

145 150 155 160

Thr Glu Gly Lys Glu Glu Ser Lys Ile Lys Val Glu Asn Ala Asn Val

165 170 175

Val Glu Asn Ile Lys Lys Trp Tyr Leu Gly Gly Thr Arg Gly Val Ser

180 185 190

Pro Ser Thr Ile Ser Ser Leu Ala Asn Thr Leu Ser Ala Glu Leu Thr

195 200 205

Lys

<210> 3

<211> 1170

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggttagcg tggcggagat tcgtcaggcg caacgtgcgg aaggtccggc gaccatcctg 60

gcgattggca ccgcgaaccc gccgaaccgt gttgaccaga gcacctaccc ggattactat 120

ttccgtatta ccaacagcga ccacatgacc gagctgaagg aaaaatttca acgtatgtgc 180

gataagagca tgatcaaaac ccgttacatg tatctgaacg aggaaattct gaaggagaac 240

ccgaacatgt gcgcgtatat ggcgccgagc ctggacgcgc gtcaggatat ggtggttgtt 300

gaggtgccga agctgggcaa agaagcggcg gtgaaggcga tcaaagaatg gggtcaaccg 360

aagagcaaaa tcacccacct gattttctgc accaccagcg gcgtggacat gccgggtgcg 420

gattaccagc tgaccaagca actgggcctg cgtccgtatg ttaaacgtta catgatgtat 480

cagcaaggtt gctttgcggg tggcaccgtg ctgcgtctgg cgaaggacct ggcggagaac 540

aacaaaggtg cgcgtgttct ggttgtgtgc agcgaaatta ccgcggtgac ctttcgtggt 600

ccgagcgaca cccacctgga tagcctggtt ggtcaggcgc tgtttggtga tggtgcggcg 660

gcggtgattg tgggtagcga tccgattccg caggttgaga agccgctgta cgaactggtg 720

tggaccgcgc aaaccattgc gccggacagc gagggtgcga ttgatggtca cctgcgtgaa 780

gtgggcctga ccttccacct gctgaaagac gttccgggta tcgtgagcaa gaacattgat 840

aaagcgctgt tcgaggcgtt taacccgctg aacatcagcg actacaacag catcttttgg 900

atcgcgcacc cgggtggccc ggcgattctg gatcaggttg agcaaaagct gggcctgaaa 960

ccggaaaaga tgaaagcgac ccgtgacgtt ctgagcgagt atggtaacat gagcagcgcg 1020

tgcgtgctgt tcatcctgga tgagatgcgt cgtaagagcg cggaaaacgg ccacaaaacc 1080

accggcgagg gcctggaatg gggtgttctg ttcggttttg gcccgggtct gaccatcgaa 1140

accgttgtgc tgcacagcgt ggcgatttaa 1170

<210> 4

<211> 1170

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggttaccg tggaggaagt tcgtaaagcg cagcgtgcgg agggtccggc gaccgtgctg 60

gcgattggca ccgcgacccc gagcaactgc gttgaccaag cgacctaccc ggattactat 120

ttccgtatta ccaacagcga acacaagacc gagctgaagg aaaaatttca acgtatgtgc 180

gacaaaagca tgatcaagaa acgttacatg tatctgaccg aggaaattct gaaggagaac 240

ccgaccgtgt gcgaatatat ggcgccgagc ctggacgcgc gtcaggatat ggtggttgtt 300

gaggtgccgc gtctgggcaa agaagcggcg accaaggcga tcaaagagtg gggtcaaccg 360

aagagcaaaa ttacccacct ggttttctgc accaccagcg gcgtggacat gccgggtgcg 420

gattaccagc tgaccaagct gctgggcctg cgtccgagcg tgaaacgtct gatgatgtat 480

cagcaaggtt gctttgcggg tggcaccgtt ctgcgtctgg cgaaggatct ggcggagaac 540

aacaaaggcg cgcgtgttct ggttgtgtgc agcgaaatta ccgcggtgac ctttcgtggt 600

ccgagcgaca cccacctgga tagcctggtg ggtcaagcgc tgtttggtga tggtgcggcg 660

gcggtgatca ttggtgcgga cccgctgccg gaagtggaaa aaccgctgtt tgagctggtg 720

agcgcggcgc agaccatcct gccggacagc gatggcgcga ttgacggtca cctgcgtgaa 780

gttggcctga cctttcacct gctgaaggat gtgccgggtc tgatcagcaa gaacattgag 840

aaaagcctga acgaagcgtt caaaccgatc ggtattagcg actggaacag cctgttttgg 900

attgcgcacc cgggtggccc ggcgattctg gatcaggtgg agagcaaact ggcgctgaag 960

ccggagaaac tggaagcgac ccgtcaagtt ctgagcaact acggtaacat gagcagcgcg 1020

tgcgttctgt tcatcctgga cgaagtgcgt cgtaagagca ccgaaaaagg cctgcgtacc 1080

accggcgagg gcctggaatg gggtgtgctg ttcggttttg gcccgggtct gaccgttgaa 1140

accgttgtgc tgcacagcgt ggcggcgtaa 1170

<210> 5

<211> 1176

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgatggtta ccgtggagga agttcgtaaa gcgcagcgtg cggaaggtcc ggcgaccgtg 60

atggcgattg gcaccgcggt gccgccgaac tgcgtggacc aagcgaccta cccggattac 120

tatttccgta tcaccaacag cgagcacaag gcggagctga aggaaaaatt tcagcgtatg 180

tgcgacaaga gccaaattaa gaaacgttac atgtatctga acgaggaagt tctgaaagaa 240

aacccgaaca tgtgcgcgta tatggcgccg agcctggacg cgcgtcagga tatcgtggtt 300

gttgaggtgc cgaagctggg caaagaagcg gcggtgaagg cgattaaaga atggggtcaa 360

ccgaagagca aaatcaccca cctggttttc tgcaccacca gcggcgtgga catgccgggt 420

gcggattacc agctgaccaa gctgctgggc ctgcgtccga gcgttaaacg tctgatgatg 480

tatcagcaag gttgctttgc gggtggcacc gtgctgcgtc tggcgaagga cctggcggag 540

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ggtccgaccg acacccacct ggatagcctg gttggtcaag cgctgtttgg tgacggcgct 660

gcggcgatca ttatcggtag cgatccgatc ccggaagtgg aaaaaccgct gtttgagctg 720

gtgagcgcgg cgcagaccat tctgccggac agcgagggcg cgatcgatgg tcacctgcgt 780

gaagtgggcc tgacctttca cctgctgaag gatgttccgg gtctgattag caagaacgtg 840

gagaaaagcc tgaccgaagc gttcaaaccg ctgggtatca gcgactggaa cagcctgttt 900

tggatcgcgc acccgggtgg cccggcgatc ctggatcaag ttgaggcgaa gctgagcctg 960

aagccggaaa aactgcgtgc gacccgtcac gttctgagcg agtacggtaa catgagcagc 1020

gcgtgcgtgc tgttcattct ggacgagatg cgtcgtaaga gcaaagaaga tggcctgaaa 1080

accaccggcg agggcatcga atggggtgtg ctgttcggtt ttggcccggg tctgaccgtt 1140

gaaaccgttg tgctgcacag cgtggcgatc aactaa 1176

<210> 6

<211> 1170

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggttaccg tggaagaata tcgtaaagca cagcgtgcag aaggtccggc aaccgttatg 60

gcaattggca ccgcaacccc gaccaattgt gttgatcaga gcacctatcc ggattattac 120

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gaagttccga aactgggtaa agaagcagca cagaaagcaa ttaaagaatg gggtcagccg 360

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agcgcagccc agaccctgct gccggatagt catggtgcaa ttgatggtca tctgcgtgaa 780

gttggtctga cctttcatct gctgaaagat gttccgggtc tgattagcaa aaacattgaa 840

aaaagcctgg aagaagcatt tcgtccgctg agcattagcg attggaatag cctgttttgg 900

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tgcgttctgt ttattctgga tgaaatgcgt aaagcgagcg caaaagaagg tctgggcacc 1080

accggtgaag gcctggaatg gggtgttctg tttggttttg gtccaggtct gaccgttgaa 1140

accgttgttc tgcatagcgt tgcaacctaa 1170

<210> 7

<211> 1206

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

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gcgaccgtgc tggcgattgg caccgcgacc ccggcgaact gcgttcacca agcggactac 120

ccggattact atttccgtat taccaagagc gagcacatga ccgagctgaa ggaaaaattt 180

aagcgtatgt gcgacaaaag ccagatccgt aagcgttaca tgcacctgac cgaggaatat 240

ctggcggaaa acccgaacat gtgcgcgtat atggcgccga gcctggacgc gcgtcaagat 300

attgtggttg ttgaggtgcc gaaactgggc aaggctgcgg cgcagaaagc gatcaaggaa 360

tggggtcaac cgaaaagcaa gattacccac ctggttttct gcaccaccag cggcgtggac 420

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ctgatgatgt atcagcaagg ttgctttgcg ggtggcaccg ttctgcgtgt ggcgaaagac 540

ctggcggaga acaaccgtgg cgcgcgtgtt ctggttgtgt gcagcgagat taccgcggtg 600

accttccgtg gtccgagcga aagccacctg gacagcatgg tgggtcaagc gctgtttggt 660

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggcgagca gcatcgacat tgcggcgatt cgtgaggcgc agcgtgcgca aggtccggcg 60

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